JPH07502884A - 薬剤としての変異増殖因子受容体および癌治療のためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 薬剤としての変異増殖因子受容体 および癌治療のためのその使用 本発明は、シグナル伝達活性か欠損しており且つ治療学的性質を有する変異受容 体チロシンキナーゼ、少なくとも１種の変異受容体を含有する薬剤、および受容 体チロシンキナーゼの無制御の機能亢進に関連する病気の治療のだめの該変異受 容体の使用に関する。

細胞増殖は生物体の特定の必要に応じて注意深く制御された過程である。幼若な 生物体では、細胞分裂速度か細胞の死亡速度よりもまさっており、生物体の大き さを増加せしめる。完全に成長した生物体ては、新しい細胞の増殖と細胞致死と は「定常状態」が形成されるように釣り合いが保たれている。しかし、まれな場 合ではあるか、細胞分裂の制御が崩壊し、生物体内のこの型の細胞数が増加する 特別の必要が何らないのに、細胞が勝手に増殖と分裂を始めることかある。この 無制御の細胞増殖か癌の原因である。転移に結びつく無制御の細胞増殖を引き起 こし得る要因は、しばしば化学的性質のものたけてなく、放射能照射のような物 理的性質のものでもあり得る。

現在、２つの選択肢か癌の治療に実質上利用可能である。外科的介入により病的 生物から癌細胞を完全に除去することて成し遂げられるか、または例えば薬剤の 投与によるかもしくは放射線療法のような物理的治療法によって生物体の形質転 換細胞を無害にしようと試みられる。

化学療法にはしばしば薬剤か使われるか、これらの薬剤は何らかの形でＤＮＡ代 謝を妨害して迅速に増殖している細胞を傷つけ、分裂していないかまたはゆっく りとしか分裂していない細胞よりも一層強力に高いＤＮＳ代謝効率を供給しなけ ればならない。しかしながら、多くの化学療法の重大な欠点は使用する活性物質 の低特異性であり、この結果として化学療法では健康な細胞までも傷つけられて しまう。活性物質のこの低特異性は更に、各場合ごとにそれらの用量を癌細胞の 致死と同時に健康な細胞への損害ができる限り少なくなるようにしなければなら ないことを必要とする。これはしばしば不可能てあり、癌細胞か次第に広がって いき末期には生存機能の不全を引き起こして癌患者は死亡する。

本発明の目的は、有益な治療学的性質を有する更なる活性物質および該活性物質 を含有する薬剤を利用可能にすることてあり、該活性物質または薬剤は特に癌性 疾患の治療に有利である。

この目的は、本発明によれば、ノブナル伝達活性か欠損している変異受容体チロ シンキナーゼによりおよび少なくとも１つの変異受容体チロシンキナーゼを含有 する薬剤により達成される。

本発明のより良い理解のために本明細書中で使用する用語をここで詳細に説明す る。

［受容体チロシンキナーゼＪは、チロシンキナーゼ活性を示すいずオ］の種類の 受容体も意味する。この用語はチロシンキナーゼ活性を示す増殖因子受容体並び にＨＥＲ２またはｍｅ４受容体を包含する。

［ノブナル伝達活性か欠損しているＪとは、変異受容体がもはや細胞外増殖シグ ナルまたは他のシグナルを細胞内シグナルに変換することかできず、その結果前 記シグナルか部分的に抑制されるかまたは完全に遮断されることを意味する。

「増殖因子」は、任意の分裂促進性化学物質、通常は正常のおよび／または形質 転換されだ補乳動物細胞から分〜、されそして細胞増殖の調節、特に細胞増殖の 刺激および細胞の生存力の維持において重要な役割を果たすポリペプチドを意味 する。「増殖因子」なる用語は、例えば表皮増殖因子（ＥＧＦ）　、血小板由来 増殖因子（ＰＤＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）を包含する。

「増殖因子受容体」は、細胞膜内外に及んでおり、増殖または分化因子を結合し 、そしてそれ自身細胞内部分にチロシンキナーゼ活性を有するかまたはそのよう な活性と関連づけられるポリペプチドを意味する。

「変異受容体チロシンキナーゼ」は、野生型受容体と比較して構造的変化を含ん でいるチロシンキナーゼ受容体であって、その結果としてもはや野生型受容体の チロシンキナーゼ活性をもたないような受容体を意味する。

［変異増殖因子受容体」は、野生型受容体と比較して構造的変化を含んでいる増 殖因子受容体であって、その結果としてもはや野生型受容体のチロシンキナーゼ 活性をもたないような受容体を意味する。

［野生型増殖因子受容体」または他の「野生型」受容体は、チロシンキナーゼ活 性を示し、従ってソゲナルを伝達することかできる天然に存在する増殖因子受容 体または他の受容体を意味する。

増殖因子受容体または他の受容体の「細胞外領域」は、通常は細胞から細胞外環 境中に突き出ている受容体の部分を意味する。細胞外領域は、例えば、増殖因子 または他の分子が結合する受容体部分を含んで成る。

増殖因子受容体または他の受容体の「経腸領域」は、通常は該受容体を発現する 細胞の細胞膜の中に位置している受容体の疎水性部分を意味する。

増殖因子受容体または他の受容体の「チロシンキナーゼ領域」または「細胞質領 域」は、通常は細胞の内側に位置しておりチロシン残基のリン酸基転移を果たす 受容体の部分を意味する。

「有効量」は、所望の治療効果を達成することかできる本発明の組成物のｌを意 味する。

［血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）Ｊは、血中血小板に含まれ、間充織由来細胞 を刺激し、そしてそれがＰＤＧＦ野生型受容体に結合すると自己リン酸化タンパ ク質チロシンキナーゼ活性を刺激する分裂促進性ポリペプチドを意味する。

「表皮増殖因子（ＥＧＦ）Ｊは、通常は繊維芽細胞中で分裂促進応答を生成し、 ＥＧＦ野生型受容体の自己リン酸化タンパク質チロシンキナーゼ活性を刺激する 分裂促進性ポリペプチドを意味する。

「過形成に基づく病気」とは、例えば、皮膚表皮、腸の上皮、肝細胞、繊維芽細 胞、骨髄細胞、他の骨細胞、軟骨および平滑筋を包含する組織または器官の病気 を意味し、該病気は乾麻や子宮内膜過形成のように組織または器官の細胞数の増 加によって特徴付けられる。

