JPH08231474A - 金属キレート−蛋白質複合体を形成するための多置換ジエチレントリアミンおよびその製造方法 - Google Patents

金属キレート−蛋白質複合体を形成するための多置換ジエチレントリアミンおよびその製造方法

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JPH08231474A JP8055048A JP5504896A JPH08231474A JP H08231474 A JPH08231474 A JP H08231474A JP 8055048 A JP8055048 A JP 8055048A JP 5504896 A JP5504896 A JP 5504896A JP H08231474 A JPH08231474 A JP H08231474A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 金属キレート−蛋白質複合体を形成するため
の多置換ジエチレントリアミンを製造する。 【解決手段】 (a) アミノ- 保護αーアミノ酸をアミノ
酸アミドと反応させ；(b) 保護したアミノ酸を脱保護
し；(c) 工程(b) で得られた生成物を還元して多置換ジ
エチレントリアミンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の属する技術分野】
【０００１】本発明は金属キレート蛋白質複合体を形成
するための多置換ジエチレントリアミンおよびその製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】金属キレートにおける技術および診断お
よび治療の目的に金属キレート- 蛋白質複合体を形成す
る方法に関心がもたれている。代表的型のキレートおよ
び複合体並びに複合体の形成方法は、特に米国特許第
4,454,106号、第 4,472,509号および第 4,339,426号に
開示されている。かかる複合体の一例は金属キレート-
モノクローナル抗体複合体である。抗体フラグメント、
ポリクローナル抗体、抗原、血液蛋白質、または血液リ
ンパ球若しくは他の細胞に結合する蛋白質もまた複合体
の形成に使用することができる。
【０００３】蛋白質に複合化する二官能金属キレートの
合成方法は、アミノ酸アミドをエチレンジアミドに還元
して一置換誘導体を形成しこれ等誘導体をハロ酢酸でア
ルキル化することにより二官能エチレンジアミン四酢酸
(EDTA)キレートに転換することを含む。（イエ等アナ
ル．バイオケム．，100 ：152, 1979)。同様に、一置換
ジエチレントリアミンはエチレンジアミンのアミノ酸エ
ステルとの反応および生成したアミドカルボニルの還元
により合成される。（ブレッチビール(Brechbiel) 等イ
ンオーガ. ケム., 25 ：2772〜2781(1986)。ジエチレン
トリアミンのハロ酢酸によるアルキル化により一置換二
官能ジエチレントリアミン- 五酢酸(DTPA)キレートが生
成する。
【０００４】二官能ＤＴＰＡの他の合成法にはＤＴＰＡ
またはＥＤＴＡカルボキシレートをクロロ蟻酸エステル
と反応させて反応性無水物を形成することが含まれる。
〔クレジカーレク(Krejcarek) 等、バイオケム, バイオ
フィーズ. レス. コミュヌ(Biochem. Biophys.Res.Comm
un.), 77：581, 1977 〕。二官能キレートとして使用す
るＤＴＰＡの二無水物は、親ＤＴＰＡの脱水により製造
される〔ハナトウイッチ(Hnatowich) 等イント. ジェ
ー. アプル. ラド. イソト、(Int.J. Appl. Rad.Iso
t.), 33：327, 1982 〕。炭素１位で一置換されたＥＤ
ＴＡキレートを用いて非置換ＥＤＴＡキレートより試験
管内でキレートから金属の遊離を一層よく妨げる実施も
また報告されている。〔ミーレス(Meares)等, アナル・
バイオケム.(Anal・Biochem.), 142：68, 1984〕。
【０００５】一般に、従来技術は金属- 蛋白質キレート
複合体を一置換二官能ＥＤＴＡ若しくはＤＴＰＡキレー
トまたはＤＴＰＡ無水物を蛋白質と混合し次いでキレー
ト化すべき金属と反応させることにより形成した。〔ク
レジカーレク等，バイオケム，バイオフィズ，レス，コ
ミュヌ 77 ：581, 1977 ；ブレッチビール等インオー
ガ. ケム(Inorg,Chem.),25：5783, 1986〕。これ等の方
法により製造された金属キレート複合化(conjugated)モ
ノクローナル抗体を用い生体内で腫瘍標的の位置を映像
化することが報告されている。〔コウ(Khaw)等、サイエ
ンス, 209 ：295,1980〕。（シャインバーグ等，サイエ
ンス，215 ：1511, 1982) 。金属キレート複合化モノク
ローナル抗体を用いる生体内人間の癌の診断が報告され
ている。（レインズバーグ等，ランセット，２：694, 1
983)。
【０００６】然し治療の目的で金属キレート複合化モノ
クローナル抗体の腫瘍局限化特性を使用する試みは部分
的には金属が生体内で金属キレート複合体から遊離（し
ばしば遊離）する場合があり、特に放射性金属塩の場合
には、複合体が偶然に結合した金属を精確に一掃する場
合でも、骨髄等に望ましくない濃度の有毒放射性核種を
生成し得るので、普通用いられなかった。偶然に結合し
た金属の金属キレート蛋白質複合体を精製する方法は米
国特許第 4,472,509号に開示されている。
【０００７】モノクローナル抗体に放射性金属を堅固に
結合するために極めて強力な金属キレートを使用するこ
とおよび複合体をきびしく精製して最大腫瘍局限化を行
い且つ標的でない組織に送達するのを最小にすることの
重要性はブレッチビール等（インオーガ．ケム，25, 19
86) によって議論されている。マウスにおいて生体内で
金属キレート複合化ポリクローナル抗体から遊離される
治療の放射性核種の望ましくない局限化は人間における
治療研究を除外した。〔バウグーン(Vaughn)等, エアー
- ベリヒト(Eir-Bericht.) 78 1986〕。
【０００８】金属キレート複合化モノクローナル抗体と
して治療のため注射される放射性金属の生体内における
骨による吸収の増加もまた報告されている。〔ハナトウ
ィッチ等、ジェー．ニュクル．メド． (J. Nucl. Me
d.), 26 ： 503, 1985 〕。放射性金属キレート化ポリ
クローナル抗体の人間における可能的治療投与量は骨髄
毒性により制限された〔オーダー等，イント．ジェー．
