PT100844A - Receptor mutante do factor de crescimento, util como medicamento - Google Patents
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Description
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0 presente invento diz respeito a receptores mutantes do factor de crescimento com propriedades terapêuticas, a medicamentos contendo pelo menos um receptor mutante do factor de crescimento e à aplicação do ou dos receptores mutantes no tratamento do cancro. 0 crescimento celular é um processo cuidadosamente regulado que depende das necessidades especiais de um organismo. Num organismo jovem a taxa de divisão celular sobrepõe-se à taxa de morte das células, o que conduz a um aumento do tamanho do organismo. Num organismo adulto a formação de novas células e a morte das mesmas está tão equilibrada que se cria uma espécie de "equilíbrio fluido". No entanto, em certos casos raros, dá-se o colapso do controlo do crescimento celular e as células começam a crescer e a dividir-se, embora no organismo não se verifique qualquer necessidade particular para um número mais elevado de células desse tipo. Esse crescimento celular não controlado está na origem do cancro. Os factores capazes de provocar o crescimento celular não controlado são frequentemente de natureza química, podendo no entanto ser também de tipo físico como sucede, por exemplo, com as radiações radioactivas.
No que se refere à terapia do cancro estão hoje em dia à nossa disposição essencialmente duas alternativas. Ou se consegue remover completamente as células cancerosas do organismo doente através de uma intervenção cirúrgica, ou se tenta tornar as células degeneradas inofensivas para o organismo através de, por exemplo, a administração de medicamentos, ou a aplicação de processos terapêuticos físicos, tais como as radiações.
Na quimioterapia utilizam-se com frequência medicamentos que, de certo modo, actuam sobre o metabolismo do DNA e que danificam mais fortemente as células em rápido crescimento, que 3 3
têm de fornecer um mais elevado rendimento no metabolismo celular, do que as células que não se dividem ou que só lentamente o fazem. Um grave inconveniente de muitas das quimioterapias é, contudo, a reduzida especificidade das substâncias activas utilizadas, o que tem como consequência que também as células saudáveis sejam danificadas pela quimioterapia. Esta reduzida especificidade das substâncias activas requer, além disso, que a dosagem das mesmas tenha de ser feita de modo a que o mínimo de células saudáveis seja, se possível, danificado, enquanto que simultaneamente se destroiem as células cancerosas. Isto não é, por vezes, possível e o paciente canceroso morre em consequência da proliferação cada vez maior das células cancerosas, que no estádio terminal provocam a paragem de funções vitais. O objecto do presente invento é a preparação de uma outra substância activa dotada de valiosas propriedades terapêuticas, bem como de um medicamento contendo a referida substância, sendo a substância activa ou o medicamento particularmente vantajosos no tratamento das doenças cancerosas.
De acordo com o presente invento esta tarefa é resolvida através de um receptor mutante do factor de crescimento usado como medicamento, bem como de um medicamento contendo pelo menos um receptor mutante do factor de crescimento.
De acordo com o presente invento foi possível demonstrar que os receptores mutantes dos factores do crescimento possuem valiosas propriedades terapêuticas, e que são particularmente apropriados no tratamento das doenças cancerosas.
Os receptores do factor de crescimento desempenham um papel decisivo na multiplicação das células cancerosas humanas. No caso das células saudáveis os receptores do factor de 4 4
crescimento participam no controlo do crescimento celular. 0 verdadeiro sinal para a divisão celular é o factor de crescimento cuja formação depende das necessidades do organismo. 0 receptor toma a seu cargo a função de conversão de sinal, isto é, participa na transformação do sinal de crescimento extracelular em actividade de divisão celular no interior da célula. No caso de muitos receptores do factor de crescimento, a capacidade dos mesmos de converter, após a ligação do factor de crescimento aos domínios extracelulares, radicais fosfato em radicais tirosina em proteínas, desempenha um papel decisivo. Estes receptores são também designados por tirosina-quinases receptoras. Um quadro geral das tirosina-quinases receptoras é-nos dado por Yarden, Y. e Ullrich, A., em "Rev. Biochem." (1988), 57, 443-78. A dimeri-zação destes receptores do factor do crescimento, após a ligação do factor do crescimento, constitui um outro fenómeno importante no processo da transferência de sinal. A transformação de um sinal extracelular num sinal intracelular mediante a intervenção dos receptores do factor de crescimento com actividade de tirosi-na-quinase pode dividir-se nas cinco etapas a seguir indicadas: 1. A ligação do factor de crescimento (também designado por ligando) ao domínio extracelular do receptor induz uma alteração da conformação; esta dá origem 2. à dimerização dos receptores com conformação alterada; juntamente com 3. a indução simultânea de uma alteração aloestérica do domínio citoplasmãtico, através da qual a actividade da quinase é de novo induzida; 4. transfosforilação dos radicais tirosina no dímero receptor, que por sua vez produz e estabiliza uma conformação activada dos receptores; e 5. fosforilação dos substratos polipeptidicos e actuação alternada com factores celulares.
