JPH08107783A - ソルビトールキナーゼを生産する実質上純粋な微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ソルビトールキナーゼのアミノ酸配列を実質
的にコードする塩基配列を有する組換えプラスミドによ
って形質転換されたソルビトールキナーゼを生産する実
質上純粋な微生物、そのアミノ酸配列を実質的にコード
する塩基配列を有するＤＮＡ、当該微生物を用いるソル
ビトールキナーゼの製造方法およびソルビトールキナー
ゼのアミノ酸配列を実質的にコードするポリペプチド。 【効果】 ソルビトールに対する基質特異性が高く、リ
ン酸供与体として主にＡＴＰを利用する微生物起源のソ
ルビトールキナーゼの遺伝子組換え技術を用いた高生産
法および該酵素を提供できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はリン酸供与体としてＡＴ
Ｐを利用し、ホスホエノールピルビン酸を実質的に利用
しないソルビトールキナーゼを生産する実質上純粋な微
生物、ソルビトールキナーゼを発現する実質上純粋なＤ
ＮＡ及びソルビトールキナーゼの製造法、そのポリペプ
チドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ソルビトールは、ポリオールのうちの代
表的なものであり、生体内ではグルコースからアルドー
ス還元酵素により生成される。糖尿病において、高血糖
状態が続き、細胞内におけるソルビトール産生が亢進す
ると、ソルビトールは微量しか細胞膜外へ拡散しないた
めに、細胞内に過剰蓄積し、蓄積されたソルビトールに
より種々の障害をきたすことが明らかとなってきた。従
ってソルビトールを正確に定量することは糖尿病を把握
する上で重要である。

【０００３】ソルビトールは特に水晶体、神経、赤血球
などに存在していることから、各臓器におけるソルビト
ールの測定が試みられているが、たとえば赤血球中のソ
ルビトールの濃度は全血に換算した場合、糖尿病患者に
おいてさえ１０μＭ〜５０μＭ程度と低濃度であること
が知られている（Ｊ．Ｍａｌｏｎｅら：Ｒｅｄ ｃｅｌ
ｌ ｓｏｒｂｉｔｏｌ：Ａｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏ
ｆ ｄｉａｂｅｔｉｃｃｏｎｔｒｏｌ．Ｄｉａｂｅｔｅ
ｓ：８６１−８６４，１９８０）。

【０００４】またさらには細胞由来の多量、多種の酵
素、基質が抽出時に漏出することは明かである。ソルビ
トールに作用する酵素を検索したところ、ソルビトール
キナーゼとしてカイコの卵（Ｔ．Ｙａｇｉｎｕｍａ，
Ｏ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐｈｙｓｉａｌ．９８Ｂ（１），１３５−１４１，１９
９１）、牛及び人眼球レンズ（Ｓ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖ
ａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，７１
７（２），２１０−２１４，１９８２）の２種がそのリ
ン酸供与体として主にＡＴＰを利用することが述べられ
ている。しかし２種共にそこからソルビトールキナーゼ
を抽出し実用化することは不可能であった。

【０００５】微生物由来のソルビトールキナーゼとして
は、Ａｅｒｏｂａｃｔｏｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（Ｎ．
Ｅ．Ｋｅｌｋｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６０−１６４，１９７１）のも
のが知られているが、リン酸供与体としてホスホエノー
ルピルビン酸を利用すると述べられている。さらに本発
明者らはソルビトールに対する基質特異性が高く、リン
酸供与体として主にＡＴＰを利用する微生物起源のソル
ビトールキナーゼを検索したところ、エルビニア・エス
ピー（Ｅｒｗｉｎａ ｓｐ．）ＳＫ−４７２−２０株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４４９２）にホスホエノールピルビ
ン酸をリン酸供与体として実質的に利用しない新規なソ
ルビトールキナーゼを見いだした。しかしながらエルビ
ニア・エスピーＳＫ−４７２−２０株が産生するソルビ
トールキナーゼ量が著しく低いため遺伝子組換え技術を
用いた高生産法の開発が待たれていた。

【０００６】エルビニア・エスピーＳＫ−４７２−２０
株が産生するソルビトールキナーゼが大量に取得できた
なら、例えばコマモナス・エスピー（Ｃｏｍａｍｏｎａ
ｓｓｐ．）ＳＹ−７７−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８１
０）のソルビトール−６−デヒドロゲナーゼと組み合わ
せることによりソルビトールの簡便な定量用の分析組成
物の提供が可能となる。

【０００７】そこで本発明者らは、エルビニア・エスピ
ー（Ｅｒｗｉｎａ ｓｐ．）ＳＫ−４７２−２０株のソ
ルビトールキナーゼ遺伝子を取得しようと試み、他のソ
ルビトールキナーゼのＤＮＡ塩基配列、アミノ酸配列の
情報検索を試みたが、いずれの情報も報告されていな
い。即ち、各生産生物によってソルビトールキナーゼが
どのようなアミノ酸配列であるかは全く推定できないも
のであった。

【０００８】このような状況下、反応性、安定性が共に
高く、ソルビトールの測定に有効であるエルビニア・エ
スピーＳＫ−４７２−２０株由来のソルビトールキナー
ゼにおいては生産性が低いことから、遺伝子工学等を用
い、効率よくこの酵素を生産する微生物の開発が望まれ
ていたが、本ソルビトールキナーゼを構成するポリペプ
チドの一次構造及び該酵素のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡの塩基配列については未だ発表されていない。

【０００９】従って、ソルビトールキナーゼを構成する
ポリペプチドの一次構造の決定、該酵素のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡの塩基配列の決定及び遺伝子工学に
よる該酵素の生産が望まれていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
実情のもとで、ソルビトールの定量に有用なソルビトー
ルキナーゼを効率よく生産する微生物を開発し、この微
生物を用いて該酵素を量産する方法および該酵素を提供
することを目的としてなされたものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために鋭意研究を重ねた結果、ソルビトールキ
ナーゼを生産する微生物由来の染色体ＤＮＡライブラリ
ーの中から、該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリー
ニングし、次いでこのＤＮＡを用いて発現ベクターを構
築したのち、例えばエッシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；以下Ｅ．ｃｏｌｉと略称する
ことがある）に属する微生物に導入して形質転換微生物
を作出し、これを培地中で培養することによって、該ソ
ルビトールキナーゼを効率よく量産することを見い出
し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

