JPH08168392A - フィトスフィンゴシン誘導体の製造法 - Google Patents

フィトスフィンゴシン誘導体の製造法

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JPH08168392A
JPH08168392A JP7182120A JP18212095A JPH08168392A JP H08168392 A JPH08168392 A JP H08168392A JP 7182120 A JP7182120 A JP 7182120A JP 18212095 A JP18212095 A JP 18212095A JP H08168392 A JPH08168392 A JP H08168392A
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tetraacetylphytosphingosine
pichia
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produced
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JP7182120A
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John Casey
ジョン・ケイシー
Katherine A Maume
キャサリン・エイ・モーム
Alfons L J Peters
アールフォンス・ロゥダバイク・ジェイ・ピータース
Rudolf M Veloo
ルドルフ・マーセル・ベルー
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Givaudan Nederland Services BV
Original Assignee
Quest International BV
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 テトラアセチルフィトスフィンゴシンを生成
する方法を提供する。 【構成】 本発明は、ピキア・シフェリイ（Pichia cif
errii ）のＦ-60-10接合型株を用いてテトラアセチルフ
ィトスフィンゴシンを生成する方法に関する。そのよう
な株を突然変異誘発させ、高テトラアセチルフィトスフ
ィンゴシン生成株を特定の操作により選抜する。流加様
式で非発酵性炭素源で26℃より高い温度でそれらの株を
増殖させ、発酵培地すらテトラアセチルふす回収する。
グリセロールが好ましい炭素源であり、好ましくはＬ−
セリンを培地に添加する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定のフィトスフィン
ゴシン誘導体の微生物学的製造法に関する。さらに特定
すると、本発明はテトラアセチルフィトスフィンゴシン
の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般的に、しばしば一般的にスフィンゴ
脂質と呼ばれるセラミド及び関連脂質化合物は、皮膚の
角質層に存在し、過剰の水の損失及び皮膚の乾燥を防ぐ
のに重要な役割を果たしている。欧州特許出願公告第00
97059 号には、皮膚の水遮断層機能におけるそれらの役
割が概説されている。又、この公告及び英国特許第2,17
8,312 号及び第2,213,723 号にはセラミド及び同様の脂
質の、老化及び乾燥皮膚の水遮断層機能を復元するのを
助けるための局所的適用組成物における使用が記載され
ている。
【０００３】セラミドは、アシル基が種々の長鎖脂肪酸
から誘導されるＮ- アシル化スフィンゴシン塩基であ
る。そのようなセラミドは、主に種々の動物及び少程度
植物源から得られているが、このように得られた生成物
が、常に化粧品用に容認できるとは限らないかあるいは
大規模な精製を必要とする。
【０００４】背の構造について多くの文献が存在する。
最近、合成セラミド及びセラミド類似物が、欧州特許出
願公告第0097059 号、欧州特許出願公開第0420722 号及
び欧州特許出願公開第0500437 号に記載されている。そ
れらのセラミド及び類似物は、種々のスフインゴシン塩
基から合成されてきた。スフインゴシンを得る種々の経
路は、Ｄ．スハピロ（Shapiro ）により「ケミストリー
・オブ・スフィンゴリピッズ（Chemistry of Sphingoli
pids）」、ヘルマン（Hermann ）、パリ（1969年）にも
