JPH07508645A - 菌培養物および分生子の保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 菌培養物および分生子の保存方法 発明の背景 本発明は、昆虫病原性菌培養物および分生子、特にＭｅｔａｒｈｉｚｉｕａ＋属 の保存の改善された手段および方法、ならびに再活性化に関する。

農業における主に経済的な損失の原因となり、そしてヒトおよび他の動物集団間 に疾病を蔓延させる多種多様な昆虫がいる。現在では、種々の化学的殺虫剤を適 用することは、これらの昆虫を防除するために用いられるアプローチである。

不運なことに、殺虫剤は高価で一般的に環境に対して危険であり、特にごく短期 間より長く効果的である場合は危険である。さらに、昆虫の殺虫剤耐性種が発現 する傾向があり、それらには多量の殺虫剤の使用、および異なる化学薬品での再 処理が必要である。化学的殺虫剤の使用もまた、標的でない昆虫を駆除してしま う。

昆虫病原体は、害虫の防除のための毒性の高い化学的殺虫剤を一般的に使用する 代わりのものである。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｇｅｎｅｓｉｓなどの細菌 が使用され、マイマイガなどの昆虫で荒されやすい植物上へのスプレーとして成 功している。菌類は、昆虫の防除のための生物学的試薬としての使用に好適な昆 虫病原体のもう一つの有望な群である。菌類にとって最も一般的な成長および再 生の態様は、栄養生殖再生、または胞子の形成に続く・胞子の発芽を包含する無 性生殖である。分生子を包含する無性生殖の胞子は、菌糸の胞子嚢細胞上の先端 および側に、多細胞性菌糸体の分枝糸状構造体を形成する。適切な環境において 、分生子は発芽し、大きくなり、そして胚芽管（ｇｅｒｍ　ｔｕｂｅ）を生成す る。胚芽管は期間にわたって、次々に菌糸体を形成する菌糸へと発達する。昆虫 が、昆虫病原性菌類の生きた胎芽（ｐｒｏｐａｇｕｌｅ）に接触により接種され る場合、菌類と標的昆虫との間の寄生の関係が確立されるとすぐに感染が起こる 。感染が進むと、菌類は徐々に殺虫する。

米国特許第５．０５７．３１６号および第５．０５７．３１５号は、ゴキブリ、 イエバエなどの飛ぶ昆虫、およびトウモロコシ根食い線虫（Ｃｏｒｎ　ｒｏｏｔ ｗＯｒａ＋）の成虫などの他の昆虫を包含する昆虫の防除および駆除方法を開示 している。昆虫は、感染チェンノく−により十分に高濃度で菌類を与えられた場 合、病原性であり得る菌類の感染により防除および駆除される。チェンバーは、 昆虫に対して病原性の菌類の胞子を可変形態で維持し、菌類を環境（雨、紫外光 、および風を包含する）から保護し、昆虫に対する誘引物として提供され、また は入れ物とされ、そして昆虫を多数の胞子で接種させる。菌培養物は、長期間に わたって胞子を供給し続ける。胞子は昆虫に付着し、そして昆虫の中に入り込ん でいく胚芽管を生じ、昆虫は３〜４日以内ｌこ死亡し得る。チェンバーのデザイ ン（すなわち、形状および色）は、昆虫にとって唯一の誘引物であり得る。ある いは、食物またはにおいが昆虫にチェンバーへの誘引をさらに増強するために使 用され得る。感染の主な手段は、外部的な接触によるが、昆虫は、昆虫同士で接 触することにより、および胞子を摂取することにより感染する場合もあり得る。

摂取した菌類の分生子が、毒性であり得る場合もある。

昆虫病原性菌類の商業的成功についての歴史的制限は、菌類が優れた保存特性を 欠くことであった。米国特許第５．０５７゜３１６号および第５．０５７．３１ ５号に記載のチェンバーは、実験室でおよび実際の野外の試験条件下での両方で 高い効果であることを示したが、生存力のある商業製品を構成するためには、チ ェンバーは輸送に耐える必要があり、そして室温での長い保存に安定でなければ ならない。

２つの最も好ましい昆虫病原性菌類は、ＭｅｔａｒｈｉｚｉｕＩｏａｎｉｓｏｐ ｌｉａｅおよびＢｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａである。しかし、これら の２つの菌類の生成物の商品化に限ってのみ非常に成功した。

なぜなら、分生子などの菌類の胎芽の安定化、保存、および保存後の再活性化に おいて障害に直面したからである。

分生子の生活史には６つの連続した段階がある：形成、成熟、二次成熟、活性化 、休眠、および発芽である。休眠段階では、胞子は、長期の静止状態を伴う生理 学的活性の低減した状態にあり、そして外的な環境条件に最も耐性である。２つ の休眠の型がある：構成的な休眠状態は、成長に好適な条件を供給することによ り簡単に克服されない内因性の束縛を包含する：外因性の休眠状態は、環境的に 課せられ、そして、成長に好適な条件が与えられると終了する。外因性の休眠状 態は、発芽に必要な特定の栄養を差し控えることによって、または阻害剤の存在 によってのいずれかにより課せられ得、そして特定の環境条件下で維持され得る 。

乾燥した微生物の胞子、細胞、および他の型の胎芽が、新鮮なものよりも長い期 間保存し得ると、しばらくの間知られていた。しかし、大部分の科学者は、生き ている細胞の脱水により、構造および機能の完全な状態の不可逆的な損失を伴う 膜状の塊の隆起を生じるということの一般化を受け入れる（ＣｒａｖｅおよびＣ ｒａｖｅ、無水生物体中の膜の安定化、ＭＥＭＢＲＡＮＥＳ。

ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ　ＡＮＤ　ＤＲＹ　ＯＲＧＡＮＩＳＭＳＳＡ、　Ｃ，Ｌｅ ｏｐｏｌｄＳＣｏｉｓｔｏｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｔｔｈｉｃａ、 ＮＹ、１８８−２０９頁　（１９８６）　；　ＢｅｋｅｒおよびＲａｐｏｐｏｒ ｔ、脱水による酵母の保存、ΔＤＶＡＮＣＥＳ　ＩＮ　ＶＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ 　ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ／ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、　ＢＩＯＴＥＣＨＮ ＯＬＯＧＹ　ＭＥＴＨＯＤＳの３５巻、＾、　Ｆｉｅｃｈｐｅｒ！ｉｆ、Ｓｐｒ ｉｎｇｅｒ　Ｙｅｒｌａｇ、１２７−１７１頁（１９８７））。この−膜化は、 胞子または他の型の微生物の胎芽が乾燥する場合、発芽速度に著しい減少がある という事実によって支持される。脱水により引き起こされる構造上の損傷におけ る調査研究の大部分は、酵母を対象としていた（ＢｅｋｅｒおよびＲａｐｏｐｏ ｒｔ、　１９８７）。糸状菌類は、異なった型の胎芽を生成し、′　そして分生 子は短い期間で豊富に生成され得る、胎芽の１つである。しかし、分生子は脱水 に対して耐性ではない。種々の昆虫病原性菌類の分生子が、乾燥プロセスに非常 に敏感であり、そして菌の生存率が非常に急速に失われることが見出された（Ｅ ｙａｌらによる欧州特許出願第９２１０００１０．５号）。菌糸体処方物を開発 する努力が払われた（Ａｎｄｅｒｓｃｈらによるオーストラリア特許出願第Ｐ３ ６３９５０８．８号；欧州特許出願第９２１０００１９．５号）。しかし、菌糸 体処方物は、高温で安定ではなく、そして適用に限界がある。

１１ｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅおよびＢｅａｕｖｅｒｉａ　 ｂａｓｓｉａｎａの分生子の安定性および有効性に及ぼす保存温度および相対湿 度（Ｒ。

Ｈｏ）の影響についていくつかの研究がある（Ｂｅ１１．１９７５　；　Ｃ１ｅ ｒｋおよびＭａｄｅｌｉｎ、１９６５　；　ＤａｏｕｓｔおよびＲｏｂｅｒｔｓ 、　Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ分生子の生存率に及ぼす処方 物の影響、Ｊ、　ｏｆ　［ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｐａｔｈｏｌｏ　、４１巻 、１５１−１６０頁　（１９８３）　、にａｗａｋａｉｉ、１９６０　；　Ｋａ ｗａｋａｍｉおよびＫｉｋｕｎｉ、　１９６５　；　５ｔｅｉｎｈａｕｓ、　１ ９６０　；Ｗａｌｓｔａｄ、　Ｊ、　Ｄ、、　ｒＭｕｓｃａｒｄｉｎｅ菌類の２ 種の環境条件に及ぼす影響（Ｂｅａｒｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａおよびＭｅ ｔａｒｈｉｚｉｕＩＩＩａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）上Ｊ、　ｏｆ　Ｉｎｖｅｒｔｅ ｂｒａｔｅ　Ｐａｔｈｏｌｏ　、１６巻、　２２１−２２６頁（１９７０））。

