JPS6345400B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な胎盤特異的な蛋白質（PP₁₀）
および胎盤からの単離に関する。 従つて、本発明の目的は、 (a) 蛋白部分 93±３％ 炭水化物含量 6.65±1.55％ （その中ヘキソース4.8±1.0％、ヘキソース
アミン1.2±0.3％、フコース0.05±0.05％、シ
アル酸0.6±0.2％） (b) 沈降係数 SΓ_20/w′ 3.8±0.2S (c) 超遠心分離で測定した分子量 48000±5000 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
クリルアミドゲル中で測定した分子量
65000±5000 (e) 吸光率 Ｅ１％ １cm（280nm） 10.9±0.5 (f) 電気泳動運動性 α₁―グロブリンの範囲内 (g) 等電点 5.1±0.3 を特性として有する胎盤特異的な蛋白PP₁₀を得
ることにある。 以下にこの新規な組織蛋白の特性を更に詳しく
説明する。 沈降係数の測定は280nmでUV走査板技法を用
いるダブルセクターセル中60000rpmでベツクマ
ン分析用超遠心器（Spinco装置型式Ｅ）中で行
われる。溶媒はNaCl0.2モル／を含有している
0.05Mりん酸塩緩衝液（PH6.8）である。蛋白濃
度は約3OD（OD＝光学濃度）に調整される。沈
降係数は温度20℃の水に基づいて計算される。 超遠心分離器中で分子量を測定するには沈降平
衡法が用いられる。蛋白質の濃度はこの目的のた
めに約1.0ODに調整される。測定は9000rpmで行
われる。表示は光電子走査装置を用い280nmで
UV光学レンズを用いて行われる。 SDS―PAAゲル中での分子量測定には0.1％の
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有している
7.5％のポリアクリルアミド（PAA）のゲルが用
いられる。比較物質として、人間の胎盤ラクトゲ
ン（HPL）および人間のアルブミンならびにそ
れらの集合物が使用される。 吸光率を測定するためには、物質を蒸留水中に
0.10％まで溶解させる。 電気泳動易動度の測定はベツクマン・インスト
ルメンツ社製「ミクロゾーン（Microzone）」
R200装置を用いるマイクロモデイフイケーシヨ
ン試験によりセルロースアセテートホイル
（Sartorius社製）およびナトリウムジエチルバル
ビツレート緩衝液（PH8.6）上で行われる。 等電点の測定はLKB社製のカラム（440m）上
で行われる。調査に用いられるいわゆるアンフオ
リン（Ampholine）混合物はPH範囲4.0〜6.0を有
する。 炭水化物の測定はH.E.Schultze、R.Schmidt―
bergerおよびH.Haupt氏等の「Biochem.Z.」第
329巻第490頁（1958）記載の方法により行われ
る。 アミノ酸は分析はS.Moore、D.H.Spackmann
およびW.H.Stein氏等の「Anal.Chem.」第30巻
第1185頁（1958）記載の方法によりベツクマン社
製の液体クロマトグラフ装置である「マルチクロ
ム（Multichrom）Ｂ」を用いて行われる。1/2
シスチンは、蛋白質を過蟻酸を用いて酸化
〔「Anal.Chem.」第30巻第1185頁（1958）参照〕
し次いでクロマトグラフ処理〔「J.Biol.Chem.」
第238巻第235頁（1963）参照〕してのちシステイ
ン酸として測定する。トリプトフアン含量はH.
