JPH08113595A - リポ蛋白の精製方法 - Google Patents
リポ蛋白の精製方法Info
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- JPH08113595A JPH08113595A JP24941494A JP24941494A JPH08113595A JP H08113595 A JPH08113595 A JP H08113595A JP 24941494 A JP24941494 A JP 24941494A JP 24941494 A JP24941494 A JP 24941494A JP H08113595 A JPH08113595 A JP H08113595A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 血清などのリポ蛋白を含有する溶液と乾式ま
たは湿式シリカ粒子を混和することにより接触させてリ
ポ蛋白をシリカ粒子に吸着させる。次いで、遠心分離な
どによりリポ蛋白吸着粒子を取り出し、該吸着粒子とト
リクロロ酢酸ナトリウム水溶液などのカオトロピック塩
水溶液を接触させて、リポ蛋白を脱着させるリポ蛋白の
精製方法。 【効果】 本発明の方法により、超遠心機のような高価
な設備を必要とせずに、簡便な吸着及び脱着操作を実施
するだけで、短時間のうちに効率よくリポ蛋白を精製す
ることができる。この方法は、臨床検査におけるリポ蛋
白の標準物質の工業的生産などに有用である。
たは湿式シリカ粒子を混和することにより接触させてリ
ポ蛋白をシリカ粒子に吸着させる。次いで、遠心分離な
どによりリポ蛋白吸着粒子を取り出し、該吸着粒子とト
リクロロ酢酸ナトリウム水溶液などのカオトロピック塩
水溶液を接触させて、リポ蛋白を脱着させるリポ蛋白の
精製方法。 【効果】 本発明の方法により、超遠心機のような高価
な設備を必要とせずに、簡便な吸着及び脱着操作を実施
するだけで、短時間のうちに効率よくリポ蛋白を精製す
ることができる。この方法は、臨床検査におけるリポ蛋
白の標準物質の工業的生産などに有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血漿、血清等のリポ蛋
白を含む溶液中からリポ蛋白を精製する方法に関する。
白を含む溶液中からリポ蛋白を精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】リポ蛋白の精製法としては、超遠心法や
分別沈澱法さらにはゲル電気泳動法が知られている。し
かし、超遠心法による精製は高価な設備を必要とする上
に、精製に長時間を要するという欠点があった。また、
超遠心法に比べて簡便な方法としては、カルシウムイオ
ンなどの２価の陽イオン存在下で、塩化ナトリウム濃度
を変化させることにより、カイロミクロンや低比重リポ
蛋白などのリポ蛋白を分別的に沈澱させる方法が知られ
ている。しかし、本法は操作が煩雑であり、また、塩化
ナトリウム濃度をいかなる濃度にしても、高比重リポ蛋
白などのリポ蛋白を沈殿させることができないという欠
点があった。ゲル電気泳動法では、各種のリポ蛋白を精
密に分画することができるが、処理量が非常に少ないこ
とや、ゲルからの溶出が煩雑な上に回収率が低いという
問題点があった。
分別沈澱法さらにはゲル電気泳動法が知られている。し
かし、超遠心法による精製は高価な設備を必要とする上
に、精製に長時間を要するという欠点があった。また、
超遠心法に比べて簡便な方法としては、カルシウムイオ
ンなどの２価の陽イオン存在下で、塩化ナトリウム濃度
を変化させることにより、カイロミクロンや低比重リポ
蛋白などのリポ蛋白を分別的に沈澱させる方法が知られ
ている。しかし、本法は操作が煩雑であり、また、塩化
ナトリウム濃度をいかなる濃度にしても、高比重リポ蛋
白などのリポ蛋白を沈殿させることができないという欠
点があった。ゲル電気泳動法では、各種のリポ蛋白を精
密に分画することができるが、処理量が非常に少ないこ
とや、ゲルからの溶出が煩雑な上に回収率が低いという
問題点があった。
【０００３】一方、血清よりリポ蛋白を除去する目的
で、非イオン性界面活性剤存在下で、Ａｅｒｏｓｉｌ
３８０ を血清に２％（Ｗ／Ｖ）添加し、室温で４時間
緩やかに撹拌してリポ蛋白を吸着させる方法が知られて
いる（ティッセンら，バイラルイムノダイアグノーシ
ス，ｐ１２５，アカデミックプレス，１９７４）。しか
し、この方法は、非イオン界面活性剤存在下でリポ蛋白
の吸着を行わせるため、リポ蛋白が変性しやすく好まし
くない。さらに、この方法では、リポ蛋白の脱着につい
ては言及されておらず、リポ蛋白の精製法として使用す
