JPH06213901A - 血液試料からの高密度リポタンパク質分離法 - Google Patents
血液試料からの高密度リポタンパク質分離法Info
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- JPH06213901A JPH06213901A JP5311543A JP31154393A JPH06213901A JP H06213901 A JPH06213901 A JP H06213901A JP 5311543 A JP5311543 A JP 5311543A JP 31154393 A JP31154393 A JP 31154393A JP H06213901 A JPH06213901 A JP H06213901A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 血液試料から高密度リポタンパク質（ＨＤ
Ｌ）を分離する方法であって、該試料を、吸着剤粒子と
して細分された多孔質シリカまたはシリケートと接触さ
せて珪質物質ゲル／ＨＤＬ複合体を形成させ、該複合体
を、固体／液体分離技術によって血液試料から分離し、
それにより実質的にＨＤＬを含まない血液試料を提供す
ることを特徴とする方法。 【効果】 本発明の方法によれば、血液試料からＨＤＬ
を高度に選択的に除去することができ、ＶＬＤＬおよび
キロミクロンを選択的に除去する手段と組合せれば、血
液試料をＬＤＬに関して直接分析することができる。
Ｌ）を分離する方法であって、該試料を、吸着剤粒子と
して細分された多孔質シリカまたはシリケートと接触さ
せて珪質物質ゲル／ＨＤＬ複合体を形成させ、該複合体
を、固体／液体分離技術によって血液試料から分離し、
それにより実質的にＨＤＬを含まない血液試料を提供す
ることを特徴とする方法。 【効果】 本発明の方法によれば、血液試料からＨＤＬ
を高度に選択的に除去することができ、ＶＬＤＬおよび
キロミクロンを選択的に除去する手段と組合せれば、血
液試料をＬＤＬに関して直接分析することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床アッセイ技術の分
野に属し、低密度リポタンパク質コレステロールの測定
に関する。
野に属し、低密度リポタンパク質コレステロールの測定
に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】リポ
タンパク質は、循環系に見出されるタンパク質と脂質を
含む複合粒子である。その機能の一つは、最終的に細胞
が利用するためのコレステロールおよびコレステロール
エステルのような水不溶性物質を運搬することである。
全ての細胞が生育のためにコレステロールを必要とする
一方、細胞によるコレステロールの過剰な蓄積は、アテ
ローム性動脈硬化症（atherosclerosis)を含むある種の
疾患に導き得る。総血清コレステロールの量は、アテロ
ーム性動脈硬化症の発病と相関し得ることが知られてい
る。
タンパク質は、循環系に見出されるタンパク質と脂質を
含む複合粒子である。その機能の一つは、最終的に細胞
が利用するためのコレステロールおよびコレステロール
エステルのような水不溶性物質を運搬することである。
全ての細胞が生育のためにコレステロールを必要とする
一方、細胞によるコレステロールの過剰な蓄積は、アテ
ローム性動脈硬化症（atherosclerosis)を含むある種の
疾患に導き得る。総血清コレステロールの量は、アテロ
ーム性動脈硬化症の発病と相関し得ることが知られてい
る。
【０００３】血清中にはいくつかのクラスのリポタンパ
ク質が存在し、それらは大部分においてその密度によっ
て分類される。これらのクラスとしては、超低密度リポ
タンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤ
Ｌ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）が挙げられ
る。これらのリポタンパク質の全てが変化する量のコレ
ステロールを含有する。総血清コレステロール測定は、
血清の総リポタンパク質集団に貢献する各リポタンパク
質の量の合計である。この測定は、さらに、採血の前に
絶食していない個体の血液中に存在し得るキロミクロン
の存在によって複雑になる。
ク質が存在し、それらは大部分においてその密度によっ
て分類される。これらのクラスとしては、超低密度リポ
タンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤ
Ｌ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）が挙げられ
る。これらのリポタンパク質の全てが変化する量のコレ
ステロールを含有する。総血清コレステロール測定は、
血清の総リポタンパク質集団に貢献する各リポタンパク
質の量の合計である。この測定は、さらに、採血の前に
絶食していない個体の血液中に存在し得るキロミクロン
の存在によって複雑になる。
【０００４】特定のリポタンパク質タイプが、アテロー
ム性動脈硬化症を含む心臓病の進行に他のものよりも密
接に関連していることが、長い間疑われていた。より最
近の研究によると、ＬＤＬは、細胞中のコレステロール
の蓄積に関連があるリポタンパク質のクラスであると解
釈されており、一方、ＨＤＬは、細胞からの過剰なコレ
ステロールの除去に活性があることが示されている。し
たがって、コレステロール担持リポタンパク質一般の、
そして特にＬＤＬの測定のために種々のシステムが提案
されてきた。
ム性動脈硬化症を含む心臓病の進行に他のものよりも密
接に関連していることが、長い間疑われていた。より最
近の研究によると、ＬＤＬは、細胞中のコレステロール
の蓄積に関連があるリポタンパク質のクラスであると解
釈されており、一方、ＨＤＬは、細胞からの過剰なコレ
ステロールの除去に活性があることが示されている。し
たがって、コレステロール担持リポタンパク質一般の、
そして特にＬＤＬの測定のために種々のシステムが提案
されてきた。
【０００５】非晶質シリカ、すなわち、結晶構造を欠く
その形態のＳｉＯ2 は、少なくとも第一次世界大戦の時
代から、吸着剤として用いられていた。当時、それは、
ガスマスクの吸着剤として考慮された。非晶質シリカ
は、広く３つのカテゴリーに分けられる：ガラス質シリ
カ、または水晶の融合により製造されるガラス；非晶質
または結晶性シリカを高速中性子で照射して製造される
シリカＭ、および微孔性シリカおよび微粒子状シリカ。
微粒子状シリカ類には、発熱性シリカ類、および水性溶
液から沈殿させたシリカ類が含まれる。発熱性シリカ類
は、高温で、蒸気相からのＳｉＯ2 の凝結により、また
は低温で、蒸気相での化学反応およびその後の凝結によ
り、形成される。
その形態のＳｉＯ2 は、少なくとも第一次世界大戦の時
代から、吸着剤として用いられていた。当時、それは、
ガスマスクの吸着剤として考慮された。非晶質シリカ
は、広く３つのカテゴリーに分けられる：ガラス質シリ
カ、または水晶の融合により製造されるガラス；非晶質
または結晶性シリカを高速中性子で照射して製造される
シリカＭ、および微孔性シリカおよび微粒子状シリカ。
微粒子状シリカ類には、発熱性シリカ類、および水性溶
液から沈殿させたシリカ類が含まれる。発熱性シリカ類
は、高温で、蒸気相からのＳｉＯ2 の凝結により、また
は低温で、蒸気相での化学反応およびその後の凝結によ
り、形成される。
【０００６】水性溶液中で形成されるシリカは、ゾル、
ゲルまたは粒子として生じ得る。ゲルは三次元の連続的
な構造を有し、一方、ゾルは微細な粒子の安定な分散液
である。
ゲルまたは粒子として生じ得る。ゲルは三次元の連続的
な構造を有し、一方、ゾルは微細な粒子の安定な分散液
である。
【０００７】シリカゲルは、３つのタイプに分類され
る。標準密度ゲル（regular densitygel)は、酸媒体中
でのゲル化により製造され、高表面域（７５０〜８００
m2/g）を有する非常に小さい粒子である。平均孔直径は
２２〜２６Åであり、その孔容量は０．３７〜０．４０
ml/gである。標準密度ゲルは、表面ヒドロキシル基とし
て約６重量％の水を含有し、これは、水および他の極性
分子の吸着のための高い傾向を与える。標準密度ゲル
は、極性分子に関する高い選択性および高パーセンテー
ジの小さい孔を示す。
る。標準密度ゲル（regular densitygel)は、酸媒体中
でのゲル化により製造され、高表面域（７５０〜８００
m2/g）を有する非常に小さい粒子である。平均孔直径は
２２〜２６Åであり、その孔容量は０．３７〜０．４０
ml/gである。標準密度ゲルは、表面ヒドロキシル基とし
て約６重量％の水を含有し、これは、水および他の極性
分子の吸着のための高い傾向を与える。標準密度ゲル
は、極性分子に関する高い選択性および高パーセンテー
ジの小さい孔を示す。
【０００８】中密度シリカ（intermediate density sil
ica)は、表面積がより少ないが（３００〜３５０m2/
g）、より大きい孔容量を有する（０．５〜１．１ml/
g）。平均孔直径は１２０〜１６０Åであり、粒子は標