ラド．オンコル． (Int.J. Rad. Oncol.), 12 ：277,
1986 〕。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】上述するところから金
属を堅固に蛋白質に結合して金属の遊離を最小にし、生
体内で標的位置に金属を選択的に送達し得る更に有効な
金属キレート蛋白質複合体に対する要求が続いているこ
とは明らかである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の目的は
新規な多置換ジエチレントリアミンを提供することにあ
る。本発明の他の目的および利点は発明の詳細な記載が
進むにつれて明らかになるであろう。
【００１１】本発明の第１の観点は炭素主鎖が多置換で
はあるが、少なくとも２個の置換基を有するジエチレン
トリアミンの合成を意図する。この合成は適切な置換ア
ルファーアミノ酸アミドを置換アミノ酸とカルボジイミ
ドカップリングし次いで生成したアミドをトリアミンに
還元することにより行う。
【００１２】本発明の他の観点は適当に置換したアルフ
ァーアミノ酸を置換アルファーアミノオキシムと縮合さ
せ次いで所望のトリアミンに還元せんとする。
【００１３】本発明によれば、炭素主鎖上で少くとも２
個の側鎖（多置換）、その一つがニトロ置換基を有する
側鎖により置換されるジエチレントリアミン五酢酸を含
む特に有用な系列の二官能キレートを意図することがで
きる。これ等のキレートは適当に多置換したジエチレン
トリアミンのハロ酸アルキル化により製造することがで
きる。
【００１４】他の観点で、本発明によれば、炭素主鎖上
で少くとも２個の置換基でその一つの置換基はニトロ，
アミノ基を有するかまたはイソチオシアネート若しくは
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル置換基である置
換基で置換された一連のジエチレントリアミン五酢酸キ
レートを意図することができる。
【００１５】尚他の観点で、本発明によれば、炭素主鎖
上で少くとも２個の置換基により置換された一連のジエ
チレントリアミン五酢酸キレートの蛋白質複合体を意図
することができる。
【００１６】本発明の尚他の観点によれば、炭素主鎖上
で水素原子ではない少くとも２個の置換基により置換さ
れた一連のジエチレントリアミン五酢酸キレートまたは
金属キレートを蛋白質に複合化することにより形成され
る金属キレート複合化蛋白質を意図することができる。
【００１７】更に特に、本発明によれば、生物学的活性
および特異性を保持し、偶然に結合した金属を実質的に
有さず、且つ従来技術で知られている複合体より生体内
で一層よく蛋白質に結合する金属を保持する金属キレー
ト複合化蛋白質、特に金属キレート複合化モノクローナ
ル抗体または抗体フラグメントを提供することができ
る。生体内で遊離される金属を血液中に存在するトラン
スフェリン、メタロチオネンまたは他の金属結合性蛋白
質（例えばフェリチン）により結合することができる。
かかる金属はしばしば長時間血液循環系に保持され網内
系(RES) の種々の器官に、骨、骨髄または肝臓に向って
離れる。かかるクリアランスの結果、肝臓、脾臓、腎
臓、骨または骨髄における金属が一定の濃度となる。肝
臓、脾臓、骨、骨髄または腎臓の如き標的とされない器
官における放射性金属の無作為の長時間循環または放射
性物質の濃度は極めて望ましくないことは明らかてあ
る。本発明の目的はかかる重要な問題を軽減することに
ある。
【００１８】金属、特に放射性金属を蛋白質に複合化す
るのに有用であることが示された多数の二官能キレート
は診断に用いるため生体内において金属を適当に保持す
るのには十分強くない。従ってインジウムの二官能ＥＤ
ＴＡ錯体は試験動物マウスにおいてインジウムの無水物
結合ＤＴＰＡ錯体の如く、脱金属する（ブレッチビール
等インオーガ．ケム., 25, 1986)。
【００１９】先行技術のＤＴＰＡ含有蛋白質複合体はＤ
ＴＰＡのカルボキシレート基を介してまたはＤＴＰＡの
窒素に結合する側鎖上の官能基を介してＤＴＰＡを結合
した。これ等のキレートは本発明にかかる主鎖多置換キ
レートの如く安定でない。主鎖一置換ＤＴＰＡもまた蛋
白質に結合されたがこのキレートのイットリウムおよび
ビスマス錯体は本発明にかかるキレートの錯体の如く安
定でない。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明の目的、特徴および付随す
る利点の多くは、次の〔化２〕〜〔化４〕に示すよう
な、化合物製造のための反応式と関連づけて考慮し、
〔化５〕〜〔化７〕ならびに表２および表３、さらに以
下の詳細な記載を読むと一層よく理解される：
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【００２１】
【表２】
【００２２】
【表３】
【００２３】〔化２〕はR1がパラ- ニトロベンジルであ
り、R3,4が以下に記載するようなアリール／アルキル基
である多置換ジエチレントリアミンの製造の反応経過を
示す。R3,4がメチル基である場合、〔化２〕の反応式で
得られるジエチレントリアミン生成物は表２に示す化合
物２(d) である。
【００２４】〔化３〕はPGが保護基 (後記) 、Ｒおよび
Ｒ′がそれぞれ以下に記載するようにパラーニトロベン
ジル基またはアリ−ル／アルキル基である多置換ジエチ
レントリアミンの製造の反応過程を示す。Ｒがパラーニ
トロベンジルでＲ′がメチルである場合、生成物ジエチ
レントリアミンは表２の化合物２(a) である。R がメチ
ルＲ′がパラーニトロベンジルである場合には生成物ジ
エチレントリアミンは表２の化合物２(c) である。
【００２５】〔化４〕はＰＧが保護基（後記）、Ｒがパ
ラ- ニトロベンジル, Ｒ′, Ｒ″がそれぞれ以下に記載
するようにアルキル／アリール基または水素原子である
多置換ジエチレントリアミンの製造の反応経過を示す。
Ｒ′がＨでＲ″がメチルである場合、生成物ジエチレン
トリアミンは表２の化合物２(b) である。
【００２６】ここで使用するすべての技術的または化学
的用語は、特記せぬ限り、本発明が属する技術の分野に
おける通常の知識を有する者により普通理解されるもの
と同じ意味を有する。ここに記載する方法および材料と
同様または均等なすべての方法および材料は本発明の実
施または試験に使用することができるが、好ましい方法
および材料を記載する。以下に挙げるすべての文献は参
考のために記載する。
【００２７】
【発明の実施の形態】本発明の好適例および詳細な説明