ることはできなかった。
で、非イオン性界面活性剤存在下で、Ａｅｒｏｓｉｌ
３８０ を血清に２％（Ｗ／Ｖ）添加し、室温で４時間
緩やかに撹拌してリポ蛋白を吸着させる方法が知られて
いる（ティッセンら，バイラルイムノダイアグノーシ
ス，ｐ１２５，アカデミックプレス，１９７４）。しか
し、この方法は、非イオン界面活性剤存在下でリポ蛋白
の吸着を行わせるため、リポ蛋白が変性しやすく好まし
くない。さらに、この方法では、リポ蛋白の脱着につい
ては言及されておらず、リポ蛋白の精製法として使用す
ることはできなかった。
【０００４】リポ蛋白を吸着体から脱離させる方法とし
ては、高濃度の塩溶液やメタノールなどのアルコールあ
るいは塩酸グアニジンなどの蛋白質の変性剤が一般的に
用いられている。しかし、これらではシリカ粒子に吸着
したリポ蛋白を効率的に脱着できなかった。
ては、高濃度の塩溶液やメタノールなどのアルコールあ
るいは塩酸グアニジンなどの蛋白質の変性剤が一般的に
用いられている。しかし、これらではシリカ粒子に吸着
したリポ蛋白を効率的に脱着できなかった。
【０００５】結局、リポ蛋白を簡便な吸着、脱着操作で
効率よく精製する技術は未だ確立されていない。
効率よく精製する技術は未だ確立されていない。
【０００６】ところで、カオトロピックイオンとは、チ
オシアン酸イオンや過塩素酸イオンなどの様に１価の陰
イオンで、イオン半径が大きいものをいい、これらの陰
イオンは水中で疎水結合を弱め、疎水性分子の水溶性を
増加させるものである。この性質から、細胞膜と結合し
た蛋白の可溶化や、抗原抗体複合体の解離にカオトロピ
ックイオンを使用する方法が知られているが、リポ蛋白
への作用については何ら知られていない。
オシアン酸イオンや過塩素酸イオンなどの様に１価の陰
イオンで、イオン半径が大きいものをいい、これらの陰
イオンは水中で疎水結合を弱め、疎水性分子の水溶性を
増加させるものである。この性質から、細胞膜と結合し
た蛋白の可溶化や、抗原抗体複合体の解離にカオトロピ
ックイオンを使用する方法が知られているが、リポ蛋白
への作用については何ら知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、リポ蛋白を
含有する溶液からリポ蛋白を、超遠心機のような高価な
設備を必要とせず、短時間で簡便に、かつ効率よく精製
しようとするものである。
含有する溶液からリポ蛋白を、超遠心機のような高価な
設備を必要とせず、短時間で簡便に、かつ効率よく精製
しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題が、リポ蛋白の
シリカ粒子への吸着操作とカオトロピック塩水溶液によ
る脱着操作とを組み合わせることにより解決されること
を見出して本発明を完成し、ここに提案するに至った。
シリカ粒子への吸着操作とカオトロピック塩水溶液によ
る脱着操作とを組み合わせることにより解決されること
を見出して本発明を完成し、ここに提案するに至った。
【０００９】即ち、本発明は、リポ蛋白を含有する溶液
にシリカ粒子を接触させてリポ蛋白をシリカ粒子に吸着
させ、ついで該吸着粒子とカオトロピック塩水溶液を接
触させてリポ蛋白を脱着させることを特徴とするリポ蛋
白の精製方法である。
にシリカ粒子を接触させてリポ蛋白をシリカ粒子に吸着
させ、ついで該吸着粒子とカオトロピック塩水溶液を接
触させてリポ蛋白を脱着させることを特徴とするリポ蛋
白の精製方法である。
【００１０】リポ蛋白は脂質と蛋白の複合体である。ト
リグリセリドとコレステロールエステルの中性脂肪を中
心部に、表層をリン脂質と遊離コレステロールの極性部
をもつ脂質が一層の単分子層で覆い、さらに蛋白が表層
脂質と結合する粒子状構造をしている。その大きさはリ
ポ蛋白の種類により異なるが、７ｎｍ〜１０００ｎｍま
で広範に亘っている。
リグリセリドとコレステロールエステルの中性脂肪を中
心部に、表層をリン脂質と遊離コレステロールの極性部
をもつ脂質が一層の単分子層で覆い、さらに蛋白が表層
脂質と結合する粒子状構造をしている。その大きさはリ
ポ蛋白の種類により異なるが、７ｎｍ〜１０００ｎｍま
で広範に亘っている。
【００１１】リポ蛋白は、構成する脂質と蛋白の組成の
違いにより比重が異なり、大きくは以下の４つの比重範
囲に分類されている。それらは、比重０.９５以下のカ
イロミクロン（乳糜粒子）、比重０.９５〜１.００６の
超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、比重１.００６〜１.０
６３の低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、比重１.０６３〜１.