準密度ゲルのそれよりも大きい。大きい孔サイズのため
に、中密度ゲルは高い湿度において高い水吸収容量を有
する。
ica)は、表面積がより少ないが（３００〜３５０m2/
g）、より大きい孔容量を有する（０．５〜１．１ml/
g）。平均孔直径は１２０〜１６０Åであり、粒子は標
準密度ゲルのそれよりも大きい。大きい孔サイズのため
に、中密度ゲルは高い湿度において高い水吸収容量を有
する。
【０００９】低密度シリカゲルは、他のタイプよりも少
ない表面積（＜２００m2/g）、大きい孔直径（＞１８０
Å）および大きい孔容量（＞１．５ml/g）を有する。そ
れは、通常、極めて低密度の非常に細かい粉末として製
造される。吸着剤としてシリカが用いられる場合、その
孔構造がゲルの吸着容量を決定する。孔は、特定の表面
積、特定の孔容量（固体１g 当りの孔の総容量）、平均
孔直径、孔サイズ分布および、小さい孔によってより大
きい分子へのエントランスが制限される度合いによって
特徴付けられる。これらのパラメーターは、気体または
蒸気吸着恒温、水銀浸透研究、低角度Ｘ線散乱、電子顕
微鏡、および気体浸透性または膨潤液体の容量の測定値
から誘導される。
ない表面積（＜２００m2/g）、大きい孔直径（＞１８０
Å）および大きい孔容量（＞１．５ml/g）を有する。そ
れは、通常、極めて低密度の非常に細かい粉末として製
造される。吸着剤としてシリカが用いられる場合、その
孔構造がゲルの吸着容量を決定する。孔は、特定の表面
積、特定の孔容量（固体１g 当りの孔の総容量）、平均
孔直径、孔サイズ分布および、小さい孔によってより大
きい分子へのエントランスが制限される度合いによって
特徴付けられる。これらのパラメーターは、気体または
蒸気吸着恒温、水銀浸透研究、低角度Ｘ線散乱、電子顕
微鏡、および気体浸透性または膨潤液体の容量の測定値
から誘導される。
【００１０】シリカゲルを製造する最も普遍的な方法
は、ナトリウムシリケートを約１０未満のpHまで酸性化
することを含む。シリカは、噴霧乾燥（spray-drying）
によりまたは小滴を不混和性液体上に噴霧することによ
り球体の形態にゲル化し得る。
は、ナトリウムシリケートを約１０未満のpHまで酸性化
することを含む。シリカは、噴霧乾燥（spray-drying）
によりまたは小滴を不混和性液体上に噴霧することによ
り球体の形態にゲル化し得る。
【００１１】微孔性シリカゲルは、水和したゲルを１０
００℃で約１０時間加熱することにより得られる。珪質
性物質は、不透性シリカ、多孔質ガラスおよび、シリカ
ゲルの表面組成および孔サイズによって決められるある
種の特定の物質のための吸着剤として用いられるシリカ
の場合のように、極めて小さい孔で製造することができ
る。本発明は、微孔性シリカ、シリカゲルおよび調節孔
ガラス（controlled pore glass)のようなシリケートお
よび大孔シリカ類を、血清または血漿からのＨＤＬのた
めの選択的吸着剤物質として用いることに関する。
００℃で約１０時間加熱することにより得られる。珪質
性物質は、不透性シリカ、多孔質ガラスおよび、シリカ
ゲルの表面組成および孔サイズによって決められるある
種の特定の物質のための吸着剤として用いられるシリカ
の場合のように、極めて小さい孔で製造することができ
る。本発明は、微孔性シリカ、シリカゲルおよび調節孔
ガラス（controlled pore glass)のようなシリケートお
よび大孔シリカ類を、血清または血漿からのＨＤＬのた
めの選択的吸着剤物質として用いることに関する。
【００１２】沈降シリカ（粒子状シリカとも呼ばれる）
は、塊状のゲルネットワーク中でリンクされていないコ
ロイドサイズの最終的粒子の凝集塊から構成されてい
る。沈降シリカは、蒸気相から（ヒュームドシリカ、す
なわち熱分解法シリカ）、または溶液からの沈殿によっ
て形成される。熱分解法シリカまたはヒュームドシリカ
の製造においては、砂を約２０００℃で気化させる。冷
却の際に、コークスのような還元剤の存在下で無水非晶
質シリカ粉末が形成される。この非晶質シリカは、約１
５００℃で昇華して、Ｓｉを生じ、これが次いで酸化さ
れて粒子状ＳｉＯ2 を生じる。熱分解法シリカまたはヒ
ュームドシリカは、典型的には、ポリエステル−ガラス
補強プラスチックにおけるチキソトロープ剤；ゴム、プ
ラスチック、シリコーンおよびエポキシ樹脂における還
元および増粘剤、ならびに増粘およびゲル化剤として用
いられる。
は、塊状のゲルネットワーク中でリンクされていないコ
ロイドサイズの最終的粒子の凝集塊から構成されてい
る。沈降シリカは、蒸気相から（ヒュームドシリカ、す
なわち熱分解法シリカ）、または溶液からの沈殿によっ
て形成される。熱分解法シリカまたはヒュームドシリカ
の製造においては、砂を約２０００℃で気化させる。冷
却の際に、コークスのような還元剤の存在下で無水非晶
質シリカ粉末が形成される。この非晶質シリカは、約１
５００℃で昇華して、Ｓｉを生じ、これが次いで酸化さ
れて粒子状ＳｉＯ2 を生じる。熱分解法シリカまたはヒ
ュームドシリカは、典型的には、ポリエステル−ガラス
補強プラスチックにおけるチキソトロープ剤；ゴム、プ
ラスチック、シリコーンおよびエポキシ樹脂における還
元および増粘剤、ならびに増粘およびゲル化剤として用
いられる。
【００１３】純粋なシリカは、珪素および酸素元素から
構成されている。物質は、金属、金属酸化物または金属
塩が付加された後にも、「シリカ（類）」と呼ばれる；
例えば、フリントは鉄酸化物が付加されたシリカであ
る。ガラスは、（Ｋ，Ｎａ）2Ｏ、（Ｃａ，Ｐｂ）Ｏ、
６ＳｉＯ2 と５（Ｋ，Ｎａ）2 Ｏ、７（Ｃａ，Ｐｂ）Ｏ
および３６ＳｉＯ2 の間の定義された組成と、一般式
（Ｋ，Ｎａ）Ｏ−Ｓｉn Ｏ2n-1（ＣａＰｂ）Ｏ−Ｓｉn
Ｏ2n-1−Ｏ（Ｋ，Ｎａ）を有する。全てのシリカベース
のガラスはシリカと呼ばれ得るが、全てのシリカがガラ
スではない。本発明において有用なＨＤＬ吸着剤物質
は、その最も広い意味で用いられるとおりのシリケート
または多孔質シリカである。
構成されている。物質は、金属、金属酸化物または金属
塩が付加された後にも、「シリカ（類）」と呼ばれる；
例えば、フリントは鉄酸化物が付加されたシリカであ
る。ガラスは、（Ｋ，Ｎａ）2Ｏ、（Ｃａ，Ｐｂ）Ｏ、
６ＳｉＯ2 と５（Ｋ，Ｎａ）2 Ｏ、７（Ｃａ，Ｐｂ）Ｏ
および３６ＳｉＯ2 の間の定義された組成と、一般式
（Ｋ，Ｎａ）Ｏ−Ｓｉn Ｏ2n-1（ＣａＰｂ）Ｏ−Ｓｉn
Ｏ2n-1−Ｏ（Ｋ，Ｎａ）を有する。全てのシリカベース
のガラスはシリカと呼ばれ得るが、全てのシリカがガラ
スではない。本発明において有用なＨＤＬ吸着剤物質
は、その最も広い意味で用いられるとおりのシリケート
または多孔質シリカである。
【００１４】米国特許第５，１４１，８７２号には、血
漿からのリポタンパク質の選択的吸着のためのヒューム
ドシリカの使用が開示されている。その特許権者は、こ
の手順がその発明より以前に公知であったことを指摘し
ているが、しかし界面活性剤を含有する処方を用いてイ
ンキュベートすることによりヒュームドシリカからＨＤ
Ｌを選択的に脱着することの改良を主張している。市販
のヒュームドシリカ、例えば、Cabot Company のCab-O-
Sil およびDegussa のAerosol が、この手順において有
用であるとして言及されている。
漿からのリポタンパク質の選択的吸着のためのヒューム
ドシリカの使用が開示されている。その特許権者は、こ
の手順がその発明より以前に公知であったことを指摘し
ているが、しかし界面活性剤を含有する処方を用いてイ
ンキュベートすることによりヒュームドシリカからＨＤ
Ｌを選択的に脱着することの改良を主張している。市販
のヒュームドシリカ、例えば、Cabot Company のCab-O-
Sil およびDegussa のAerosol が、この手順において有
用であるとして言及されている。
【００１５】ＬＤＬ粒子およびＶＬＤＬ粒子の直径は、
それぞれ２２０〜２５０Åおよび３００〜８００Å、そ
してキロミクロンはそれより大きいと見積もられてい
る。Aersol 380のようなヒュームドシリカの大きさは約
７０Å未満であり、ＨＤＬ粒子は直径１００〜１５０Å
と見積もられているので、米国特許第５，１４１，８７
２号に開示されているとおりのこのリポタンパク質の結
合は、非特異的表面吸着のみに基づいていると結論する
ことができる。ＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子は大き過ぎて
７０Åのシリカ粒子に存在し得るいかなる孔にも適合し
ないので、比較的大きいリポタンパク質粒子の粒子サイ
ズ排除は、その方法においては要因ではない。この技術
は、別個の工程における脱着によってその選択性を達成
する。本発明は、シリカゲルによるより小さいＨＤＬ粒
子の選択的吸着を含み、それは、ＶＬＤＬおよびキロミ
クロンの分離の機序と組合わされると、それ以上の処理
なしに残っているＬＤＬに関して分析し得る試料を提供
する。
それぞれ２２０〜２５０Åおよび３００〜８００Å、そ
してキロミクロンはそれより大きいと見積もられてい
る。Aersol 380のようなヒュームドシリカの大きさは約
７０Å未満であり、ＨＤＬ粒子は直径１００〜１５０Å