これらの研究の結果は、高いＲ，Ｈ，存在下の中間の温度（２６℃＋９７％Ｒ， Ｈ，または１９℃＋９７％Ｒ，Ｈ，）で、Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生子 が最も長く生存したことを示した。しかし、３７℃では分生子は短い期間にそれ らの発芽能力を失った。発芽は、昆虫病原性菌類の確立における第１段階である 。

輸送および倉庫に保存中、温度は３７°Ｃの高さであり得た。

先行技術では、分生子の発芽しない状態の注意深い研究への努力がなされていな かった。しかし、Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生子の発芽を促進および同調 するための技術を、新鮮な分生子材料を用いて研究した。１０〜４４時間の間蒸 留水中に浸すこと、および好適な栄養源が必要である（ＤｉｌｌｏｎおよびＣｈ ａｒｎｌｅｙ、　１９８５）。昆虫病原性菌類（Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅお よびＢ、　ｂａｓｓｉａｎａなど）の分生子は、天然では疎水性である。それら を水に懸濁すると、水と分生子の表面との間の界面は、発芽に必要な水を分生子 が吸収するのを防ぐ高い表面張力が存在することにより特徴付けられる。種々の 界面活性剤を注意深く試験することにより、この問題を緩和することが可能とな り得る。界面活性剤は、分子が別々の部分によりはっきりと区別されるかまたは あまりはっきり区別されないという構造によって特徴付けられる。１つの部分は 親水性であり、他の部分は疎水性である。界面活性剤の親水性−親油性の性質を 定量化するために用いた方法は、親水性−親油性バランス０１ｙｄｒｏｐｈｉｌ ｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ　Ｂａ１ａｎｃｅ）（ＨＬＢ）法である。この方法では 、ＨＬＢ数は、それぞれの界面活性剤に割り当てられており、そしてＨＬＢ数は 、界面活性剤の好適な適用へのスケールに関連している。スケールは、より親水 性の界面活性剤がさらに高いＨＬＢ数を有するように考案されている。界面活性 剤をスクリーニングするＨＬＢ法は化学的殺虫剤の処方に用いたが、乾燥および 保存後の微生物胎芽を再活性化するのに好適な界面活性剤のスクリーニングにＨ ＬＢ法を適用することは、新規の分野である。さらに、分生子を種々の温度−Ｒ ，Ｈ，の組み合わせで保存する場合、分生子の生存率に及ぼす０２レベルの影響 に関してはほとんど知られていない。酸素は菌類の胞子の発芽に重要である。

従って、本発明の目的は、栄養培地上での病原性菌類、特にＭｅｔａｒｈｉｚｉ ｕｍ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの保存期間を増加するための方法および手段を提供 することである。

本発明のさらなる目的は、病原性菌類を利用する昆虫感染チェンバーのための改 善された包装を提供することである。

本発明の他の目的は、より高温での昆虫病原性菌類の分生子の保存期間を増加さ せる保存のための方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、保存後の分生子を再活性化する適切な方法を開発する ことである。

ｌ匪■１１ 菌培養物または昆虫病原性菌類の分生子、特にＭｅｔａｒｈｉｚｉｕＩｎ属の分 生子を含有する感染チェンバーの包装方法が記載されている。これらの方法は、 ３７°Ｃまでの温度での分生子の長期間保存、および昆虫（ゴキブリ、ハエ、ア リ、軟体昆虫、芝生の害虫、イモムシなど）の防除のための保存後の再活性化を 可能にし、昆虫に対する菌類の能力の損失がほとんどない、または検出し得す、 そして感染しやすい昆虫の死亡を引き起こす。

研究により、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生子が・大気 中の酸素レベル（２０％０２）および高い相対湿度（９０〜１００％Ｒ，Ｈ，） 下で、室温で良好な生存を維持したが、３７°Ｃにおける他のＲ１Ｈ３と酸素と の組み合わせでは生存率を失ったことが示される。

低い酸素レベル（０〜５％０２）、０〜ｌＯ％Ｒ，１１，レベルの条件下で、分 生子は、２５℃および３７℃の２ケ月保存後、それぞれ５６％および２６％が発 芽し得た。Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生子を、好適な界面活性剤（親水性 −親油性バランス（ＨＬＢ）数１０のエトキシ化アルコールなど）混合物に浸し た場合、２５°Ｃおよび３７℃での発芽速度は、それぞれ５６％から７７％に、 および２６％から７４％に上昇した。３つの異なる環境条件下で２ケ月保存した 分生子を、ワックスガ、Ｇａ１ｌｅｒｉａ　１ｅｌｌｏｎｅｌｌａの幼虫を防除 するバイオアッセイにおいて試験した。保存条件は：　（１）２５°Ｃで９０〜 １００％Ｒ，Ｈ，および大気酸素レベル、（２）２５℃でＯ〜１０％Ｒ０Ｈ９お よび０〜５％０２、および（３）３７℃で０〜１０％Ｒ，Ｈ，および０〜５％○ 、であった。これらの３つの異なる分生子の群で処理された幼虫の生存百分率は 、保存した分生子が新鮮な分生子に匹敵したこと、またはそれよりも優れていた ことを示す。低い相対湿度中での包装は、分生子が急速に脱水し、そして休眠状 態になる環境を提供する。低い酸素環境中に保存した脱水分生子は、保存中休眠 状態のままであるので、従って、上昇した温度においてさえ良く生存する。しか し、脱水によって表面張力が増大し、そして保存の後は発芽が低減する。好適な 界面活性剤の使用により、分生子の表面張力が低下し、休眠状態を破る再水和を 促進する。

従って、分生子含有感染チェンバーの包装の好ましい実施態様では、包装は、ガ ス不透過性、水蒸気不透過性、可撓性のあるパウチ材料（アルミニウム箔および 低密度ポリエチレン被覆アルミニウム箔など）で作られている。包装は、保存の 間一定の酸素およびＲ，Ｈ，のレベルを保証する。乾燥剤は、低いＲ，Ｉｌ、の ０〜１０％の環境を作るのに使用され得る。低酸素環境は、それぞれのパウチ中 へ乾燥剤とともに使用され得る酸素吸収剤を包装することにより作られる。水寒 天（ｗａｔｅｒ　ａｇａｒ）プレートは、９０〜１００％Ｒ，Ｈ，を維持するの に使用され得る。

３５〜４０％のＲ，Ｂ、レベルは、３５〜４０％Ｒ，Ｈ，を含む空気の存在下で 、分生子を包装中に密閉することにより提供され得る。

分生子を所望の酸素およびＲ，Ｅｌ、で感染チェンバーなどのデバイス中に包装 し得る。分生子はまた、好適な条件下で大量に包装され、次いで、害虫にスプレ ー適用するために混合タンク中で懸濁され得る。この実施態様において、菌類分 生子の表面張力を低下させて、菌類の分生子の生存率に影響することなく、適用 担体中で、発芽を促進する界面活性剤を含有するのが望ましくあり得る。分生子 を適用担体と混合した後、現在の十分に処方した菌類試薬を、昆虫の防除のため に処理される植物および他の地域にスプレーするための従来のデバイスおよび方 法を用いて適用する準備が整っている。

菌培養物含有感染チェンバーの包装の好ましい実施態様では、可撓性のあるパウ チ材料は、水蒸気不透過性およびガス不透過性であるものが提供され、そして菌 培養物は、高湿度存在下で包装される。

図面の簡単な説明 図１ａは、期間（日）にわたって防除しない条件下でインキュベートした感染チ ェンノく一内のＭｅｔａｒｈｉｚｉｕＩｏａｎｉｓｏｐｌｉａｅの４つのバッチ の菌類の生存率％のグラフである。

図１ｂは、期間（日）にわたって、好気的（−黒菱形−）または嫌気的（−０− ’）条件下で保存した菌類を含有する感染チェンバーに曝したゴキブリの生存率 ％のグラフである。菌類に曝していないゴキブリの生存率は、（−白四角−）で 示す。

図２は、種々の相対的湿度でインキュベートした感染チェンバー内の菌類の生存 率の三次元グラフである：生存率％対相対湿度対時間。

図３は、２２°Ｃで、０％Ｒ，Ｈ，（黒四角）、３３％Ｒ，Ｈ，（黒丸）、１０ ０％Ｒ，Ｈ，（黒菱形）、および対照（白丸）で保存したＭｅｔａｒｈｉｚｉｕ ｒｎａｎｉｓｏｐｌｉａｅ培養物を含有する感染チェンバーに曝した期間（日） にわたるゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ　ｇｅｒｍａｎｉｃａ）の生存率％のグラ フである。