２１の高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）である。
違いにより比重が異なり、大きくは以下の４つの比重範
囲に分類されている。それらは、比重０.９５以下のカ
イロミクロン（乳糜粒子）、比重０.９５〜１.００６の
超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、比重１.００６〜１.０
６３の低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、比重１.０６３〜１.
２１の高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）である。
【００１２】リポ蛋白は、体内での脂質の貯蔵や運搬、
さらに細胞の構造維持に必須な生体成分であるが、血中
濃度が一定水準以上の場合、心筋梗塞や脳梗塞などの動
脈硬化症の発症と関係が深いことが知られている。した
がって、臨床検査において重要な検査項目として位置づ
けられている。
さらに細胞の構造維持に必須な生体成分であるが、血中
濃度が一定水準以上の場合、心筋梗塞や脳梗塞などの動
脈硬化症の発症と関係が深いことが知られている。した
がって、臨床検査において重要な検査項目として位置づ
けられている。
【００１３】また、上記の分類に加えて、リポ蛋白
（ａ）〔以下Ｌｐ（ａ）と略記〕やレムナントリポ蛋白
と呼ばれる特殊なリポ蛋白の存在も知られている。例え
ばＬｐ（ａ）は、３００万〜５００万の分子量をもつ平
均粒径２６ｎｍのＬＤＬに類似したリポ蛋白であり、動
脈硬化の危険因子として近年注目されている。本発明の
精製方法は、特にこのＬｐ（ａ）の精製に好適に使用で
きる。
（ａ）〔以下Ｌｐ（ａ）と略記〕やレムナントリポ蛋白
と呼ばれる特殊なリポ蛋白の存在も知られている。例え
ばＬｐ（ａ）は、３００万〜５００万の分子量をもつ平
均粒径２６ｎｍのＬＤＬに類似したリポ蛋白であり、動
脈硬化の危険因子として近年注目されている。本発明の
精製方法は、特にこのＬｐ（ａ）の精製に好適に使用で
きる。
【００１４】本発明で使用するリポ蛋白を含有する溶液
としては、血清や血漿の他に、リポ蛋白を含む水溶液な
どがある。
としては、血清や血漿の他に、リポ蛋白を含む水溶液な
どがある。
【００１５】本発明に用いられるシリカ粒子としては、
精製された四塩化ケイ素を酸素と水素で燃焼して作られ
る気相法の乾式シリカ粒子及びケイ酸ナトリウムと硫酸
のような鉱酸から作られる湿式シリカ粒子のいずれのシ
リカ粒子も好適に使用することができる。
精製された四塩化ケイ素を酸素と水素で燃焼して作られ
る気相法の乾式シリカ粒子及びケイ酸ナトリウムと硫酸
のような鉱酸から作られる湿式シリカ粒子のいずれのシ
リカ粒子も好適に使用することができる。
【００１６】乾式シリカ粒子の例示としては、粒径５〜
５０ｎｍのレオロシールＱＳ−１０、レオロシールＱＳ
−２０、レオロシールＱＳ−４０〔いずれも（株）トク
ヤマ社製〕などがあり、湿式シリカ粒子の例示として
は、粒径１０〜２０μｍのトクシールＧＵ−Ｎ、トクシ
ールＵＲ〔いずれも（株）トクヤマ社製〕などが挙げら
れる。
５０ｎｍのレオロシールＱＳ−１０、レオロシールＱＳ
−２０、レオロシールＱＳ−４０〔いずれも（株）トク
ヤマ社製〕などがあり、湿式シリカ粒子の例示として
は、粒径１０〜２０μｍのトクシールＧＵ−Ｎ、トクシ
ールＵＲ〔いずれも（株）トクヤマ社製〕などが挙げら
れる。
【００１７】リポ蛋白を含有する溶液にシリカ粒子を接
触させてリポ蛋白をシリカ粒子に吸着させる方法は特に
限定されない。例えば、一定量のシリカ粒子を秤量し
て、血清や血漿などのリポ蛋白を含有する溶液に直接添
加混合してもよいし、シリカ粒子の一定量を懸濁した水
溶液を添加混合してもよい。
触させてリポ蛋白をシリカ粒子に吸着させる方法は特に
限定されない。例えば、一定量のシリカ粒子を秤量し
て、血清や血漿などのリポ蛋白を含有する溶液に直接添
加混合してもよいし、シリカ粒子の一定量を懸濁した水