ｒＨＥＲ２Ｊは、表皮増殖因子受容体との配列相同性を示す受容体チロシンキナ ーゼを意味する。

「リポソーム」は、水性環境を取り囲んだ脂質二重膜により形成されている水性 媒質中の粒子を意味する。

「過剰活性」は、過剰な細胞分裂活性や他の結果、例えば同様の細胞型の正常細 胞に比へて成る種の癌細胞において起こる結果を引き起こす、増殖因子により付 与される制御できない過剰なノブナル伝達経路の活性化を意味する。

「絹換えベクターｊは、正常受容体または変異受容体チロシンキナーゼをコート する核酸断片を組み込むために組換えＤＮＡ技術を使って遺伝学的に変更された ベクターを意味する。組換えベクターはけ的細胞に感染せしめることかでき、且 つ正常または変異受容体を発現するように標的細胞を誘導することができる。

「組換えレトロウィルスベクター」はレトロウィルスである組換えベクターを意 味する。

本発明によれば、変異受容体チロシンキナーゼが、受容体チロシンキナーゼの機 能亢進に関連づけられる病気を治療するために利用することかできる有益な治療 学的性質を有することを示すことかできた。前記変異受容体は特に癌疾患の治療 に適する。

増殖因子受容体はヒトの癌細胞の発達と増殖に重大な役割を果たしている。健康 な細胞では、増殖因子受容体は細胞増殖の制御に関与している。細胞分裂の実際 のシグナルは、生物体の必要性の関数として形成される増殖因子である。該受容 体はシグナル伝達の機能、すなわち細胞外の増殖シグナルを細胞の内部で細胞分 裂活性に変換することに関与していると考えられる。多くの増殖因子受容体では 、増殖因子を細胞外領域に結合した後でタンパク質中のチロシン残基にリン酸基 を転移する該受容体の能力が重要な役割を表している。

それらの受容体は受容体チロシンキナーゼとも呼称される。受容体チロシンキナ ーゼの概説はＹａｒｄｅｎ、　Ｙ、およびＬｌｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、、　Ｒｅｖ 。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、　１９８８．５７．４４３−７８に見つかる。増殖因子の結合 後のそれらの増殖因子受容体の三量化は、シグナル伝達の過程のもう１つの重要 な段階である。チロシンキナーゼ活性を有する増殖因子受容体による細胞外シグ ナルから細胞内シグナルへの変換は、次の５段階に分けることかできる： １）受容体の細胞外領域への増殖因子（リガンドとも呼ばれる）の結合かコンホ メーションの変化を誘導し：これが２）コンホメーションを変えた受容体の三量 化を引き起こし；これは ３）細胞質領域中のアロステリック変化の同時誘発を伴い、これによって他方で はキナーゼ活性が誘導され。

４）受容体二量体中のチロシン残基のリン酸基転移が起こり、活性化された受容 体コンホメーションを生成・安定化し；そして５）ポリペプチド基質のリン酸化 と細胞性因子との相互作用が起こる。

受容体の過剰発現または突然変異によるこのシグナル伝達連鎖の無制圓の過剰活 性は、結果として対応細胞の過剰な分裂活性、極端な場合には、形質転換された 癌細胞に至る。増殖因子受容体および細胞外環境から細胞内環境へのシグナル伝 達におけるそれらの機能並びに異常発現された受容体によって起こり得る癌の発 達に対する影響についての概説は、Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、およびＳｃｈｌｅｓ ｓｉｎｇｅｒ、　Ｊ。

（１９９０）　Ｃｅ１ｌ　６１．２０３−２１２に記載されている。

表皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）は、チロシンキナーゼ活性を有する１７０　 ｋＤの糖タンパク質であるＣＵｌｌｒｉｃｈら（＋９８４）、　Ｎａｔｕｒｅ３ ０９、４１８−４２５）。それのりガントの結合およびそれのキナーゼ活性の刺 激の際の分子過程はＵｌｌｒｉｃｈら（＋９９０）　Ｃｅ１ｌ　６１．２０３− ２１２に詳細に記載されている。ＥＧＦは通常は繊維芽細胞中の分裂促進応答を 引き起こすが、受容体の過剰発現の結果生じるＥＧＦ受容体によるシグナル伝達 過程の過剰活性は、Ｎ［）（３Ｔ３マウス細胞のリガント依存性形質転換を引き 起こすＣＲｉｅｄｅｌら（１９８８）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．　１４７７−１４８］およびＤｉ　Ｆｉｏｒｅら（１ ９８７）、　Ｃｅ１ｌ　５１．　１０６３−１０７０）。多くの臨床実験は、乳 癌、卵巣癌および肺癌といった特定の癌の発達におけるこの受容体の機能を支持 しているＣ３ｌＣ５１ａら（１９８７１５ｃｉｅｎｃｅ　２３５．　１７７−１ ８２および（１９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．７０７−７１２並びにＫ ｅｒｎら（１９９０）、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　５０．５１８４−５１９１ ）。

驚くべきことに、１つの細胞から変異受容体と野生型受容体とが同時に発現され るならば、上記に説明した５段階のシグナル伝達連鎖を変異増殖因子受容体によ って遮断または抑制できることか発見された。よって、シグナル伝達欠損性変異 型増殖因子受容体は、対応する受容体による細胞の内側への増殖シグナルの伝達 の増加に関連つけられる病気を治療することができる薬剤として適当である。

好ましい受容体変異体はもはや野生型受容体のチロシンキナーゼ活性をもたない 。この変異体はもはやリガンド結合後に受容体二量体中またはポリペプチド基質 中のチロシン残基をリン酸化することかできない。かくして、細胞外増殖シグナ ルから細胞内シグナルへの変換が遮断されるかまたは部分的に抑制される。

野生型受容体中の点変異は、点変異によってそれかチロシンキナーゼ活性を失っ ているならば野生型受容体がもはや適切には機能しないので十分である。そのよ うな魚受異体（例えば１（ＥＲＫ７２１Ａ）が特に好ましい。