記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】スフインゴシン塩基の
１つのタイプは、構造、 R-CHOH-CHOH-CH(NH2)-CH2OH （式中、Ｒは長鎖のアルキル基、特にＣ14Ｈ29である）
を有するフィトスフィンゴシンである。このフィトスフ
ィンゴシンは、ヒトの皮膚の脂質において同定されたセ
ラミド３及び６ｂにおける塩基成分である。このよう
に、正しい立体異性体すなわち、皮膚の脂質に存在する
ものをさらに好ましく提供しなくてはならない、フィト
スフィンゴシンの効率のよい合成に対する必要性が存在
する。
【０００６】種々の刊行物には、ピキア・シフェリイ
（Pichia ciferrii ）とも名付けられている非病原性酵
母ハンセヌラ・シフェリイ（Hansenula ciferrii）がテ
トラアセチルスフインゴシン（ＴＡＰＳ）を少量生成す
ることができると記載されている（L.J. ウィッカーハ
ム（Wickerham ）及びF.H. ストドラ（F.H. Stodola）
によるＪ．Bacteriol 、80巻（1960年）、484 乃至491
頁；H.G.マイスター（Maister ）らによるAppl. Microb
iol. 10 巻（1962年）、401 乃至406 頁；M.L.グリーン
（Greene）らによるBiochim. Biochem. Biophys.、143
巻（1965年）、553乃至565 頁；R. クルマックス（ Kul
macs）及びG.シュロップファー（ Schroepfer ）による
Biochem. & Biophys Res. Comm. 82巻１号（1978年）、
371 乃至377頁；Y. バーレンホルツ（Barenholtz）らに
よる、Biochim & Biophys Acta、248 巻（1971年）、45
8 乃至465 頁；Y. バーレンホルツ（ Barenholtz ）ら
によるBiochim & Biophys Acta、306 巻（1973年）、34
1 乃至345 頁参照）。
【０００７】Ｆ-60-10接合型株を用いてマイスター（Ma
ister ）は、25℃で炭素源としてグルコースを用いてパ
イロットスケール流加様式発酵で300 mg／ｌまで製造で
きた。生成されたテトラアセチルスフインゴシンは、ヒ
トの皮膚において生じるフィトスフィンゴシンと同じ立
体化学を有するＤ- Ｄ- エリトロ異性体である。テトラ
アセチルフィトスフィンゴシンは、容易に脱アセチル化
され、フィトスフィンゴシンになる。しかし、テトラア
セチルフィトスフィンゴシンの収率は余りに低く、工業
的生成には実際的な価値を有しない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、(1) ピキ
ア・シフェリイ（Pichia ciferii）のＦ-60-10接合型株
を突然変異誘発させる工程、(2) ピキア・シフェリイの
高テトラアセチルフィトスフィンゴシン（ＴＡＰＳ）生
成突然変異株を選抜する工程、(3) 選抜された突然変異
株を26℃より高い温度で非発酵性炭素源で流加様式（fe
d-batch mode）で増殖させる工程及び(4) 生成されたテ
トラアセチルフィトスフィンゴシン又はその加水分解生
成物を培地から回収する工程を含む、ピキア・シフェリ
イのＦ-60-10接合型株を増殖させることによりテトラア
セチルフィトスフィンゴシンの工業的生成量を生成する
方法を見出だした。
【０００９】工程(1) では、古典的な突然変異誘発例え
ば、紫外線照射又は、エチルメタンスルホン酸（ＥＭ
Ｓ）、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、N-メチル-N'-ニト
ロ-N-ニトロソグアニジン、ブロモウラシル及びその他
のヌクレオチド塩基類似物及びアクリジンのような突然
変異誘発化学物質を用いる細胞の処理が用いられ得る。
そのような技術は、シャーマル（Shermal ）らによるメ
ソッズ・イン・イースト・ジェネティックス（MEthods
in Yeast Genetics ）、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）
（1979年）及び、当業者に公知のその他のテキストで論
述されている。
【００１０】そのように処理された細胞を従来の方法
で、好ましくは非発酵性培地で培養し、生存するコロニ
ーをテトラアセチルフィトスフィンゴシンを生成する能
力について試験する。ざらざらした凸状の表面外見を有
する比較的小さなコロニーを、なめらかな表面外観を有
する他のコロニーと比較したとき、テトラアセチルフィ