図４ａ、４ｂ、および４Ｃは、２２°Ｃ（黒四角）、２７℃（白四角）、３２℃ （黒菱形）、および３７℃（白菱形）でのＭ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ株ＥＳＦ ５３（図４ａ）、Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ株ＥＳＦＩ（図４ｂ）、およびＢ ｅａ　ｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａ株ＥＳＦ２（図４ｃ）の期間（週）にわ たる生存率％のグラフである。

図５は、Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ分生子の発芽百分率対１ケ月および２ケ月 の期間２５℃および３７°Ｃの両方で種々の保存条件を作り出す包装システムの グラフである。包装システムは、箔のみ、箔＋ＤｒｉｅｒｉｔｅＴ′、箔＋水寒 天、箔＋＾ｇｅｌｅｓｓ”、箔＋Ｄｒｉｅｒｉｔｅ　Ｔ　Ｍ＋＾ｇｅｌｅｓｓＴ Ｍ、箔＋水寒天＋Ａｇｅｌｅｓｓ”であった。条件（左から右へ）は：２５℃で ４０％Ｒ，Ｈ，＋　２０％　０．；３７°Ｃで４０％Ｒ，ＩＩ。

＋２０％Ｏ、、２５℃で０％Ｒ，Ｈ，＋　２０％Ｏｚ　；　３７℃テＯ％Ｒ，Ｈ 。

＋２０％ｏ、２５℃で１００％Ｒ，Ｈ，＋　２０％Ｏｘ；３７℃でＩＱＯ％Ｒ１ Ｈ，＋２０％　０□；２５℃で４０％Ｒ，Ｈ，＋０％　０２；３７℃で４０％Ｒ １Ｈ，＋　Ｏ％　Ｏ、；　２５℃テ０％　Ｒ，Ｈ，＋０％　Ｏ＊；３７°ＣでＯ ％Ｒ。

Ｈ０＋０％０．；２５℃で１００％Ｒ，Ｈ，＋Ｏ％０．；および３７℃で１００ ％Ｒ，Ｆｌ、　＋　０％　０２であった。

図６は、Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ分生子の発芽百分率対保存後界面活性剤で 処理をして、またはしないで２ケ月間２５℃および３７℃の両方での種々の保存 条件を作り出す包装システムのグラフである。包装システムは、箔のみ、箔十〇 ｒｉｅｒｉｔｅ”、箔＋水寒天、箔＋＾ｇｅｌｅｓｓ”、箔＋Ｄｒｉｅｒｉｔｅ Ｔ１″＋　ＡｇｅｌｅｓｓＴ＆ｌ、箔＋水寒天＋＾ｇｅｌｅｓｓＴ′であった。

使用した界面活性剤は、エトキシ化トリデシルアルコールであった。保存条件は 、図５に記載したのと同じであった。

図７は、２ケ月の異なる環境条件下で保存したＬ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生 子で処理したワックスガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ　ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）の幼虫の 外因的な条件のグラフである。分生子は、（１）新鮮；（２）１００％Ｒ，＋１ ．を保つ水寒天プレートで包装され、２５°Ｃで保存された、（３）Ｄｒｉｅｒ ｉｔｅ”＋＾ｇｅｌｅｓｓＴ′で包装され、２５℃、または（４）３７°Ｃで保 存された。体上に新たに形成された分生子を有する幼虫は、分生子が発芽した（ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ）幼虫として認識された。死亡率は、全ての処理におい て１００％であった。

発明の詳細な説明 昆虫病原性菌類の、特にＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｆｆｌ属およびその分生子の保存 のための包装方法が、記載されている。これらの方法により、菌類の分生子を長 期間保存し得、これに引き続いて、昆虫（ゴキブリ、ハエ、アリ、軟体昆虫、芝 生の害虫、およびイモムシなど）の防除のために使用される。

生物学的防除システムの商業的開発における不可欠な要素は、試薬が相応な保存 期間を有していなければならないことである。相応な保存期間を保証するために 使用される包装システムは、経済的で、そして組立、輸送、および保存が簡単で なければならない。包装は、合理的な温度範囲で、分生子などの所望の菌類胎芽 の型の生存および毒性を保たなければならない。

生存率の維持において最も重要と思われる因子は、相対湿度（Ｒ，Ｈ，）、酸素 、および温度である。本明細書中で使用した［低イＪＲ，Ｈ，は、１０％より低 イＲ，Ｈ，、まりＬｔ　０−１０％（７）Ｒ，）１．を意味し、そして「高いＪ Ｒ，Ｈ，は、９０％より高いＲ，Ｈ，、または９０〜１００％のＲ，Ｈ，を意味 する。中間のＲ，Ｈ，は、３５〜４０％を意味する。酸素レベルは、一般的に、 大気の酸素レベル２０％、低酸素レベル０〜５％、または高酸素レベル９０〜１ ００％の範囲である。

菌培養物の保存条件 本明細書中に援用されている米国特許第５．０５７．３１５号および第５．０５ ７．３１６号に記載の教示では、昆虫病原性菌類（例えば、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉ ｕ＋ｎ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅおよびＢｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａを 包含する）の散布を用いて、ゴキブリおよび他の昆虫の防除および駆除の方法を 記載している。菌類は、昆虫のための入り口を有する、閉鎖されたチェンバーか らなり、そして昆虫にとって病原性の生きた菌類の培養物を含有する汚染チェン バーを用いて、処理される環境に適用される。デバイスの構造は、昆虫がチェン バーに入って病原性菌類の培養物の有効量と接触するようなものである。チェン バーまたは保存用コンテナの形状に関わらず、昆虫感染チェンバー中に使用した 菌類は、酸素の不在下、室温ではほとんど保存されないことが発見された。菌類 が、チェンバー中での分生子の生存率を１％まで減少させ、そしてなお有効であ ることは可能であるが、連続して酸素の出入りがないと、菌類はその生存力を失 い、昆虫に致死量を感染させるのに効果的ではないチェンバーとなる。

菌類はまた高湿度の必要性も有する。保存温度が室温から上昇すると（すなわち 、２２℃〜２５℃が４２℃まで上昇）、相対湿度の必要性が減少する。

これらの両方の必要性（十分な酸素および高い湿度）を満たすために、一般的な 菌培養物と同様に、昆虫保存用チェンバーの酸素および二酸化炭素を含むガスの 自由交換が可能な限り、大部分の水蒸気を保持する包装材料が設計された。材料 は、菌類の胞子、細菌、およびウィルスを包含する微生物不透過性が好ましい。

Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍの保存期間を延ばし得る条件が、本明細書中に記載され ている。これらの条件は、大気および１００％ＲＨ下で、菌類を包装することに より達成される。包装材料は、１００％ＲＨを維持すると同時に、ガスが平衡に 達し得るように選択される。

包装材料 材料の防壁特性（すなわち、材料の層を通してガスが移動すること含むまたは移 動し得る材料の能力）に関して特徴が明らかである種々の材料が、市販されてい る。これらの材料は、堅い型および可撓性のある型の両方がある。防壁フィルム で出来たパウチは、種々の特性および形状において容易に利用し得る。

チェンバーを包装するための最も好ましい材料は、熱で密閉し得る２〜８ミルの 厚さの低密度および高密度ポリエチレン（ポリマーの分枝の程度を言う）である 。ポリプロピレンを包含する他の材料は、ポリエチレンよりわずかにガスの透過 性が低い。以下に示すように、これらの市販材料は、高いガス透過性の他に低い 水蒸気透過性により特徴付けられる。

（以下余白） 表１＝菌培養物のための包装材料の特性材料　水蒸気　ガス透過性ゝ　吸水性 透過性”　０１　Ｎ＊　Ｃｏ！ ポリエチレン　１．３　５５０　１８０　２９００　低い（低密度） ポリエチレン　０．３　６００　７０　４５００　低い（高密度） ポリプロピレン　０．７　２４０　６０　８００　低いａ　９５°Ｆ、９０％Ｒ ，Ｈ，での損失ｇ／２４時間／１００平方インチ／ミル ｂ　７７°Ｆ、５０％Ｒ，Ｈ，でのｃｃ／２４時間７１００平方インチ／ミル； ＡＳＴＭ　Ｄ１４３４−６３ 市販されている他の材料が、等量のガスおよび水蒸気の輸送を提供するために、 ポリエチレンおよびポリプロピレンと代用され得る。これらの材料は、Ｄ　＆　 Ｂ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ、　Ｆａｉｒｒｌｏｕｔｈ、　ＭＮ、またはプラスチック シートの他の提供者から得られ得る。