チロシンキナーゼ領域中にチロシンキナーゼ活性の損失をもたらす欠失を有する 変異受容体が更に好ましい。

しかしながら、細胞質領域中の欠失により変異された受容体はまだ経腸領域を含 んでいることが好ましい（例えばＨＥＲＣＤ−５３３）。経腸領域か存在してい る変異受容体は増殖シグナル伝達の一層効果的な抑制をもたらし、よって経腸領 域を持たない受容体、例えば細胞外領域のみから成る変異体（例えば図１　、　 ＨＥＲＣＤ−５６６参照）よりも優れた治療効果を示す。

ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−１，ＭＥＴ受容体、ＥＧＦ受容体関連受容体（例え ばＨＥＲ２，ｎｅｕ、　Ｃ−ｅｒｂＢ２受容体）またはＮＧＦ受容体といった受 容体チロシンキナーゼの変異体か薬剤として特に適する。

例えはＭＥＴタンパク質は、Ｇｉｏｒｄａｎｏら（１９８８）　Ｍｏ１ｅｃ、　 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

８、３５１０−３５１７およびＧｌｏｒｄａｎｏら（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ 、　３３９中に詳細に記載されている。

表皮増殖因子（ＥＧＦ）の変異受容体か特に非常に適する。

ＥＧＦ受容体の特に好ましい変異体では、野生型受容体配列のアミノ酸位置７２ １位に点変異がある。好ましい変異体では７２１位のりシン残基かアラニン残基 により置換されている。この変異体は、ブダペスト条約のもとドイツ国微生物寄 託機関（ｔｈｅ　Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏ ｒｇａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＧｍｂＨ）にＤＳＭ　 ６６７８のもとに寄託されている。更に好ましいＥＧＦ受容体変異体では、野生 型受容体の５３３個のＣ末端アミノ酸が欠失している。この変異体はＤＳＭ　６ ６７９のもとに寄託されている。

受容体変異体は、野生型受容体から出発してＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら（＋９ ８９）　λＩｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記載されたような常用の遺伝 子操作法に従って製造することかできる。

本発明の薬剤は、上述した変異増殖因子受容体の少な（とも１つ並ひに常用の補 助剤および担体物質を含有する。

リポソ−ム中に封入された受容体変異体を含有する薬剤が特に好ましい。リポソ ームを標的組織に選択的に運ぶために、リポソームかそれらの膜の中に抗体を含 むと有利である。前記抗体は標的細胞の特異的エピトープを認識してそれらに選 択的に結合する。こうして、受容体変異体が標的組織に標的されると、そこで所 望の効果を導き出すことかできる。リポソーム中に封入された活性物質の投与は 今日普通の投与形式である。

１個または数個の組換えレトロウイルスヘクターの形で該受容体を含む薬剤か更 に好ましい。組換えへフタ−は該受容体をコートする核酸１断片を含む。患者へ の薬剤の投与後、レトロウィルスか標的細胞に感染し、標的細胞中ての該受容体 変異体の発現をもたらす。

特に好ましい薬剤は、ＥＧＦ受容体変異体をコードするしトロウィルスベクター ｐＮＴＫ−ＨＥＲ−に７２１Ａおよび／またはｐＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５３３を 含有する。これらのベクターはそれぞれＤＳＭ　６６７８とＤＳＭ　６６７９の もとにＤＳＭ　（ドイツ国微生物寄託機関、Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ　ｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　；　Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｎ　Ｗｅｇ 　ＩＢ、　Ｄ−３３００，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託されている。

変異受容体は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ、　Ａ、編）　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ ｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８０）および続刊に記載 されたようにして、通常のやり方で薬剤中に組み込むことかできる。

上述の変異受容体および／またはそれらを含有する薬剤は癌治療に特に適する。

増殖因子受容体の過剰活性の結果であるようなタイプの癌を特に十分に治療する ことができる。それらのタイプの癌としては、特に乳癌、卵巣癌および肺癌が挙 げられる。それらの癌疾患における表面受容体の役割は、Ｓｌａｍｏｎ、　Ｄ、 Ｊ、ら（＋９８７）　５ｃｉｅｎｃｅ２３５、　１７７−１８２および（＋９８ ９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．７０７−７１２並びにＫｅｒｎ、　Ｊ。

Ａ、ら（１９９０）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　５０．５１８４−５１９１中に 詳細に記載されている。

医薬組成物は、塩、緩衝剤、添加剤、および変異受容体の効能を向上させるのに 望ましい他の物質を含むことができる。

非経口投与用組成物は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液または乳濁液を 含んで成る。注射用水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことが でき、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、フルビットおよび／ま たはデキストランを含んで成ることができる。該懸濁液は所望により安定剤を含 んでもよい。

非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、 例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルで ある。

皮膚浸透性並びに薬剤の皮膚吸収を増加させるために担体物質または閉塞性硬膏 を使ってもよい。

投薬の液体形態は、典型的には液体形態の用量を含有するリポソーム溶液を含む ことができる。リポソームを懸濁させるのに適当な形態としては、この分野で汎 用される不活性希釈剤（例えば精製水）を使った乳濁液、懸濁液、溶液、シロッ プ剤およびエリシキル剤か挙げられる。

不活性希釈剤の他に、それらの組成物は添加剤、湿潤剤、乳化剤もしくは懸濁剤 または芳香剤を含んでもよい。本発明の医薬組成物における使用に適する他の材 料の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ−ｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　（Ｏｓｏｌ、　Ａ、編）　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ ｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ（１９８０）および続刊に示されている。

腫瘍を有する個体の治療は、患者または動物への１回量、数回量または輸液の形 での変異受容体または変異受容体を生産する組換えベクターの有効量の投与を含 んで成る。

本発明によれば、医薬組成物のｒ有効量］とは、所望の生物学的効果を達成する のに十分な量である。概して、該組成物の有効量を提供するのに必要であり且つ 専門家によって設定することができる用量は、特に使用される受容体、他の治療 剤の存在や種類、患者または動物の年齢、並びにそれの状態、性別および臨床的 状態（病気の程度や他の変数を含む）といった因子に依存するだろう。

ヒトの場合の本発明の医薬組成物の好ましい用量は１人あたり＞１０’プラ一ク 形成単位であり、これは癌の種類や受容体の機能亢進の程度に依存する。

本発明の医薬組成物の好ましい投与方法は非経口法である。最も好ましい方法は 、静脈内、腹腔内もしくは局所投与法、または脳、を髄液もしくは腫瘍それ自体 への直接的方法である。