Edelhoch氏による「Biochemistry」第６巻第
1948頁（1967）記載の直接測光試験により測定さ
れる。 実施例により得られるPP₁₀のアミノ酸分析の
結果を表に掲げる。

【表】

【表】 以下のようなPP₁₀の諸性質が見出され、これ
らは新規な組織蛋白の単離に使用され得る。 １ PP₁₀はPH7.0で飽和度30〜60％の硫酸アンモ
ニウムを用いると水溶液から沈殿される。 ２ PP₁₀は水溶性アクリジン塩基例えば２―エ
トキシ―６，９―ジアミノアクリジンラクテー
ト〔リバノール（Rivanol）（登録商標）〕を用
いるとPH７〜９で0.4〜0.8（ｗ／ｖ）％で沈殿
される。しかしながらリバノール濃度が0.4％
である場合はPH6.0で全然かもしくはほとんど
沈殿されない。 ３ エタノールで沈殿させた場合、PP₁₀はアル
コール濃度25％までのPH7.0の生理食塩水溶液
中で上澄み液中に残留する。 ４ 製造用（プレパラテイブ）電気泳動において
は、PP₁₀はα₁―グロブリンの範囲内で移動す
る。 ５ ゲル過〔セフアデツクス（Sephadex）（登
録商標）〕において、PP₁₀は分子量30000〜
90000を有する蛋白質の範囲内に生じる。 ６ PP₁₀は低伝導度（約０〜2mS）で中性もし
くは弱アルカリ性PH（約７〜９）で例えば
DEAE―セルロースあるいはDEAE―セフアデ
ツクスのような弱塩基性イオン交換体に吸着さ
れうる。 ７ PP₁₀はその水溶液から免疫吸着により濃縮
且つ単離されうる。 本発明はさらに、上述の性質を利用して胎盤の
水性抽出物、およびまたこの蛋白質を含有してい
るその他の水溶液を分別することからなるPP₁₀
単離方法に関する。硫酸アンモニウムと並んで、
生化学に普通に使用される中性塩がPP₁₀の沈殿
に使用されうることは明白である。アクリジン塩
基に加え、蛋白の分別に使用されるキノリン塩基
の水溶性誘導体も同様に使用されてよい。 その電気泳動挙動および本発明により見出され
た分子量に相当して、α₁―グロブリンを他の血漿
蛋白あるいは組織蛋白から分離しうるその他の蛋
白単離方法も使用されてよい。分子量の見地か
ら、ゲル過、ゲルクロマトグラフイーあるいは
限外過の種々の方法が使用されてよい。弱塩基
性イオン交換体上に結合されることができ、そし
てそこから溶離されることもPP₁₀の性質として
証明された。 本発明の物質の単離は、一方ではPP₁₀の濃縮
（富化）を招来し、他方ではこの蛋白を他の組織
蛋白あるいは血漿蛋白から分離させる上記処置の
選択された組み合せにより行われうる。従つて、
本発明の目的はPP₁₀を濃縮するための個個の段
階を提供すると共にPP₁₀精製のための種種の工
程の組み合せを有する方法を提供することにあ
る。 PP₁₀の濃縮法は前記１〜７の処理置の少くと
も一つあるいはそれらの化学的あるいは生化学的
に等価の操作の少くとも一つを使用することを特
徴とする。 PP₁₀は抗原性を有している。もし動物をこの
蛋白で免疫賦与すると、特異的な抗体が形成され
る。免疫学的方法によるPP₁₀の検出および測定
は一方では妊娠の制御に、他方では特に栄養胚葉
性腫瘍のみならず非栄養胚葉性腫瘍の発見、およ
び疾患の経路制御およびかかる疾患の治療の制御
に対して診断上重要である。 以下の実施例により本発明を説明する。 実施例Ａ 胎盤の抽出およびその抽出液のリバノ
ールおよび硫酸アンモニウムによる分別 冷凍した人間の胎盤1000Kgを切断ミキサー中で
粉砕しそして0.4％（ｗ／ｖ）NaCl溶液1000を
用いて抽出する。組織残留物を遠心分離により分
離したのち、抽出液を20％（ｗ／ｗ）酢酸を用い
てPH6.0に調整し、そして２―エトキシ―６，９
―ジアミノアクリジン―ラクテート〔リバノール
（登録商標）〕の３％（ｗ／ｖ）溶液200と撹拌
しつつ合する。形成される沈殿を遠心分離して除
去し且つ捨てる。上澄み液をベントナイト
（Bentonite）Ａ（Erbsloh ＆ Co.製）１％
（ｗ／ｖ）と合し、2N NaOHを添加することに
よりPHを7.0に調整しそして過する。液を硫
酸アンモニウム30％（ｗ／ｖ）と撹拌しつつ徐々
に合すると、胎盤蛋白PP₁₀が他の蛋白と共に沈
殿する。沈殿を過すると約12Kgの湿つたペース
トが得られ、これは以下にフラクシヨンＡと呼
ぶ。平均してこのペースト500ｇは約250mgの
PP₁₀を含有している。 実施例Ｂ セフアデツクス―150でのゲル過 フラクシヨンA500ｇを水400ml中に溶解し、そ
して1.0モル／のNaClおよび0.1％のNaN₃を含
有している0.1M Tris―HCl緩衝液（PH8.0）（緩
衝溶液）に対して透析する。蛋白含有溶液をセ
フアデツクスＧ―150を充填したカラム（20×100
cm）に適用しそしてゲル過に付する。溶離には
緩衝溶液を使用する。溶離液を特異的な抗
PP₁₀ウサギ血清を用いてアウチターロニー
（Ouchterlony）によるゲル拡散試験により試験
する。胎盤特異的な蛋白質PP₁₀を含有している
すべてのフラクシヨンを集め、そしてPM―10膜
を用いて限外過器〔アミコン（Amicon）
UF2000〕上で約300mlまで濃縮する。この溶液
（フラクシヨンＢ）は合計で約100mgのPP₁₀を含
有していた。 実施例Ｃ 免疫吸着によるPP₁₀の濃縮 １ 免疫吸着剤の調製 ウサギの抗PP₁₀血清470mlを0.02Mりん酸塩緩
衝液（PH7.0）に対して透析し、そして免疫グロ
ブリンを分離するためにDEAE―セルロース上で
クロマトグラフ処理する。次に免疫グロブリンフ
ラクシヨン（蛋白3.23ｇ）をシアノーゲンブロマ
イド40.5ｇで活性化され従つて担体に共有結合さ
れている球形の特別に精製されたアガロース〔セ
フアロース（Sepharose）4B、（登録商標）〕323
ｇと反応させる。 この方法はR.Axen、J.PorathおよびA.