を次に記載し、利用を実施例により更に記述する。本発
明にかかる、二官能キレートは、その構造の一部分とし
て、キレート主鎖の炭素原子に結合する側鎖を有しこれ
がキレートから金属を遊離するのに必要とされるキレー
ト構造の配座開放（opening)を立体的に妨害するのに役
立つ。種々の側鎖の任意のものを使用することができ、
選択はこの技術の分野における通常の知識を有する者の
範囲にある。側鎖は炭素に対する炭素またはエーテル結
合等を含むことができる。炭化水素側鎖が好ましい。例
えばエーテル結合に存在する異原子がある場合には、こ
れ等は鎖長の決定の目的に炭素原子として教えることが
できる。
【００２８】かかる構造は、制限なく１〜約15個の炭素
原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基例えばメチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル等；エテ
ン、プロペン、ブテン等を含む１〜約15個の炭素原子を
有する直鎖または分岐鎖アルケン基およびそのアイソマ
ー；フェニル、ジフェニル、ナフチル等を含むアリール
基；および１個以上の分岐または直鎖アルキル基におけ
る１〜約15個の炭素原子を有するベンジル、フェニルエ
チレン、フェニルプロピレン等を含むアルキルアリール
基を含む。側鎖は活性基、特に水素および水素化物試薬
により容易に還元されるものを実質的に有するべきでは
ない。好ましくは側鎖には５個以下の炭素を有する直鎖
または分岐鎖アルカン、ベンジルおよびフェニルエチレ
ンが含まれる。最も好ましいかかる側鎖は表３および
〔化６〕，〔化７〕に示すようにメチル基である。
【００２９】本発明にかかる二官能キレートはその分子
構造の他の部分にキレート主鎖の炭素原子に結合し且つ
蛋白質のアミノ酸残基と直接反応して共有結合を形成す
る反応性官能基を持つ置換基を有する。かかる反応性官
能基にはイソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミドエステルおよびハロアセトアミドが含まれる。本
発明によれば、反応性官能基はキレート主鎖に直接結合
するかまたは広範囲の側鎖を介して結合することができ
る。広範囲の側鎖の任意のものを用いることができ特定
なものの選定は当業者が選定し得る範囲内にある。炭化
水素側鎖が好ましい。異原子が、例えばエーテル結合に
存在し炭素主鎖を中断する場合、異原子は鎖長の決定の
目的のため炭素原子として数える。
【００３０】かかる構造は、制限なしに、１〜約15個の
炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖アルキレン基例え
ばメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソプ
ロピレン等；エテニレン、プロペニンン、ブテニレン等
を含む１〜約15個の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐
鎖アルケニレン基およびそのアイソマー；フェニレン、
ジフェニレン、ナフチレン等を含むアリーレン基；およ
び１個以上の分岐鎖または直鎖アルキレン基におけるベ
ンジル、フェニルエチレン、フェニルプロピレン等を含
む１〜約15個の炭素原子を有するアリールアルキレン基
を含む。この側鎖の本質的目的はキレートと官能基との
間の安定な結合として役立つだけである。側鎖は上記の
所望の官能基以外の活性基を本質的に含むべきではな
い。好ましい側鎖には置換直鎖アルカン、ベンジルおよ
びフェニルエチレンが含まれる。
【００３１】本発明の好ましい観点において、〔化
６〕，〔化７〕の多置換ＤＴＰＡ誘導体の製造に際し中
間体として表２の置換基を有する、〔化５〕に示す構造
のジエチレントリアミンが望ましい。
【００３２】好ましいキレートは〔化６〕で表わされ
る。〔化６〕において、Ｘは好ましくはハロアセトアミ
ド、イソチオシアネートまたはＮ−ヒドロキシサクシン
イミドでR1〜R4, R2′〜R4′は水素原子、または５個以
下の炭素原子を有するアルキル基で、アイソマー構造に
関係なく任意のものでよくｎ＝５である。
【００３３】本発明にかかる他の好ましい観点におい
て、〔化７〕に示す構造のキレートが好ましく、この場
合Ｘ，R1〜R4, R1′, R3′, R4およびｎは〔化６〕のも
のと同じである。
【００３４】本発明によれば、最も好ましいものは、置
換基が表３に示すような〔化６〕および〔化７〕の化合
物で化合物３(a) 、３(b) 、３(c) および３(d) として
示す。
【００３５】活性側鎖のキレート炭素主鎖への導入は先
行技術に記載されている（ミーレス等、アナル・バイオ
ケム．142, 68,1984) 。ＤＴＰＡの殆ど全部の合成は終
りから２番目の反応工程として親ジエチレントリアミン
のアルキル化を有する。従って炭素主鎖多置換ＤＴＰＡ
の製造方法は親ジエチレントリアミンの製造に帰する。
【００３６】置換ジエチレントリアミンの従来の製造方
法は〔化２〕に示してある。この方法はアミノ酸エステ
ルとエチレンジアミンを反応させ次いでジエチレンジア
ミンに還元する。〔化２〕の反応を使用してR1がパラ-
ニトロベンジルでR3, R4がメチルである表２の新規な化
合物２(d) を得ることができる。この反応系に従って、
2, 3- ジアミノブタンをp-ニトロベンジルアラニン メ
チルエステルと反応させ生成物をジボランで還元して３
(d)の親ジエチレントリアミンを得る。３(d)を製造する
ため、親ジエチレントリアミンの窒素をブロモ酢酸でア
ルキル化し、次いでニトロ基を水素で接触還元し、生成
したアミンをチオホスゲンと反応させる。
【００３７】然し〔化２〕の方法を使用して表３の化合
物３(a) および／または３(b)を製造する場合は、1, 2-
ジアミノプロパンとp-ニトロフェニルアラニン メチ
ルエステルとの反応、続く上記の還元、アルキル化、還
元およびチオカルボキシル化工程の結果、幾何異性体で
ある化合物３(a)および３(b)の混合物が得られる。異性
体の分離は現在有効な方法により実施されない。〔化
２〕の方法を改良しても単離した３(a)および３(b)の純
粋な試料を製造するのに用いることはできない。
【００３８】３(a) および３(b) の純粋な試料が製薬用
に必要である場合に、多置換ＤＴＰＡの親ジエチレント
リアミンを製造するため〔化３〕、〔化４〕に示す新規
な方法が考え出された。化合物３(a) を製造するため
〔化３〕の方法に従って、アミノ- 保護α- アミノ酸、
この場合はt-ブチルオキシカルボニル-p- ニトロフェニ