特定の理論に傾倒することなく、野生型受容体に加えて受容体変異体が標的細胞 の膜の中に組み込まれることで標的細胞中で受容体変異体がそれらの効果を発し 、次いで１つが野生型または腫瘍形成性受容体で１つがシグナル伝達欠損性変異 受容体から成るシグナル伝達不能二量体を形成することにより、受容体変異体か 野生型受容体の機能を付与すると推定される。

モデルとしてＥＧＦ受容体変異体を使って本発明をより詳細に説明する。

驚くへきことに、もはや全くチロシンキナーゼ活性をもたないＥＧＦ受容体変異 体の発現が、ＥＧＦ野生型受容体を発現している形質転換癌細胞において形質転 換された表現型を元に戻すことができることが発見された。

材料および方法。

組換えレトロウィルスの製造 レトロウィルス発現ベクターｐＮ２．　ｐＮＴＫ２およびｐＮＴに−ＨＥＲｃは 、Ｋｅｌｌｅｒ、　Ｇ、ら（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１８．１４９− １５４　；　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｃ，Ｌ、ら（＋９８７）、　ＥＭＢＯＪ、、　 ６．３８３−３８８　：　ｖｏｎ　Ｒ１１ｄｅｎ、　Ｔ、およびＷａｇｎｅｒ、 　Ｅ。

Ｆ、　（１９８８）、　Ｅ九ＩＢＯＪ、、　７．２７４９−２７５６に詳細に記 載されている。

ｐＮＴに−ＨＥＲ−に７２１Ａは、ｐＮＴＫ−ＨＥＲｃ中でＣＭＶＨＥＲ−に７ ２１ＡのＢｇｌｌＩ断片をクローニングすることによって作製した。ｐＮＴＫ− ＨＥＲＣＤ−５３３は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒしａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記載されたような常用のクローニング方法を使って、 Ｌｉｖｎｅｈ、　Ｅ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６０．　１２４ ９０−１２４９７中に記載のｐＬＳＸＮＡ　８の２　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ　／Ｘｈ ｏ　Ｉ大断片の両端にＣ１ａ　Ｉ部位を造成し、次いて前記２　ｋｂ　Ｃ１ａ　 Ｉ断片をＣ１ａ　Ｉて切断したｐＮＴＫ２と連結せしめることによって作製した 。ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５６６構成物は、ＣＶＮＨＥＲＸＣＤのＣ１ａ　Ｉ断片 を１ｌＮＴＫ２のＣｌａ　１部位中にクローニングすることによって製造した。

この構成物はＤＳλ＋　６６８０のちとに寄託された。自己向性組換えしｌ・ロ ウイルスは、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ、　Ｄ、　（１９８８）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、 、　６２゜１１２０−１１２４に記載されたヘルパーウィルスフリー生産系ＧＰ ＋Ｅ−８６から製造した。安定なＧＰ＋Ｅ−８６生産系は、八ｔｉｌｌｅｒ、　 Ａ、Ｄ、およびＢｕｔｔｉ−ｍｏｒｅ、　Ｃ，（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、、　６．２８９５−２９０２に記載されたような改良さオ］た感 染教示により製造した。Ｍｉｌｌｅｒ、　Ａ、Ｄ、ら（＋９８５）Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　５．４３１−４３７に記載のヘルパーウイルスフリーパ ソケーシング細胞系ＰＡ３１７中へのレトロウィルス発現プラスミドの一過性ト ランスフェクションによって低力価を有する両性ウィルスを製造し、そして第二 のパッケージング細胞系ＧＰ＋Ｅ−８６を感染せしめるのに使い、次いてＧ４１ ８　（１■／ｍｌ’）中で生産系ＧＰ＋Ｅ−８６のクロールを選別した。無細胞 のＧＰ＋Ｅ−８６上清を含んたしＩ・ロウイルスの一系列の希釈液をＮ１）Ｉ　 ３Ｔ３細胞系に感染せしめ、そして６４１８耐性コロニーの数を測定することに より、ウィルス力価を測定した。腫瘍増殖因子α（ＴＧＦα）遺伝子を含むレト ロウィルス（Ｖ　２ＴＧＦα）はＢｌａｓｂａｎｄ、　Ａ、Ｊ、　（１９９０） 　０ｎｃｏＢｅｎｅ、　５．１２１３−１２２１に記載されている。

レトロウィルスを使った遺伝子伝達 集密下のＮＩＨ３Ｔ３細胞（１０Ｓ細胞／　６　ＣＩ［＋プレート）を、４ａｇ ／ｍｌのポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で高力価のＮＴＫ−ＨＥＲｃウ ィルス（５ＸＩＯ５Ｇ４１８’　：Ｉロニー形成単位／ｒｎｌ）を放出するＧＰ 十Ｅ−８６細胞の上清と共に４〜１２時間イ時間インキュレートに高力価のＮ２ ．　ＮＴＫ−ＨＥＲＫ７２１Ａ、ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５３３またはＮＴＫ−Ｈ ＥＲＣＤ−５６６ウイルスのいずれかを放出するＧＰ＋Ｅ−８６細胞の上清と共 にインキュベートした。

Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ、　Ｃ，ら（＋９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６．６７４８−６７５２に記載されたような数回 の感染サイクルによって受容体の発現レベルを増加させた。記載の実験では、高 力価のＮ２．　ＮＴＫ−ＨＥＲＫ７２１Ａ。

ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５３３またはＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５６６ウイルスのいず れかを放出するＧＰ十ε−８６細胞の希釈上清］　ｍｌ　（］、　２５Ｘ　１０ ’コロニ一形成単位）で１回、または同容量の未希釈上清（５ＸＩＯ’コロニ一 形成単位）で１〜４回感染を実施した。