と見積もられているので、米国特許第５，１４１，８７
２号に開示されているとおりのこのリポタンパク質の結
合は、非特異的表面吸着のみに基づいていると結論する
ことができる。ＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子は大き過ぎて
７０Åのシリカ粒子に存在し得るいかなる孔にも適合し
ないので、比較的大きいリポタンパク質粒子の粒子サイ
ズ排除は、その方法においては要因ではない。この技術
は、別個の工程における脱着によってその選択性を達成
する。本発明は、シリカゲルによるより小さいＨＤＬ粒
子の選択的吸着を含み、それは、ＶＬＤＬおよびキロミ
クロンの分離の機序と組合わされると、それ以上の処理
なしに残っているＬＤＬに関して分析し得る試料を提供
する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は、血液試料から
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を分離するための方法
であって、血液試料をＨＤＬの吸着剤としての細分され
た多孔質シリカまたはシリケート粒子と接触させ、該吸
着剤粒子が、直径約８０Å〜５００Åの表面孔を有して
吸着剤粒子／ＨＤＬ複合体を形成し、該複合体を、固体
／液体分離技術によって血液試料から分離し、実質的に
ＨＤＬを含まない血液試料を提供することを特徴とする
方法に関する。好ましい吸着剤物質としては、微孔性シ
リカ、シリカゲルおよび調節孔ガラスが挙げられる。
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を分離するための方法
であって、血液試料をＨＤＬの吸着剤としての細分され
た多孔質シリカまたはシリケート粒子と接触させ、該吸
着剤粒子が、直径約８０Å〜５００Åの表面孔を有して
吸着剤粒子／ＨＤＬ複合体を形成し、該複合体を、固体
／液体分離技術によって血液試料から分離し、実質的に
ＨＤＬを含まない血液試料を提供することを特徴とする
方法に関する。好ましい吸着剤物質としては、微孔性シ
リカ、シリカゲルおよび調節孔ガラスが挙げられる。
【００１７】血液試料からＨＤＬを分離するこの高度に
選択的な方法を、ＶＬＤＬおよびキロミクロンを選択的
に除去する手段と組合せることにより、血液試料をＬＤ
Ｌ濃度に関して直接分析することができる。
選択的な方法を、ＶＬＤＬおよびキロミクロンを選択的
に除去する手段と組合せることにより、血液試料をＬＤ
Ｌ濃度に関して直接分析することができる。
【００１８】本発明の実施においては、選択的な孔サイ
ズを有するシリカゲルは、血液試料中に存在するＨＤＬ
を特異的に吸着するために用いられる。試料からＶＬＤ
Ｌおよびキロミクロンを分離する種々の手段、例えば、
多価陰イオンおよび二価陽イオンを用いることによる手
段などを利用することができる。この除去は、血液試料
を多価陰イオンおよび二価陽イオン、例えばヘパリンお
よびＭｎＣｌ2 と、液相または固相において接触させる
ことによって達成するのが好ましい。
ズを有するシリカゲルは、血液試料中に存在するＨＤＬ
を特異的に吸着するために用いられる。試料からＶＬＤ
Ｌおよびキロミクロンを分離する種々の手段、例えば、
多価陰イオンおよび二価陽イオンを用いることによる手
段などを利用することができる。この除去は、血液試料
を多価陰イオンおよび二価陽イオン、例えばヘパリンお
よびＭｎＣｌ2 と、液相または固相において接触させる
ことによって達成するのが好ましい。
【００１９】本発明は、血漿または血清中のリポタンパ
ク質の混合物からＨＤＬ成分を除去することが望ましい
状況において、医学的診断に適用し得る。このような状
況の例としては、この技術を、その他のリポタンパク質
も除去して単一のリポタンパク質のみを残し、それをコ
レステロール含量アッセイにより直接測定し得るシステ
ムの一成分として用いる場合が挙げられる。このシステ
ムと、キロミクロンおよび超低密度リポタンパク質（Ｖ
ＬＤＬ）を除去する手段との組合せは、最も興味深い脂
質である低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に関する直接
アッセイをもたらすことになる。
ク質の混合物からＨＤＬ成分を除去することが望ましい
状況において、医学的診断に適用し得る。このような状
況の例としては、この技術を、その他のリポタンパク質
も除去して単一のリポタンパク質のみを残し、それをコ
レステロール含量アッセイにより直接測定し得るシステ
ムの一成分として用いる場合が挙げられる。このシステ
ムと、キロミクロンおよび超低密度リポタンパク質（Ｖ
ＬＤＬ）を除去する手段との組合せは、最も興味深い脂
質である低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に関する直接
アッセイをもたらすことになる。
【００２０】あるいは、本明細書中で示唆するように処
理した血液試料中のコレステロールに関する値を、元来
の試料中の総コレステロールの値から引き算すれば、試
料中のＨＤＬによって担持されているコレステロールの
量を推定することが可能になるであろう。
理した血液試料中のコレステロールに関する値を、元来
の試料中の総コレステロールの値から引き算すれば、試
料中のＨＤＬによって担持されているコレステロールの
量を推定することが可能になるであろう。
【００２１】別の応用においては、本発明は、リポタン
パク質反応性試薬を少量の正確な量で分取する手段とし
て、特に血清または血漿からの特定のリポタンパク質の
除去を必要とする後の手順においてシリカ試薬が用いら
れるであろう場合に、用いることができる。医学的診断
試験具の製造の容易さのために、リポタンパク質反応性
試薬は、乾燥シートに均一に分布させることができる。
そのシートのよく定義された領域を切り出すことによっ
て、正確な量の活性試薬を、所望の容器または位置に便
利に移すために手にすることができる。その最も簡便な
形態において、本発明は、血液試料からＨＤＬを選択的
に除去する液体系に関し、それは好ましくはＶＬＤＬお
よびキロミクロンを試料から除去してＬＤＬを直接測定
可能な試料を提供するような一つ以上の技術と組合せら
れている。
パク質反応性試薬を少量の正確な量で分取する手段とし
て、特に血清または血漿からの特定のリポタンパク質の
除去を必要とする後の手順においてシリカ試薬が用いら
れるであろう場合に、用いることができる。医学的診断
試験具の製造の容易さのために、リポタンパク質反応性
試薬は、乾燥シートに均一に分布させることができる。
そのシートのよく定義された領域を切り出すことによっ
て、正確な量の活性試薬を、所望の容器または位置に便
利に移すために手にすることができる。その最も簡便な
形態において、本発明は、血液試料からＨＤＬを選択的
に除去する液体系に関し、それは好ましくはＶＬＤＬお
よびキロミクロンを試料から除去してＬＤＬを直接測定
可能な試料を提供するような一つ以上の技術と組合せら
れている。
【００２２】本発明の実施においては、前述したような
タイプのシリカまたはシリケート、多価陰イオンおよび
二価陽イオンの可溶性塩を、好適な容器中で水またはそ
の他の好適な溶媒に予め分散させ、そこに血液を血清ま
たは血漿の形態で添加する。混合し、室温で数分間イン
キュベートした後、固体−液体分離技術、例えば、遠心
分離、またはシリカ粒子の直径よりも小さい孔を有する
フィルター、例えば孔サイズが約２μのフィルターを通
してろ過することによって、シリカおよびフロキュレー
トとなった（浮いている）ＶＬＤＬ−キロミクロン／多
価陰イオン−二価陽イオン複合体を混合物から除去す
る。別の方法としては、遊泳物（infranate)をピペット
でサンプリングすることもできる。ろ過物または遠心分
離infranate の一部を、従来の血清総コレステロールア
ッセイ試薬、例えば、Technicon Method No. SM4-2139F
90, June 1990 、すなわちTechnicon （登録商標）AXON
（商標） system におけるTechnicon コレステロール試
薬の利用のためのTechnicon（登録商標）AXON（商標）
法シートに開示されているようなコレステロールオキシ
ダーゼ法によるコレステロール濃度測定のためにサンプ
リングする。報告された値は、主要な興味の対象である
ＬＤＬによって担持されるコレステロールを表わす。
タイプのシリカまたはシリケート、多価陰イオンおよび
二価陽イオンの可溶性塩を、好適な容器中で水またはそ
の他の好適な溶媒に予め分散させ、そこに血液を血清ま
たは血漿の形態で添加する。混合し、室温で数分間イン
キュベートした後、固体−液体分離技術、例えば、遠心
分離、またはシリカ粒子の直径よりも小さい孔を有する
フィルター、例えば孔サイズが約２μのフィルターを通
してろ過することによって、シリカおよびフロキュレー
トとなった（浮いている）ＶＬＤＬ−キロミクロン／多
価陰イオン−二価陽イオン複合体を混合物から除去す
る。別の方法としては、遊泳物（infranate)をピペット
でサンプリングすることもできる。ろ過物または遠心分
離infranate の一部を、従来の血清総コレステロールア