ルアラニンをアミノ酸アミド、この場合は、アラニン
アミドに、カルボキシレートを適当な試薬によって活性
化することにより、カップリングする。かかる試薬は業
界で知られており特に好ましくは1, 3- ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド若しくは他のカルボジイミド、カルボ
キシカルボン酸エステル、混合無水物等が含まれる。カ
ップリングした生成物は次いでトリフルオロ酢酸若しく
は他の脱保護用試薬により脱保護し、次いでジボランで
還元して３(a) の親ジエチレントリアミンを生成する。
標準のアルキル化、還元およびチオカルボニル化工程に
より幾何学的に純粋な３(a) が得られる。化合物３(c)
を類似する過程により製造することができる。
【００３９】３(b) の親ジエチレントリアミンを製造す
るため、〔化４〕の新規な合成方法が考え出された。
〔化４〕に示す方法に従って、アミノ保護α- アミノ
酸、t-ブチルオキシカルボニル−ｐ−ニトロフェニルア
ラニン、をα- アミノケトンに、この場合アミノアセト
ンに、カルボキシレートを適当な試薬で活性化すること
によりカップリングする。有用なカップリング試薬は業
界で知られており特に好ましくは1, 3- ジシクロヘキシ
ルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド、カルボキ
シカルボン酸エステル、混合無水物等が含まれる。
【００４０】次いでケトン生成物をメトキシルアミンと
の反応により対応するメチルオキシムエーテルに転化す
る。生成したオキシムを脱保護し還元して３(b) の親ジ
エチレントリアミンを得る。アルキル化、還元およびチ
オカルボキシル化の標準反応過程により幾何学的に純粋
な３(b) が得られる。また3-アミノ−２−ブタンがアミ
ノアセトンとおきかわる場合〔化４〕に示す反応および
連続工程を使用して化合物３(d) を製造することができ
ることは勿論である。便宜のため、α- アミノケトンを
それらのアルキルオキシムエーテル、好ましくはメチル
エーテルに、〔化４〕におけるカップリング工程前に、
メトキシルアミン等で処理することにより、転化するこ
とができる。
【００４１】〔化６〕および〔化７〕のチオシアネート
キレートおよび表３のキレートを複合化する方法は、業
界でよく知られており、文献に記載されている〔ブレッ
チビール等前記文献〕。
【００４２】金属キレート蛋白質複合体に用いるための
蛋白質の選定は絶対的なものでない。任意の望ましい蛋
白質を複合体を形成するために用いることができる。モ
ノクローナル抗体が診断用および治療の目的に金属キレ
ート蛋白質複合体の形成用の好ましい蛋白質としてしば
しば選定されることは勿論である。他の適当な蛋白質に
はポリクローナル抗体、抗原、血液蛋白質等が含まれ
る。一般にキレートおよび蛋白質は蛋白質の濃度により
決定さるが１：１より大で約 100:１より小であるモル
比で混合する。約２：１〜約４：１の比が好ましいが、
反応条件の選定は当業者の選定しうる範囲内である。
【００４３】本発明によれば、蛋白質と結合させるのに
好ましい金属はキレートを蛋白質に結合する前または後
でキレート化することができる。方法の選定は使用する
特定金属の加水分解性向により、当業者には充分選定さ
れる。本発明によれば、即ち、蛋白質複合体を形成する
ためハロアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
エステルまたはイソチオシアネートを使用する場合に
は、複合体の形成に触媒は必要でなく、反応のpHは約６
〜9.5 が望ましい。触媒は必要でないが、使用すると３
〜４倍またはそれ以上複合化反応の速度を増すことがで
きる。適当な触媒は一般の塩基触媒でトリエチルアミ
ン、N, N−ジメチルアミノピリジン等が含まれる。
【００４４】任意適当な金属をキレートに用いることが
できかかる金属には常磁性を示す金属、蛍光性金属およ
び放射性金属が含まれる。代表的常磁性金属にはガドリ
ニウムおよび鉄があり、蛍光性金属にはランタニド系の
数種の金属例えばテルビウムおよびユウロピウムがあ
り; 放射性金属には放射性核種のビスマス、インジウ
ム、イットリウムおよびスカンジウムが含まれる。
【００４５】金属キレート化は水溶液、好ましくは約１
〜約７のpH、最も好ましくは約４〜約６のpHを有する希
酸媒質中で実施される。約20℃〜27℃若しくはそれ以下
（凍結直前まで）の周囲温度を金属キレート化に用いる
のが好ましい。固形または溶液とした任意適当な金属塩
を溶液中で遊離のキレートと接触させるかまたはキレー
ト化した金属を形成するために蛋白質に結合させる。金
属の使用量は痕跡量からキレートと等モル以上の分量と
することができる。広範囲の金属塩、例えば硝酸塩、沃
化物、塩化物、クエン酸塩、酢酸塩等を使用することが
できる。任意所定の金属に対する適当な金属塩の選定並
びに任意所定の金属に対する特に適するキレートの選定
は当業者が選定し得る範囲のものである。本発明の実施
はむしろ少量の金属および蛋白質を処理して金属キレー
トおよび金属キレート蛋白質複合体の形成を可能にする
ことは明らかである。
【００４６】予め形成した金属キレートを蛋白質と結合
しなければならない場合には、この際キレート化した金
属を水溶液中で所望蛋白質と約６〜11のpH、最も好まし
くは約７〜約9.5 のpHで混合する。pHは重炭酸塩緩衝液
の如き緩衝液で調整するのが好ましい。適当な緩衝液の
選定も当業者が選定し得る範囲に入る。溶液の温度は凍
結直前からキレートが不安定になるかまたは蛋白質が変
性する温度までの範囲とすることができる。37℃以上の
温度がしばしば蛋白質を変性する傾向がある。
【００４７】本発明によれば、金属キレート蛋白質複合
体は、所要に応じて、そのまま適当なpHに調整して使用
することがでる。或いはまた、複合体を複合化してない
キレートまたは任意の副反応による生成物から精製する
ことが望ましい場合には、生成物を精製することができ
る。カラムクロマトグラフィおよび高性能液体クロマト
グラフィ（ＨＰＬＣ）を含む業界で知られている種々の
標準的精製技術を使用することができる。
【００４８】本発明によれば、放射性キレート複合化モ
ノクローナル抗体を体内に導入し標的領域において濃厚
にすることができる生体内治療法を意図することができ
る。安定なＤＴＰＡ錯体を形成し細胞毒性ベーター粒
子、陽電子、オージェ電子およびアルファー粒子を放出
する広範囲の放射性アイソトープがある。アイソトープ