溶液を添加混合してもよい。
【００１８】尚、その際に公知の方法にあるように非イ
オン性界面活性剤を共存させることは特に必要ではな
い。
オン性界面活性剤を共存させることは特に必要ではな
い。
【００１９】シリカ粒子の添加量は特に限定されない
が、リポ蛋白の吸着効率や操作性を考慮すると、血清や
血漿に対して１〜３％（Ｗ／Ｖ）添加することが好まし
い。添加したシリカ粒子にリポ蛋白を効率よく吸着させ
る方法は、５分以上、好ましくは１時間程度ゆるやかに
振盪するだけでよい。その際の温度は、リポ蛋白が変性
しない範囲であれば特に限定されないが、２０〜４０℃
が好適である。
が、リポ蛋白の吸着効率や操作性を考慮すると、血清や
血漿に対して１〜３％（Ｗ／Ｖ）添加することが好まし
い。添加したシリカ粒子にリポ蛋白を効率よく吸着させ
る方法は、５分以上、好ましくは１時間程度ゆるやかに
振盪するだけでよい。その際の温度は、リポ蛋白が変性
しない範囲であれば特に限定されないが、２０〜４０℃
が好適である。
【００２０】以上のようにしてリポ蛋白を吸着させたシ
リカ粒子を取り出すには、遠心分離、デカンテーション
あるいは濾過などの一般的分離操作が用いられるが、操
作性や処理時間を考慮すると、遠心分離が好適に用いら
れる。その際の、遠心分離の条件はリポ蛋白吸着粒子が
沈降する条件であれば何ら限定されなく、例えば、遠心
加速度８０００×ｇ〜１２０００×ｇ、５〜１５分間の
条件が好適である。
リカ粒子を取り出すには、遠心分離、デカンテーション
あるいは濾過などの一般的分離操作が用いられるが、操
作性や処理時間を考慮すると、遠心分離が好適に用いら
れる。その際の、遠心分離の条件はリポ蛋白吸着粒子が
沈降する条件であれば何ら限定されなく、例えば、遠心
加速度８０００×ｇ〜１２０００×ｇ、５〜１５分間の
条件が好適である。
【００２１】リポ蛋白吸着粒子とカオトロピック塩水溶
液を接触させてリポ蛋白を脱着させる方法としては、リ
ポ蛋白吸着粒子を充填したカラムにカオトロピック塩水
溶液を通過させる方法や、リポ蛋白吸着粒子を入れた容
器にカオトロピック塩水溶液を加えて静置するかまたは
緩やかに振盪した後に、遠心分離する方法などがあり、
特に限定されないが、操作性や吸着効率の点で緩やかに
振盪する方法が好適に用いられる。その際の条件として
は、リポ蛋白が変性しない範囲であれば特に限定されな
いが、好ましくは２０〜４０℃の温度で５分以上好まし
くは０．５〜２時間とすればよい。
液を接触させてリポ蛋白を脱着させる方法としては、リ
ポ蛋白吸着粒子を充填したカラムにカオトロピック塩水
溶液を通過させる方法や、リポ蛋白吸着粒子を入れた容
器にカオトロピック塩水溶液を加えて静置するかまたは
緩やかに振盪した後に、遠心分離する方法などがあり、
特に限定されないが、操作性や吸着効率の点で緩やかに
振盪する方法が好適に用いられる。その際の条件として
は、リポ蛋白が変性しない範囲であれば特に限定されな
いが、好ましくは２０〜４０℃の温度で５分以上好まし
くは０．５〜２時間とすればよい。
【００２２】本発明において用いるカオトロピック塩を
例示すると次の通りである。トリクロロ酢酸ナトリウム
などのトリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸ナトリウム
などのトリフルオロ酢酸塩、過塩素酸ナトリウムなどの
過塩素酸塩、チオシアン酸ナトリウムなどのチオシアン
酸塩、酢酸ナトリウムなどの酢酸塩、また、塩化マグネ
シウムのようなアルカリ土類金属の塩化物、ヨウ化ナト
リウムのようなアルカリ金属のヨウ化物、臭化ナトリウ
ムのようなアルカリ金属の臭化物などである。
例示すると次の通りである。トリクロロ酢酸ナトリウム
などのトリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸ナトリウム
などのトリフルオロ酢酸塩、過塩素酸ナトリウムなどの
過塩素酸塩、チオシアン酸ナトリウムなどのチオシアン
酸塩、酢酸ナトリウムなどの酢酸塩、また、塩化マグネ
シウムのようなアルカリ土類金属の塩化物、ヨウ化ナト