トスフィンゴシンの高度の生成体である最高の可能性を
有している。顕微鏡でテトラアセチルフィトスフィンゴ
シンの薄い針状結晶がしばしばそのコロニーに見られ、
それは、テトラアセチルフィトスフィンゴシンを高度に
生成する株の他の表示である。
【００１１】有望な株を非発酵炭素源を有する培地ょ用
いて振盪フラスコ培養におけるそのテトラアセチルフィ
トスフィンゴシン生成能力についてさらに試験する。下
記の選抜工程において、0.5 ｇ／ｌ以上の、好ましくは
0.8 ｇ／ｌ以上の、より好ましくは1.0 ｇ／ｌ以上のテ
トラアセチルフィトスフィンゴシンを生成する株のみを
次の使用のために選抜した。
【００１２】このように、本発明は又、回分培養条件下
で増殖した場合、より特定すると選抜工程に用いられる
回分培養条件下で増殖した場合に培養ブイヨンにおいて
0.8ｇ／ｌ以上、より好ましくは1.0 ｇ／ｌ以上のテト
ラアセチルフィトスフィンゴシンを生成することができ
るＦ-60-10接合型ピキア・シフェリイの株を提供する。
そのような株は公知のＦ-60-10接合型ピキア・シフェリ
イ株の突然変異により本発明に従って得られる。
【００１３】選抜された株は、流加様式で非発酵炭素源
で増殖することにより工業的スケールでテトラアセチル
スフィンゴシンを生成するのに用いることができる。
【００１４】適する炭素源は例えばグリセロール、グル
コン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、キシリトール及びエタ
ノールである。グリセロールが特に適しており、経済的
な炭素源である。炭素源を、好ましくは10ｇ／ｌ以上の
濃度で発酵の最初に培養ブイヨン中にすでに存在させ、
さらに、増殖を維持するように間欠的に又は連続的に発
酵中に添加する。好ましくは、培養ブイヨンにおける炭
素源濃度でなく酸素の利用可能性がバイオマス生成の速
度を制限するような速度で炭素源を添加する。
【００１５】文献ではピキア・シフェリイは25℃付近で
一貫して培養されている。しかし、本発明の方法におい
て、培養は26℃より高い、好ましくは28乃至33℃の、よ
り好ましくは30℃付近の温度で行う。
【００１６】グリーン（上記）は、セリン及びパルミチ
ン酸塩の両方が１：１のモル比においてピキア・シフェ
リイによるテトラアセチルフィトスフィンゴシンの合成
に関与うることを示した。本発明の方法において、セリ
ンの添加は、テトラアセチルフィトスフィンゴシンの生
成において良好な影響を有し、従ってセリンを培養ブイ
ヨンに20ｇ／ｌ以下の、好ましくは10ｇ／ｌ以下の、よ
り好ましくは６ｇ／ｌ以下の濃度で添加するのが有利で
ある。
【００１７】しかし、パルミチン酸塩の添加はテトラア
セチルフィトスフィンゴシン生成をそれほど増加させ
ず、いずれにしても培養ブイヨンの10ｇ／ｌ未満にそし
て又、セリン濃度に対して等モル未満に保つのが好まし
いことが見出だされた。セリン及びあるいはパルミチン
酸塩も流加様式においても好ましくは添加される。
【００１８】本方法では、種々のアセチル化度のそして
種々の鎖長、すなわちＲがＣ12乃至Ｃ14のフィトスフィ
ンゴシンの混合物が生成する。しかし、ＲがＣ14である
テトラアセチルフィトスフィンゴシンが優勢の生成物で
ある。
【００１９】テトラアセチルフィトスフィンゴシン（本
発明の目的では総フィトスフィンゴシン混合物からなる
ことを意味する）を本技術分野において公知の方法、特
に有機溶媒を用いる抽出により培養ブイヨンから単離で
きる。これを培養ブイヨンからバイオマスの分離前に行
ってもよいが、好ましい方法ては、遠心分離又は濾過に
よるような従来の方法で培養ブイヨンからバイオマスを
最初に分離する。その後に、メタノール、エタノール、
イソプロパノール、酢酸エチル、ヘキサン等のような適
する有機溶媒を用いてバイオマスからテトラアセチルフ
ィトスフィンゴシンを抽出することができる。好ましい
方法では、抽出に用いられる前に、少量の、例えば１ｗ
／ｗ％の酢酸を溶媒に添加する。湿潤状態でバイオマス
を抽出するか又は、例えば凍結乾燥で最初に乾燥させて
もよい。培養ブイヨンからのバイオマスの分離後に得ら
れた上清の抽出により付加量のテトラアセチルフィトス
フィンゴシンを得ることができる。
【００２０】その代わりとして、培養ブイヨンにおいて
最初にテトラアセチルフィトスフィンゴシンをアルカリ
加水分解し、フィトスフィンゴシンを生成し、その後に
フィトスフィンゴシンを抽出し、所望な場合にテトラア
セチルフィトスフィンゴシンに再変換する。
【００２１】テトラアセチルフィトスフィンゴシン（又