【００１２】すなわち、本発明は、リン酸供与体として
ＡＴＰを利用し、実質的にホスホエノールピルビン酸を
利用しない新規なソルビトールキナーゼを発現すること
を見出したものであり、配列表の配列番号１に記載のア
ミノ酸順位１から３１３のアミノ酸配列（図１）を実質
的にコードする塩基配列を有する組換えプラスミドによ
って形質転換されたソルビトールキナーゼを生産する実
質上純粋な微生物、配列表の配列番号１に記載のアミノ
酸順位１から３１３のアミノ酸配列を実質的にコードす
る塩基配列を有するＤＮＡ、配列表の配列番号１に記載
のアミノ酸順位１から３１３のアミノ酸配列を実質的に
コードする塩基配列を有する組換えプラスミドによって
形質転換された微生物であるソルビトールキナーゼを生
産する実質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその
培養物からソルビトールキナーゼを採取することを特徴
とするソルビトールキナーゼの製造方法および配列表の
配列番号１に記載のアミノ酸順位１から３１３のアミノ
酸配列を実質的にコードするポリペプチドである。

【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、ソルビトールキナーゼを生産する形質転換され
た微生物を作出するのに用いられるソルビトールキナー
ゼを発現する遺伝子ＤＮＡは、例えば該酵素を生産する
微生物由来の染色体ＤＮＡライブラリーの中から、スク
リーニングすることによって得ることができる。

【００１４】本発明においては、前記のソルビトールキ
ナーゼを生産する微生物として、エルビニア・エスピー
ＳＫ−４７２−２０株が好ましく用いられる。このエル
ビニア・エスピーＳＫ−４７２−２０株の染色体ＤＮＡ
ライブラリーから該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスク
リーニングする方法の具体例について説明すると、ま
ず、該微生物の染色体ＤＮＡ１００〜２０００μｇ程度
を通常用いられている方法によって抽出する。

【００１５】次に、ソルビトールキナーゼをコードする
遺伝子ＤＮＡを組み込んだプラスミドを構築する。この
ライブラリー作製ベクターとしては、宿主微生物で自律
的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組
換え用として構築されたものが適している。前者のファ
ージとしては、例えばＥ．ｃｏｌｉを宿主微生物とする
場合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが用いられ
る。また、プラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主微
生物とするに、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐ
ＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ブルー
スクリプトＳＫ＋、ブルースクリプトＫＳ＋、ブルース
クリプトＳＫ−、ブルースクリプトＫＳ−、ブルースク
リプトＳＫＩＩ＋、ブルースクリプトＫＳＩＩ＋、ブル
ースクリプトＳＫＩＩ−、ブルースクリプトＫＳＩＩ−
などが用いられる。さらに、バチルス属を宿主微生物と
する場合は、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫなどを用いれば
よく、サッカロミセス属を宿主微生物とする場合は、例
えばｐＹＡＣ５などを用いればよい。

【００１６】これらのベクターに、該ソルビトールキナ
ーゼ遺伝子ＤＮＡを組み込む方法については特に制限は
なく、従来慣用されている方法を用いることができる。
例えば先に抽出した該微生物の染色体ＤＮＡ１〜１０μ
ｇ程度を適当な制限酵素を用い、同様にライブラリー作
製ベクター１〜１０μｇ程度も適当な制限酵素を作用さ
せたのち、それぞれの接着末端をアニーリング後、適当
なＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、目的の宿主微生物
に形質転換させることによって、染色体ＤＮＡライブラ
リーが得られる。

【００１７】この際用いられる宿主微生物としては、
Ｅ．ｃｏｌｉがよく使用され、構築されたプラスミドを
Ｅ．ｃｏｌｉに属する微生物に導入する方法としては、
コンピテントセル法を用いてもよく、あるいはカルシウ
ムイオンの存在下に組換えＤＮＡの導入を行ってもよ
い。また宿主微生物への所望組換えＤＮＡ導入の有無の
選択については、組換えＤＮＡを構成するベクターの薬
剤耐性マーカーに基づく選択培地で、該宿主微生物を培
養し、生育する宿主微生物を選択すればよい。

【００１８】一方、ソルビトールキナーゼ精製標品のＮ
末端側アミノ酸配列、リシルエンドペプチダーゼ処理断
片アミノ酸配列を決定し、これに基づいて種々のオリゴ
ヌクレオチドを合成した後、例えばアイソトープで標識
して放射性オリゴヌクレオチドプローブを作製する。次
いで、これらの放射性オリゴヌクレオチドプローブを用
い、従来慣用されている方法に従って、前記の染色体Ｄ
ＮＡライブラリーの中から、ソルビトールキナーゼを発
現する遺伝子を持つ組換え体大腸菌をスクリーニングす
るわけであるが、この段階が本発明において非常に困難
な部分であり、ソルビトールキナーゼの部分的なアミノ
酸配列から種々のプローブを作製したが、ソルビトール
キナーゼ遺伝子を保持するクローンをなかなか見い出せ
なかった。具体的に述べるとプローブを設計する場合、
一般に推定されるＤＮＡ配列の組合せがなるべく少ない
配列を選択してプローブを合成するが、本発明のソルビ
トールキナーゼの場合、組合せの少ない配列が余り存在
せず、エルビニアの遺伝子のコドン使用頻度を参考にし
て数多い組合せの中から組合せを絞ったプローブを作製
したり、複数に推定される部分の塩基をイノシンにした
プローブを作製したり、またプローブの長さについても
種々検討し、さらにハイブリダイゼーション、及びその
後の洗浄の条件（溶液の組成、温度、時間）を種々検討
した結果、後の実施例で述べるが、本発明においてはＮ
末端アミノ酸配列に基づく放射性オリゴヌクレオチドプ
ローブを用い、特定の条件でハイブリダイゼーション、
洗浄を行って釣り上げられた組換え体大腸菌が、目的の
遺伝子ＤＮＡを持つものであることが判明した。

【００１９】次に、この目的の遺伝子ＤＮＡを含む組換
え体ライブラリーから、例えばマニアティス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）らの方法［「モレキュラル・クローニング：
コールドスプリングハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）」（１９８２年）］などに従って、ソルビトールキ
ナーゼ遺伝子を有するＤＮＡを含む組換えプラスミド
（ｐＳＫ１と命名）を調製することができる。このプラ
スミドの構成を示す模式図を図４に示す。また、該プラ
スミド中のエルビニア・エスピーＳＫ−４７２−２０株
染色体ＤＮＡ由来の部位の制限酵素地図は図３に示すと
おりである。

【００２０】上記図４に示すプラスミド中の染色体由来
の部分をジデオキシ法［「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）」第２１４巻、第１２０５〜１２１０ページ（１９
８１年）］により、塩基配列を決定し、ソルビトールキ
ナーゼをコードする全ＤＮＡが含まれていることを確認
すると共に、その全塩基配列を決定し、少なくとも図２
にて示される配列を含むものであることを確認した。