リウムのようなアルカリ金属のヨウ化物、臭化ナトリウ
ムのようなアルカリ金属の臭化物などである。
【００２３】特にＬｐ（ａ）を脱着する場合には、トリ
クロロ酢酸ナトリウム、塩化マグネシウム、チオシアン
酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウムなどが脱着効率の観
点から特に好適に使用できる。
クロロ酢酸ナトリウム、塩化マグネシウム、チオシアン
酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウムなどが脱着効率の観
点から特に好適に使用できる。
【００２４】リポ蛋白吸着粒子に接触させるカオトロピ
ック塩水溶液のｐＨはリポ蛋白が変性しない範囲であれ
ばよく、通常ｐＨ６〜８に調整される。また、その濃度
は脱着効率の観点から溶解度の範囲内で高濃度であるこ
とが望ましく、０．５〜５Ｍの濃度範囲で好適に使用さ
れる。その際のカオトロピック塩水溶液の使用量は、特
に限定されるものではないが、リポ蛋白吸着後に分離除
去した際の血清などの液量と等量程度にすることが好ま
しい。
ック塩水溶液のｐＨはリポ蛋白が変性しない範囲であれ
ばよく、通常ｐＨ６〜８に調整される。また、その濃度
は脱着効率の観点から溶解度の範囲内で高濃度であるこ
とが望ましく、０．５〜５Ｍの濃度範囲で好適に使用さ
れる。その際のカオトロピック塩水溶液の使用量は、特
に限定されるものではないが、リポ蛋白吸着後に分離除
去した際の血清などの液量と等量程度にすることが好ま
しい。
【００２５】脱着したリポ蛋白溶液からシリカ粒子を分
離除去する方法としては、遠心分離、デカンテーショ
ン、濾過などの一般的分離操作が用いられるが、操作性
や処理時間を考慮して、遠心分離が好適に用いられる。
その際の遠心分離の条件は、シリカ粒子が充分に沈降す
る条件であれば何ら限定されなく、例えば、遠心加速度
８０００×ｇ〜１２０００×ｇ、５〜１５分間の条件が
好適である。
離除去する方法としては、遠心分離、デカンテーショ
ン、濾過などの一般的分離操作が用いられるが、操作性
や処理時間を考慮して、遠心分離が好適に用いられる。
その際の遠心分離の条件は、シリカ粒子が充分に沈降す
る条件であれば何ら限定されなく、例えば、遠心加速度
８０００×ｇ〜１２０００×ｇ、５〜１５分間の条件が
好適である。
【００２６】脱着したリポ蛋白溶液はそのまま保存する
こともできるが、必要に応じて生理食塩水などに対して
透析や、ゲル濾過などの一般的な脱塩処理を行った後に
保存してもよい。
こともできるが、必要に応じて生理食塩水などに対して
透析や、ゲル濾過などの一般的な脱塩処理を行った後に
保存してもよい。
【００２７】
【発明の効果】本発明の方法により、超遠心機のような
高価な設備を必要とせずに、リポ蛋白含有溶液にシリカ
粒子を添加して得たリポ蛋白吸着粒子に、カオトロピッ
ク塩水溶液を接触させるだけで、短時間のうちに効率よ
くリポ蛋白を精製することができる。この方法は、臨床
検査におけるリポ蛋白の標準物質の工業的生産などに有
用である。
高価な設備を必要とせずに、リポ蛋白含有溶液にシリカ
粒子を添加して得たリポ蛋白吸着粒子に、カオトロピッ
ク塩水溶液を接触させるだけで、短時間のうちに効率よ
くリポ蛋白を精製することができる。この方法は、臨床
検査におけるリポ蛋白の標準物質の工業的生産などに有
用である。
【００２８】
【実施例】以下実施例をあげて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。
【００２９】実施例１ （１）乾式シリカ粒子によるリポ蛋白の吸着 血清 ２０ｍｌに、１％（Ｗ／Ｖ）に当たる０.２ｇの
乾式微粉体シリカ粒子〔レオロシールＱＳー２０；
（株）トクヤマ〕を添加し、５０ｍｌ容のプラスチック
チューブ内で室温（２７℃）下で１時間振盪することに
より、リポ蛋白をシリカ粒子に吸着させた。次に、１０
０００×ｇ、１０分間の遠心分離によりリポ蛋白吸着粒
子を沈降させた後、上清を採取した。採取した上清をリ