菌分生子の保存条件 菌類の胞子、分生子は、「不活性」ではなく、かなりの量の酸素を消費する。し かしこの酸素量は、活発に成長している菌類のコロニーにより／ｌ！１費される 酸素量よりは、はるかに少ない。高いＲ，１１，において酸素の出入りがないと 、分生子は生存力を失う。しかし、２５°Ｃで高Ｒ，Ｈ，および大気の酸素レベ ルで包装された分生子は、３７°Ｃで２ケ月間の保存後に発芽する能力を失う。

行ってきた研究は、直に接している環境がほとんど酸素のない（０〜５％）場合 、分生子が低いＲ，Ｈ，（１０％より低い）の存在下で分生子の生存力を維持す ることを示す。低酸素および低相対湿度の必要性を満たすために、あらゆるガス または水蒸気に対して不透過性の包装材料が、乾燥剤と共に用いられ、そして酸 素を除去する化合物またはプロセスと共に用いられ得る。

酸素を消耗または除去するために用いられる材料分生子と共に包装し得る、種々 の酸素吸収剤などの酸素消耗剤がある。パウチまたはあらゆる他の種類のコンテ ナ中の酸素の除去に用いられる酸素吸収剤は、菌分生子には無毒性でなければな らない。例えば、Ａｇｅｌｅｓｓ”は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ　Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｆｏｏｄ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　”Ｂ ”、　５２０　Ｍａｄｉｓ。

ｎ　Ａｖｅｎｕｅ、　ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、　１００２２から市販され ている。Ａｇｅｌｅｓｓ”の主成分は、粉末の活性な酸化鉄であり、これは酸素 の吸着後に酸化鉄および水酸化鉄になる。空気を通さないコンテナ中で、Ａｇｅ ｌｅｓｓ”は酸素を０．０１％（１００ｐｐｍ）またはそれ以下にまで減少する 。選択された酸素吸収剤はまた、乾燥剤と和合しな（すればならない。Ａｇｅｌ ｅｓｓ”　Ｔｙｐｅ　Ｚは、乾燥材料と共に使用するのに特に好適であり、そし て乾燥剤と共に用いられ得る。密閉されコンテナ中で酸素を除去する酸素吸収剤 の容量は、考慮すべき他の因子である。＾ｇｅｌｅｓｓＴ′−Ｚ　３００の１っ のバッグは、３０（１ｍｌの酸素を吸収する容量を有し、これは１５００ｍｌの 大気の体積に相当する。

あるいは、真空にすることにより、または密閉する前に包装を窒素で満たすこと により、密閉時に包装から酸素を除去し得る。

水分を消耗または除去するために用いられる材料種々の乾燥剤が、包装から水分 を除去するために用いられ得、例えば、Ｄｒｉｅｒｉｔｅ”“という無水硫酸カ ルシウムは、Ｗ、＾。

［１ａｍｍｏｎｄ　Ｄｒｉｅｒｉｔｅ　ＣｏＩＩＩｐａｎｙ、　Ｐ、０．　Ｂｏ ｘ　４６０．　Ｘｅｎ１ａ、　０ｈｉｏ　４５３８５から市販されている。Ｄｒ ｉｅｒｉｔｅＴＭは、周囲の高温にさらされた場合に、吸収した水を全く放出し ないので、微生物殺虫剤包装システムに用い得る好適な乾燥剤である。水は、硫 酸カルシウムの部分水和の形状で確実に保たれる；これは水を放出するために３ ５０°Ｆ（１７７℃）より高い温度を必要とする。

これは、種々の天候条件の間で微生物製品を輸送するのに重要な特徴である。ガ スを乾燥するために、ＤｒｉｅｒｉｔｅＴ＆ｌｉ１１０〜１４重量百分率の水容 量を有する。１つのＤｒｉｅｒｉｔｅ”乾燥剤バッグは、密閉した内容物中の湿 度を約１０時間またはそれより少ない時間以内で一１００°Ｆ（−７３°Ｃ）の 露点まで減少する。１つのバッグは、約Ｚｏｏ　−２５０ｃ＋ｎ”の体積を有す る２４ｃｎＸ　１４ｃＩｏのコンテナと用いられる。他の化合物（シリカ、特定 の粘土、ポリアクリル酸誘導体など）、および他の乾燥剤もまた、低いＲ，Ｈ。

環境を作り出すのに用いられ得る。

包装材料 菌培養物を包装するために用いた材料と比べて、分生子を包装するために用いる 材料は、ガス不透過性である。分生子を包装するために好ましい材料は、少なく とも０．００３インチの厚さ、最も好ましくは０．００フインチの厚さのポリエ チレン−アルミニウム箔−ポリエチレンであり、これはＬａｍ１ｎａｔｅｄ　Ｆ ｏｉｌａｎｄ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ、　Ｐｏｒｔｓａ＋ｏｕｔｈ、　Ｎ、Ｈ，か ら市販されている。

１日当たり０．００５ｃｃの酸素／１００平方インチより低い酸素透過率、およ び１日当たり０．００５ｃｃ水蒸気／１００平方インチより低い蒸気透過率を有 する他の材料を用い得る。本明細書中で用いたように、これらの透過の特徴を有 する材料は、水およびガスに対して「不透過性」と考えられる。

、■エチレンバ　の 厚さ　酸素透過性　蒸気透過性 Ｏｚ　ｃｃ／１００平方佇チ／２４時間　ｇ／平方メートル／２４時間０、００ ３インチ または３ミル　０．００５　０ ０、００５インチ または５ミル　ｏ、　ｏｏｏ　。

市販されている類似の材料が、等価なガスを提供するためにラミネート箔に代用 し得、水蒸気の不透過性もまた好適であり得る。これらの材料は、他の提供者か ら入手し得る。

保存のための菌培養物および分生子の包装方法菌培養物または分生子は、熱で密 閉するような当業者に公知の従来の方法を用いて、パウチ材料内に密閉される。

超音波で密閉することが用いられ得るが、好ましくない。分生子は、最小のパウ チ内に密閉され、パウチは密閉時に追加の空気または水を可能な限り加えずに分 生子を含む。

好ましい実施態様では、ガス−不透過性材料ｌこ包装される分生子は、十分量の 乾燥剤および酸素吸収剤と包装され、パウチ内に１０％のＩＩｌ、　）１．より 少ないおよび５％の酸素より少ない条件を作り出す。あるいは、有用ではあるが 好ましくはない実施態様では、ガス−不透過性材料内に包装される分生子は、酸 素吸収剤を省略して、限られた量の乾燥剤と共に包装して、パウチ内を１０％の Ｒ，Ｈ，より少ない条件を作り出す。

包装は、複数のコンパートメントおよびコンパートメントの内容物を混合するた めの手段を含み得る。例えば、処理される領域に付与するための菌胎芽の懸濁液 を形成するために、第１のコンパートメントは界面活性剤を含み得、第２のコン パートメントは菌胎芽を含み得る。同様に、菌胎芽の乾燥処方物を形成するため に、第１のコンパートメントは乾燥界面活性剤を含み得、第２のコンパートメン トは菌胎芽を含む。

界面活性剤 界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）または湿潤剤として公知の界面活性剤（ｓ ｕｒｆａｃｅ　ａｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ）が、保存後の分生子を再活性化する のに用いられ得る。界面活性剤は、５つの主要なりラスに分けられ得る＝（１） アニオン性、（２）カチオン性、（３）非イオン性、（４）両イオン性、および （５）非水溶性。はとんどの場合、カチオン性および非イオン性の試薬は、好ま しい界面活性剤である。それぞれの非イオン性界面活性剤は、より親水性の界面 活性剤がより高い［ＨＬＢ数を有するスケール内でＨＬＢ数を割り当てられる。

ＦＩＬＢ法は、非イオン性界面活性剤に主として適用され、ＨＬＢのＩＯを有す るＩｃｏｎｏｌ　ＴＤＡ、エトキシ化トリデシルアルコール（ＢＡＳＦ　Ｃｏｒ ｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｐｅｒｓｉｐｐａｎｙ、　Ｎ、Ｊ。