【００２１】さらに、本発明の目的とするソルビトール
キナーゼの活性発現および解析したソルビトールキナー
ゼのＮ末端側アミノ酸配列、リシルエンドペプチダーゼ
処理断片アミノ酸配列との同一フレームにおいて完全一
致の確認事実から図１にて示されるアミノ酸配列を含む
ものであることを確認した。さらに本発明では、上記図
１または図２の配列において、そのアミノ酸を実質的に
コードするポリペプチドやアミノ酸を実質的にコードす
る塩基配列を有するものであって、本発明のソルビトー
ルキナーゼ活性を有するものであればいずれも包含する
ものである。

【００２２】ソルビトールキナーゼの発現には、このｐ
ＳＫ１を用いてもよく、さらにソルビトールキナーゼを
コードしている遺伝子ＤＮＡを新たにに組み込んだ発現
ベクターを構築してもよい。この発現用ベクターとして
は、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプ
ラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適
している。前者のファージとしては、例えばＥ．ｃｏｌ
ｉを宿主微生物とする場合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ
・λＢなどが用いられる。また、プラスミドとしては、
Ｅ．ｃｏｌｉを宿主微生物とするに、例えばｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐ
ＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐ
ＵＣ１１９、ブルースクリプトＳＫ＋、ブルースクリプ
トＫＳ＋、ブルースクリプトＳＫ−、ブルースクリプト
ＫＳ−、ブルースクリプトＳＫＩＩ＋、ブルースクリプ
トＫＳＩＩ＋、ブルースクリプトＳＫＩＩ−、ブルース
クリプトＫＳＩＩ−などが用いられる。さらに、バチル
ス属を宿主微生物とする場合は、例えばｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫなどを用いればよく、サッカロミセス属を宿主微生
物とする場合は、例えばｐＹＡＣ５などを用いればよ
い。

【００２３】これらのベクターに、該ソルビトールキナ
ーゼ遺伝子ＤＮＡを組み込む方法については特に制限は
なく、従来慣用されている方法を用いることができる。
例えば適当な制限酵素を用いて、前記のソルビトールキ
ナーゼ遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドＤＮＡ及び
該発現用ベクターを処理し、それぞれソルビトールキナ
ーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片及びベクター断片を得たの
ち、それぞれの接着末端をアニーリング後、適当なＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させることによって、あらたな
発現ベクターが得られる。

【００２４】このようにして、構築されたプラスミドの
Ｅ．ｃｏｌｉへの導入および宿主微生物への所望組換え
ＤＮＡ導入の有無の選択については、前述した方法を用
いればよい。本発明においては、前記組換えプラスミド
ｐＳＫ１によって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉに属する
微生物は、エシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐＳＫ１
（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＳＫ１：ＦＥＲＭ ＢＰ−
４４９６）と命名される。

【００２５】このようにして得られた形質転換微生物の
培養は、該微生物の生育に必要な炭素源や窒素源などの
栄養源や無機成分などを含む培地中において行うことが
できる。該炭素源としては、例えばグルコース、デンプ
ン、ショ糖、モラッセス、デキストリンなどが、窒素源
としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加水分
解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アンモニウム塩
などが、無機成分としては、例えばナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛、マン
ガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫酸、リン酸などの陰
イオンを含む塩が挙げられる。

【００２６】培養方法については特に制限はなく公知の
方法、例えば通気撹拌培養、振盪培養、回転培養、静置
培養などの方法によって、通常２０〜５０℃、好ましく
は２５〜４２℃、より好ましくは３７℃近辺で、１２〜
４８時間程度培養する方法が用いられる。このようにし
て培養を行ったのち、遠心分離処理などの手段によって
菌体を集め、次いで酵素処理、自己消化、フレンチプレ
ス、超音波処理などによって細胞を破壊して目的とする
酵素を含有する抽出液を得る。この抽出液から、該酵素
を分離、精製するには、例えば、塩析、脱塩、イオン交
換樹脂による吸脱着処理などを行ったのち、さらに吸着
クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動法などによっ
て精製すればよい。

【００２７】この精製標品について、ソルビトールキナ
ーゼの酵素活性及び物理化学的性質を調べることによっ
て、該形質転換微生物がソルビトールキナーゼの産生能
を有することが確認された。したがって、本発明におい
て用いたソルビトールキナーゼを発現する遺伝子ＤＮＡ
は、図１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
を有し、かつその塩基配列が図２に示す配列であること
が明らかである。

【００２８】このようにして得られたソルビトールキナ
ーゼは、エルビニア・エスピーＳＫ−４７２−２０（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ４４９２）株のソルビトールキナーゼと同
様な触媒作用、酵素学的性質を有していた。即ちＭｇ²⁺
の存在下で、Ｄ−ソルビトールとＡＴＰからＤ−ソルビ
トール−６−リン酸とＡＤＰを生成させる反応を触媒す
る、リン酸供与体としてＡＴＰを利用し、ホスホエノー
ルピルビン酸を実質的に利用しない、基質特異性として
ソルビトールを相対活性１００％とした場合、フルクト
ース、グルコース、ガラクトース、マンノース、イノシ
トール、サッカロース、マルトース、ラクトースが相対
活性０％である、ＳＤＳ−アクリルアミドゲルクロマト
法での分子量が３５，０００±４，０００である、等電
点が４．８０±０．５である、至適ｐＨが８．５〜９．
５である、６０℃までの熱安定性を有する、ｐＨ６．５
〜１０．０までのｐＨ安定性を有する、金属イオンの活
性に及ぼす影響が銅イオン、ニッケルイオン、コバルト
イオン、ＥＤＴＡによって阻害を受け、カリウムイオン
によって活性化される、などである。

【００２９】このことからこのようにして得られたソル
ビトールキナーゼは、例えば血清中のソルビトール定量
などの臨床用酵素として有用である。なお、本発明明細
書に記載の塩基配列の記号及びアミノ酸配列の記号は、
当該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例
を以下に列記する。また、すべてのアミノ酸はＬ体を示
すものとする。

【００３０】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン Ｈ：アデニン、チミンまたはシトシン Ｎ：アデニン、チミン、グアニン、シトシンまたは他の
塩基 Ｒ：アデニンまたはグアニン Ｙ：チミンまたはシトシン Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：システイン Ｇｌｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏ：プロリン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン Ｘａａ：不明または他のアミノ酸

【００３１】

【実施例】次に、参考例及び実施例によって本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってな
んら限定されるものではない。

【００３２】

【参考例１】 染色体ＤＮＡの分離 エルビニア・エスピーＳＫ−４７２−２０株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４４９２）を培地（酵母エキス０．５％、ペプ
トン０．５％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．０５％、ＫＨ ₂ ＰＯ₄
０．０５％、ＮＨ₄ Ｃｌ０．０５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ０．０３％、［ｐＨ７．０］）１００ｍｌにて３７
℃で４０時間振盪培養した後、この培養液を高速冷却遠
心機（トミーＣＸ−２５０型）を用い、６５００ｒｐｍ
（７６６０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して、菌体を集
菌した。