Ernbach氏等により「Nature」第214巻第1302頁
（1967）に記載されている。 この方法で調製された免疫吸着剤を用いると、
胎盤蛋白PP₁₀は、その溶液特にPP₁₀を富化され
た胎盤抽出液フラクシヨンから単離されうる。 ２ 免疫吸着の実施 免疫吸着剤を緩衝溶液〔1.0モル／のNaCl
および0.1％のNaN₃を含有するPH8.0の0.1MTris
HCl緩衝液〕中に懸濁し、そして次いでクロマト
グラフイーカラム（5.5×20cm）中に導入しそし
て緩衝溶液で洗う。次いで、PP₁₀含有溶液
（フラクシヨンＢ）60mlをゆつくりカラム中を移
動させるとそれによりPP₁₀が免疫吸着的に結合
される。カラムを充分に緩衝液で洗い、そして
吸着された蛋白質を3Mチオシアン酸カリウム溶
液約600mlを用いて溶離する。PP₁₀含有溶離液を
緩衝溶液で透析し、そして限外過器で約15ml
まで濃縮する。１回吸着当りの収量はPP₁₀は６
〜７mgである。 PP₁₀溶離の直後に、カラム中の吸着剤を緩衝
溶液で中和しそして充分に洗う。次いでこれは
再びPP₁₀の吸着固定に使用されうる。 実施例Ｄ PP₁₀の高度の精製 免疫吸着により単離された蛋白はしばしば非特
異的に結合した血清蛋白および他の胎盤組織蛋白
により汚染されている。附随血清蛋白の主要量の
分離は例えばセフアデツクスＧ―150上のゲル
過によりあるいはDEAE―セルロース上の不純物
クロマトグラフイーにより行われうる。次いで他
の残留不純物は逆のあるいは負の免疫吸着、すな
わち依然として汚染物として存在している蛋白に
対する担体結合した抗体を用いることにより除去
される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記特性すなわち (a) 蛋白部分 93±３％ 炭水化物含量 6.65±1.55％ （ただしその中ヘキソース4.8±1.0％、ヘキ
   ソースアミン1.2±0.3％、フコース0.05±0.05
   ％、シアル酸0.6±0.2％） (b) 沈降係数 SΓ_20/w′ 3.8±0.2S (c) 超遠心分離器で測定した分子量48000±5000 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
   クリルアミドゲル中で測定した分子量
   65000±5000 (e) 吸光率 Ｅ１％ １cm（280nm） 10.9±0.5 (f) 電気泳動運動性 α₁―グロブリンの範囲内 (g) 等電点 5.1±0.3 を有することを特徴とする組織蛋白PP₁₀。 ２ 胎盤抽出物あるいは後記組織蛋白PP₁₀を含
   有している溶液を下記の処置すなわち (1) PH５〜８の範囲において30〜60％飽和におけ
   る硫酸アンモニウムを用いる沈澱、 (2) 弱酸性PH値において0.4w／ｖ％の濃度の水
   溶性アクリジン塩基を用いる付随蛋白の沈澱
   （この場合後記組織蛋白PP₁₀は上澄み液中に残
   る）、 (3) 濃度25％でPH7.0でエタノールを使用する付
   随蛋白の沈澱（この場合後記組織蛋白PP₁₀は
   上澄み液中に残る）、 (4) 調製用ゾーン電気泳動およびα₁―グロブリン
   フラクシヨンの単離、 (5) 30000〜90000の範囲の分子量を有する蛋白質
   を単離するためのゲル過、 (6) 弱塩基性イオン交換体への吸着および組織蛋
   白の溶離 の少なくとも１つに付し、そして後記組織蛋白
   PP₁₀が濃縮（富化）されたフラクシヨンを単離
   することからなる、下記特性を有する組織蛋白
   PP₁₀の製造方法。 (a) 蛋白部分 93±３％ 炭水化物含量 6.65±1.55％ （ただしその中ヘキソース4.8±1.0％、ヘキ
   ソースアミン1.2±0.3％、フコース0.05±0.05
   ％、シアル酸0.6±0.2％） (b) 沈降係数 SΓ_20/w′ 3.8±0.2S (c) 超遠心分離器で測定した分子量48000±5000 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
   クリルアミドゲル中で測定した分子量
   65000±5000 (e) 吸光率 E¹%₁cm（280nm） 10.9±0.5 (f) 電気泳動運動性 α₁―グロブリンの範囲内 (g) 等電点 5.1±0.3。