を放出する有用なベーター粒子にはSc-46, Sc-47，Sc-4
8, Ga-72およびGa-73 並びにＹ-90 が含まれる。Bi- 21
2 は有用なアルファー エミッターである。治療効果は
複合体が標的の細胞に近いかまたは接触し結合する場合
に起こる。細胞の死は細胞に接近して位置する放射性金
属の放射される場合の直接のまたは間接の結果とするこ
とができる。
【００４９】本発明のこの観点における利点はいくつか
ある。第一に複合化したモノクローナル抗体の高度の特
異性は全放射投与量を最小にする。標的細胞に対する十
分な放射を使用する必要がある。更に、一般に放射性金
属キレートを人体から速やかに浄化して複合化した抗体
を分裂させる必要がある。アイソトープは短時間存在す
ることができアイソトープがキレートに保持される親和
性定数は極めて大でこの結果金属が安定に結合される。
さらに、放射性金属の使用量が最小となることにより、
放射性金属キレート複合化抗体を製造し投与する人に対
する放射の危険が著しく低減する。
【００５０】本発明によれば、使用する放射性金属キレ
ート複合化モノクローナル抗体の特性によって、治療中
の組織の損傷または全体の身体への投与量は、現在使用
されている放射治療法例えばアイソトープ インプラン
ト、生体外放射治療、およびヨウ素131 標識付けしたポ
リクローナル抗体または自己抗体を用いる免疫放射治療
に比べて著しく低い。更に、標的放射生物学の生物学お
よび物理学的の半減期が制御され、全体の身体への放射
の影響が最小になる。放射が特定の細胞型( 例えば、腫
瘍性細胞) を標的とするので、治療投与量は局限される
かまたは転移する悪性細胞に特異的に送達される。特に
転移した細胞に治療放射の有効量を供給する放射性金属
キレート複合化モノクローナル抗体の能力もまた独特
で、癌の治療に特に有効である。
【００５１】他の例において、本発明は生体内診断法を
意図することができ、この方法は金属キレート複合化モ
ノクローナル抗体を体内に導入し、複合体を十分な時間
局限化しその程度および局限化の部位を確認する。本発
明はまたキレート複合化モノクローナル抗体を使用する
生体内分析法を意図することができる。本発明によれ
ば、複合化抗体は偶然にまたは弱くキレート化した金属
を実質的に有しない。本発明によれば、抗体に複合化す
るキレートはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）
の誘導体である。
【００５２】他の診断および治療技術はここに参考のた
め記載する米国特許第4,454,106 号に記載されている。
次の実施例は例示の目的だけに用い本発明を制限せんと
するものではない。
【００５３】
【実施例】実施例１ 1, (2)−メチル−４−（ｐ−イソチオシアナトベンジ
ル) ジエチレントリアミン五酢酸の製造。（表３の化合
物３(a),３(b) の幾何異性体の混合物）。
【００５４】メチルｐ- ニトロフェニルアラニン ヒド
ロクロリド 乾燥メタノール(200ml) を−10℃に冷却した二つ口丸底
フラスコ中でHCl (ガス) で飽和した。 p- ニトロフェ
ニルアラニン(10.0g, 47.6ミリモル) を一回で添加し約
18時間かきまぜ、溶液を回転蒸発機で乾燥近くまで蒸発
させ沈澱した生成物をブフナ漏斗に収集した。約50℃で
真空下乾燥させた後、収量は10.97g(88.3 ％) であっ
た。遊離アミノエステルのＴＬＣ（薄層クロマトグラフ
ィ）を CHCl3： MeOH （４：１）で行い Rf ＝0.85〜0.
88であた。 1Ｈ NMR 220 MHz, D2O,pH 1.5)8.20(d,2 J
＝10.0), 7.53(d, 2, J＝10.0), 4.55(t, 1, J ＝5.0
0),3.84(s, 3), 3.43(m, 2); CI-MS 225((Ｍ＋1)/z) 。 C10H13N2O4C1に対する分析、計算値:C, 46.07; H, 5.0
3; N, 10.74; C1, 13.60。 実験値: C, 45.87; H, 5.08; N, 10.48; C1, 13.58。
【００５５】Ｎ−（２−アミノ−〔１(a) −メチル〕エ
チル)-p-ニトロフェニル アラニンアミド メチル p- ニトロフェニルアラニン ヒドロクロリド
(9.80g, 37.63 ミリモル) をトリエチルアミン(6.78 m
l, 45.2ミリモル) で処理してアミノエステルを遊離さ
せた。溶媒を除去した後、残留油状物をメタノール（５
ml）中1, 2- ジアミノプロパン(50 ml) に室温 (20℃〜
24℃) で激しくかきまぜながら滴下した。18時間かきま
ぜた後、過剰の溶媒を回転蒸発機により50℃ 0.01mの真
空下で一定重量(10.01g, 96 ％) に達するまで除去し
た。生成物のＴＬＣをシリカ上 CHCl3：MeOH（４：１）
で行い Rf ＝0.10〜0.12であった。 1Ｈ NMR(220 MHz,
D), pH10.0) 8.06(d,2, Ｊ＝7.5), 7.41(d, 2,Ｊ＝7.
5), 3.72(t, 1,Ｊ＝8.0), 3.18-2.73(m, 5), 0.918(m,
3);CI-MS 267((M ＋1)/z) 。 C12H18N4O3に対する分析、計算値:C, 54.53; H, 6.77;
N, 21.05; 実験値：Ｃ,54.33; H, 6.76; Ｎ, 20.92 。
【００５６】１(2) −メチル−4 −(p−ニトロベンジ
ル) ジエチレン トリアミン トリヒドロクロリド Ｎ−（２−アミノ−〔１(2) −メチル〕エチル−ｐ−ニ
トロフェニルアラニンアミド(9.90g, 37.2ミリモル) を
１モルのBH3THF（水素化ホウ素テトラヒドロフラン）(2
00 ml)で還元した１リットルの三つ口丸底フラスコに還
流冷却器、隔壁、アルゴン入口およびバブラー出口を取
付け火炎で乾燥した。アミド(8.12g,38.9ミリモル) を
乾燥テトラヒドロフランＴＨＦ(150 ml)の入った反応フ
ラスコ中に入れ−10℃に冷却した。
【００５７】次いで、１モルのBH3THF溶液(200 ml)を注
射器で添加した。反応溶液を−10℃で１時間かきまぜ、
次いでおだやかに18時間還流し、然る後これを−10℃に
冷却し乾燥メタノール(25 ml) を注入した。溶液を室温
にしほぼ乾燥するまで溶媒を除去した。再びメタノール
(25 ml) を添加し溶液を蒸発させた。ボラン凝集体の開
裂は HCl飽和エタノール性溶液の激しい還流と濃HCl水
溶液（５ml）の添加を必要とした。生成物がきれいに沈
澱し０℃に６時間冷却した後収集し真空下乾燥した(11.