【００３３】次いで、この菌体を５０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及
び１５％シュークロースからなる溶液２０ｍｌに懸濁
し、最終濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチーム
（生化学工業（株）社製）を加え、３７℃で１０分間処
理して菌株の細胞壁を破壊した。次に、これに１０％ラ
ウリル硫酸ナトリウム（シグマ社製）水溶液１ｍｌを加
えて、３７℃で５分間処理した後、クロロホルム／フェ
ノール（１：１）混合液２１ｍｌを加え撹拌後、１００
００ｒｐｍ（１２０８０Ｇ）で１０分間遠心分離処理し
て水相を回収した。この水相に２倍量のエタノールを静
かに混合し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながら、ＤＮＡ
をガラス棒にまきつかせて分離した後、１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶
液２０ｍｌで溶解し、最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなる
ようにＲＮａｓｅ（ファルマシア社製）を加えて３７℃
で３０分処理をした。ついでこれに等量のフェノール／
クロロホルム（１／１）混合液を加え、前記と同様に処
理してそれぞれ水相を分取した。

【００３４】次に、この水相に２倍量のエタノールを加
えて前記の方法でもう一度ＤＮＡを分離した後、１０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡか
らなる溶液２ｍｌに溶解した。

【００３５】

【参考例２】 エルビニア・エスピーＳＫ−４７２−２０株遺伝子ライ
ブラリーの作製 参考例１で得られたエルビニア・エスピーＳＫ−４７２
−２０株染色体５μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝
酒造社製）１０単位を用い、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐ
Ｈ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ
₂ 及び１ｍＭＤＴＴからなる溶液中、３７℃で２時間切
断処理した。

【００３６】一方、ベクタープラスミドｐＵＣ１１８
（宝酒造社製）３μｇを別の容器中で、制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ（宝酒造社製）１０単位を用い、１０ｍＭトリ
ス−酢酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂ 及び１ｍＭのＤＴＴからなる溶液中で、
３７℃で２時間切断処理した後、５’末端を脱リン酸化
するために、反応液にアルカリ性ホスファターゼ（宝酒
造社製）１単位を加えて６５℃で２時間処理した。

【００３７】次に、前記のようにして得られた２種のＤ
ＮＡ溶液を混合し、この混合液に等量のフェノール／ク
ロロホルム（１／１）混合液を加えて処理した後、遠心
分離処理によって水相を分取した。さらに、この水相に
１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液および２倍量のエ
タノールを加えて遠心分離処理することによってＤＮＡ
を回収し、減圧乾燥した。

【００３８】そのＤＮＡを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡ溶液からなる溶液にて溶
解した後、６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、６．
６ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＤＴＴ及び６６０μＭ
のＡＴＰ（ベーリンガーマンハイム社製）の存在下、Ｔ
４ＤＮＡライゲース（宝酒造社製）３００単位を用い、
４℃で１６時間ライゲーションを行った。

【００３９】次にこれを、Ａ．Ｍｉｓｈｉｍｕｒａらの
方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１
８巻、第６１６９ページ（１９９０年））によってコン
ピテント細胞としたＥ．ｃｏｌｉＤＨ１（ＡＴＣＣ３３
８４９）［Ｆ−、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９
６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒk-、ｍk+）、Ｓｕｐ
Ｅ４４、ｒｅｌＡ１、λ−］［「モレキュラル・クロー
ニング：コールドスプリングハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ）」５０４〜５０６ページ（１９８２年）］に
トランスフォーメーションし、これをアンピシリン５０
μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ寒天培地にて、３７℃で一昼夜培
養し、約１０，０００の形質転換微生物を得て、エルビ
ニア・エスピーＳＫ−４７２−２０株遺伝子ライブラリ
ーとした。

【００４０】

【実施例１】 放射性オリゴヌクレオチドプローブの作製 ソルビトールキナーゼ精製標品のＮ末端側アミノ酸配列
を調べた結果を図５（配列番号２）に示し、さらに、、
リシルエンドペプチダーゼ処理断片のアミノ酸配列を調
べた結果を図６（配列番号３）、図７（配列番号４）お
よび図８（配列番号５）に示した。

【００４１】この情報をもとに遺伝子の５’末端側から
塩基配列を予想した。この予想された塩基配列には種々
の組合せが考えられるので、組合せの数が少ない部分の
オリゴヌクレオチドを設計して実験を行った。このオリ
ゴヌクレオチドはアール・エル・レッシンジャーらの方
法［「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
エティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」第９８巻、
３６５５ページ］に基づき、ＤＮＡシンセサイザー［サ
イクロン（バイオサーチ社製）］を用いて作製した。

【００４２】まず図５のＮ末端アミノ酸配列で、３４ア
ミノ酸残基目のＡｓｐから３９アミノ酸残基目のＴｈｒ
に対応する合成ＤＮＡを作製した。この組合せは１７マ
ーのものを考えた場合３２通り存在する。したがって、
アミノ酸配列から推定されるｍＲＮＡに相補的な図９の
、配列番号６に示すプローブＳＫ１、１７マーのオリ
ゴヌクレオチドを作製した。

【００４３】このようにして得られたオリゴヌクレオチ
ド５ｐｍｏｌをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファ
ー［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの
ＭｇＣｌ₂ 、４ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
０．１ｍＭのスペルミジン］および３７０キロベクレル
の［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム社製）の存在下、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）８．５単
位を用い、３７℃で３０分間反応させて、アイソトープ
³²Ｐを取り込ませ、放射性オリゴヌクレオチドプローブ
を作製した。しかしながら本放射性オリゴヌクレオチド
プローブを用い、種々の条件を検討してソルビトールキ
ナーゼ遺伝子のクローニングを試みたが目的の遺伝子は
取得できなかった。

【００４４】次に図５のＮ末端アミノ酸配列で、３４ア
ミノ酸残基目のＡｓｐから４０アミノ酸残基目のＩｌｅ
に対応する合成ＤＮＡを作製した。この組合せは２０マ
ーのものを考えた場合１２８通りも存在する。そこでエ
ルビニアの遺伝子のコドン使用頻度を参考にして（Ｋ．
Ｗａｄａらのデータ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ２０巻、第２１１４ページ、１９９２
年））数多い組合せの中から３９アミノ酸残基目のＴｈ
ｒの組合せをＡＣＣとＡＣＧに絞ったプローブを考案
し、アミノ酸配列から推定されるｍＲＮＡに相補的な図
９の、配列番号７に示すプローブＳＫ２、２０マーの
オリゴヌクレオチドを作製した。