ッセイ試薬、例えば、Technicon Method No. SM4-2139F
90, June 1990 、すなわちTechnicon （登録商標）AXON
（商標） system におけるTechnicon コレステロール試
薬の利用のためのTechnicon（登録商標）AXON（商標）
法シートに開示されているようなコレステロールオキシ
ダーゼ法によるコレステロール濃度測定のためにサンプ
リングする。報告された値は、主要な興味の対象である
ＬＤＬによって担持されるコレステロールを表わす。
【００２３】本発明の便利な態様においては、ＨＤＬ、
ＶＬＤＬおよびキロミクロンは、血清または血漿から、
それと多孔質シリカまたはシリケート、すなわち多孔質
珪質物質、二価陽イオンおよび多価陰イオンとを、上面
に少なくとも一つの開口を有する圧縮可能な容器内にお
いて合わせることにより分離される。この開口は、フィ
ルターでおおわれ、これは取りはずし可能またはシール
もしくはキャップで置換可能であり、その孔は、多孔質
珪質粒子と吸着された血液試料からの高密度リポタンパ
ク質との複合体を保持するようなサイズを有する。同様
に、これらの孔は、ＶＬＤＬ／キロミクロンと二価陽イ
オンおよび多価陰イオンの相互作用により形成された複
合体を実質的に全て保持するのに充分小さいものである
べきである。混合され、インキュベートされると、ＨＤ
ＬおよびＶＬＤＬ／キロミクロンは、各々フィルター要
素に保持されている珪質物質および二価陽イオン／多価
陰イオンと複合体を形成する。したがって、容器を、例
えば、絞ったりまたはピストンタイプの機構を用いたり
して圧縮することにより、残存するＬＤＬのみを含む血
液試料をフィルターの孔から押し出す。典型的には、孔
サイズは、直径１〜１０μの範囲であり、１〜２μの範
囲が好ましい。
ＶＬＤＬおよびキロミクロンは、血清または血漿から、
それと多孔質シリカまたはシリケート、すなわち多孔質
珪質物質、二価陽イオンおよび多価陰イオンとを、上面
に少なくとも一つの開口を有する圧縮可能な容器内にお
いて合わせることにより分離される。この開口は、フィ
ルターでおおわれ、これは取りはずし可能またはシール
もしくはキャップで置換可能であり、その孔は、多孔質
珪質粒子と吸着された血液試料からの高密度リポタンパ
ク質との複合体を保持するようなサイズを有する。同様
に、これらの孔は、ＶＬＤＬ／キロミクロンと二価陽イ
オンおよび多価陰イオンの相互作用により形成された複
合体を実質的に全て保持するのに充分小さいものである
べきである。混合され、インキュベートされると、ＨＤ
ＬおよびＶＬＤＬ／キロミクロンは、各々フィルター要
素に保持されている珪質物質および二価陽イオン／多価
陰イオンと複合体を形成する。したがって、容器を、例
えば、絞ったりまたはピストンタイプの機構を用いたり
して圧縮することにより、残存するＬＤＬのみを含む血
液試料をフィルターの孔から押し出す。典型的には、孔
サイズは、直径１〜１０μの範囲であり、１〜２μの範
囲が好ましい。
【００２４】好適なフィルター物質としては、多孔質プ
ラスチックまたはガラス繊維が挙げられる。一般的なフ
ィルター試験具は、界面活性剤、液流強化剤（fluid fl
ow enhancers）、およびフィルター物質への結合を減少
する薬剤のような添加物を含有する。これらの添加物
は、アガロースゲル電気泳動のプロフィールによって示
されるように、リポタンパク質を変化させ得る。ＬＤＬ
リポタンパク質が変性していない状態で送達される必要
がある場合には、界面活性剤または液流強化剤が添加さ
れていないフィルター物質が好ましい。総コレステロー
ル分析系においては、その系のＬＤＬ画分に含有される
コレステロールのみがフィルターを通過することになる
ので、少量の溶解されたフィルター添加物の影響は問題
ではない。
ラスチックまたはガラス繊維が挙げられる。一般的なフ
ィルター試験具は、界面活性剤、液流強化剤（fluid fl
ow enhancers）、およびフィルター物質への結合を減少
する薬剤のような添加物を含有する。これらの添加物
は、アガロースゲル電気泳動のプロフィールによって示
されるように、リポタンパク質を変化させ得る。ＬＤＬ
リポタンパク質が変性していない状態で送達される必要
がある場合には、界面活性剤または液流強化剤が添加さ
れていないフィルター物質が好ましい。総コレステロー
ル分析系においては、その系のＬＤＬ画分に含有される
コレステロールのみがフィルターを通過することになる
ので、少量の溶解されたフィルター添加物の影響は問題
ではない。
【００２５】本発明の実施においては、珪質吸着剤は、
典型的には約５０〜３５０mg/ml 試験血液（血清または
血漿の形態）の量で用いられる。珪質物質の量が８０〜
２５０mg/ml であるのが好ましい。選択的なＨＤＬの除
去は、８０〜２５０mg/ml の範囲の、The Separations
Group, Hesperia, CA の４μ粒子サイズのVYDAC 101TP
に関して最も効率的である。Crossfield Sorbsil C500
シリカは、同様であるが、９０〜約３００mg/ml の範囲
のほうがよい。シリカの量が少ないと、約２／３を越え
るＨＤＬが除去されないが、一方、シリカの量が多いと
１／３を越えるＬＤＬが除去されることが観察された。
図１に示すように、ＨＤＬ分離のための理想的なVydac
シリカの量は、１３３mg/ml である。ＬＤＬアッセイの
ための最適なシリカ濃度は、混合の完全性または錯化試
薬（ヘパリンおよびマンガンイオン）の存在のような他
の要因によって影響される。
典型的には約５０〜３５０mg/ml 試験血液（血清または
血漿の形態）の量で用いられる。珪質物質の量が８０〜
２５０mg/ml であるのが好ましい。選択的なＨＤＬの除
去は、８０〜２５０mg/ml の範囲の、The Separations
Group, Hesperia, CA の４μ粒子サイズのVYDAC 101TP
に関して最も効率的である。Crossfield Sorbsil C500
シリカは、同様であるが、９０〜約３００mg/ml の範囲
のほうがよい。シリカの量が少ないと、約２／３を越え
るＨＤＬが除去されないが、一方、シリカの量が多いと
１／３を越えるＬＤＬが除去されることが観察された。
図１に示すように、ＨＤＬ分離のための理想的なVydac
シリカの量は、１３３mg/ml である。ＬＤＬアッセイの
ための最適なシリカ濃度は、混合の完全性または錯化試
薬（ヘパリンおよびマンガンイオン）の存在のような他
の要因によって影響される。
【００２６】種々の量のシリカ（VYDAC 101TP)を、ＬＤ
Ｌ範囲にわたる５つの新鮮血清試料を用いて研究した。
フリーデワルド参照法（Friedewald reference method)
を用いた相関に基づくと、相関の傾き（スロープ）は８
０mgシリカ／ml血清で１．０に最も近く、最も低い相関
の切片は１１１mg/ml であった。この範囲内において、
その５つの試料にわたる参照フリーデワルド法からルー
ト平均平方バイアス（root-mean-square bias)の最低値
を選んだ；これは９１mg/ml であった。
Ｌ範囲にわたる５つの新鮮血清試料を用いて研究した。
フリーデワルド参照法（Friedewald reference method)
を用いた相関に基づくと、相関の傾き（スロープ）は８
０mgシリカ／ml血清で１．０に最も近く、最も低い相関
の切片は１１１mg/ml であった。この範囲内において、
その５つの試料にわたる参照フリーデワルド法からルー
ト平均平方バイアス（root-mean-square bias)の最低値
を選んだ；これは９１mg/ml であった。
【００２７】本発明における使用に好ましい多孔質シリ
カおよびシリケート、すなわち、調節孔ガラスとも呼ば
れるものは、低密度の三次元の連続的な構造で、表面積
が２００m2/gを越えるものである。粒子サイズは、もっ
とも長い寸法において１〜１，０００μの範囲にわたる
ことができ、２〜５００μの範囲が好ましい。孔サイズ
は、通常、直径約８０Åから約１，０００Åまで（好ま
しくは３００Å〜５００Å）にわたり、孔容量は１．５
ml/gを越える。
カおよびシリケート、すなわち、調節孔ガラスとも呼ば
れるものは、低密度の三次元の連続的な構造で、表面積
が２００m2/gを越えるものである。粒子サイズは、もっ
とも長い寸法において１〜１，０００μの範囲にわたる
ことができ、２〜５００μの範囲が好ましい。孔サイズ
は、通常、直径約８０Åから約１，０００Åまで（好ま
しくは３００Å〜５００Å）にわたり、孔容量は１．５
ml/gを越える。
【００２８】ＨＤＬを吸着するその能力のために本発明
において有用な多孔質シリカおよびシリケートは、ＨＤ
Ｌ粒子よりも大きいサイズを有し、かなりの数の孔を有
するようなものである。好ましくは、粒子の孔サイズ分
布の平均孔サイズは、ＨＤＬ粒子の直径よりも大きい。
ＬＤＬより優先してＨＤＬを選択的に吸着するのに好適
な珪質吸着剤粒子は、約５００Åまでの孔直径の多孔質
物質に相当することが実験的に見出されている孔サイズ
の上限を有する。ＬＤＬより優先してＨＤＬに対する選
択性を示す孔サイズの下限は、５μWhatman Partisil 5