０７０５４）のようなものが、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ の保存した分生子に最高の再活性を提供するようである。ＨＬＢ　１０は、Ｉｃ ｏｎｏｌ　ＴＤＡ６（ＨＬＢ＝１１）と、Ｉｃｏｎｏｌ　ＴＤＡ　３（ＨＬＢ＝ ８）とを２　：　１　（ｗ／Ｗ）の比で混合することにより得られ得る。単独で または混合物で、８〜１３の間のＨＬＢを有する他の非イオン性界面活性剤は、 以下の異なる化学物質を有する；ブロックポリマー；エトキシ化アルコール；エ トキシ化アルキルフェノール：エトキシ化アミンおよび／またはアミド；エトキ シ化脂肪酸；エトキシ化脂肪エステルおよびオイル（動物および野菜）；脂肪エ ステル：グリセロールエステル：グリコールエステル；ラノリンに基づく誘導体 ；モノグリセリドおよび誘導体：ポリマー性（多糖類、アクリル酸、アクリルア ミド）：プロポキシ化およびエトキシ化脂肪酸、アルコールまたはアルキルフェ ノール；ソルビタン誘導体：ショ糖およびグルコースエステルおよび誘導体もま た、この目的のために用いられ得る。８〜１４の範囲のＨＬＢを有するいくつか のアニオン性およびカチオン性界面活性剤もまた用いられ得る。アニオン性群ま たは他の群について、分生子の再活性化のために好適ないくつかの界面活　、柱 側があり、それはスルホコハク酸塩（例えば、ジオクチルスルホコハク酸ナトリ ウム）、スルホン酸の塩（例えば、ドデシルベンゼンスルホネート）、ナフタレ ンスルホネートの塩、およびタウレート（ｔａｕｒａｔｅ）（Ｉｇｅｐｏｎ　Ｔ −７７）などである。これらの界面活性剤の例は、以下を包含するニブロックポ リマー、ｅｒｇｉｔｏｌ　１５　Ｓ−５；エトキシ化アルキルフェノール、例え ば、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｎ−５７；エトキシ化アミンおよびアミド、例えば、Ｅｔｈ Ｏのｉｄ　０−１７　；エトキシ化脂肪酸、例えば、ＰＥＧオレ二一トートトキ シ化脂肪エステルおよびオイル、例えば、ＡｌｋａＩＩＩｕｌｓ　ＥＬ−６２０ ；グリセロールエステル、例えば、Ｅｍｅｒｅｓｔ　２４２１　；グリコールエ ステル、例えば、Ｅｔｈｏｘ　Ｄｏ−９；ポリマー性多糖類、アクリル酸、およ びアクリルアミド、例えば、八ＰＧ　３２５グリコシド：プロポキシ化およびエ トキシ化脂肪酸、アルコール、またはアルキルフェノール；ソルビタン誘導体、 例えば、５ｐａｎ６０；ならびにショ糖およびグルコースエステルおよび誘導体 、例えば、Ｃｒｏｄｅｓｔａ　Ｆ−５０゜アニオン性界面活性剤の例は、以下を 包含する：スルホコハク酸（例えば、ジオクチルスルホスクシネート）、スルホ ン酸の塩（例えば、ドデシルベンゼンスルホネートの塩、アルキルナフタレンス ルホネートのナトリウム塩）、リン酸エステル、およびタウレート。

Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅに対する界面活性剤のＨＬＢ数は、好ましくは９〜 １１の範囲内である。Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａに対する界面活性 剤のＨＬＢ数は、好ましくは９〜１４の範囲内である。

分生子を再活性化するのに必要な界面活性剤（すなわち、１種の界面活性剤また は界面活性剤の混合物）の量は、使用する界面活性剤により、分生子の量の０． ０１〜１００％（ｗ／ｖ）（すなわち、１　：１Ｏ００〜１００：　１の範囲の 比率内）と同じくらい低くし得る。

一旦好適なＦＩＬＢ数が決定すれば、適合型の菌胎芽、細菌細胞、または他の微 生物に害のない同じＨＬＢ数を有する他の異なる界面活性剤が、分生子の再活性 化に用いられ得るため、界面活性剤のスクリーニングにおける、ＨＬＢ値の再検 討が好ましい。

好ましい実施態様では、分生子は、包装内で低いＲ，Ｈ，を作り出すために十分 な量の乾燥剤、および包装内で低酸素環境を作り出すために十分な量の酸素吸収 剤と共に箔内に包装される。次いで、この包装を界面活性剤混合物または混合物 の懸濁液を含む、第２の包装の内容物と混合し、付与前に分生子を再活性化する 。さらに、必要に応じて、好ましい界面活性剤を最終処方物として分生子および いくつかの不活性材料と混合し得、そして上記のように保存し得る。分生子は、 界面活性剤、あるいは分生子および界面活性剤を含む処方された材料と最後に混 合されて、スプレー、粉末、錠剤、顆粒、またはゲルとして適用され得る。例え ば、最終処方物の２つの成分（すなわち、分生子および界面活性剤）は、別々に 包装され得、そして適用前に混合され得る。次いで、完全に処方された画側は、 スプレー、水薬、または粉末付与物としてゴキブリ、コナジラミ、アリマキ、シ ロアリ、またはアリなどの昆虫に対して適用され得る。

本発明は、方法および包装材料の種々の特徴の重要性を示している次の限定され ない実施例を参考としてさらに理解される。

次の材料および方法を用いて、次の実施例中の菌培養物の生存率および有効性に おける種々の保存条件の効果を測定した。

虫」象良上 Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ（Ｍ、ａ、）分生子の生存（発芽）百分率は、次の 手法に従って、ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤ＾）プレートを用いて測定 した： ＰＤ＾の新鮮で滅菌したプレートを得る。分生子ローン（ｌａｗｎ）に小さな滅 菌筆の先を軽く触れることにより、分生子を集める。筆先を滅菌ペトリ皿の内側 に触れて、過剰な分生子を取り除く。少量の分生子のみが必要である。ＰＤＡプ レート上の４分の１に分生子を注意深く、そして軽く掃き（ｂｒｕｓｈ）、Ｍｅ ｔａｒｈｉｚｉｕｍ原料の異なる部分から得た分生子を用いて、他の４分の３に 繰り返し掃く。４分の１当たり筆の１回または２回往復で十分である。２８℃で １１〜１３時間、ベトリ皿をインキュベートする。１３時間のインキュベーショ ンの後、それぞれの接種した部分の表面を、２００倍の化合物顕微鏡で検査する 。個々の分生子の検査をし得る視野を見つける。少なくとも２００個の分生子を 数え、そして生存可能な分生子および生存不可能な分生子の数を記録する。生存 可能な分生子は、少なくとも分生子の直径と同じ長さの胚芽管を有する。それぞ れの接種した４分の１について生存可能な分生子／全体の分生子の数を得、４つ の数をともに平均し、そして１００を掛けて生存可能な分生子の百分率を決定す る。

勉に− 実施例１〜６のために、靴箱なかのＢｌａｔｅｌｌａ　ｇｅｒＩｌ］ａｎｉｃａ をバイオアッセイを用いて、効果を測定した。

材料： ポリエステルの蚊用の網で覆われた蓋に空気穴を有する、ポリスチレンの靴保存 箱（１２，５ｘ６．７５ｘ３．６インチ）。

ティッシュ（ｔｉｓｓｕｅ）で栓をした蒸留水が自由に出入りする試験管中で、 Ｐｕｒｉｎａ　Ｌａｂ　Ｃｈｏｗ（Ｐｕｒｉｎａ　＃５００１　；　Ｐｕｒｉｎ ａ　Ｍｉｌｌｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を餌とした成虫ノチャバネゴキブリ （Ｂ、　ｇｅｒｒｌａｎｉｃａ　；　ＪＫ−Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ、＾ｍｈｅｒ ｓｔ、　Ｍ＾）。

靴箱を置いた、温度および湿度が対照であり、そして連続データレコーダーを備 えた環境チェンバー（２８℃および７５％Ｒ，Ｈ，）。

方法： 靴箱の垂直側を、ワセリンの薄い層でコートした。オートクレーブにかけたＰｕ ｒｉｎａ　Ｌａｂ　Ｃｈａｔのペレットおよび水の管を、それぞれの靴箱に入れ た。２０匹のゴキブリを、それぞれの箱の中に入れた。ゴキブリの靴箱を、環境 チェンバーの中に置いた。米国特許第５．０５７．３１５号および第５．０５７ ．３１６号に記載の１つの感染チェンバーを、４つのゴキブリの靴箱それぞれに 入れた。別の４つの靴箱を対照として用いた。

ゴキブリの靴箱を、１０時間の光同期で２８±３℃、および７５±１５％Ｒ，Ｈ ，でインキュベートした。ゴキブリの死亡率を、１週間に１度、６週間記録した 。「死亡」の基準は、昆虫を尖った道具で突いた時、動きを観察しなかった場合 である。

（以下余白） 実施例１：チェンバーを室温で、湿度を制御しないで、保護せずに放置した場合 の菌の生存率の低下異なる４つのバッチの菌類からのチェンバーを、室内温度お よび室内湿度のキャビネットの内部に置いた。数日おきにチェンバーをサンプリ ングし、そして菌類の生存率を決定した。