ポ蛋白分析用ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動
キット〔リポフォー；常光（株）〕によって調べた結果
を図１に示す。リポ蛋白は青い染色バンドとして検出さ
れる。
乾式微粉体シリカ粒子〔レオロシールＱＳー２０；
（株）トクヤマ〕を添加し、５０ｍｌ容のプラスチック
チューブ内で室温（２７℃）下で１時間振盪することに
より、リポ蛋白をシリカ粒子に吸着させた。次に、１０
０００×ｇ、１０分間の遠心分離によりリポ蛋白吸着粒
子を沈降させた後、上清を採取した。採取した上清をリ
ポ蛋白分析用ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動
キット〔リポフォー；常光（株）〕によって調べた結果
を図１に示す。リポ蛋白は青い染色バンドとして検出さ
れる。
【００３０】レーン１は、リポ蛋白を含有する血清を泳
動したものである。先端部にＨＤＬの鮮やかな青いバン
ドが見られ、中間部にＬＤＬの青く広がったバンドが見
られた。さらにゲル境界部にはＶＬＤＬの青いバンドが
見られた。レーン２は、レオロシールＱＳー２０処理後
の上清を泳動したものである。先端部には薄茶色のアル
ブミンの屈折線が見られた。しかし、リポ蛋白の青く染
色されたバンドはゲルのいずれの部位にも認められなか
った。
動したものである。先端部にＨＤＬの鮮やかな青いバン
ドが見られ、中間部にＬＤＬの青く広がったバンドが見
られた。さらにゲル境界部にはＶＬＤＬの青いバンドが
見られた。レーン２は、レオロシールＱＳー２０処理後
の上清を泳動したものである。先端部には薄茶色のアル
ブミンの屈折線が見られた。しかし、リポ蛋白の青く染
色されたバンドはゲルのいずれの部位にも認められなか
った。
【００３１】図１より、シリカ粒子による吸着処理を行
った後の上清には、リポ蛋白が確認されなかった。即
ち、リポ蛋白が乾式シリカ粒子にほとんど完全に吸着す
ることがわかる。
った後の上清には、リポ蛋白が確認されなかった。即
ち、リポ蛋白が乾式シリカ粒子にほとんど完全に吸着す
ることがわかる。
【００３２】（２）脱着 （１）で得られたリポ蛋白粒子に、脱着液としてｐＨ
７．５の３Ｍトリクロロ酢酸ナトリウム水溶液を、吸着
操作で除去した上清と等量（約１８ｍｌ）添加し、該吸
着粒子を分散させた後、３７℃の温度条件下で１時間振
盪（振幅１０ｃｍ，４０回／分）してリポ蛋白を乾式シ
リカ粒子より脱着した。次に、１００００×ｇ、１０分
間遠心分離後の上清を精製画分として回収した。リポ蛋
白の精製操作に要した時間はシリカ粒子への吸着操作を
含めて、約２時間であった。
７．５の３Ｍトリクロロ酢酸ナトリウム水溶液を、吸着
操作で除去した上清と等量（約１８ｍｌ）添加し、該吸
着粒子を分散させた後、３７℃の温度条件下で１時間振
盪（振幅１０ｃｍ，４０回／分）してリポ蛋白を乾式シ
リカ粒子より脱着した。次に、１００００×ｇ、１０分
間遠心分離後の上清を精製画分として回収した。リポ蛋
白の精製操作に要した時間はシリカ粒子への吸着操作を
含めて、約２時間であった。
【００３３】回収した精製画分を０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に対して透析した後に、ラテックス凝集比濁法試薬
〔イムノティクルスオートＬｐ（ａ）；（株）Ａ＆Ｔ〕
によりＬｐ（ａ）濃度を測定し、Ｌｐ（ａ）の脱着効率
を算出した。脱着効率は、血清中のＬｐ（ａ）がシリカ
粒子に完全に吸着したものとして、血清中のＬｐ（ａ）
量を１００％としたときの相対値として求めた。回収し
た精製画分の脱着効率は７０．２％であった。 実施例２ （１）湿式シリカ粒子によるリポ蛋白の吸着 シリカ粒子に湿式シリカ粒子であるトクシールＧＵ−Ｎ
を血清に対して３％（Ｗ／Ｖ）添加した以外は、実施例
１−（１）と同様の操作を行った。その結果を図１のレ
ーン３に示した。先端部に薄茶色のアルブミンの屈折線
が見られたが、しかし、リポ蛋白の青く染色されたバン
ドはゲルのいずれの部位にも認められなかった。