はフィトスフィンゴシン）をさらに再結晶（例えば、メ
タノール又はイソプロパノールから）により又はシリカ
ゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製すること
ができる。
【００２２】テトラアセチルフィトスフィンゴシンを所
望のＤ- Ｄ- エリトロ配置を有するフィトスフィンゴシ
ンに加水分解し得る。このように得られるフィトスフィ
ンゴシン（又はフィトスフィンゴシン混合物）を本技術
分野で公知の方法でセラミドに変換される。
【００２３】突然変異株の選抜方法 １つの輪の有望なコロニーを下記の組成（濃度はｇ／
ｌ）の25mlの培地を含有する50ml容の邪魔板付きの振盪
フラスコ内で培養する。 2.0 ＫＨ２ＰＯ４ 1.5 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ 5.0 （ＮＨ４）２ＰＯ４ 0.5 ＫＣｌ 5.0 酵母抽出物［ディフコ（Defco ）］ 30.0 グリセロール 5.0 Ｌ- セリン
【００２４】そのフラスコをガレンカンプ（Gallenkam
p）振盪インキュベーターで培養し、150 乃至200 回毎
分でそして30℃において７日間インキユベーションす
る。その後に、その含有物を乾燥物質及びテトラアセチ
ルフィトスフィンゴシン濃度について分析した。
【００２５】重さを計った管中の３mlのブイヨンの試料
をスピンダウン（spin down ）することによって乾燥物
質を測定する。上清をデカンテーションした後に、残存
するバイオマスを110 ℃で一晩乾燥させる。密閉管を冷
却後、管の重さを計ることによりバイオマスを測定す
る。
【００２６】テトラアセチルフィトスフィンゴシンを気
液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）により決定する。内標
準として既知量のステアリン酸メチルを添加する既知量
のブイヨンを酢酸エチルとメタノールの４：１の混合物
を用いて抽出する。
【００２７】
【実施例】実施例１ ピキア・シフェリイ接合型Ｆ-60-10（ＮＲＲＬ Ｙ103
1）株は、下記の方法によりエチルメタンスルホン酸塩
（ＥＭＳ）を用いた突然変異体であった。
【００２８】その株をミクロフィル（microphil ）ブイ
ヨン［10ｇ／ｌの豆粉（soymeal ）ペプトン、10ｇ／ｌ
のグルコース、１ｌの蒸留水、ｐＨ5.0 ］で培養した。
オービタルシェーカー（orbital shaker）で30℃におい
て２乃至３日間のインキュベーションの後に、細胞が後
期の対数増殖期であるときに10mlのブイヨンを回収しそ
して無菌的に遠心分離した。上清の除去の後に得られた
細胞塊を0.1 Ｍ、ｐＨ7.0 のリン酸塩緩衝液の滅菌溶液
10mlと無菌的に混合した。得られた混合物を振盪し、ス
ピンダウンし、バイオマスを含有する球粒を回収した。
球粒に１mlのリン酸塩緩衝液（上記のような）を、５、
40又は100 μｌの突然変異誘発物質エチルメタンスルホ
ン酸（ＥＭＳ）とともに添加した。
【００２９】溶液を完全に混合し、30℃でさらに１時間
インキュベーションした。この時間の後に、突然変異誘
発物質を不活性化するためにＮａ２Ｓ２Ｏ３の５ｗ／ｖ
％溶液９mlを添加した。10分後、試料を再びスピンダウ
ンし、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３の５ｗ／ｖ％溶液９ml中に再溶解
した。再び、細胞を回転（spinning）及びリン酸塩緩衝
液中に２回再溶解／洗浄を行い、希釈物を生成し、下記
のグリセロール培地（濃度はｇ／ｌ）で培養した。 1.0 ＫＨ２ＰＯ４ 0.7 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ 2.5 （ＮＨ４）２ＰＯ４ 0.2 ＫＣｌ 0.5 酵母抽出物「ディフコ（Difco ）］ 20.0 グリセロール 5.0 セリン 15.0 寒天
【００３０】30℃で３日間インキュベーションした後
に、生存するコロニーを数え、死滅した％を計測した。
希釈物を調製し、プレート当り50のコロニーのコロニー
数にした。
【００３１】実施例２ 下記の方法により選抜された株を増殖することによりテ
トラアセチルフィトスフィンゴシンを生成した。
【００３２】選抜操作でも用いた100ml の培地を含有す
る250ml 容の邪魔板付き振盪フラスコに１％の選抜され
た株を入れることにより供給回分培養用の種培養物（se
ed culture）を増殖させた。記載した条件を用いてフラ
スコをインキュベーションした。
【００３３】実際のテトラアセチルフィトスフィンゴシ