完全な細胞中での受容体のリン酸化 上述したように感染させた細胞を１０ｃｍプレート中で９０％集密まで培養し、 洗浄し、そして５０μＣｉ／ｍｌの３６３−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を 含む１％ＦＣ３が補足されたメチオニン不含有ＤＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ）中で１ ６時間培養した。２０　ｎｇ／ｍｌのＥ　Ｇ　Ｆ　（Ａｍｇｅｎ　Ｃｏｒｐ、） により１０分間細胞を刺激し、０．５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ 　ｐＨ７，２，１５０ｍＭＮａＣ１，１，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　１ｍＭ　ＥＧ ＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００゜１ｍＭ　ＰへＩｓ Ｆ、　１０■／ｍｌアプロチニン、１００μＭオルトバナジン酸ナトリウム）中 で４°Ｃにて溶解せしめた。細胞溶解物をエッペンドルフ遠心機中で４°Ｃにて 約１２，０００　ｇで１０分間遠心分離した。次いて上清をＨｏｎｅｇｇｅｒ、 　Ａ、Ｍ、、　Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、　およびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、　 Ｊ、　（１９８９）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 　８６．９２５−９２９に記載の過剰のモノクローナル抗体１０８．１およびプ ロティンＡ−セファロースと共に４°Ｃにて４時間インキュベートした。免疫沈 澱物をＨＮＴＧ　（２０ｍＭ　ＨｅｐｅｓｐＨ７，３，１５０ｍＭ　ＮａＣ１， ０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００および１０％グリセロール）で２回洗浄した 。ベレットを試料緩衝液中に再懸濁し、５分間煮沸し、そして５ＯＳ−ＰＡＧＥ 　（７，５％）により分析した。タンパク質を電気泳動的にニトロセルロースに 移行せしめ、次いてＦｅｎｄｌｙ、　Ｂ、Ｍ、ら（１９９０）　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　５０．１５５０−１５５８に記載されたホルホチロシンに 対するマウスモノクローナル抗体（５Ｅ２）と共にインキュへ一トシた。検出の ため、ニトロセルロースフィルターをペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス抗体と 共にインキュベートし、次いでＥＣＬ基質反応液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にイ ンキュベートした。コダックのＸ−Ｏｍａｔフィルムを使ってＥＣＬ基質反応を 検出した後、ニトロセルロースフィルターを０．２％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰ ＢＳて洗浄した。その後、オートラジオグラフィーにより３５３−メチオニン標 識タンパク質を検出した。バンドの密度はデンシトメトリーによって評価した。

〔３Ｈ〕−チミジン取り込み 集密下のＮＩＨ３Ｔ３細胞（＋ＯＳ細胞／　６　ｃｍプレート）を、上述の通り ＮＴＫ−ＨＥＲｃ、次にＮ２．　ＮＴＫ−ＨＥＲＫ７２１Ａ、ＮＴに−ＨＥＲＣ Ｄ−５３３またはＮＴに−ＨＥＲＣＤ−５６６のいずれかての４回の感染サイク ルで同時感染せしめた。

細胞を１２ウエルのＣ０３ｔｅｒプレートに分配した。集密に到達した後、細胞 単層を０．５ｍｌのＤＭＥＭ、　０．５％ＦＣ３中で２４時間飢えさせ、モして ＥＧＦ添加から１８時間後、細胞を０．５μＣｉのメチル−〔３Ｈ〕−チミジン （Ａｍｅｒｓｈａｍ）で４時間標識した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いてｌ Ｏ％ＴＣＡを使って氷上で１時間沈澱させた。沈澱物を１０％ＴＣＡて洗浄し、 そして２００μβの０．２Ｎ　ＮａＯＨ１０，２％ＳＤＳ中に再溶解させた。

この溶解物を中和し、取り込まれた放射能をシンチレーノヨンカウンティングに より定量した。

形質転換試験 ＮＩＨ３Ｔ３細胞の軟寒天中てのコロニー形成能力を調へるために、集密下のＮ ＩＨ３Ｔ３細胞（１０６細胞／　６　ｃｍプレート）をＮＴＫ−ＨＥＲｃにより 感染せしめ、次にＮ２．　ＮＴＫ−ＨＥＲＫ７２１Ａ、ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５ ３３またはＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５６６のいずれかによる４サイクルの感染を行 った。自己分泌刺激を引き起こそうとする場合には、細胞にＷ　２ＴＧＦαウイ ルス（５ＸＩＯ’　Ｇ４１８”コロニー形成単位／ｍｌ）を感染させた。ｌＯ％ ＦＣ３と０．２％寒天（Ｇｉｂｃｏ）を含有する３ｍｌのＭＥＭの最上層中１０ 　ｎｇ／−のＥＧＦの存在下または非存在下てＮＩＨ３Ｔ３細胞（１０’）を６ ａｎプレート上に塗抹した。基底層はＭＥＭ、１０％ＦＣ３および０．４％寒天 を含有した。４週間後、目に見えるコロニーをカランｌ−した。

フォーカス形成試験用には、集密下のＮＩＨ３Ｔ３細胞（１０５細胞／６ａｎプ レート）にＮＴＫ−ＨＥＲｃ　（Ｉ　ｘｌＯ’　Ｇ４１８１′コロニ一形成単位 ／　ｍｌ　）を感染せしめ、次にＮ２．　ＮＴＫ−ＨＥＲＫ７２１Ａ、ＮＴＫ− １（ＥＲＣＤ−５３３またはＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５６６ウイルスのいずれかに よる４サイクルの感染を行った。

幾つかの実験では、細胞にＷ　２ＴＧＦαウイルス（Ｉ　Ｘｌ０３Ｇ４１８Ｒコ ロニ一形成単位／ｍｌ’）を重感染せしめた。感染細胞を１０　ｎｇ／ｍｌのＥ ＧＦの存在下または非存在下で４％ＦＣ３を含むＤＭＥＭの入った６ａｍプレー ト上で培養した。３日毎に培地を交換した。プレートをクリスタルバイオレット で染色し、１８日ローフォーカス（細胞増殖巣）をカウントした。

図面についての説明 図１　ヒｌ−Ｅ　Ｇ　Ｆ野生型受容体と変異ＥＧＦ受容体の略図。システィンに 富む領域（ｃｙｓ）　、チロキンキナーゼ（Ｔ　Ｋ　）領域および縁膜（ＴＭ） 領域の位置か示される。変異体ＨＥＲＫ７２１Ａは７２１位に魚受異を有しくリ ジンからアラニンへの変換）、一方ＨＥＲＣＤ−５３３とＨＥＲＣＤ−５６６は それぞれ５３３個と５６６個のＣ末端アミノ酸の欠失を有する。それらの変異体 はＬｉｖｎｅｈ、　Ｅ、　ら（１９８６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２６０、　１２４９０−１２４９７およびＨｏｎｅｇｇｅｒ、　Ａ、　Ｍ、ら（ １９８７）　Ｃｅ１１．５１．　１９９−２０９において詳細に記載されている 。