多孔質シリカゲルによって示される６６〜８８Åであっ
た。
において有用な多孔質シリカおよびシリケートは、ＨＤ
Ｌ粒子よりも大きいサイズを有し、かなりの数の孔を有
するようなものである。好ましくは、粒子の孔サイズ分
布の平均孔サイズは、ＨＤＬ粒子の直径よりも大きい。
ＬＤＬより優先してＨＤＬを選択的に吸着するのに好適
な珪質吸着剤粒子は、約５００Åまでの孔直径の多孔質
物質に相当することが実験的に見出されている孔サイズ
の上限を有する。ＬＤＬより優先してＨＤＬに対する選
択性を示す孔サイズの下限は、５μWhatman Partisil 5
多孔質シリカゲルによって示される６６〜８８Åであっ
た。
【００２９】極端な場合には、多孔質珪質物質の供給源
が重要であるように思われる。Whatman Partisil 5物質
は、述べられている６６〜８８Åの孔サイズでＨＤＬに
対するある程度の選択性を示したのに対し、Sigma 調節
孔ガラスは、述べられている７９Åの孔サイズでは選択
的ではなかった。製造者の孔サイズ測定法は、本発明に
おいてシリカまたはシリケートが用いられる条件下での
見かけ上の孔サイズに対応しない可能性がある。最適孔
サイズは、製造者の方法で測定すると約３００Åである
ように見える。好ましい範囲は、全ての製造者の中で最
も有用なシリカまたはシリケートの例がこの範囲に入る
ので、約２００Å〜３５０Åである。
が重要であるように思われる。Whatman Partisil 5物質
は、述べられている６６〜８８Åの孔サイズでＨＤＬに
対するある程度の選択性を示したのに対し、Sigma 調節
孔ガラスは、述べられている７９Åの孔サイズでは選択
的ではなかった。製造者の孔サイズ測定法は、本発明に
おいてシリカまたはシリケートが用いられる条件下での
見かけ上の孔サイズに対応しない可能性がある。最適孔
サイズは、製造者の方法で測定すると約３００Åである
ように見える。好ましい範囲は、全ての製造者の中で最
も有用なシリカまたはシリケートの例がこの範囲に入る
ので、約２００Å〜３５０Åである。
【００３０】粒子状吸着物質によるＨＤＬの除去に加え
て、血液試料からＶＬＤＬおよびキロミクロンを除去す
る手段を用いることにより、ＬＤＬのみが残って、その
コレステロール濃度を直接測定することができる。多価
陰イオン／二価陽イオンの使用は、ＶＬＤＬおよびキロ
ミクロンの除去に好ましい手段である。二価陽イオンは
典型的にはＭｎＣｌ2 またはＭｇＣｌ2 の形態であり、
多価陰イオンは典型的にはヘパリンまたは硫酸デキスト
ランである。それらの最も有用な濃度は相互依存性であ
り、最終濃度が約２５〜５００mMの二価陽イオンおよび
０．０５〜０．１５g /lの多価陰イオンは有用である。
て、血液試料からＶＬＤＬおよびキロミクロンを除去す
る手段を用いることにより、ＬＤＬのみが残って、その
コレステロール濃度を直接測定することができる。多価
陰イオン／二価陽イオンの使用は、ＶＬＤＬおよびキロ
ミクロンの除去に好ましい手段である。二価陽イオンは
典型的にはＭｎＣｌ2 またはＭｇＣｌ2 の形態であり、
多価陰イオンは典型的にはヘパリンまたは硫酸デキスト
ランである。それらの最も有用な濃度は相互依存性であ
り、最終濃度が約２５〜５００mMの二価陽イオンおよび
０．０５〜０．１５g /lの多価陰イオンは有用である。
【００３１】１１１mg/ml 血清のVydac シリカおよび
０．０５g /lのブタヘパリンの存在下で、二価陽イオン
の最も有用な範囲は５０〜１００mMＭｎＣｌ2 であるこ
とがわかったが、一方、１１１mg/ml 血清のVydac シリ
カおよび０．１０g /lのブタヘパリンの存在下では、二
価陽イオンの有用な範囲は２００〜４６７mMＭｎＣｌ2
であった。
０．０５g /lのブタヘパリンの存在下で、二価陽イオン
の最も有用な範囲は５０〜１００mMＭｎＣｌ2 であるこ
とがわかったが、一方、１１１mg/ml 血清のVydac シリ
カおよび０．１０g /lのブタヘパリンの存在下では、二
価陽イオンの有用な範囲は２００〜４６７mMＭｎＣｌ2
であった。
【００３２】液相において血液からリポタンパク質を分
離するこの方法は、米国特許第４，７４６，６０５号に
さらに記載されており、その開示は参照により本明細書
中に含まれる。この特許に開示された技術においては、
ＨＤＬは高密度リポタンパク質特異的抗体の使用が関与
する沈殿によって血液試料から除去される。本発明の実
施を以下の例によってさらに説明する。
離するこの方法は、米国特許第４，７４６，６０５号に
さらに記載されており、その開示は参照により本明細書
中に含まれる。この特許に開示された技術においては、
ＨＤＬは高密度リポタンパク質特異的抗体の使用が関与
する沈殿によって血液試料から除去される。本発明の実
施を以下の例によってさらに説明する。
【００３３】
例１ ５００μl エッペンドルフ（Eppendorf ）ポリプロピレ
ンチューブ中の１１．１mgシリカ（Vydac Silica、４μ
粒子サイズ、３００Å孔サイズ）に、０．１５mg/ml ヘ
パリン（ブタ H-3125、 Sigmaより）を含む３００mM水
性ＭｎＣｌ2 （Sigma M-3634）５０μl を添加し、続い
て混合した。血清の一部１００μl を添加し、血清対試
薬の容量比を２：１とし、それにより最終濃度１００mM
ＭｎＣｌ2 とした。混合物を１５分間の間に５回ボルテ
ックス（vortex）し、１２，０００×ｇで１０分間遠心
分離した。遊泳物を沈殿した固形物から分離し、COBAS
FARA (Roche)総コレステロールアッセイを用いて分析し
た。
ンチューブ中の１１．１mgシリカ（Vydac Silica、４μ
粒子サイズ、３００Å孔サイズ）に、０．１５mg/ml ヘ
パリン（ブタ H-3125、 Sigmaより）を含む３００mM水
性ＭｎＣｌ2 （Sigma M-3634）５０μl を添加し、続い
て混合した。血清の一部１００μl を添加し、血清対試
薬の容量比を２：１とし、それにより最終濃度１００mM
ＭｎＣｌ2 とした。混合物を１５分間の間に５回ボルテ
ックス（vortex）し、１２，０００×ｇで１０分間遠心
分離した。遊泳物を沈殿した固形物から分離し、COBAS
FARA (Roche)総コレステロールアッセイを用いて分析し
た。
【００３４】標準総コレステロールアッセイについて報
告された値を、希釈率１．５で掛け算して水性ヘパリン
−塩化マンガン溶液による希釈に関してさらに調整し
た。あるいは、この場合には１．４５８を用い、シリカ
ゲルにより失われた少量の水に関してさらに調整した。
もとの血清の対照分析、すなわち、COBAS FARA総コレス
テロール、COBAS FARAＨＤＬコレステロール、COBAS FA
RAトリグリセリドおよびParagon Lipogel、電気泳動、N
WLRC （Northwest Lipid Research Center)フリーデワ
ルドコレステロールを実施した。
告された値を、希釈率１．５で掛け算して水性ヘパリン
−塩化マンガン溶液による希釈に関してさらに調整し
た。あるいは、この場合には１．４５８を用い、シリカ
ゲルにより失われた少量の水に関してさらに調整した。
もとの血清の対照分析、すなわち、COBAS FARA総コレス
テロール、COBAS FARAＨＤＬコレステロール、COBAS FA
RAトリグリセリドおよびParagon Lipogel、電気泳動、N
WLRC （Northwest Lipid Research Center)フリーデワ
ルドコレステロールを実施した。
【００３５】本発明の技術による血液試料からのＨＤＬ
の除去は、総コレステロールアッセイおよびＨＤＬコレ
ステロールアッセイを行うことができる種々の系での使
用に好適である。この系は以下の例に示されているフリ
ーデワルドおよびTechniconRA-XT 法とよく匹敵する。
の除去は、総コレステロールアッセイおよびＨＤＬコレ
ステロールアッセイを行うことができる種々の系での使
用に好適である。この系は以下の例に示されているフリ
ーデワルドおよびTechniconRA-XT 法とよく匹敵する。
【００３６】例２ ２量の血清対１量のＭｎＣｌ2 −ヘパリン溶液の比で、
ＭｎＣｌ2 、ブタヘパリンのスラリーに血清を添加し、
１１１．１mgシリカVydac 101TPB 4 ／ml血清とした。
処理した血清試料をボルテックスで混合し、室温で約１
２分間静置してから、１２，０００×ｇで３分間遠心分
離した。遊泳物の総コレステロールを、Roche Cobas Fa
ra臨床分析機で測定した。ＬＤＬコレステロール値は、
遊泳物の総コレステロールを１．５で掛けて得た。フリ
ーデワルドＬＤＬコレステロール値は、総コレステロー
ル、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの個別
の測定から、以下の式により算出した： ＬＤＬコレステロール＝総コレステロール−ＨＤＬコレ
ステロール−トリグリセリド／５
ＭｎＣｌ2 、ブタヘパリンのスラリーに血清を添加し、
１１１．１mgシリカVydac 101TPB 4 ／ml血清とした。
処理した血清試料をボルテックスで混合し、室温で約１
２分間静置してから、１２，０００×ｇで３分間遠心分
離した。遊泳物の総コレステロールを、Roche Cobas Fa