図１ａに示した結果は、菌類が保護せずに任意の有意な時間間隔にわたって保存 されると、生存率が低下することを示してる。

実施例２：嫌気性条件下でチェンバーを保存した場合の菌の生存率への影響 気密性のふたで密閉できる１クオートの一組の石型の（ｉａｓｏｎ）の容器のそ れぞれの中に、５個の感染チェンバーを置いた。

対照であり、大気条件に曝されるチェンバーは、容器のふたをゆるめておいた。

嫌気性条件に曝すべきチェンバーは＾ｇｅｌｅｓｓＴ′（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ ）脱酸素パックを入れてふたを堅くしめた。

Ａｇｅｌｅｓｓ”パックの中身は微細に分割された酸化されていない鉄くずであ り、これは空気に曝されると酸化し始める。この酸化が上記容器のような密閉さ れた環境で起こると、酸素はすべて除去され、嫌気性環境が形成される。

表３および図１ｂに示すデータは、これらの条件下で４２日間保存した後の感染 チェンバーの平均生存率と有効性とを示している。この結果は、通常の大気湿度 、室温において、長期間の保存を成功させるためには、酸素が必要であることを 示している。

表３＝　感染チェンバーの内部の菌類の生存率実施例３：酸素流を通す、菌の培 養物のための適切な包装材料の決定 感染チェンバー内の生きた菌類がどのようにして酸素を消費するか、そして、菌 類が包装された場合、異なる包装材料が、酸素を通すことによって酸素の不足を どのように軽減するかまたはしないかを決定するために、数種の材料を試験した 。

２つの研究を行った： １）菌類を入れた６個のチェンバーを、次のいずれかの中に置いた：　（ａ）Ｒ ｕｂｂｅｒａ＋ａｉｄ”容器（７，５インチスフ。５インチ×２゜７５インチ） 、（ｂ）および４ミル（０，００４インチ）の低密度ポリエチレンパウチ（Ｌ　 Ｄ　Ｐ　Ｅ　）　（Ｄ＆Ｂ　ＰｌａｓｔｉｃｓＳＦａｉｒｍｏｕｔｈ、　ＭＮ） 、または（ｃ）８　ミルのＬＤＰＥパウチ。それぞれについて、ｒＡＪおよびｒ ＢＪで示す２個の試料があった。ＲｕｂｂｅｒのａｉｄＴ′容器は厚いポリプロ ピレンでつくられており、これは酸素透過性の低い材料であるが、ふたのシール の周囲から容器への酸素の移動が起こり得る。表１に示したように、ＬＤＰＥは その低い水蒸気透過特性と高い酸素および二酸化炭素透過特性で知られている。

包装されたチェンバーを３０℃で１４日間保存した。この期間の最後に、包装の 内部の酸素および二酸化炭素の含有量を、５ｅｒｖｏＩｏｅｘ”　Ｃｏｌｌ１ｐ ａｎｙＳＮｏｒｖｏｏｄ、　Ｍ＾のガス分析装置を用いてサンプリングした。次 に、チェンバー内の菌類の平均生存率を決定した。結果を表４に示す。

表４３０℃、１４日後の、感染チェンバーの包装内の状態 ０２％　ＣＯ，％　生存率％ ２）１２個のチェンバーを、箔をラミネートしたパウチ（Ｌａｍｉｎａｔｅｄ　 Ｆｏｉｌ　ａｎｄ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ１Ｐｏｒｔｓａ＋ｏｕｔｈ、　ＮＨ）の 数種のそれぞれの中に密閉した。ラミネートは、ポリエチレン−アルミニウム箔 （０，０００フインチ）−ポリエチレンであった；この包装材料は、いかなるガ スまたは蒸気に対しても完全に不透過性であると考えられる。このパウチを保存 し、そしてその酸素および二酸化炭素のレベルを次に測定した。各サンプリング 点に対して２個のパウチを用いた。

結果を表５に示す。酸素はすべて消費されそして二酸化炭素が大量に生成された ことが示されている。次に、菌類の平均生存率を決定した。

表５３ケ月後の箔パウチ内部の状態 ０：％　ｃｏ！％　生存率％ これらの２種の実験の結果から、菌類による酸素消費の程度が示され、そして、 他の実施例と組み合わせると、適切な包装を提供することの重要性が示される。

酸素に接近できる菌類は生き残っている。

実施例４：菌類の保存安定性に対する高湿度の重要性菌類を入れた５個の感染チ ェンバーを数組のＲｕｂｂｅｒｍａｉｄ”容器のそれぞれの中に置き、容器内の 相対湿度（Ｒ，）１．　）が菌類の長期間の保存安定性に対して果たす役割につ いて測定した。−組の容器は、その内側に濡れたスポンジを置くことで容器雰囲 気を１００％Ｒ，Ｈ，に保った。他の一組の容器は、その中に塩化マグネシウム （Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２）の飽和溶液を置き、３ｏ％Ｒ，Ｈ，に保持した。最後の組 の容器は、内部に多量のシリカゲルを置くことにより、０％Ｒ，Ｈ，に保った。

これらの容器をすべて室温で保存し、そしてこの容器中のチェンバーを周期的に サンプリングして、長期間にわたる菌の生存率とチェンバーの有効性を決定した 。

結果を表６および図２に示す。これらの結果は、１４ケ月にわたっての保存での 、測定された平均生存率を表およびグラフの形に表したものである。９ケ月の感 染チェンバーの有効性も、図３に示す。

この結果は、長期間の菌類の保存を成功させるためには、１００％Ｒ，Ｈ，が他 の湿度よりも顕著に良好であることを示している。

表６二種々の相対湿度に対する生存百分率１週　８１　６１．１　６９．１ ２週　６９　７４　５１ ３週　６８．５　７３，１　１９．２ １　ケ月　６７、コ　コ０．５　１２．７６週　５８．４　１１．４　０．５４ ２ケ月　５３．５　２８　２３．９ ３　ケ月　７８．３　１５．３　２９．８６ケ月　８２．３３　、０．０Ｂ　０ ．７４実施例５：興なる市販の包装材料の、菌類を長期保存するために遺した条 件を提供する能力に関する比較１２個の感染チェンバーを２組のパウチのそれぞ れのパウチの中に置いた。１組目のパウチは８ミルのＬＤＰＥであった。他の組 のパウチは実施例３のように箔ラミネートされていた。パウチを２２°Ｃまたは ３０℃のいずれかで保存した。

菌類の寒天成長培地（これは、菌類の成長（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の後もチ ェンバー内に残る）により、パウチ内を１００％Ｒ−Ｈ，とじた。

周期的な間隔でパウチを保存条件下から取り出し、そして最初にガス含有量につ いてのサンプリングを行った。各試料は２個のパウチ（ＡおよびＢ）から成って いた。得られた結果は実施例３の結果と一致した。すなわち、短期間の間に、箔 ラミネートされたパウチ内の酸素は無くなったが、ＬＤＰＥパウチ内にはかなり の量が残っていた。次に、パウチを開き、その中のチェンバーを、菌類の生存率 についてサンプリングした。この結果は、３ケ月で、酸素透過性（ＬＤＰＥ）パ ウチと酸素不透過性（箔）パウチとの間に明確な差異が現れることを示す。

菌培養物が酸素を必要とし、そしてＬＤＰＥの袋が菌類の生存率を長期間にわた って維持するのに充分な交換（ｅｘｃｈａｎｇｅ）を可能にすると結論すること ができる。

（以下余白） 表７Ａ：箔パウチ内の３ケ月目の状態 。２％　００１％　生存率％ ０２％　ＣＯ，％　生存率％ ９２．１ ２２’ＣＡ　：：：　晋　９ｏ、９ ３．０．　８６．０ ”°ｃＡ：：盃４．２　８７．８ 実施例６：異なる菌の生存率に対する包装条件の比較図４ａ、ｂ、およびＣは、 実施例３で記載した条件下で保存した３種の異なる菌の、時間に対する生存百分 率を示している。ＥＳＦＺ株はＢｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａ株であり 、そしてＥＳＦＩ株およびＥＳＦ５３株はＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏ ｐｌｉａｅ株である。

同一条件下では、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａ株は、両方のＭｅｔａ ｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ株を保持する包装材料と同一の包装材料 を用いても、良好に生存しない。これらの結果は、菌の生存を促進する包装の有 効性に関して、他の種類の微生物の包装置こ関するデータから菌について類推す ることが不可能であることを示している。

実施例７：菌分生子の生存率および有効性に対する、種々の保存条件の効果の決 定 以下の材料および方法を用いて、菌分生子の生存率および有効性に対する、種々 の保存条件の効果を決定した。