【００４５】このオリゴヌクレオチドについても前記と
同様に、アイソトープ³²Ｐを取り込ませ、放射性オリゴ
ヌクレオチドプローブを作製した。しかしながら本放射
性オリゴヌクレオチドプローブを用いたものについて
も、種々の条件を検討してソルビトールキナーゼ遺伝子
のクローニングを試みたが目的の遺伝子は取得できなか
った。これは、後述の本発明の成果で確かめられたが、
ここで選択したＴｈｒのコドン使用頻度が本来非常に少
ないＡＣＴが用いられていたためで、このことからも本
遺伝子の取得は困難で、種々の工夫を要求された。

【００４６】そこで次に、図５のＮ末端アミノ酸配列の
下線で示した、３４アミノ酸残基目のＡｓｐから４４ア
ミノ酸残基目のＡｌａに対応する合成ＤＮＡを作製し
た。この組合せは３２マーのものを考えた場合９２１６
通りも存在する。そこで６つのアミノ酸においてはコド
ンの３レター目にイノシンを用い、１６通りの組み合わ
せに絞ったものを考案した。このアミノ酸配列から推定
されるｍＲＮＡに相補的な図９の、配列番号８に示す
プローブＳＫ３、３２マーのオリゴヌクレオチドを作製
した。

【００４７】このオリゴヌクレオチドについても前記と
同様に、アイソトープ³²Ｐを取り込ませ、放射性オリゴ
ヌクレオチドプローブを作製した。

【００４８】

【実施例２】 ソルビトールキナーゼ遺伝子含有ＤＮＡのスクリーニン
グ 参考例２で得たエルビニア・エスピーＳＫ−４７２−２
０株遺伝子ＤＮＡライブラリー、すなわち平板寒天培地
上のアンピシリン耐性コロニーの上に、ナイロンメンブ
レンフィルター（マグナグラフナイロン（ミクロンセパ
レーション社製））を重ね、フィルター上に該コロニー
菌体の一部を移行させた後、このフィルターをアルカリ
変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｎ−ＮａＯＨ
溶液）中に５分間浸し、さらに中和溶液［０．５Ｍトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．０）及び３ＭＮａＣｌ混合液］に５
分間浸漬後、乾燥させた。

【００４９】次に、このフィルターを８０℃で２時間加
熱し、菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフィルターに
固定した。さらに、このフィルターをハイブリダイゼー
ション溶液（ＮａＣｌ４３．８ｇ／リットル、クエン酸
３ナトリウム２２．１ｇ／リットル、５０ｍＭリン酸３
ナトリウム（ｐＨ６．５）、ラウリル硫酸ナトリウム１
ｇ／リットル、フィコール１ｇ／リットル、ポリビニル
ピロリドン１ｇ／リットル、ＢＳＡ１ｇ／リットル、サ
ケ精子ＤＮＡ２５０ｍｇ／リットル、ホルムアミド２０
０ｍｌ／リットル）に浸し、４２℃で１時間プレハイブ
リダイゼーションを行った。その後、フィルターを、新
しいハイブリダイゼーション溶液に浸し、先に実施例１
で得られた図９のに示した配列の放射性オリゴヌクレ
オチドプローブを加え、４２℃で一昼夜ハイブリダイゼ
ーションを行った。

【００５０】ハイブリダイゼーション後、洗浄液（Ｎａ
Ｃｌ４．３８ｇ／リットル、クエン酸３ナトリウム２．
２１ｇ／リットル、ラウリル硫酸ナトリウム１ｇ／リッ
トル）でフィルターを３回洗浄し、次いでこのフィルタ
ーを４２℃の洗浄液に１０分間浸し、余分なプローブを
洗い落とした。ついで、フィルターを風乾後、Ｘ線フィ
ルム（富士写真フィルム社製、ＨＲ−Ｈ）に重ね、遮光
下−８０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行っ
た。

【００５１】その後、フィルムを現像したところ、ポジ
ティブシグナルを示すコロニーを確認した。該コロニー
を形成する組換え体Ｅ．ｃｏｌｉに含まれるプラスミド
に挿入されたＤＮＡの制限酵素切断地図を図３に示し
た。該コロニーを、ソルビトールキナーゼをコードする
ＤＮＡを含む形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＳＫ
１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４４９６）と命名し、その形質転
換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＳＫ１中に含まれるプラ
スミドはｐＳＫ１と命名した。このプラスミドｐＳＫ１
を構築する流れを図１０に示した。

【００５２】

【実施例３】 ソルビトールキナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列の決
定 プラスミドｐＳＫ１で形質転換したＥ．ｃｏｌｉＤＨ１
から、ティー・マニアティスらの方法［「モレキュラル
・クローニング：コールド・スプリング・ハーバー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）」第８６〜９４ページ（１９８
２年）］によって、ｐＳＫ１ＤＮＡを抽出した。このプ
ラスミドの構成を示す模式図を図４に示す。該プラスミ
ド中のエルビニア・エスピーＳＫ−４７２−２０株染色
体由来の部位をジデオキシ法［「サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）」第２１４巻、第１２０５〜１２１０ページ
（１９８１年）］により、塩基配列を決定し、ソルビト
ールキナーゼをコードする全ＤＮＡが含まれていること
を確認すると共に、その全塩基配列を決定し、少なくと
も図２にて示される配列を含むものであることを確認し
た。

【００５３】今回解析したソルビトールキナーゼのＮ末
端側アミノ酸配列、リシルエンドペプチダーゼ処理断片
アミノ酸配列とも同一フレームにおいて完全に一致し
た。またこのことから図１で示されるソルビトールキナ
ーゼ（下記活性発現と合わせて）のアミノ酸配列を含む
ものであることを確認した。

【００５４】

【実施例４】 大腸菌内でのソルビトールキナーゼの活性発現 実施例２で得られたソルビトールキナーゼをコードする
ＤＮＡを含む形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＳＫ
１をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ培地にて３
７℃一昼夜培養した後、培養液を１５，０００ｒｐｍで
１分間遠心分離処理して沈澱を回収した。この沈澱に、
該培養液と同量の１０Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）を
加え、超音波破砕を行った。