ウムを含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に対して透析した後に、ラテックス凝集比濁法試薬
〔イムノティクルスオートＬｐ（ａ）；（株）Ａ＆Ｔ〕
によりＬｐ（ａ）濃度を測定し、Ｌｐ（ａ）の脱着効率
を算出した。脱着効率は、血清中のＬｐ（ａ）がシリカ
粒子に完全に吸着したものとして、血清中のＬｐ（ａ）
量を１００％としたときの相対値として求めた。回収し
た精製画分の脱着効率は７０．２％であった。 実施例２ （１）湿式シリカ粒子によるリポ蛋白の吸着 シリカ粒子に湿式シリカ粒子であるトクシールＧＵ−Ｎ
を血清に対して３％（Ｗ／Ｖ）添加した以外は、実施例
１−（１）と同様の操作を行った。その結果を図１のレ
ーン３に示した。先端部に薄茶色のアルブミンの屈折線
が見られたが、しかし、リポ蛋白の青く染色されたバン
ドはゲルのいずれの部位にも認められなかった。
【００３４】この結果より、リポ蛋白が湿式シリカ粒子
にほとんど完全に吸着することがわかった。 （２）脱着 実施例１−（２）と同様の操作を行い、湿式シリカ粒子
からリポ蛋白を脱着し、脱着効率を算出した結果、６
８.３％であった。
にほとんど完全に吸着することがわかった。 （２）脱着 実施例１−（２）と同様の操作を行い、湿式シリカ粒子
からリポ蛋白を脱着し、脱着効率を算出した結果、６
８.３％であった。
【００３５】実施例３ 脱着液としてｐＨ７．５の３Ｍ過塩素酸ナトリウムを用
いた以外は、実施例１と同様の操作を行った結果、脱着
効率は４２.１％であった。
いた以外は、実施例１と同様の操作を行った結果、脱着
効率は４２.１％であった。
【００３６】実施例４ 脱着液としてｐＨ７．５の３Ｍチオシアン酸ナトリウム
を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った結果、
脱着効率は４５.６％であった。 実施例５ 脱着液としてｐＨ７．５の４．５Ｍ塩化マグネシウムを
用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った結果、脱
着効率は５２.６％であった。
を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った結果、
脱着効率は４５.６％であった。 実施例５ 脱着液としてｐＨ７．５の４．５Ｍ塩化マグネシウムを
用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った結果、脱
着効率は５２.６％であった。
【００３７】比較例１ 脱着液として２０％メタノールを用いた以外は、実施例
１と同様の操作を行った結果、脱着効率は７.８％であ
った。
１と同様の操作を行った結果、脱着効率は７.８％であ
った。
【００３８】比較例２ 脱着液として６Ｍ塩酸グアニジンを用いた以外は、実施
例１と同様の操作を行った結果、脱着効率は９.２％で
あった。
例１と同様の操作を行った結果、脱着効率は９.２％で
あった。
【００３９】比較例３ 脱着液として１％ツイーン２０を用いた以外は、実施例
１と同様の操作を行った結果、脱着効率は１０.２％で
あった。 比較例４ 脱着液として３Ｍ塩化ナトリウムを用いた以外は、実施
例１と同様の操作を行った結果、脱着効率は０.９％で
あった。以上のことより、カオトロピック塩水溶液は、
有機溶媒、変性剤あるいは界面活性剤よりも明かに効率
よくシリカ粒子からリポ蛋白の一種であるＬｐ（ａ）を
脱着させることがわかる。
１と同様の操作を行った結果、脱着効率は１０.２％で
あった。 比較例４ 脱着液として３Ｍ塩化ナトリウムを用いた以外は、実施
例１と同様の操作を行った結果、脱着効率は０.９％で
あった。以上のことより、カオトロピック塩水溶液は、
有機溶媒、変性剤あるいは界面活性剤よりも明かに効率
よくシリカ粒子からリポ蛋白の一種であるＬｐ（ａ）を
脱着させることがわかる。
【図１】 本図は、シリカ粒子を血清に添加してリポ蛋
白を吸着させた後に、遠心分離によりリポ蛋白吸着粒子
と分離した上清と未処理血清のポリアクリルアミドゲル