図２　（Ａ）　：野生型ＥＧＦ受容体と変異ＥＧＦ受容体のチロシンリン酸化。

野生型受容体のみを発現するかまたは野生型受容体と変異受容体を同時発現する 細胞を（”Ｓ）−メチオニンで一晩標識し、次いて２　ｎｇ／ｙｎｌのＥＧＦの 存在下または非存在下で１０分間インキュへ−１−１，た。細胞を溶解し、抗Ｅ ＧＦ受容体抗体釦Ａｂ　１０８）で沈澱せしめ、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し 、そして抗ホスホチロシン抗体（５Ｅ２）を使って免疫学的に分析し、次いてＥ ＣＬ基質反応を行った。

（Ｂ　）　：　ＮＩＨ３Ｔ３細胞上てのＥＧＦ受容体の発現。野生型受容体のみ を発現するかまたは野生型受容体と変異受容体を同時発現する細胞を（”Ｓ）− メチオニンで一晩標識し、次いで２０　ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下または非存 在下で１０分間インキュベートした。細胞を溶解し、抗ＥＧＦ受容体抗体（ｍＡ ｂ　１０８）で沈澱せしめ、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして抗ホスホチ ロシン抗体（５Ｅ２）を使って免疫学的に検出し、次いてＥＣＬ基質反応を行っ た。Ｅ　ＣＬ基質を０．２％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳて洗浄し、（３５Ｓ ）−メチオニン標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって検出した。

図３　：　ＥＧＦで刺激された〔３Ｈ〕−チミジン取り込み。野生型受容体のみ を発現する細胞（点線）または野生型受容体と変異受容体を同時発現する細胞（ Ａ：野生型ＥＧＦ受容体十に７２１Ａ　、　Ｂ　：野生型ＥＧＦ受容体＋ＣＤ− ５３３、Ｃ１野生型ＥＧＦ受容体十ＣＤ−５６６）を１２ウエルのＣｏ５ｔａｒ プレート上て集密まて培養し、そして０．５％ＦＣ８を含むＤＭＥＭ中で２日間 飢餓状態にした。１０％ＦＣ３または様々なＥＧＦ濃度を添加し、そしてＥＧＦ 添加後１８時間目に〔３Ｈ〕−チミンン（０，５μＣｉ／ウエル）を４時間添加 し、ＤＮＡ中へのそれの取り込みを測定した。用量と応答との関係を示すために 分裂促進性［、こ：答を記録した。その数値を基底値のチミジン取り込みによっ て補正し、そして観察されたＥＧＦに対する最大応答を１００％として定義した 。ぬりつぶした三角形（ム）は半量大量チミジン取り込み（ＥＤｓｏ）を示す。

椛！− 野生型受容体のみを発現するかまたは野生型受容体と変異受容体とを一緒に発現 する細胞を（”Ｓ）−メチオニンで標識し、ＥＧＦの存在下または非存在下でｌ Ｏ分間インキュベートし、細胞を溶解し、ヒ１−ＥＧＦ受容体に対するマウス抗 体（ｍＡｂ　１０８）で免疫沈澱せしめた。試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離 し、ニトロセルロースフィルターに移行せしめ、そしてホスホチロシン特異的マ ウス抗体５Ｅ２を使ってチロシンのリン酸化を検出した（図２Ａ）。免疫沈澱物 中に存在する受容体の量を同しニトロセルロースフィルターのオートラジオグラ フィーにより検出した（図２Ｂ）。

図２へのレーンｂとＣに示されるように、野生型ＥＧＦ受容体を含むウィルスに より感染させた完全なＮＩＨ３Ｔ３細胞へのＥＧＦの添加は、１７０　ｋＤのＥ ＧＦ受容体バンドの強いチロシンリン酸化を誘導する。図２ＢのレーンｂとＣか られかるように、リン酸化されてし１ないＥＧＦ受容体と比較すると、リン酸化 によって５ＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＥＧＦ受容体の電気泳動移動度が減少する。

たとえ細胞外領域か野生型受容体に対して４倍過剰に発現されたとしても、野生 型受容体のＥＧＦ刺激されたリン酸化のレベルは、ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５６６ ウイルスゲノムによりコードされるＥＧＦ受容体の可溶性細胞外領域の同時発現 により減少しなかった（図２Ａ、レーンｄ−ｆ；図２Ｂ、レーンｄ−ｆ）。

対比して、膜に固定されたＥＧＦ受容体または欠失変異体ＨＥＲＣＤ−５３３（ 図１）を発現するウィルスを使った同様な実験では、＋７０　ｋＤのＥＧＦ受容 受容体タンパク−ベルは一定に保持されたけれとち（図２Ｂ、レーンｇ−ｉ）、 野生型ＥＧＦ受容体のＥＧＦ誘発リン酸化には強力な用量依存性阻害が観察され た（図２Ａ、レーンｇ〜ｉ）。チロシンがリン酸化されたバンドの強度はそれぞ れ１００％から７１％または３０％に減少した。それらの条件下では、ＥＧＦ受 容体はリン酸化されていない受容体ど同じ電気泳動特性を有した（図２Ｂ、レー ン］）。これはｍＡｂ　５Ｅ２により検出されたチロシンリン酸化の状態と一致 する（図２Ａ、レーン１）。

野生型受容体がキナーゼ陰性変異体１（ＥＲＫ７２１Ａと同時発現された場合、 ＋２０　ｋＤバンドのチロノンリン酸化の増加か観察された（図２Ａ。

レーンに−ｍ）。受容体のチロシンリン酸化のシグナル強度は、オートランオグ ラフのデンシトメトリー分析によると、２５１％から３３７％または４５０％に それぞれ増加した。野生型受容体とキナーゼ陰性変異体は同じ大きさであるため 、図２Ｂのレーンに−ｍにおける増加した＋７０　ｋＤシグナルは、変異受容体 が野生型受容体によりリン酸基転移さオ］得ることから両受容体のリン酸化の合 計を表している。

ＥＧＦにより誘発される細胞分裂速度の抑制Ｒｉｅｄｅ１．　Ｈ，ら（１９８８ ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５．１４７ ７−１４８１およびＰｒｙｗｅｓ、　Ｒ，ら（１９８６）　ＥＭＢＯＪ、、　５ ．２１７９−２１９０に記載されたように、Ｅ　Ｇ　Ｆ　（ｌ！Ｅ　Ｇ　Ｆ受容 体を発現しているＮ［Ｈ３Ｔ３　ｍ維芽細胞において細胞分裂を刺激する。野生 型ＥＧＦ受容体により調節された細胞分裂に対する変異受容体の影響を、ＤＮＡ 合成の誘導を使って測定した。