ン生成用に、2.0 乃至2.6 ｌの作業容量を有する７ｌ容
のＭＢＲラブフェルメンター（Labfermenter）を用い、
２つの電磁作動の６羽根ラッシュトン型（Rushton-typ
e）羽根車により攪拌した。ｐＨ及び溶解した酸素をイ
ンゴールド（Ingold）電極により測定した。設定流量に
空気流を制御した。10％ＮａＯＨ溶液の添加によりｐＨ
を制御した。種培養物を用いてインキュベーションする
前に、電極を有する容器をその場で120 ℃で20分間滅菌
した。ＤＯ２及び枯渇した気体のＣＯ２及びＯ２量を測
定し、この炭素生成速度（ＣＰＲ）及び酸素取り込み速
度（ＯＵＲ）を計算した。
【００３４】培地は下記の組成（濃度はｇ／ｌ）を有し
た。 4.0 ＫＨ２ＰＯ４ 2.5 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ 10.0 （ＮＨ４）２ＰＯ４ 1.0 ＫＣｌ 10.0 酵母自己分解物質 40.0 グリセロール 5.0 Ｌ−セリン
【００３５】培養条件は下記に設定した通りであった。 ＤＯ２ 分（min ）10％ 温度 30℃ ｐＨ 6.4 攪拌速度 800 乃至1300回毎分 ＯＵＲ 100 乃至170 ミリモル／ｌ・分 空気流 0.5 乃至1.0 ｖｖｍ 消泡剤 0.3 ml／ｌ回分容量シリコーン油
【００３６】10ｖ／ｖ％の種培養物を発酵槽内の培地に
添加した。酸素取り込み速度（ＯＵＲ）（典型的には20
乃至25時間の期間後）における急降下を示す枯渇気体の
分析により示されたようにバッチにおけるグリセロール
が枯渇した場合に、50ｗ／ｗ％のグリセロール及び４ｗ
／ｗ％のＬ−セリンの供給原料水溶液、300 ｇ／ｌ作業
容量を発酵槽に15時間かけて徐々に供給した。発酵槽か
ら取った試料における総バイオマスとテトラアセチルフ
ィトスフィンゴシン濃度を規則的にモニターし、上記の
選抜操作で記載したように分析した。
【００３７】典型的には、180 乃至190 ｇ／ｌのグリセ
ロールの総供給原料に対して60ｇ／ｌのバイオマス最大
量が達せられ、2.0 ｇ／ｌ以上のテトラアセチルフィト
スフィンゴシン濃度を生成した。それぞれ3.8 ｇ／ｌ及
び5.0 ｇ／ｌのテトラアセチルフィトスフィンゴシンを
生成し、ＤＳＭ9227及びＤＳＭ9228としてドイッチェ・
サムラング・フォン・マイクロオルガニスメン・ウント
・ゼルクルチュレン・ＧｍｂＨ（Deutsche Sammlung vo
n Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ）に寄託し
た２つの突然変異株を同定した。
【００３８】遠心濾過により培養ブイヨンからバイオマ
スを分離することによりテトラアセチルフィトスフィン
ゴシンを単離した。その湿潤した細胞塊を１ｗ／ｗ％の
酢酸を添加した、等重量のイソプロパノールで抽出し
た。その混合物を15分間攪拌した。その後、塩化ナトリ
ウムを添加し、イソプロパノールの１／４量で混合し、
その混合物を放置し、イソプロパノール層を除去した。
その後に、湿潤細胞塊を同じ量の酢酸エチルを用いて、
１時間攪拌することにより再び抽出し（１ｗ／ｗ％の酢
酸を添加した）、有機層を除去した。その結合有機層を
40℃、減圧下で蒸発させ、油状残渣をシリカゲルのカラ
ムクロマトグラフィーによりさらに精製した。各１ｇの
油状残渣に対して５ｇのシリカゲルを用いた。そのカラ
ムを ｉ． １カラム容量のヘキサン ｉｉ． １カラム容量の、９：１のヘキサン／酢酸エチ
ル ｉｉｉ．１カラム容量の、５：１のヘキサン／酢酸エチ
ル ｉｖ． １カラム容量の、３：２のヘキサン／酢酸エチ
ル ｖ． １カラム容量の酢酸エチル ｖｉ． １カラム容量のイソプロパノール ｖｉｉ．１カラム容量のイソプロパノール で溶出する。
【００３９】減圧下、画分ｖ．及びｖｉ．で95％濃度精
製テトラアセチルフィトスフィンゴシンを生成した。こ
れを１ｗ／ｗ％の酢酸を添加したイソプロパノール又は
ブタノールからの再結晶によりさらに精製した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 ジョン・ケイシー 英国、エヌエヌ９・２ピーエル、ノーザン プトン、ウェリングボロ、スタンウィッ ク、マノア・ガーデンズ ２ (72)発明者 キャサリン・エイ・モーム 英国、ジーユー15・２ディーエイ、サリ ー、キャンバリ、クローリ・ヒル 17 (72)発明者 アールフォンス・ロゥダバイク・ジェイ・ ピータース オランダ国、1402・ブイケイ・バーサム、 ジェイ・エイチ・バーント・ホーフウェグ 24 (72)発明者 ルドルフ・マーセル・ベルー オランダ国、1412・イーシー・ナーデン、 バーン・ティエンホゥファンストラート 24