【００５５】ソルビトールキナーゼ活性の測定は、１０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、２ｍＭ ＡＴ
Ｐ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５ユニット／ｍｌソルビトー
ル−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（参考例３に記載）、
１ｍＭ ＮＡＤ、５ユニット／ｍｌジアホラーゼ（旭化
成工業（株）社製）、０．０２５％ニトロテトラゾリウ
ムブルー、１００ｍＭ Ｄ−ソルビトール、０．１％ト
リトンＸ−１００からなる反応液１ｍｌと、先に示した
超音波砕液を適宜希釈した後、２０μｌとり、３７℃で
１０分間反応させる。０．１Ｎ塩酸２．０ｍｌを加えて
反応をとめ、この反応液の５５０ｎｍにおける吸光度を
測定することによって、ソルビトールキナーゼ活性を定
量した。なお、比較のためにｐＵＣ１１８をトランスフ
ォーメーションしたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１の破砕液につ
いても前記と同様の処理を行い、ソルビトールキナーゼ
活性を測定した。その結果、驚くことにプラスミドｐＳ
Ｋ１を保持した形質転換微生物での活性は２００ｍＵ／
ｍｌも発現していたが、ｐＵＣ１１８を持つものの活性
は０Ｕ／ｍｌであった。これより、ソルビトールキナー
ゼ活性をもつ形質転換体が得られていることが確認され
た。さらに得られたソルビトールキナーゼを単離・精製
し、分子量、等電点が先に示したエルビニア・エスピー
ＳＫ−４７２−２０株と全く同一であったことなど、発
現蛋白の物理化学的性質を確認した。

【００５６】

【参考例３】 ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼのコマモナ
ス・エスピーＳＹ−７７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８１
０：菌学的性質は米国特許第３９６０６６２号明細書に
て記載されている）株からの製造法、理化学的性質及び
酵素活性測定法 ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の活性測定法 ０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．２５
ｍｌ、０．１Ｍのソルビトール−６−リン酸０．２ｍ
ｌ、１０ｍＭのＮＡＤ０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのジ
アホラーゼ０．０５ｍｌ、０．２５％のＮＴＢ（ニトロ
テトラゾニウムブルー）０．１ｍｌ、１０％のトリトン
Ｘ−１００を０．０１ｍｌ、および蒸留水０．２９ｍｌ
よりなる反応液１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した
後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させ
る。反応後、０．１Ｎの塩酸を２ｍｌ添加して反応を停
止させ、５分以内に層長１．０ｃｍセルを用いて波長５
５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検
として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同
一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素
使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度
差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単
位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤを生成さ
せる酵素量とし、計算式は下記のとうりである。

【００５７】

【数１】

【００５８】理化学的性質 （１）酵素作用 基質としてソルビトール−６−リン酸を用いた酵素作用
を以下に示す。

【００５９】

【化１】

【００６０】（２）基質特異性 ソルビトール−６−リン酸に基質特異性を示す。各種基
質に対する特異性は表１の通りである。

【００６１】

【表１】

【００６２】（３）Ｋｍ値 ソルビトール−６−リン酸に対して２．０±０．５（ｍ
Ｍ）、ＮＡＤに対して０．１３±０．０５ｍＭ、チオＮ
ＡＤに対して０．１４±０．０５ｍＭであった。 （４）等電点 ｐＨ３．５−１０．０のキャリアアンフォライトを用い
た電気泳動法により本酵素の等電点は４．８±０．２で
あった。 （５）分子量 トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（０．７５×６０
ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定した本酵素の分子
量は７００００±５０００であった。 （６）至適ｐＨ 前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求め、その
結果を図１１に示した。ｐＨ６．０〜６．５の範囲は１
００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ６．５〜８．０の範囲は１
００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０の範囲は
１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１０．
０の範囲は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは
８〜８．５であった。 （７）ｐＨ安定性 １Ｕ／ｍｌのソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を各
種緩衝液中、３７℃、６０分間、処理し、その残存活性
を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図
１２に示した。ｐＨ５．５〜６．５の範囲は１００ｍＭ
の酢酸緩衝液、ｐＨ６．５〜８．０の範囲は１００ｍＭ
のリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０の範囲は１００ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０の範囲
はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。ｐＨ
８〜１１の範囲で最も良好な安定性を示した。 （８）至適温度 前記酵素活性測定法に従って、温度を３７〜６０℃の範
囲で変化させて至適温度を求め、その結果を図１３に示
した。至適温度は５０℃付近であった。 （９）熱安定製 １Ｕ／ｍｌのソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を１
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で調製し、
１０分間の加熱処理の後に残存活性を前記酵素活性測定
法にしたがって測定した。その結果は図１４に示される
通りであって、酵素活性は少なくとも３７℃までは安定
であった。 （１０）金属イオンの影響 １ｍＭの各種金属イオンのソルビトール−６−リン酸脱
水素酵素活性への影響について調べた結果は表２に示す
通りで、銅イオン、鉛イオンによる強い阻害がみられ
た。

【００６３】

【表２】

【００６４】ついで、ソルビトール−６−リン酸脱水素
酵素の製造法を詳しく述べた。 （コマモナス・エスピーＳＹ−７７−１株の培養）ソル
ビトール２．０％、ブレインハートインフュージョン
２．０％を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを、
５００ｍｌ溶三角フラスコ２０本に分注し、１２０℃、
２０分間加熱滅菌した後、これにコマモナス・エスピー
ＳＹ−７７−１の菌体１白金耳を接種し、２８℃で１２
０ｒｐｍの振とう培養機で２０時間培養し、酵素活性
２．７Ｕ／ｍｌの培養液１．９ｌを得た。 （酵素の分離精製）得られた培養液１．９ｌを遠心分離
して、得られた菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）２ｌで１回洗浄した。洗浄菌体を同様の
緩衝液に懸濁して５０ｍｌに調製し、クボタ社製の超音
波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ ２０１Ｍ）を用いて１
８０Ｗ、３０分間処理して破砕液を得た。この破砕液を
１２０００ｒｐｍ２０分間遠心分離し、４２ｍｌ（酵素
活性１０５Ｕ／ｍｌ、４２００Ｕ）の上清を得た。この
上清を透析チューブを用いて２０ｍＭのトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）５ｌに対して５℃で１夜透析し、５
１ｍｌの粗酵素液（酵素活性８５Ｕ／ｍｌ、４３４０
Ｕ）を得た。得られた酵素液を２０ｍＭのトリス塩酸−
緩衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）１００ｍｌ
（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０．２ＭのＫＣ
ｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
１ｌを流し、次いで、０．３Ｍ ＫＣｌを含む２０ｍＭ
のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出し、酵素液２
５０ｍｌ（酵素活性１３Ｕ／ｍｌ、３２５０Ｕ）を得
た。得られた酵素液に３ＭになるようにＮａＣｌを溶解
し、３ＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭのトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）５０ｍｌ（１．５×
２８ｃｍ）カラムに通した。溶出は３Ｍ〜０ＭのＮａＣ
ｌ直線濃度勾配により行い、１Ｍ〜０ＭのＮａＣｌの溶
出画分（酵素活性３５Ｕ／ｍｌ、２４５０Ｕ）を回収し
た。この酵素液に牛血清アルブミンを１００ｍｇ溶解
し、凍結乾燥し、酵素粉末として６８ｍｇ（酵素活性３
３Ｕ／ｍｇ）を得た。