（３Ｈ）−チミジン取り込みと同様にしてＮＴＫ−ＨＥＲｃウィルスとＮ２ウィ ルス対照により感染させた細胞においてＤＮＡ合成を測定するど、２　ｎｇ／　 ｍｐのＥＧＦのところて合成か最大に刺激され、半量大量刺激（ＥＤＳｏ）は０ ．６６　ｎｇ／ｍ／のところてあった（図３　）　ｏ　Ｈｏｎｅｇｇｅｒ。

Ａ、　Ｍ、ら（１９８８）　ＥＭＢＯＪ、、　７．３０４５−３０５２およびＲ ｉｅｄｅｌ、　Ｈ，ら（＋９８８）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ、　８５．１４７７−１４８１に記載されたような初期の結果と同 様な様式において、図３に示される通り、高いＥＧＦａ度はより低い〔３Ｈ〕− チミジン取り込みレベルを引き起こした。ＥＧＦ受容体とＨＥＲＣＤ−５３３ま たはＨＥＲＫ７２１Ａとの同時発現は、対応するウィルスでの４サイクルの感染 後、用量依存曲線を一層高いＥＧＦ濃度のほうへ著しくシフトさせた（図３Ａお よび３Ｂ）。このことは、それらの細胞かＨＥＲｃ／Ｎ２細胞に比へて増殖因子 に対する感受性かより小さくなったことを指摘する。欠失変異体ＨＥＩ’１ＣＤ −５３３と声変異体ＨＥＲに７２１Ａ　（図１）は共に、ＥＧＦ野生型受容体に より付与される細胞分裂シグナルへの同様な効果を示し、ＥＤｓｏを６．６ｎｇ ／ｍ１ＥＧＦに１０倍増加させた。これに対して、ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５６６ ウイルスでの重感染は、ＥＧＦにより刺激される野生型受容体のＤＮＡ合成に対 して何ら有意な効果をもたなかった（図３Ｃ）。

ＥＧＦ受容体変異体の癌抑制活性 Ｄｉ　Ｐｉｏｒｅ、　Ｐ、Ｐ、ら（１９８７）、　Ｃｅ１ｌ、　５１．１０６３ −＋０７０　：　Ｖｅｌｕ、　Ｔ、Ｊ。

ら（１９８７）、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３７．１４０８−１４１０およびＲｉ ｅｄｅｌ、　ｔ（、ら（１９８８）。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５．１４７７− １４８１に記載されているように、ＥＧＦ受容体の過剰発現がＮＩＰ（３Ｔ３細 胞のＥＧＦ依存性細胞形質転換を引き起こすことは知られている。過剰発現され たＥＧＦ受容体の形質転換能力がＥＧＦ受容体変異体により抑制され得るかどう かを調へるために、ＥＧＦ受容体を受容体変異体と同時発現させ、次いて軟寒天 中のコロニー形成能または単層細胞培養物中のフォーカス形成能を調へた。培地 へのＥＧＦの添加によるかまたはウィルス（Ｗ２ＴＧＦα）（該ウィルスは自己 分記、活性化系を生成するためにＴＧＦ−αＤＮＡを担持している）での感染に より、過剰発現されたＥＧＦ受容体の刺激を行った（表１は４回の実験からの平 均値を示す）。

ＮＴＫ−ｔ（ＥＲｃウィルスおよびＮ２対照による感染後、Ｎ［Ｈ３Ｔ３細胞は ｌＯｎｇ／　ｍｌのＥＧＦの存在下で軟寒天中に約２５０個のコロニーを形成し た。１１ｆ２ＴＧＦαウイルスとの同時感染を使うと、他は同し条件下で（表］ ）　＋４８［１のコロニーが形成された。しかしなから、ＥＧＦ受容体を感染さ せた細胞にＮＴＫ−ＨＥＲに７２１ＡウイルスまたはＮＴに−ＨＥＲＣＤ−５３ ３ウィルスのいずれかを重感染させると、はとんど完全にコロニー形成能か抑制 された。ＥＧＦ受容体と細胞外領域ＨＥＲＣＤ−５６６との同時発現は、軟寒天 中の１０　ｎｇ／ｍｌのＥＧＦによる刺激ではコロニー形成能を約５０９６減少 させ、そして曹２ＴＧＦαウィルス感染後の自己骨？ＪＴＧＦによる刺激では約 ３３９６減少させた。

同様な様式て、１０　ｎｇ／ｒｎｌのＥＧＦの存在下で（これはｌＯ６ウイルス あたり９２０個のフォーカスを形成した）またはＷ　２ＴＧＦαウイルス感染後 に（これは１０’　ＮＴＫ−ｔ（ＥＲｃウィルスあたり４８０個のフォーカスを 形成した）　、Ｎ［Ｈ３Ｔ３単層培養物においてＮＴＫ−ＨＥＲｃウィルスの） す−ブＪス形成能を調へた。ＮＴＫ−ＨＥＲＫ７２１ＡまたはＮＴＫ−ＨＥＲＣ Ｄ−５３３ウイルスによる重感染は、ＥＧＦでの刺激の場合にはそれぞれ１００ ％または９０９ｆｉ、そして１１’２ＴＧＦαウイルスでの刺激の場合にはそれ ぞれ７５０もまたは７１９６、フォーカスの数を減少させた（表２）。

ＥＧＦ野生型受容体とＨＥＲＣＤ−５６６との同時発現は、ＥＧＦ受容体を発現 しそして対照ウィルスＮ２により感染させた細胞と同じ数のフォーカスを示した 。二の結果は、ＥＧＦての刺激と’Ｉ’　２ＴＧＰαウイルスでの刺激の両方に おいて観察された。