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (1) ピキア・シフェリイ（Pichia cifer
    ii）のＦ-60-10接合型株を突然変異誘発させる工程、
    (2) ピキア・シフェリイの高テトラアセチルフィトスフ
    ィンゴシン（ＴＡＰＳ）生成突然変異株を選抜する工
    程、(3) 選抜された突然変異株を26℃より高い温度で非
    発酵性炭素源で流加様式において増殖させる工程及び
    (4) 生成されたテトラアセチルフィトスフィンゴシン又
    はその加水分解生成物を培地から回収する工程を含むピ
    キア・シフェリイのＦ-60-10接合型株を増殖させること
    によりテトラアセチルフィトスフィンゴシンを生成する
    方法。
  2. 【請求項２】 前記接合型株をエチルメタンスルホン酸
    にさらすことにより突然変異を行う、請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 選抜工程において、0.5 ｇ／ｌ以上のテ
    トラアセチルフィトスフィンゴシンを生成する突然変異
    株を選ぶ、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 選抜工程における前記突然変異株が、0.
    8 ｇ／ｌ以上のテトラアセチルフィトスフィンゴシンを
    生成する、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 選抜工程における突然変異株が１ｇ／ｌ
    以上のテトラアセチルフィトスフィンゴシンを生成す
    る、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 選抜された株を非発酵炭素源としてグリ
    セロールにおいて増殖させる、請求項１乃至５のいずれ
    か１請求項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 選抜された株を28乃至33℃の温度で増殖
    させる、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 Ｌ−セリンを培地に添加する、請求項１
    乃至７のいずれか１請求項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 酸素の利用可能性がバイオマス生成の速
    度を決定するような速度でグリセロールを培地に供給す
    る、請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１乃至９のいずれか１請求項に
    記載の方法により生成されるテトラアセチルフィトスフ
    ィンゴシンを加水分解する、フィトスフィンゴシンを生
    成する方法。
  11. 【請求項１１】 加水分解がアルカリを用いて行われ
    る、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 培地からのテトラアセチルフィトスフ
    ィンゴシンの分離の前に、加水分解を培養ブイヨンにお
    いて行う、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 流加培養条件下で増殖した場合に、培
    養ブイヨンにおいて0.8 ｇ／ｌ以上のテトラアセチルフ
    ィトスフィンゴシンを生成することができるＦ-60-10接
    合型ピキア・シフェリイ株。
  14. 【請求項１４】 公知のピキア・シフェリイのＦ-60-10
    接合型株を突然変異させることにより得られる、請求項
    １３に記載のピキア・シフェリイ株。
  15. 【請求項１５】 1.0 ｇ／ｌ以上のテトラアセチルフィ
    トスフィンゴシンを生成することができる、請求項１３
    又は請求項１４に記載のピキア・シフェリイ株。
  16. 【請求項１６】 ＤＳＭ 9227 又はＤＳＭ 9228 であ
    る、請求項１３又は請求項１４に記載のピキア・シフェ
    リイ。
JP7182120A 1994-06-24 1995-06-26 フィトスフィンゴシン誘導体の製造法 Pending JPH08168392A (ja)

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