Ｂ、　ｂａｓｓｉａｎａまたはＭ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生子の生存率を 、各パウチ（反復実験）中で保存された分生子を、上記のようにジャガイモデキ ストロース寒天（ＰＤＡ）プレート上に線状に筐ることにより、決定した。ＰＤ Ａプレート上のＢ、　ｂａｓｓｉａｎａの分生子を２２℃で１８時間インキュベ ートし、そして麗。

ａｎｉｓｏｐｌｉａｅは２５℃で１５時間インキュベートした。インキュベート の後、各ＰＤＡプレート上の発芽した分生子の数を数えた。各反復実験の生存率 は発芽百分率として表す。次いで、各処理の平均発芽百分率を４回の反復実験か ら計算し、そして標準偏差とともに示した。

Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅのＥＳＣ−１株およびＢ、　ｂａｓｓｉａｎａのＥ ＳＣ−１７０株を用い、モして菌胎芽タイプである用いた分生子を小さい秤量皿 （ｐａｎ）の中に保持した。このタイプは分生子からなり（これは菌糸体層を「 掃き落として（”ｂｒｕｓｈｅｄ”ｏｆｆ）Ｊある）、秤量皿の中に置いた。Ａ ｇｅｌｅｓｓＴ＆′を用いて、直ちに低酸素（く５％）環境を形成した。Ａｇｅ ｌｅｓｓ”　Ｚ−３００タイプを用いた。なぜなら、これは乾燥物質に特に適し ており、そして乾燥剤とともに用い得るからである。１袋のＡｇｅｌｅｓｓＴ＆ ｌＺ　３００は３００＋ｎｌの酸素を吸収し得、これは容積１５００ｎ＋１の空 気に対応する。箔パウチ（袋）の容積は約２５（ｌｎｌであった。特定のパウチ については、菌を有していす、かつ分生子に直接接触しない水寒天（ｗａｔｅｒ 　ａｇａｒ）プレートから発生する水蒸気によって、実験の間中、その内部にお いて高いＲ，１１，を維持した。Ｄｒｉｅｒｉｔｅ”を用いて、特定のパウチの 内部のＲ，Ｂ、レベルを１０％未満に低減した。１オンスのＤｒｉｅｒｉｔｅ” の袋を、より低いＲ，［１，環境を必要とする各パウチ内にパックした。箔パウ チでは空気の交換はなかった。

処理物はすべて、２５℃および３７℃で４週間または８週間のいずれかの期間イ ンキュベートした。各処理ごとに４回の反復実験を行い、この４回の反復実験の 平均を標準偏差とともに示した。

大気の酸素レベル（２０％Ｏｘ）でのＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏｐｌ ｉａｅについての結果を図５に示す。ｋｌ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生子はＢ 、　ｂａｓｓｉａｎａの分生子に比べて安定性が低い。これらは、２５０Ｃで通 常の大気の酸素レベルかつ９０〜１００％Ｒ，［１，で包装されると十分に生存 するが、３７°Ｃで他のＲ，Ｈ，と酸素の組み合わせでは、生存率が損失する。

０〜５％の酸素かつＯ〜１０％Ｒ，Ｈ，レベルで包装されると、２５℃および３ ７℃で２ケ月の保存の後、それぞれ５６％および２６％の分生子が発芽した。

実施例８二保存したＭ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの乾燥分生子のための適切な界 面活性剤の決定 発芽百分率の影響に基づいて、異なる化学的性質および異なるＨＬＢ値を有する 界面活性剤をスクリーニングした。

特定のＨＬＢ数または化学的性質を有する界面活性剤溶液／懸濁液１００ｎｌを ２５ｈ＋１のビーカーに入れた。ｏ、　ｏｉ　ｇから０．５ｇの乾燥分生子を、 この界面活性剤溶液または懸濁液の表面上に撒いた。分生子試料が界面活性剤溶 液で濡れたら、この溶液を１００＋ｎｌのメスシリンダーに移し、そして倒置す ることにより混合した（１分間に３０回）。分生子を、室温で、メスシリンダー の底に沈降させた。上澄み液をデカンテーションし、そして沈殿した分生子を滅 菌綿棒でサンプリングした。次に、ＰＤＡプレートに各分生子試料を接種し、２ ５℃で２５時間インキュベートし、そして総分生子を１００として発芽した分生 子の数を決定した。

結果を表８および図６に示す。図６は、２５℃および３７℃で２ケ月間、種々の 保存条件を生じる、種々の包装システムに対するＭ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの 発芽百分率（保存の後、界面活性剤処理を行うかまたは行わずに決定された）の グラフである。

包装システムは、箔のみ、箔十Ｄｒｉｅｒｉｔｅ？１″、箔十水寒天、箔＋　Ａ ｇｅｌｅｓｓ”、箔＋Ｄｒｉｅｒｉｔｅ”＋　Ａｇｅｌｅｓｓ”、箔＋水寒天＋ ＾ｇｅｌｅｓｓ”とした。用いた界面活性剤は、親水性−親油性バランス（ＨＬ Ｂ）数が１０のエトキシ化トリデシルアルコールであった。分生子に１０秒間ポ ルテックスをかけ、そしてこの界面活性剤に１５分間浸漬した。

表８：保存されたＬ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの乾燥分生子の再活性化に対する、 ＨＬＢＩＯのエトキシ化トリデシルアルコール０．０５％（ｖ／ｖ）溶液への分 生子の浸漬の効果処理　発芽％　標準偏差 乾燥分生子、対照　２０．６２．７ この結果は、Ｍ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生子をエトキシ化トリデシルアル コール（親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）数が１０）のような適切な界面活性 剤に浸漬すると、発芽率が、それぞれ５６％から７７％におよび２６％から７４ ％に上昇することを明確に示している。

実施例９：保存した分生子の有効性のバイオアッセイによる決定 保存した分生子の有効性を対照のワックスガ（Ｇａ１ｌｅｒｉａ　ｒｈｅｌｌｏ ｎｅｌｌａ）に対してバイオアッセイすることにより試験した。

ワックスガの最終齢幼虫は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂａ１ｔ、　１５２０　Ｋｎａ ｐｐ　Ｓｔ、、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　２１６、ＣｈｅｔｅｋＳＷｉｓｃｏｎｓｉｎ　 ５４７２８から入手した。

表９：２ケ月後の箔パウチ内部のガス組成および相対湿度ワックスガの最終齢幼 虫を小さいビーカー中の、あらかじめ撹拌した分生子の懸濁液に漬けて１５秒間 保持した。１０匹の昆虫の群を一緒に茶こしの中に入れて処理し、そして１罰１ の脱イオン水で湿らせたバーミキュライトとともに１００■のプラスチックのベ トリ皿の中に置いた。４日後および１１日後の死亡率を記録した。すべてをさら に１週間保持し、そして外側の分生子の発芽（ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ）を記録 した。

することによって試験した。条件は以下の通りであった＝（１）２５℃で９０〜 １００％Ｒ，Ｈ，および大気の酸素レベル、（２）２５℃で０％Ｒ，Ｈ，および ０〜５％の酸素、および（３）３７℃で０％Ｒ，Ｈ，および０〜５％の酸素でそ れぞれ２ケ月間。これらの３種の異なる群の分生子で処理して、Ｍ、　ａｎｉｓ ｏｐｌｉａｅの分生子が発芽した幼虫の百分率を図７に示した。これが、新鮮な 分生子と同等かそれ以上であることが示された。

（以下余白） ままであり、その結果、高温レベルであっても良好に生き残（Ｒ，Ｂ、　’）に 対するＭ、　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ分生子の生存率２ケ月保存後のガス組成およ び生ＴＹ 密閉時。ガニ組成　。・％　ｃｏ・％　生存率％Ｒ，Ｈ，０−Ｌｏｔ　＋　０１ ０２　０．４　０．０　５６．ＩＲ，Ｈ，３５−４０％　＋　２０１０２２０． ２　０．５　２０．１Ｒ，Ｈ，１ｓ−４ｏｔ　＋　０１０２　０．４　０．ｏ　 １ｓ、２Ｒ，Ｈ，９ｏ−Ｌｏｏｔ　＋　２ｏ＠　０２１９．３　Ｌ２　９５．。