60g, 86.3 ％) 。CI-MS 362((M＋1)/z）。C12H23N4O2Cl
3 に対する分析、計算値： C, 39.85; H, 6.65; N, 15.
49。実験値:C, 39.99; H, 6.64; Ｎ,15.14 。
【００５８】１(2) メチル-4(p- ニトロベンジル) ジエ
チレントリアミン五酢酸：親ジエチレントリアミン(1.0
g, 2.77 ミリモル) をブロモ酢酸(5.767g, 41.5 ミリモ
ル) および7N KOH (13.04 ml) で処理した。反応溶液を
室温で72時間かきまぜた。溶液を濃HBr でpH1.5 の酸性
としエーテルで抽出した（３×100 ml) 。水溶液を蒸発
させ固体とし2.6 ×30cmイオン交換カラムAG50W X8, 2
00〜400 メッシュ, Ｈ+形〔米国，カリフォルニア州，
リッチモンド所在のバイオラド(Bio Rad) 社〕上に負荷
し水洗して未反応物質、加水分解生成物および塩を除去
した。粗生成物を2Nアンモニア水溶液で溶離した。
【００５９】粗生成物を更に10×250 mm, C18 逆相カラ
ムを使用するＨＰＬＣにより 100％メタノールに対し0.
05モルのトリエチレアンモニウム アセテートの25分変
化度で３ml／分の流速を用いて精製した。生成物は 9.1
分の滞留時間を有した。ＨＰＬＣからの画分を混合し上
記のAG50W X8カラムで再びクロマトグラフィーにかけト
リエチルアンモニウムアセテート緩衝液を除去した。生
成物を収集し溶媒を蒸発させて固形物(0.648g, 43.2
％) を得た。
【００６０】１(2) −メチル−４−（ｐ−アミノベンジ
ル) ジエチレントリアミン五酢酸：親ニトロベンジルＤ
ＴＰＡ(100.0mg, 0.1845ミリモル) をPd/Cを用いて水素
化した。水ジャケット付三つ口フラスコ(50 ml) に10％
Pd/C(43 mg) 、H2O (5 ml)およびかきまぜ棒を入れた。
中心の頸部を常圧水素化装置に取付け、一側の頸部に注
入弁を取付け、残りの頸部にしっかり栓をした。組立て
た水素化装置を排気し水素でフラッシュしこの間反応フ
ラスコを４℃に冷却した。ニトロ化合物を水(10ml) に
溶解し５モルNaOHを添加してpHを10.0にした。溶液を反
応フラスコに注入し水素の消費量を監視した。反応後、
混合物を微細フリットとセライト535(フルカ社(Fluka A
G), スイス国) を介して濾過した。溶媒を除去し残留物
を真空下18時間乾燥し収率はほぼ定量的であった。
【００６１】１(2) −メチル−４−（ｐ−イソチオシア
ナトベンジル）ジエチレントリアミン五酢酸：（表３の
化合物３(a),３(b) の混合物）。アニリン前駆物質と上
記化合物３(a)，３(b)の親混合物(0.095g, 0.1845 ミリ
モル) を水（５ml）pH8.5 に溶解し、チオフォスゲン
(0.212g, 1.845ミリモル) の CHCl3(10ml) 溶液で処理
することにより粗生成物に転換した。この粗生成物を１
×30cmフロリシル(Florisil)( シグマ, セント. ルイ
ス, Mo) 上でカラム クロマトグラフィにかけ CH3CN：
H2O (30:８）で溶離し生成物が最初に溶離した。溶媒を
最小加熱で除去し残留する水溶液を一夜凍結乾燥し
た。シリカ上でCH3CN:H2O(30：８）を使用して得た生成
物の Rf は0.20であった。ＩＲスペクトルはイソチオシ
アネートに対し2100cm-1に特徴ある吸収を示した。
【００６２】実施例２ 実施例１の方法において合成の第２段階で1, 2- ジアミ
ノ プロパンの代わりに2, 3- ジアミノブタンを用いた
以外は同様にして表３の化合物２(d) を製造した。
【００６３】実施例３ １（p-イソチオシアナトベンジル)-3-メチルＤＴＰＡ。 （単−幾何異性体として表３における化合物３(a) の合
成）ｔ- ブトキシカルボニル-(d, l)-p-ニトロフェニルアラ
ニン : p-ニトロフェニルアラニン(7.94g, 37.8ミリモ
ル) を50％ジオキサン水溶液(60 ml) に溶解し、トリエ
チルアミン(7.9 ml, 56.7 ミリモル) を添加した。〔2-
(t- ブトキシカルボニルオキシアミノ)2- フェニルアセ
トニトリル〕 (10.24g, 41.6 ミリモル, アルドリッヒ
ケミカル コンパニー) を添加し溶液を２時間かきま
ぜた。酢酸エチル(100 ml)および水(50 ml) を添加し内
容物を分離漏斗に注入した。
【００６４】水性相を保持し酢酸エチル(100 ml)で２回
抽出した。水性相を０℃に冷却し、pHを３NHClで2.0 に
調整し、この際形成された沈澱を集め真空下乾燥した。
濾液を酢酸エチルで２回（100 ml) 抽出し、MgSO4 上で
乾燥し溶媒を除去し乾燥した。２つの画分は同一である
ことが立証され混合した(11.0g, 94.0％）。化合物の融
点は165 ℃であった。1 Ｈ NMR (220 MHz, DMSO-d6) 8.036 (d, 2, J=8.00),
7.29 (d, 2, J=8.00),5.38 (d, 1, J=8.00), 4.44 (m,
1), 3.25 (dd, 1, J=13.0, 6.00), 3.05 (dd,1, J=13.