ra臨床分析機で測定した。ＬＤＬコレステロール値は、
遊泳物の総コレステロールを１．５で掛けて得た。フリ
ーデワルドＬＤＬコレステロール値は、総コレステロー
ル、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの個別
の測定から、以下の式により算出した： ＬＤＬコレステロール＝総コレステロール−ＨＤＬコレ
ステロール−トリグリセリド／５
【００３７】本発明の方法を用いて得られた値（直接Ｌ
ＤＬコレステロール）を、フリーデワルド法により測定
したこれらの値と比較した。本発明の方法とフリーデワ
ルド法との相関係数は、表１からわかるように０．９８
であった。
ＤＬコレステロール）を、フリーデワルド法により測定
したこれらの値と比較した。本発明の方法とフリーデワ
ルド法との相関係数は、表１からわかるように０．９８
であった。
【００３８】
【表１】
【００３９】例３ 血清（２２０μl)を、プラスチックPorex SQEASY容器中
の０．３M ＭｎＣｌ2および０．１５mg/ml ブタヘパリ
ンを含有する１１０μl の水性溶液およびVydac 101 ２
０mgに添加した。容器にキャップを付け、手短に混合
し、室温で約１２分間静置した。容器上に、Porex UF２
ミクロンフィルターを備えたろ過キャップを置き、容器
を絞ることによりその内容液にフィルターを通過させ
た。このようにして、結合していないＬＤＬを含有する
ろ過物を得、一方、シリカゲルに結合したＨＤＬおよび
ＭｎＣｌ2 ／ヘパリンと結合したＶＬＤＬ／キロμを２
μフィルターにより効果的に除去した。このことは、ア
ガロースゲル電気泳動からのリポタンパク質バンドの光
学密度によって証明され、それによると、ろ過物にはＬ
ＤＬの損失が見られず、ＨＤＬ対ＬＤＬの比が処理前の
１：２から処理後の１：２１に変化することが明らかに
なった。
の０．３M ＭｎＣｌ2および０．１５mg/ml ブタヘパリ
ンを含有する１１０μl の水性溶液およびVydac 101 ２
０mgに添加した。容器にキャップを付け、手短に混合
し、室温で約１２分間静置した。容器上に、Porex UF２
ミクロンフィルターを備えたろ過キャップを置き、容器
を絞ることによりその内容液にフィルターを通過させ
た。このようにして、結合していないＬＤＬを含有する
ろ過物を得、一方、シリカゲルに結合したＨＤＬおよび
ＭｎＣｌ2 ／ヘパリンと結合したＶＬＤＬ／キロμを２
μフィルターにより効果的に除去した。このことは、ア
ガロースゲル電気泳動からのリポタンパク質バンドの光
学密度によって証明され、それによると、ろ過物にはＬ
ＤＬの損失が見られず、ＨＤＬ対ＬＤＬの比が処理前の
１：２から処理後の１：２１に変化することが明らかに
なった。
【００４０】例４微孔性シリカによる血清からの選択的なＨＤＬの除去 （１）微孔性シリカ（VYDAC 101 TP ; ２７０−３２０
Å、平均３００Å孔サイズ、The Separations Group, H
esperia, CA より入手）、（２）調節孔ガラス（３３０
Å孔、ＰＧ３５０−２００、Sigma Chemical Co.）、
（３）調節孔ガラス（７９Å孔、ＰＧ７５−２００）ま
たは（４）非晶質ヒュームドシリカ（非多孔質CAB-O-SI
L, Grade M5 、２μ凝集塊、Cabot Corp. ）を含有する
１．５mlプラスチック微量遠心容器に、約３００μl の
新鮮ヒト血清を添加した。シリカを含まない第５の容器
を対照として用いた。容器の内容物を表２にまとめて示
す。
Å、平均３００Å孔サイズ、The Separations Group, H
esperia, CA より入手）、（２）調節孔ガラス（３３０
Å孔、ＰＧ３５０−２００、Sigma Chemical Co.）、
（３）調節孔ガラス（７９Å孔、ＰＧ７５−２００）ま
たは（４）非晶質ヒュームドシリカ（非多孔質CAB-O-SI
L, Grade M5 、２μ凝集塊、Cabot Corp. ）を含有する
１．５mlプラスチック微量遠心容器に、約３００μl の
新鮮ヒト血清を添加した。シリカを含まない第５の容器
を対照として用いた。容器の内容物を表２にまとめて示
す。
【００４１】
【表２】
【００４２】各チューブにキャップをし、手短にボルテ
ックスして、大きいシリンダー状チューブの中に置き、
同時に回転ヘマトロジーミキサー（Fisher Scientific
）上に１５分間置いた。容器を、次いで１４，０００
×ｇで８分間遠心した。約２２５μl の透明な上清液
を、各容器から新しい容器に移し、キャップをしてボル
テックスした。遊泳物試料およびもとのヒト血清を、ア
ガロースゲル（Beckman Lipogel ）電気泳動（Beckman
Paragon System）、脂質染色および光学密度測定（Beck
man Appraise）により分析した。
ックスして、大きいシリンダー状チューブの中に置き、
同時に回転ヘマトロジーミキサー（Fisher Scientific
）上に１５分間置いた。容器を、次いで１４，０００
×ｇで８分間遠心した。約２２５μl の透明な上清液
を、各容器から新しい容器に移し、キャップをしてボル
テックスした。遊泳物試料およびもとのヒト血清を、ア
ガロースゲル（Beckman Lipogel ）電気泳動（Beckman
Paragon System）、脂質染色および光学密度測定（Beck
man Appraise）により分析した。
【００４３】処理血清の結果と非処理血清との比較は、
微孔性シリカ（Vydac)および３３０Å調節孔ガラスによ
り、ＬＤＬまたはＶＬＤＬの除去に対して優先的にＨＤ
Ｌが除去されることを示した。ヒュームドシリカまたは
ＰＧ７５−２００調節孔ガラスによるＨＤＬに対する有
用な選択性は観察されなかった。この実験においては、
吸光度単位は、各電気泳動ゲルのレーンのスキャンの各
々０．１mmについてBeckman Appraiseデンシトメーター
を用いて得られた。６００nmでの吸光度は、Appraise吸
光度の生データを２，２００で割り算することによっ
て、Hewlett Packard 8452A 分光光度計のそれに対して
標準化した。この係数は、各機器での青い透明フィルム
標準に対する応答の比較によって導き出した。吸光度値
を、式：１００％×〔吸光度×実験リポタンパク質バン
ドの幅（mm）〕／〔吸光度×対照リポタンパク質バンド
の幅（mm）〕によって、リポタンパク質の回収率％に変
換した。対照血清は、ヒト血清：水の２：１希釈したも
のであった。この実験の結果を、吸光度およびリポタン
パク質の回収率％の両方について表３および表４に示
す。
微孔性シリカ（Vydac)および３３０Å調節孔ガラスによ
り、ＬＤＬまたはＶＬＤＬの除去に対して優先的にＨＤ
Ｌが除去されることを示した。ヒュームドシリカまたは
ＰＧ７５−２００調節孔ガラスによるＨＤＬに対する有
用な選択性は観察されなかった。この実験においては、
吸光度単位は、各電気泳動ゲルのレーンのスキャンの各
々０．１mmについてBeckman Appraiseデンシトメーター
を用いて得られた。６００nmでの吸光度は、Appraise吸
光度の生データを２，２００で割り算することによっ
て、Hewlett Packard 8452A 分光光度計のそれに対して
標準化した。この係数は、各機器での青い透明フィルム
標準に対する応答の比較によって導き出した。吸光度値
を、式：１００％×〔吸光度×実験リポタンパク質バン
ドの幅（mm）〕／〔吸光度×対照リポタンパク質バンド
の幅（mm）〕によって、リポタンパク質の回収率％に変
換した。対照血清は、ヒト血清：水の２：１希釈したも
のであった。この実験の結果を、吸光度およびリポタン
パク質の回収率％の両方について表３および表４に示
す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
【００４６】１１１mg/ml で用いた調節孔ガラスについ
ては、算出されたＨＤＬおよびＬＤＬの回収率は、８０
Å孔物質ではそれぞれ１０９％および１１０％であり、
３００Å孔物質ではそれぞれ７％および１００％であっ
た。微孔性シリカVYDAC 101TP は、１１１mg/ml で用い
た場合、ＨＤＬ／ＬＤＬが１２％／１１２％で回収され
た。ヒュームドシリカを用いた以前の実験は、１１１mg
/ml シリカによるリポタンパク質の除去は、処理血清の
電気泳動により選択性に関する何の情報も得られない
程、完全であることを示唆した。したがって、より適切
な量のCab-O-Silを用いた。５５mg/ml で、ＨＤＬ／Ｌ
ＤＬの回収率％はそれぞれ３％／４％であった。より低
いレベル（１１mg Cab-O-Sil/ml 血清）では、ＨＤＬ／
ＬＤＬ回収率％はそれぞれ５９％／６５％であった。し
たがって、ヒュームドシリカは血清からＨＤＬを除去す
るが、ＬＤＬよりもＨＤＬに対する吸着の有用な優先性
を示さないことがわかる。もとの試料中のキロミクロン
リポタンパク質の量は、少な過ぎて信頼性のある回収率
％の数字を算出することは不可能であった。
ては、算出されたＨＤＬおよびＬＤＬの回収率は、８０
Å孔物質ではそれぞれ１０９％および１１０％であり、
３００Å孔物質ではそれぞれ７％および１００％であっ