【００６５】

【発明の効果】本発明によるとエルビニア・エスピーＳ
Ｋ−４７２−２０株由来の染色体ＤＮＡライブラリーか
ら、ソルビトールキナーゼを発現する遺伝子ＤＮＡをス
クリーニングし、これを用いて構築された発現ベクター
の組み換えプラスミドを例えばＥ．ｃｏｌｉに属する微
生物に導入することによって、得られた形質転換微生物
は効率よくリン酸供与体としてＡＴＰを利用し、ホスホ
エノールピルビン酸を実質的に利用しないソルビトール
キナーゼを生産することができる。

【００６６】また、本発明によって、ソルビトールキナ
ーゼの全アミノ酸配列及びこのアミノ酸をコードする遺
伝子ＤＮＡの塩基配列が決定できたので、該酵素の基質
及び補酵素特異性の変換や耐熱性の向上などのプロテイ
ンエンジニアリングが可能となった。

【００６７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１０７５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：エルビニア・エスピー 株名：ＳＫ−４７２−２０ 配列の特徴： ３１−９６９ Ｅ ソルビトールキナーゼ遺伝子 配列 GTTGATAATC AAAATAATGA GGAGTGTCTT GTG CGT ATT GGG ATT GAT TTG GGC 54 Met Arg Ile Gly Ile Asp Leu Gly 1 5 GGC ACT AAA ACA GAA GTC ATC GCA CTG AGC GAG CAG GGG GAG CAA CTG 102 Gly Thr Lys Thr Glu Val Ile Ala Leu Ser Glu Gln Gly Glu Gln Leu 10 15 20 TTC CGC CAC CGT CTG CCT ACG CCG CGC GAT GAT TAT CAC CAG ACT ATC 150 Phe Arg His Arg Leu Pro Thr Pro Arg Asp Asp Tyr His Gln Thr Ile 25 30 35 40 GAG ACG ATT GCC CGG CTG GTC GAC ATG GCT GAG CAG GCG ACA GGG CAG 198 Glu Thr Ile Ala Arg Leu Val Asp Met Ala Glu Gln Ala Thr Gly Gln 45 50 55 ACC GGC ACC GTT GGG ATG GGG ATC CCG GGG TCA ATC TCG CCC TAT ACC 246 Thr Gly Thr Val Gly Met Gly Ile Pro Gly Ser Ile Ser Pro Tyr Thr 60 65 70 GGG GTG GTT AAA AAC GCC AAC TCC ACC TGG CTC AAC GGT CAG CCT TTT 294 Gly Val Val Lys Asn Ala Asn Ser Thr Trp Leu Asn Gly Gln Pro Phe 75 80 85 GAT AAA GAT TTA AGT CAG CGC CTG AAC CGG GAA GTG CGT CTG GCA AAT 342 Asp Lys Asp Leu Ser Gln Arg Leu Asn Arg Glu Val Arg Leu Ala Asn 90 95 100 GAC GCC AAC TGT CTG GCC GTC TCC GAA GCC ATT GAC GGT GCC GCC GCA 390 Asp Ala Asn Cys Leu Ala Val Ser Glu Ala Ile Asp Gly Ala Ala Ala 105 110 115 120 GGG GCC CAG ACC GTT TTT GCG GTC ATT ATC GGG ACC GGC TGT GGC GCA 438 Gly Ala Gln Thr Val Phe Ala Val Ile Ile Gly Thr Gly Cys Gly Ala 125 130 135 GGC GTG GCC CTG GGC GGG CGT GCC CAT ATT GGC GGC AAC GGT ACG GCG 486 Gly Val Ala Leu Gly Gly Arg Ala His Ile Gly Gly Asn Gly Thr Ala 140 145 150 GGC GAG TGG GGA CAT AAC CCC TTG CCG TGG ATG GAT GAA GAT GAA CTT 534 Gly Glu Trp Gly His Asn Pro Leu Pro Trp Met Asp Glu Asp Glu Leu 155 160 165 AAA TAC CGC GCC GAG GTG CCG TGC TAT TGC GGC AAG CAG GGC TGT ATT 582 Lys Tyr Arg Ala Glu Val Pro Cys Tyr Cys Gly Lys Gln Gly Cys Ile 170 175 180 GAG ACG TTT ATC TCC GGC ACC GGT TTT GCC ACC GAT TAC CAC CGC CTG 630 Glu Thr Phe Ile Ser Gly Thr Gly Phe Ala Thr Asp Tyr His Arg Leu 185 190 195 200 AGT GGC CAG CCA CTC AAG GGG AAC GAG ATT ATG CGC CGG GTC GGG GAA 678 Ser Gly Gln Pro Leu Lys Gly Asn Glu Ile Met Arg Arg Val Gly Glu 205 210 215 CAC GAT CCG GTG GCT GAG CTG GCT CTC AGC CGC TAT GAA ATG CGG CTG 726 His Asp Pro Val Ala Glu Leu Ala Leu Ser Arg Tyr Glu Met Arg Leu 220 225 230 GCG AAA TCC CTG GCG CAC GTG GTG AAT ATC CTT GAC CCT GAC GTG ATT 774 Ala Lys Ser Leu Ala His Val Val Asn Ile Leu Asp Pro Asp Val Ile 235 240 245 GTG CTC GGC GGC GGG ATG AGC AAC GTC GAC CGT TTA TAT GCC ACG GTA 822 Val Leu Gly Gly Gly Met Ser Asn Val Asp Arg Leu Tyr Ala Thr Val 250 255 260 CCG AAT CTG GTG AAG CAG TGG GTC TTC GGG GGT GAG TGT GAA ACC CCG 870 Pro Asn Leu Val Lys Gln Trp Val Phe Gly Gly Glu Cys Glu Thr Pro 265 270 275 280 ATC CGA AAG CGG TGC ACG GGG ACT CCA GCG GCG TGC GCG GCG CCG CGT 918 Ile Arg Lys Arg Cys Thr Gly Thr Pro Ala Ala Cys Ala Ala Pro Arg 285 290 295 GGC TCT GGC CGC TAT AGC CAT TCT CCC TCT CCC TAC GTG AGA GGG GCG 966 Gly Ser Gly Arg Tyr Ser His Ser Pro Ser Pro Tyr Val Arg Gly Ala 300 305 310 GGA TGA GGGTGCCCTC ATGCAGGGCA CCCTCACTCC ACCGCAAACA CCTTATCCAG 1022 Gly *** 313 CTTGCTATAC CCCAGCCCGT TAATCTTCTT CACTTTGATC TGCACCGGGA TCC 1075