Ｒ，Ｈ，９ｏ−１ｏｏｔ　＋　ｏｔ　ｏ２　０．５　ｏ、ｏ　３７．ＩＲ，Ｈ， ０−Ｌｏｔ　＋　０１０２　０．４　０．０　２６．４Ｒ，Ｈ，コ５−４０ｔ　 ＋　２０１　０２　２０．４　０．３　０．０Ｒ０Ｈ，コ５−４ｏｔ　＋　０％ 　Ｏ□　０．４　０＋０　０．ＯＲ，Ｈ，９Ｏ−Ｌｏｏｔ　＋　２０１０．　１ ６．７　３．３　０．ＯＲ，Ｈ，９Ｏ−Ｌｏｏｔ　＋　０１０２　０．４　０． ０　０・Ｏ要約すると、低いＲ，Ｉ＋、の包装は、分生子が急速に脱水され、そ して休眠状態になると考えられる環境を提供する。低酸素の環境で保存され、脱 水された分生子は、保存中休眠状態のる。しかし、脱水により表面張力が増大し 、そして保存の後は発芽が低減する。適切な界面活性剤の使用により分生子の表 面張力が低下し、そして再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）が促進され休眠が破 られる。

この好適な実施態様では、包装はガス不透過性で水蒸気不透過性の、可撓性のあ るパウチ材料（アルミニウム箔および低密度ポリエチレン被覆アルミニウム箔な ど）で作成される。

この包装によって、し４中に一定の酸素およびＲ，Ｈ，レベルが確実になる。低 酸ムかつＯ〜１０％Ｒ，Ｈ，の条件下では、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａ ｎａの分生子は２５℃および３７℃の両方で２ケ月間良好に生き残った。しかし 、同じ条件（２５℃および３７℃で、低酸素かつＯ〜１０％Ｒ，Ｈ−）下で保存 したＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生子の発芽率は、それ ぞれ、わずか５６％および２６％である。これらの分生子を界面活性剤（例えば 、ＨＬＢ　１０の０．０５％（ｖ／ｖ）エトキシ化トリデシルアルコール）に１ ５分間浸漬すると、発芽率が顧著に上昇して、それぞれ、７７％および７４％と なった。

日数 ＦＩＧ、Ｉ。

日数 ＦＩＧ、Ｉｂ ＦＩＧ、２ 日数 ＦＩＧ、３ ２Ｊ　４週　６週　８週　１０週　１２週ＦＩＧ、　４σ Ｆ／に、４ｂ ＦＩＧ、４ｃ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ フロントページの続き Ｃ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、Ｋ Ｐ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＯ，ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ 、ＳＫ、ＵＡ、ＶＮ （７２）発明者　ジョンソン、キャロル　アンアメリカ合衆国　マサチューセッ ツ ０１６０３　、ウースター、ボルト　リュ　ロード　６ （７２）発明者　ぺり−、ポール アメリカ合衆国　マサチューセッツ ０１７２０　、　アクトン、ドラマ−ロード　８５（７２）発明者　ミラー、デ ィピッド　ダブリュー。

アメリカ合衆国　マサチューセッツ ０１００２　、アムハースト、ティーベリー　レーン　２７

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ菌培養物を長期間保存する方法であって、該菌培養 物を、ガス透過性、水蒸気不透過性材料中に、１００％の相対湿度存在下に密閉 する工程を包含する、方法。
2. ２．前記材料が可撓性の膜である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記材料が、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、およびポリプロピ レンからなる群から選択され、ここで該材料の厚みが２ミルと８ミルとの間であ る、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記材料が、菌培養物を含有する栄養培地を取り巻いている熱で密閉された 袋である、請求項１に記載の方法。
5. ５．前記菌培養物が、昆虫用の感染性チェンバーに含まれている、請求項１に記 載の方法。
6. ６．前記菌類が、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅである、請求 項１に記載の方法。
7. ７．包装されたＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ菌培養物であって、栄養培地上の生きた 菌培養物、および 該菌培養物をカプセル化する包装材料を含む培養物：ここで、該材料はＯ２およ びＣＯ２透過性であり、そして水蒸気不透過性であり、そしてカプセル化された 該菌培養物の相対湿度は１００％相対湿度である。
8. ８．前記材料が可撓性の膜である、請求項７に記載の培養物。
9. ９．前記材料が、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、およびポリプロピ レンからなる群から選択され、厚みが２ミルと８ミルとの間である、請求項７に 記載の培養物。
10. １０．前記培養物が、感染性チェンバーに含まれ、昆虫誘引性であり、そして該 昆虫が該チェンバーに入ると致死量の菌類で昆虫を感染させるように設計されて いる、請求項７に記載の培養物。
11. １１．前記菌類が、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅである、請 求項７に記載の培養物。
12. １２．菌胎芽（ｆｕｎｇａｌ　ｐｒｏｐａｇｕｌｅ）を、長期間、室温およびさ らに高温の両方で、包装中で安定に保存する方法であって、該包装の酸素含有量 が５％よりも少なく、そして相対湿度が１０％よりも低く、そして該包装材料が ガスと水蒸気の両方に対して不透過性である、方法。
13. １３．前記胎芽が乾燥剤および酸素吸収剤とともに包装される、請求項１２に記 載の方法。
14. １４．密閉する前に、減圧を適用することにより、または前記包装に窒素を吹き 込むことにより、酸素を枯渇させる、請求項１２に記載の方法。
15. １５．前記菌胎芽がＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ属の胎芽である、請求項１２に記載 の方法。
16. １６．菌胎芽を、長期間、室温およびさらに高温の両方で安定に保存するための 処方物であって、酸素含有量が５％よりも少なく、そして相対湿度が１０％より も低い包装を含み、ここで該包装材料がガスと水蒸気の両方にたいして不透過性 である、処方物。
17. １７．前記胎芽が乾燥剤および酸素吸収剤の存在下で包装される、請求項１６に 記載の処方物。
18. １８．前記菌胎芽がＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ属の胎芽である、請求項１６に記載 の処方物。
19. １９．前記包装材料が、（ｉ）１日あたり、０．００５ｃｃ（Ｏ２）／１００平 方インチより低い酸素透過率、および（ｉｉ）１日あたり、０．００５ｃｃ（水 蒸気）／１００平方インチより低い水蒸気透過率を有する、請求項１６に記載の 処方物。
20. ２０．分生子処方物に界面活性剤を導入し、そして該分生子を相対湿度および酸 素の低い条件下に包装する工程により、菌胎芽の表面特性をその生存率に影響を 及ぼすことなく改変する方法。
21. ２１．前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、およ びそれらの組み合わせからなる群から選択され、親水性−親油性バランスが８〜 １４の範囲内である、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記非イオン性界面活性剤が、ブロツクポリマー、エトキシ化アルコール 、エトキシ化アルキルフェノール、エトキシ化アミンおよびアミド、エトキシ化 脂肪酸、エトキシ化脂肪エステルおよびオイル、グリセロールエステル、グリコ ールエステル、多糖類のポリマー、アクリル酸のポリマー、アクリルアミドのポ リマー、プロポキシ化およびエトキシ化脂肪酸、アルコールフェノール、アルキ ルフェノール、ソルビタン誘導体、およびショ糖およびグルコースエステル、お よびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. ２３．前記アニオン性界面活性剤が、スルホコハク酸塩、スルホン酸塩、リン酸 エステル、タウレート（ｔａｕｒａｔｅ）、およびそれらの混合物からなる群か ら選択される、請求項２１に記載の方法。
24. ２４．前記界面活性剤が、前記菌胎芽に、１：１０００から１００：１の範囲の 割合で混合される、請求項２１に記載の方法。
25. ２５．前記菌胎芽が、ＢｅａｕｖｅｒｉａおよびＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍからな る群から選択される属の昆虫病原性菌由来である、請求項２１に記載の方法。
26. ２６．界面活性剤を含有する溶液を菌胎芽と混合し、処理される領域に付与する ための菌胎芽懸濁液を形成する工程により、 菌胎芽の表面特性をその生存率に影響を及ぼすことなく改変する方法。
27. ２７．前記懸濁液を処理される領域に付与する工程をさらに包含する、請求項２ ６に記載の方法。
28. ２８．乾燥界面活性剤を菌胎芽と混合し、処理される領域に付与するために適切 な、あるいは再懸濁に適切な乾燥処方物を形成する工程により、 菌胎芽の表面特性をその生存率に影響を及ぼすことなく改変ずる方法。
29. ２９．前記乾燥処方物を処理される領域に付与する工程をさらに包含する、請求 項２８に記載の方法。
30. ３０．菌胎芽の懸濁液を形成するための装置であって、複数のコンパートメント （ここで第１のコンパートメントは界面活性剤を含み、そして第２のコンパート メントは菌胎芽を含む）、および該コンパートメントの内勤を混合して、処理さ れる領域に付与するための該菌胎芽の懸濁液を形成するための手段を有する、装 置。
31. ３１．菌胎芽の乾燥処方物を形成するための装置であって、複数のコンパートメ ント（ここで第１のコンパートメントは乾燥界面活性剤を含み、そして第２のコ ンパートメントは菌胎芽を含む）、および該コンパートメントの内容物を混合し て、菌胎芽の乾燥処方物を形成するための手段を有する、装置。