た。微孔性シリカVYDAC 101TP は、１１１mg/ml で用い
た場合、ＨＤＬ／ＬＤＬが１２％／１１２％で回収され
た。ヒュームドシリカを用いた以前の実験は、１１１mg
/ml シリカによるリポタンパク質の除去は、処理血清の
電気泳動により選択性に関する何の情報も得られない
程、完全であることを示唆した。したがって、より適切
な量のCab-O-Silを用いた。５５mg/ml で、ＨＤＬ／Ｌ
ＤＬの回収率％はそれぞれ３％／４％であった。より低
いレベル（１１mg Cab-O-Sil/ml 血清）では、ＨＤＬ／
ＬＤＬ回収率％はそれぞれ５９％／６５％であった。し
たがって、ヒュームドシリカは血清からＨＤＬを除去す
るが、ＬＤＬよりもＨＤＬに対する吸着の有用な優先性
を示さないことがわかる。もとの試料中のキロミクロン
リポタンパク質の量は、少な過ぎて信頼性のある回収率
％の数字を算出することは不可能であった。
【００４７】例５絶食ｖｓ非絶食直接ＬＤＬコレステロールおよびキロミ
クロン ５人の被験者から２回、すなわち絶食状態で１回と、そ
の後に同日の食事後１．５時間（食後）に、新鮮血清を
採取した。被験者のうち４人は、試薬処理後にキロミク
ロンに関する回収率％を算出することが可能な充分な量
の食後キロミクロンを生成した。キロミクロンの量は、
本発明の方法によりバックグラウンドレベルまで減少し
た。直接ＬＤＬコレステロールの測定値は、食後状態に
よりわずかに影響を受けたに過ぎず、以下の実験の項に
より説明するように、３mg/dl ＋絶食値の２％の範囲内
であった。
クロン ５人の被験者から２回、すなわち絶食状態で１回と、そ
の後に同日の食事後１．５時間（食後）に、新鮮血清を
採取した。被験者のうち４人は、試薬処理後にキロミク
ロンに関する回収率％を算出することが可能な充分な量
の食後キロミクロンを生成した。キロミクロンの量は、
本発明の方法によりバックグラウンドレベルまで減少し
た。直接ＬＤＬコレステロールの測定値は、食後状態に
よりわずかに影響を受けたに過ぎず、以下の実験の項に
より説明するように、３mg/dl ＋絶食値の２％の範囲内
であった。
【００４８】Vydac 101TP ４μシリカ２０mgと、３０
０mMＭｎＣｌ2 および２６．７U/ml（０．１５mg/ml ）
ブタヘパリンの溶液１００μl とのスラリーを含有する
プラスチック遠心容器に、血清２００μl を添加した
（１１１mgシリカ/ml 血清）。容器を、１５分間の間に
５回ボルテックスして混合し、次いで１４，０００×ｇ
で１０分間遠心分離した。遊泳物の一部分を、Beckman
Paragon Systemでのアガロースゲル電気泳動（Beckman
Lipogel ）とその後のデンシトメトリー（Beckman Appr
aise）によって、もとの血清の２：１の血清：水希釈物
と比較した。遊泳物を、the Northwest Lipid Research
Center によるフリーデワルドＬＤＬコレステロールに
ついて評価した。結果を、表５に示す。
０mMＭｎＣｌ2 および２６．７U/ml（０．１５mg/ml ）
ブタヘパリンの溶液１００μl とのスラリーを含有する
プラスチック遠心容器に、血清２００μl を添加した
（１１１mgシリカ/ml 血清）。容器を、１５分間の間に
５回ボルテックスして混合し、次いで１４，０００×ｇ
で１０分間遠心分離した。遊泳物の一部分を、Beckman
Paragon Systemでのアガロースゲル電気泳動（Beckman
Lipogel ）とその後のデンシトメトリー（Beckman Appr
aise）によって、もとの血清の２：１の血清：水希釈物
と比較した。遊泳物を、the Northwest Lipid Research
Center によるフリーデワルドＬＤＬコレステロールに
ついて評価した。結果を、表５に示す。
【００４９】
【表５】
【００５０】食後・直接ＬＤＬコレステロールと、絶食
・直接ＬＤＬコレステロールとの相関は、傾き＝１．０
２および切片＝−３．１７mgコレステロール/dl 血清で
あった。
・直接ＬＤＬコレステロールとの相関は、傾き＝１．０
２および切片＝−３．１７mgコレステロール/dl 血清で
あった。
【００５１】被験者血清の電気泳動プロフィールを、本
発明の試薬による処理をしたものとしないものとで比較
した。有為な食後キロミクロンが存在した血清は、ＬＤ
Ｌ分離試薬で処理するとバックグラウンドレベルまでの
キロミクロンの減少を示した。血清「Ａ」は、最低レベ
ルのキロミクロンを含有し、また、ＬＤＬとＶＬＤＬの
間に有為な解像されない中間ピークを有したので、表６
から削除した。
発明の試薬による処理をしたものとしないものとで比較
した。有為な食後キロミクロンが存在した血清は、ＬＤ
Ｌ分離試薬で処理するとバックグラウンドレベルまでの
キロミクロンの減少を示した。血清「Ａ」は、最低レベ
ルのキロミクロンを含有し、また、ＬＤＬとＶＬＤＬの
間に有為な解像されない中間ピークを有したので、表６
から削除した。
【００５２】
【表６】
【００５３】血清「Ｆ」、「Ｇ」、「Ｉ」および「Ｓ」
についての光学密度測定によるキロミクロンの回収率％
は、以下のとおりである：それぞれ１２％、２７％、２
０％および２１％。この回収率％の一部には、非特異的
バックグラウンド光学密度が含まれている。
についての光学密度測定によるキロミクロンの回収率％
は、以下のとおりである：それぞれ１２％、２７％、２
０％および２１％。この回収率％の一部には、非特異的
バックグラウンド光学密度が含まれている。
【００５４】これらのデータから、本発明で用いられる
とおりの多孔質シリカは、ＨＤＬに対して高度に選択的
であり、したがって、低密度および超低密度リポタンパ
ク質を含有する血清からのＨＤＬの分離のための系にお
いて、非常に有用であると直ちに決定することができ
る。
とおりの多孔質シリカは、ＨＤＬに対して高度に選択的
であり、したがって、低密度および超低密度リポタンパ
ク質を含有する血清からのＨＤＬの分離のための系にお
いて、非常に有用であると直ちに決定することができ
る。
【００５５】本発明における使用のために好適な多孔質
シリカとしては、ＨＤＬの選択的吸着の効率が高いもの
から順に、以下のものが挙げられる： １）Vydac 101TP - Separations Group, Hesperia, CA ２）Crossfield Sorbsil C500 40/60 ３）Regis Chemical Co. 023001; 300Å/3μシリカ ４）E.M. Merck Lichosphere Si 300; 300Å孔シリカ ５）E.M. Merck Fractosil 500; 420-490 Å孔シリカ ６）E.M. Merck Fractosil 200; 200 Å孔シリカ ７）E.M. Merck Fractosil 1000; 1000 Å孔シリカ ８）E.M. Merck Licrosorb Si 100; 100Å孔シリカ ９）Whatman Partisil 5; 5 μ/66 - 88Å孔シリカ １０）Regis Chemical Co. 024000; 100Å孔シリカ
シリカとしては、ＨＤＬの選択的吸着の効率が高いもの
から順に、以下のものが挙げられる： １）Vydac 101TP - Separations Group, Hesperia, CA ２）Crossfield Sorbsil C500 40/60 ３）Regis Chemical Co. 023001; 300Å/3μシリカ ４）E.M. Merck Lichosphere Si 300; 300Å孔シリカ ５）E.M. Merck Fractosil 500; 420-490 Å孔シリカ ６）E.M. Merck Fractosil 200; 200 Å孔シリカ ７）E.M. Merck Fractosil 1000; 1000 Å孔シリカ ８）E.M. Merck Licrosorb Si 100; 100Å孔シリカ ９）Whatman Partisil 5; 5 μ/66 - 88Å孔シリカ １０）Regis Chemical Co. 024000; 100Å孔シリカ
【図１】ＶＹＤＡＣ１０１ＴＰシリカを種々の量で用い
た場合の選択的リポタンパク質回収を表わす図である。
た場合の選択的リポタンパク質回収を表わす図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート・シー・ペイン アメリカ合衆国、インデイアナ州、46614、 サウス・ベンド、アイリッシュ・ヒルズ・ ドライブ 4241−２エー (72)発明者 ジェームズ・エー・プロフィット アメリカ合衆国、インデイアナ州、46526、 ゴーシェン、バークレー・プレイス 1805
Claims (17)
- 【請求項１】 血液試料から高密度リポタンパク質（Ｈ
ＤＬ）を分離する方法であって、該試料を、吸着剤粒子
として細分された多孔質シリカまたはシリケートと接触
させて珪質物質ゲル／ＨＤＬ複合体を形成させ、該複合
体を、固体／液体分離技術によって血液試料から分離
し、それにより実質的にＨＤＬを含まない血液試料を提
供することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 吸着剤粒子が、その最も長い寸法におい