【００６８】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：５２アミノ酸残基 配列の種類：ペプチド 配列の名称：ソルビトールキナーゼのＮ末端アミノ酸配
列 配列 Met Arg Ile Gly Ile Asp Leu Gly Gly Thr Lys Thr Glu Val Ile 15 Ala Leu Ser Glu Gln Gly Glu Gln Leu Phe Arg His Arg Leu Pro 30 Thr Pro Arg Asp Asp Tyr His Gln Thr Ile Glu Thr Ile Ala Arg 45 Leu Val Asp Met Ala Glu Gln 52

【００６９】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：１４アミノ酸残基 配列の種類：ペプチド 配列の名称：ソルビトールキナーゼのリジルエンドペプ
チダーゼ処理断片Ｋ−２０アミノ酸配列 配列 Asn Ala Asn Ser Thr Trp Leu Asn Gly Gln Pro Phe Asp Lys 14

【００７０】

【配列表】

配列番号：４ 配列の長さ：１４アミノ酸残基 配列の種類：ペプチド 配列の名称：ソルビトールキナーゼのリジルエンドペプ
チダーゼ処理断片Ｋ−２７アミノ酸配列 配列 Xaa Trp Val Phe Gly Gly Glu Xaa Glu Thr Pro Ile Arg Lys 14

【００７１】

【配列表】

配列番号：５ 配列の長さ：３２アミノ酸残基 配列の種類：ペプチド 配列の名称：ソルビトールキナーゼのリジルエンドペプ
チダーゼ処理断片Ｋ−３５アミノ酸配列 配列 Tyr Arg Ala Glu Val Pro Cys Tyr Cys Gly Lys Gln Gly Cys Ile 15 Glu Thr Phe Ile Ser Gly Thr Gly Phe Ala Thr Asp Tyr His Arg 30 Leu Ser 32

【００７２】

【配列表】

配列番号：６ 配列の長さ：１７塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ソルビトールキナーゼ遺伝子プローブ Ｓ
Ｋ１ 配列 GAYGAYTAYC AYCARAC 17

【００７３】

【配列表】

配列番号：７ 配列の長さ：２０塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ソルビトールキナーゼ遺伝子プローブ Ｓ
Ｋ２ 配列 GAYGAYTAYC AYCARACSAT 20

【００７４】

【配列表】

配列番号：８ 配列の長さ：３２塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ソルビトールキナーゼ遺伝子プローブ Ｓ
Ｋ３ 配列の特徴：Ｎはイノシン 配列 GAYGAYTAYC AYCANACNAT NGANACNATN GC 32

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はソルビトールキナーゼのアミノ酸配列を
示す図である。

【図２】図２は図１のアミノ酸をコードするソルビトー
ルキナーゼ遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す図である。

【図３】図３はプラスミドｐＳＫ１におけるエルビニア
・エスピーＳＫ−４７２−２０由来の染色体ＤＮＡの制
限酵素地図である。

【図４】図４はプラスミドｐＳＫ１の構造を示す模式図
である。

【図５】図５はソルビトールキナーゼ精製標品のＮ末端
側アミノ酸配列を示す。下線で示した部分は作製したオ
リゴヌクレオチドプローブに対応する領域である。

【図６】図６はリシルエンドペプチダーゼ処理断片アミ
ノ酸配列を解析したソルビトールキナーゼのアミノ酸配
列を示す図である。

【図７】図７はリシルエンドペプチダーゼ処理断片アミ
ノ酸配列を解析したソルビトールキナーゼのアミノ酸配
列を示す図である。なお、Ｘａａは不明アミノ酸を示
す。

【図８】図８はリシルエンドペプチダーゼ処理断片アミ
ノ酸配列を解析したソルビトールキナーゼのアミノ酸配
列を示す図である。

【図９】図９はオリゴヌクレオチドプローブの作製に用
いたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図である。
はオリゴヌクレオチドプローブＳＫ１の塩基配列を示す
図である。はオリゴヌクレオチドプローブＳＫ２の塩
基配列を示す図である。はオリゴヌクレオチドプロー
ブＳＫ３の塩基配列を示す図である。なお、Ｎはイノシ
ンを示す。

【図１０】図１０は本発明で用いたソルビトールキナー
ゼ遺伝子発現ベクターの構築の流れを示す模式図であ
る。

【図１１】図１１はソルビトール−６−リン酸脱水素酵
素の至適ｐＨ曲線を示す。

【図１２】図１２はソルビトール−６−リン酸脱水素酵
素のｐＨ安定曲線を示す。

【図１３】図１３はソルビトール−６−リン酸脱水素酵
素の至適温度曲線を示す。

【図１４】図１４はソルビトール−６−リン酸脱水素酵
素の熱安定曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸順
   位１から３１３のアミノ酸配列を実質的にコードする塩
   基配列を有する組換えプラスミドによって形質転換され
   たソルビトールキナーゼを生産する実質上純粋な微生
   物。
2. 【請求項２】 実質上純粋な微生物が、プラスミドｐＳ
   Ｋ１によって形質転換エッシェリヒア・コリーに属する
   微生物ある請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】 プラスミドｐＳＫ１によって形質転換さ
   れたエッシェリヒア・コリーに属する微生物が、エッシ
   ェリヒア・コリーＤＨ１−ｐＳＫ１（ＦＥＲＭＢＰ−４
   ４９６）である請求項２記載の微生物。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸順
   位１から３１３のアミノ酸配列を実質的にコードする塩
   基配列を有するＤＮＡ。
5. 【請求項５】 塩基配列が、配列表の配列番号１に記載
   の塩基順位３１から９６９の塩基配列である請求項４記
   載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸順
   位１から３１３のアミノ酸配列を実質的にコードする塩
   基配列を有する組換えプラスミドによって形質転換され
   た微生物であるソルビトールキナーゼを生産する実質上
   純粋な微生物を培地に培養し、次いでその培養物からソ
   ルビトールキナーゼを採取することを特徴とするソルビ
   トールキナーゼの製造方法。
7. 【請求項７】 実質上純粋な微生物が、プラスミドｐＳ
   Ｋ１によって形質転換されたエッシェリヒア属に属する
   微生物である請求項６記載のソルビトールキナーゼの製
   造方法。
8. 【請求項８】 エッシェリヒア属に属する微生物が、エ
   ッシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐＳＫ１（ＦＥＲＭ Ｂ
   Ｐ−４４９６）である請求項７記載のソルビトールキナ
   ーゼの製造方法。
9. 【請求項９】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸順
   位１から３１３のアミノ酸配列を実質的にコードするポ
   リペプチド。
10. 【請求項１０】 ポリペプチドが、リン酸供与体として
    ＡＴＰを利用し、ホスホエノールピルビン酸を実質的に
    利用しないソルビトールキナーゼである請求項９記載の
    ポリペプチド。