0, 6.00), 1.39 (s, 9); CI-MS 311((M+1)/z) 。
【００６５】ｔ−ブトキシカルボニル−(d) −ｐ−ニト
ロフェニルアラニニル−(1) −アラニンアミド:BOC-(d
l)−ｐ−ニトロフェニルアラニン(10.0g, 32.26 ミリモ
ル),1-アラニンアミド ヒドロブロミド（5.45g, 32.26
ミリモル),トリエチルアミン(4.487 ml,32.36ミリモル)
および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(3.84g, 28.4
ミリモル）を酢酸エチル(400 ml)に溶解した。ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド(7.30g,35.44 ミリモル) の酢
酸エチル(25 ml) 溶液を添加し反応混合物を18時間かき
まぜ然る後３滴（約0.15 ml)の濃酢酸を添加した。ジシ
クロヘキシル尿素を濾別し濾液を飽和塩化ナトリウム溶
液(100 ml), 1N HCl(3×100 ml), 飽和塩溶液(100ml),
５％ NaHCO3 （３×100 ml) および飽和塩溶液(100 ml)
で順次抽出した。
【００６６】有機溶液をMgSO4 上で乾燥し、濾過し、50
ml に減した。石油エーテル(50 ml) を添加しフラスコ
の内容物を０℃に12時間冷却した。沈澱をブフナ漏斗上
に集めて真空下乾燥した （10.55g, 86.1％) 。1 Ｈ NMR (220 MHz, CDCl3/d6-DMSO) 8.08 (d, 2, J=9.
0),7.91 (m, 1) 7.45(d, 2, J=9.0), 7.14 (d, 1, J=1
2.0),6.68(m,2), 4.35(m,2), 3.17 (dd, 1, J=15.0, 6.
0), 2.98 (dd, 1, J=15.0, 8.0), 1.38 (s, 9); CI-MS
381((M+1)/z)。 C17H24N4O6に対する分析、計算値：C, 53.68; H, 6.31;
N, 14.73。実験値：C,53.92; H, 6.59; N, 14.84 。
【００６７】２−メチル−４−（ｐ−ニトロベンジル）
ジエチレントリアミントリヒドロクロリド 上記ジペプチド アミド(5.10g, 13.42 ミリモル) をト
リフルオロ酢酸(50 ml) で１時間処理することにより脱
保護し然る後溶液を回転蒸発機でほぼ乾燥するまで蒸発
させた。メタノール(50 ml) を添加し溶液を取出し乾燥
させた。生成した固体を0.01mm, 50℃に８時間保持して
残留する酸の除去を確保した。
【００６８】生成したアンモニウム塩(5.10g, 13.42 ミ
リモル) のTHF (50 ml) 溶液をコンデンサを取付けた25
0 mlの火炎乾燥した三つ口フラスコにアルゴン雰囲気下
で添加した。フラスコを０℃に冷却し１モルのBH3THF
(30.8 ml)を注射器により添加した。反応溶液を２時間
加熱し激しく還流させ次いで室温で更に２時間かきまぜ
た。反応フラスコを０℃に冷却しメタノール(25 ml) を
緩徐に注入して過剰の水素化物を分解した。
【００６９】溶液を乾燥するまで減らし、無水エタノー
ル(50 ml) に供給し、濃HCl(50 ml)を添加した。溶液を
２時間激しく還流させ次いで乾燥させた。残留物を水に
溶解し、1.5 ×20cmAG50W X8，Ｈ+ 形, イオン交換カラ
ムに負荷し、溶離剤が中性になるまで水洗した。生成物
を濃塩化水素酸(125 ml)を用いてカラムから溶離し、10
ml まで濃縮し、一夜凍結乾燥した。残留する固体はほ
ぼ純粋であることを確かめた(1.823g, 66.2 ％) 。
【００７０】1Ｈ NMR (500 MHz, D2O, pH 1.0) 8.268
(d, 2, J=8.0), 7.614 (d, 2, J=8.0), 4.106 (m, 1)
3.773 (m, 1), 3.680 -3.450 (m, 3), 3.393 (m, 1),
3.312(m, 1), 3.212 (m,1),1.493 (br. t, 3); (500 MH
z, D2O, pH 11.0) 8.091 (d,2, J=8.0), 7.438(d, 2, J
=8.0), 3.167 (m, 1), 2.910 (m,1) 2.75-2.45（極め
て複雑な多重線，6), 1.031 (br.s, 3);CI-MS 253((M+
1)/z)。 C12H23N4O2Cl3 に対する分析、計算値：C, 39.85; H,6.
36; N, 15.49。実験値：C, 39.88; H, 6.36; N, 15.28
。 このジエチレントリアミンの化合物３(a) への転化は実
施例１に記載した方法により達成した。
【００７１】実施例４ １−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−４−メチルDT
PA（〔化４〕に示す反応経過に従って純粋な幾何異性体
として製造される化合物３(b) 〕)BOC-p-ニトロフェニルアラニン2-オキソプロピル アミ
ド t-ブチルオキシカルボニル-p- ニトロフェニルアラニン
(4.42g, 14.26 ミリモル), アミノアセトン ヒドロク
リド(1.56g, 14.26 ミリモル) 、トリエチルアミン(1.4
4g, 14.26 ミリモル), 1- ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル(1.69 g, 12.55ミリモル) を、酢酸エチル(400 ml)に
溶解した。
【００７２】1,3-ジシクロヘキシルカボジイミド(3.23
g, 15.68 ミリモル) の酢酸エチル(25 ml) 溶液を添加
し溶液を18時間かきまぜた。氷酢酸(0.2 ml)を添加し溶
液を濾過した。濾液を飽和塩溶液(100 ml)、1NHCl 溶液
（３×100 ml) 、飽和塩溶液(100 ml)、５％重炭酸塩溶
液（３×100 ml) および飽和塩溶液(100 ml)で抽出し
た。有機層をMgSO4 上で乾燥し、濾過し50mlに濃縮し
た。石油エーテル(50 ml) を添加し溶液を12時間０℃に
冷却した。沈澱した生成物を集め真空下で乾燥した。
【００７３】BOC-p-ニトロフェニルエラニン-2-(オキシ
ムメチルエーテル）プロピルアミド ケトン(200g, 5.47 ミリモル) をピリジン(10 ml) に溶
解しメトキシルアミンヒドロクロリド(0.914g, 10.95ミ
リモル) を添加した。溶液を12時間かきまぜ然る後溶媒