電気泳動図である。
白を吸着させた後に、遠心分離によりリポ蛋白吸着粒子
と分離した上清と未処理血清のポリアクリルアミドゲル
電気泳動図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 リポ蛋白を含有する溶液とシリカ粒子を
接触させてリポ蛋白をシリカ粒子に吸着させ、ついで該
吸着粒子とカオトロピック塩水溶液を接触させてリポ蛋
白を脱着させることを特徴とするリポ蛋白の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24941494A JP3515817B2 (ja) | 1994-10-14 | 1994-10-14 | リポ蛋白（ａ）の脱着方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24941494A JP3515817B2 (ja) | 1994-10-14 | 1994-10-14 | リポ蛋白（ａ）の脱着方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08113595A true JPH08113595A (ja) | 1996-05-07 |
| JP3515817B2 JP3515817B2 (ja) | 2004-04-05 |
Family
ID=17192623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24941494A Expired - Fee Related JP3515817B2 (ja) | 1994-10-14 | 1994-10-14 | リポ蛋白（ａ）の脱着方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3515817B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010037222A (ja) * | 2008-07-31 | 2010-02-18 | Hiroshima Univ | タンパク質の精製方法 |
| JP2012157351A (ja) * | 2011-01-11 | 2012-08-23 | Fujifilm Corp | 血液中の高密度リポタンパク質の除去方法 |
-
1994
- 1994-10-14 JP JP24941494A patent/JP3515817B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010037222A (ja) * | 2008-07-31 | 2010-02-18 | Hiroshima Univ | タンパク質の精製方法 |
| JP2012157351A (ja) * | 2011-01-11 | 2012-08-23 | Fujifilm Corp | 血液中の高密度リポタンパク質の除去方法 |
| EP2474620B1 (en) * | 2011-01-11 | 2018-04-25 | Fujifilm Corporation | Method for removing high density lipoprotein in blood |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3515817B2 (ja) | 2004-04-05 |
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|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040108 |
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| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
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