て約１μ〜１，０００μの粒子サイズを有し、約８０Å
〜１，０００Åのサイズの表面孔を有する、請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 吸着剤粒子が、その最も長い寸法におい
て２μ〜５００μであり、その孔のサイズが、３００Å
〜５００Åである、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 吸着剤物質が、微孔性シリカ、シリカゲ
ルまたは調節孔ガラスである請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 血液試料を、超低密度リポタンパク質
（ＶＬＤＬ）およびキロミクロンに対して親和性を有す
る第２の試薬系でさらに処理し、それによりこれらの物
質を血液試料から除去して、ＨＤＬ、ＶＬＤＬおよびキ
ロミクロンによる干渉なしに低密度リポタンパク質また
は低密度リポタンパク質コレステロールに関して分析し
得る血液を提供する請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 第２の試薬系が、多価陰イオンおよび二
価陽イオンを含む請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 多価陰イオンがヘパリンであり、陽イオ
ンがＭｎ++である請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 多価陰イオンが硫酸デキストランであ
り、陽イオンがＭｇ++である請求項６記載の方法。 - 【請求項９】 血液試料中のＬＤＬコレステロール濃度
を測定する工程が加えられている、請求項１〜８のいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 血液試料から超低密度リポタンパク
質、キロミクロンおよび高密度リポタンパク質を分離
し、かつ低密度リポタンパク質をその中に懸濁された状
態で残す方法であって、以下の工程： ａ） 高密度リポタンパク質の吸着剤としての多孔質シ
リカまたはシリケート粒子と血液試料中の高密度リポタ
ンパク質との間で形成される複合体を保持するサイズの
孔のあるフィルターにより閉めることができる少なくと
も一つの開口を上面に有し、圧縮可能な容器を用意し； ｂ） 血液試料を、該圧縮可能な容器中でシリカゲル粒
子と一緒にし、それによりシリカゲル／高密度リポタン
パク質複合体を形成させ； ｃ） 該圧縮可能な容器を圧縮し、複合体を形成してい
ない低密度リポタンパク質を含有する血液にフィルター
を通過させて、それにより複合体を形成していない低密
度リポタンパク質を含む血液を複合体を形成した高密度
リポタンパク質から分離するを含むことを特徴とする方
法。 - 【請求項１１】 粒子状吸着剤物質が、その最も長い寸
法において１〜１，０００μの粒子サイズを有し、約８
０〜１，０００Åのサイズの表面孔を有する請求項１０
記載の方法。 - 【請求項１２】 吸着剤粒子が、その最も長い寸法にお
いて２〜５００μであり、その孔のサイズが、３００〜
５００Åである請求項１０記載の方法。 - 【請求項１３】 吸着剤物質が、微孔性シリカ、シリカ
ゲルまたは調節孔ガラスである請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 圧縮可能な容器に、超低密度リポタン
パク質およびキロミクロンに対して親和性を有する第２
の試薬系も添加されており、それによりこれらの物質を
血液試料から除去して、ＨＤＬ、ＶＬＤＬおよびキロミ
クロンによる干渉なしに低密度リポタンパク質に関して
分析し得る血液を提供する請求項１０記載の方法。 - 【請求項１５】 第２の試薬系が、多価陰イオンおよび
二価陽イオンを含む請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 多価陰イオンがヘパリンであり、陽イ
オンがＭｎ++である請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 多価陰イオンが硫酸デキストランであ
り、陽イオンがＭｇ++である請求項１５記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US990592 | 1992-12-14 | ||
| US07/990,592 US5290703A (en) | 1992-12-14 | 1992-12-14 | Method for the separation of high density lipoprotein from blood samples |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06213901A true JPH06213901A (ja) | 1994-08-05 |
Family
ID=25536307
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5311543A Pending JPH06213901A (ja) | 1992-12-14 | 1993-12-13 | 血液試料からの高密度リポタンパク質分離法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5290703A (ja) |
| EP (1) | EP0602455B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06213901A (ja) |
| AT (1) | ATE179801T1 (ja) |
| AU (1) | AU667984B2 (ja) |
| CA (1) | CA2111350C (ja) |
| DE (1) | DE69324777T2 (ja) |
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2002214234A (ja) * | 2001-11-05 | 2002-07-31 | Vessel Research Laboratory:Kk | 循環器系疾患の診断方法 |
| JP4646475B2 (ja) * | 1999-11-22 | 2011-03-09 | パナソニック株式会社 | コレステロールセンサおよびコレステロールの定量方法 |
| EP2474620A1 (en) | 2011-01-11 | 2012-07-11 | Fujifilm Corporation | Method for removing high density lipoprotein in blood |
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| US5409840A (en) * | 1993-10-12 | 1995-04-25 | Miles Inc. | Purification and recovery of lipoprotein cholesterol |
| WO1996010177A1 (en) * | 1994-09-28 | 1996-04-04 | Spectral Diagnostics Inc. | Method and device for determination of proteins |
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| CN111718404A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-09-29 | 光景生物科技(苏州)有限公司 | 一种分离血清中高密度脂蛋白的装置、其制备方法及分离血清中高密度脂蛋白的方法 |
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| CA1221307A (en) * | 1982-12-02 | 1987-05-05 | Nobutaka Tani | Adsorbent and process for preparing the same |
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1992
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1993
- 1993-12-01 AT AT93119355T patent/ATE179801T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-12-01 EP EP93119355A patent/EP0602455B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-01 DE DE69324777T patent/DE69324777T2/de not_active Expired - Fee Related
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