を除去した。残留物を最少量の酢酸エチルに溶解し石油
エーテルを添加することにより晶出しオキシムエーテル
アミドを得た。
【００７４】1-メチル-4-(p-ニトロベンジル) ジエチレ
ントリアミン トリヒドロクロリド 上記オキシム エーテル(3.00g, 7.61ミリモル) を適当
なトリフルオロ酢酸(10 ml) を用いかきまぜて脱保護し
た。溶媒を高真空回転蒸発により除去した。
【００７５】残留物をテトラヒドロフラン(50 ml) に溶
解し還流冷却器、アルゴン入口およびバブラー出口およ
び注入口を取付けた火炎乾燥したフラスコに添加した。
溶液を０℃に冷却し１モルBH3THF (200 ml) を注射器に
より添加した。６時間還流して反応を行い０℃に冷却
し、メタノール(25 ml) を添加しすべての過剰水素化物
を分解した。溶液を回転蒸発機で蒸発させてほぼ乾燥さ
せ残留物をメタノール(100 ml)中に供給した。エタノー
ル溶液を HCl（ガス）で飽和させ４時間還流し、然る後
溶液を０℃で18時間冷却した。沈澱を集め、ジエチルエ
ーテルで洗浄し、真空下で乾燥した。このジエチレント
リアミンの化合物３(b) への転化を実施例１に記載した
方法により達成した。
【００７６】参考例１ ロウシャー(Rauscher)白血病ウィルスに対し特有のモノ
クローナル抗体に以下の如く表３のキレート３(a) およ
び３(b) の混合物を用いて標識付けした。抗体を約8.5
のpHを有する普通の緩衝塩溶液中に懸濁させた。キレー
トを水溶液に添加した。この蛋白質溶液を反応一夜後金
属を含まない0.05モルクエン酸塩、0.15モルNaCl緩衝
液、pH 5.5に対して透析により精製した。金属で標識付
けする前に、蛋白質を0.02モルのN-モルホリノエタンス
ルホン酸および0.08モルの酢酸塩を含む溶液、 pH5.9に
対して透析した。イットリウム-90 で標識付けするた
め、蛋白質溶液を約４〜5.5 のpHのアイソトープ酢酸塩
溶液と反応させTSK 3000サイズ排除カラム（米国カリフ
ォルニア州, バークレイ所有のベックマン社) を通すこ
とおよび透析により精製した。
【００７７】このようにして得た標識付けした抗体を脾
臓がロウシャー白血病ウイルスにおかされたマウスに注
射した場合、抗体が脾臓において局限化され注射薬量の
３０％が腫瘍状の脾臓に結合しているのが見られ僅か１
〜２％の放射性薬量が骨髄が破壊されることになる骨内
に見出された。これに対し、従来のDTPAの混合無水物を
用いて標識付けした抗体は上述の如くY-90で標識付けし
同じマウス腫瘍試験動物に注射した場合もほぼ同じ程度
に脾臓において局限化されたが注射した放射性薬量の約
８〜12％が骨髄に見出され望ましくなかった（データは
示さず）。
【００７８】別の研究で、アイソトープのヨウ化物溶液
を表３に記載したようなキレート３(a),３(b) を用いて
つくった抗体との反応によりビスマス-212若しくは Bi-
206で標識付けした。またこれ等の調剤をマウスに注射
したところ組織分布データは薬量の５〜10％が腎臓中に
見出されることを示した。然し従来技術の混合無水物キ
レートを用いて標識付けした抗体は同じ時間中に50％も
の多量の薬量を腎臓において損失し腎臓の損傷をおこし
た。他の放射性アイソトープを用いて同様に標識付けを
行い標的組織または器官に対して同様に試験を行った。
【００７９】これ等の研究は本発明にかかるキレートが
腫瘍に対し治療アイソトープを特異的に送達するのに使
用するために顕著に利用されしかも腎臓および骨の如き
標的とされない器官への化合物の分布が最小化されるこ
とを示す。標的組織または器官の撮像は業界でよく知ら
れている標準の放射線透過写真技術により行うことがで
きる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ガンソー オットー エイ アメリカ合衆国 ワシントン ディーシー 20008 ダブリュー524 エヌ ダブリュー ファン ネス 3003 (72)発明者 ブリッチビル マーチン ダブリュー アメリカ合衆国 ヴァージニア州 22042 フォールス チャーチ サマーフィール ド ロード 2824

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a) アミノ- 保護αーアミノ酸をアミノ
    酸アミドと反応させ；(b) 保護したアミノ酸を脱保護
    し；(c) 工程(b) で得られた生成物を還元して多置換ジ
    エチレントリアミンを生成することを特徴とする多置換
    ジエチレントリアミンの製造方法。
  2. 【請求項２】 (a) アミノ- 保護αーアミノ酸をα−ア
    ミノケトンと反応させ；(b) 生成したケトンをメトキシ
    ルアミンと反応させることによりオキシムエーテルに転
    換し；(c) 生成したオキシムエーテルを脱保護し次いで
    脱保護したオキシムエーテルを還元して多置換ジエチレ
    ントリアミンを生成することを特徴とする多置換ジエチ
    レントリアミンの製造方法。
  3. 【請求項３】 トリアミンの炭素主鎖に結合した少くと
    も２つの側鎖を有し、その側鎖のうち１つがニトロベン
    ジル基である次式： 【化１】 （式中、R1, R2およびR1′, R2′を、水素；１〜15個の
    炭素原子を有する 直鎖または分岐鎖アルキル基；１〜
    15個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルケン基；
    ６〜14個の炭素原子を有するアリール基；１つ以上の分
    岐鎖または直鎖アルキル基に１〜15個の炭素原子を有す
    るアルキルアリール基；およびパラ−ニトロベンジル
    基；ならびにそれらの混合物よりなる群から選択し、R
    3 ,R4およびR3, R4′を水素；１〜15個の炭素原子を有
    する直鎖または分岐鎖アルキル基；１〜15個の炭素原子
    を有する直鎖または分岐鎖アルケン基；６〜14個の炭素
    原子を有するアリール基；１個以上の分岐鎖または直鎖
    アルキル基に１〜15個の炭素原子を有するアルキルアリ
    ール基；およびそれらの混合物よりなる群から選択す
    る）で表わされることを特徴とする多置換ジエチレント
    リアミン。
  4. 【請求項４】 R1〜R4, R1′〜R4′基が次表 【表１】 で表わされることを特徴とする請求項３記載の多置換ジ
    エチレントリアミン。
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