上記陳述から、ＥＧＦ受容体変異体か顕著な増殖抑制能力と癌抑制能力の両方を 有し、従って癌の治療に非常に適していることか明らかである。

表１　軟寒天中のコロニー形成 コロニーの数／ＩＯ’ＣＦＵ ゛感染　−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−−− ＋ｌＯｒｉｇ／ｍｅ　ＥＧＦ　＋’ＬＩｒ２ＴＧＦαＮＴＫ−ＨＥＲＫ７２１　 Ａ　Ｏ０ ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５３３００ ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５６６０Ｏ ＮＴに−ＨＥＲｃ／Ｎ２　２４６　１４８ＮＴＫ−ＨＥＲｃ／ＮＴＫ−ＨＥＲに ７２１Ａ　８　２ＮＴＫ−ｔｌＥＲｃ／ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５３３６４４週間 後にコロニーをカウントした。数値は４回の独立した実験力へらの平均値を表す 。ＣＦＵはコロニー形成単位を意味する。

表２　：　ＮＩＨ３Ｔ３のフォーカス形成フォーカスの数／ＩＯ”ＣＦＵ 細胞系　−一−−−−−−−−−−−−−−−−−〜−−−−−−−−−−−− ＋ＩＯｎｇ／ｙｎｌ　ＥＧＦ　＋ＩＦ２ＴＧＦαＮＴＫ−ＨＥＲＫ７２１Ａ　Ｏ Ｏ ＮＴに−ＨＥＲＣＤ−５３３００ ＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５６６０Ｏ ＮＴに−ｔ（ＥＲｃ／Ｎ２　９２０　４８ＯＮＴに−ＨＥＲｃ／ＮＴＫ−ＨＥＲ Ｋ７２１Ａ　４０　１８ＮＴに−ｔ（ＥＲｃ／ＮＴＫ−ｔ（ＥＲＣＤ−５３３９ ０１４１４〜１６日後にフォーカスをカウントした。数値は４回の独立した実験 からの平均値を表す。ＣＦＵはコロニー形成単位を意味する。

ａｂｃｄｅｆ　ｇｈｉ　ｋ　ｌ　＋ｎ ａｂｃｄｅｆ　ｇｈｉ　ｋ　Ｉ　ｍ Ｆｉ〔；、７．ｂ 補正上の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年３月７日

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．シグナル伝達活性が欠損している変異受容体チロシンキナーゼ。
2. ２．前記受容体がもはや対応する野生型受容体のチロシンキナーゼ活性をもたな いことを特徴とする、請求項１に記載の変異受容体。
3. ３．前記受容体がそれのチロシンキナーゼ領域中に欠失を有することを特徴とす る、請求項２に記載の変異受容体。
4. ４．前記受容体がそれのチロシンキナーゼ領域中に点変異を有することを特徴と する、請求項２に記載の変異受容体。
5. ５．前記受容体がそれの細胞外領域と経膜領域を含むことを特徴とする、請求項 ２に記載の変異受容体。
6. ６．前記受容体が細胞外領域を含むことを特徴とする、請求項２に記載の変異受 容体。
7. ７．前記細胞外領域と前記経膜領域が野生型に由来することを特徴とする、請求 項５に記載の変異受容体。
8. ８．前記細胞外領域が野生型に由来することを特徴とする、請求項６に記載の変 異受容体。
9. ９．前記変異受容体が増殖因子受容体であることを特徴とする、請求項１〜８の いずれか一項に記載の変異受容体。
10. １０．前記受容体が表皮増殖因子（ＥＧＦ）の変異受容体であることを特徴とす る、請求項９に記載の変異受容体。
11. １１．前記受容体が血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の変異受容体であることを 特徴とする、請求項９に記載の変異受容体。
12. １２．前記受容体が変異ＨＥＲ２受容体であることを特徴とする、請求項１〜８ のいずれか一項に記載の変異受容体。
13. １３．前記受容体がｍｅｔ受容体であることを特徴とする、請求項１〜８のいず れか一項に記載の変異受容体。
14. １４．前記点変異がＥＧＦ野生型受容体配列のアミノ酸位置７２１位にあること を特徴とする、請求項４に記載の変異受容体。
15. １５．前記点変異体がアミノ酸位置７２１位にアラニン残基を有し、そしてＤＳ Ｍ　６６７８のもとにドイツ国微生物寄託機関（ｔｈｅ　ＧｅｒｍａｎＣｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託されていることを 特徴とする、請求項１４に記載の変異受容体。
16. １６．ＥＧＦ野生型受容体の５３３個のＣ末端アミノ酸が欠失していることを特 徴とする、請求項３に記載の変異受容体。
17. １７．ＥＧＦ野生型受容体の５６６個のＣ末端アミノ酸が欠失しており、そして ＤＳＭ　６６８０のもとにドイツ国微生物寄託機関に寄託されていることを特徴 とする、請求項３に記載の変異受容体。
18. １８．請求項１〜１７のいずれか一項に記載の受容体を含んで成る医薬組成物。
19. １９．前記受容体がリポソームと結合されることを特徴とする、請求項１８に記 載の医薬組成物。
20. ２０．前記組成物が前記受容体をコードする核酸断片を担持している１または複 数の組換えベクターの形で前記変異受容体を含有することを特徴とする、請求項 １８に記載の医薬組成物。
21. ２１．前記ベクターが組換えレトロウイルスベクターであることを特徴とする、 請求項２０に記載の医薬組成物。
22. ２２．前記レトロウイルスベクターが、それぞれＤＳＭ　６６７８およびＤＳＭ 　６６７９のもとにドイツ国微生物寄託機関に寄託されたｐＮＴＫ−ＨＥＲ−Ｋ ７２１ＡおよびｐＮＴＫ−ＨＥＲＣＤ−５３３から選ばれることを特徴とする、 請求項２１に記載の医薬組成物。
23. ２３．癌に冒された人または動物の治療方法であって、請求項１８〜２２のいず れか一項に記載の医薬組成物の有効最の投与を含んで成る方法。
24. ２４．前記癌が受容体チロシンキナーゼの機能冗進の結果であることを特徴とす る、請求項２３に記載の方法。
25. ２５．前記癌が乳癌、卵巣癌および肺癌から選ばれることを特徴とする、請求項 ２４に記載の方法。
26. ２６．受容体チロシンキナーゼの機能亢進により特徴づけられ過形成に基づいて いる人または動物の病気の治療方法であって、請求項１８〜２２のいずれか一項 に記載の医薬組成物の有効量の投与を含んで成る方法。
27. ２７．前記病気が乾癬であることを特徴とする、請求項２６に記載の利用法。