Um sobrefuncionamento desta cadeia de conversão de sinal poderá conduzir a uma actividade de divisão excessiva da célula correspondente e, no caso extremo, a uma célula cancerosa degenerada. Um quadro geral dos receptores do factor de crescimento e das suas funções na conversão de sinal do meio extracelu-lar para o meio intracelular, bem como a possível influência dos receptores mutantes no aparecimento do cancro é-nos dado por Ullrich, A. e Schlessinger, J. (1990) em "Cell", 61, 203-212.
Descobriu-se agora surpreendentemente que a acima referida cadeia de conversão de sinal em cinco etapas pode ser bloqueada ou inibida através de um receptor mutante do factor de crescimento, quando os receptores mutantes são expressos juntamente com os receptores de tipo selvagem de uma célula. Isto faz com que os receptores mutantes do factor do crescimento sejam adequados como medicamentos, com os quais se torna possível tratar doenças que estejam relacionadas com uma conversão acrescida de sinais de crescimento no interior da célula através dos receptores correspondentes.
Um receptor mutante preferido deixa de possuir a actividade de tirosina-quinase do receptor de tipo selvagem. Este mutante já não está em posição, após a ligação dos ligandos, de fosforilar os radicais tirosina no dímero receptor ou nos substratos polipeptidicos. Fica assim bloqueada ou parcialmente
inibida a transformaçao de um sinal de crescimento extracelular num sinal intracelular.
Bastará então uma mutação pontual no receptor de tipo selvagem, para que este não esteja apto a funcionar após ter perdido a actividade da tirosina-quinase através da mutação pontual. Um mutante pontual desse tipo é o que se prefere como medicamento. É, além disso, preferido um receptor mutante que seja portador de uma delecção no domínio da tirosina-quinase conducente a uma perda de actividade da tirosina-quinase.
Prefere-se que o receptor mutante, através de uma delecção no domínio citoplasmático continue, no entanto, a conter a região da transmembrana. Os receptores mutantes em que se encontra presente a região da transmembrana conduzem a uma inibição mais eficaz da conversão do sinal de crescimento, revelando assim melhores efeitos terapêuticos do que os receptores sem a região da transmembrana como, por exemplo, mutantes que apenas são constituídos pelos domínios extracelulares. São particularmente adequados como medicamentos os mutantes das tirosina-quinases dos receptores tais como, por exemplo, os receptores-EGF, -PDGF ou -NGF. É muito particularmente adequado ura receptor mutante do factor de crescimento epidérmico (EGF).
Num mutante particularmente preferido do receptor EGF existe uma mutação pontual na posição 721 do aminoácido da sequência de receptores do tipo selvagem. Num mutante preferido o radical lisina na posição 721 é substituído no mutante por um 7 7
radical alanina. Este mutante encontra-se depositado, em conformidade com o Acordo de Budapeste, na "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (Colecção Alemã de Micor-ganismos e .Culturas Celulares) sob o ns DSM 6678. Num outro mutante do receptor EGF preferido os aminoácidos C-terminais 533 do receptor do tipo selvagem são eliminados. Este mutante foi depositado sob o n2 6679.
Os receptores mutantes podem ser obtidos, de acordo com os processos usuais de tecnologia genética, a partir de receptores do tipo selvagem, tal como é descrito por Sambrook, J. et al (1989) em "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press. 0 medicamento de acordo com o invento contém, pelo menos, um dos receptores mutantes do factor de crescimento acima descritos e os adjuvantes e veículos usuais. É particularmente preferido um medicamento contendo o ou os receptores mutantes envolvidos em lipossomas. Para se levar os lipossomas selectivamente até ao tecido a que se destinam, é vantajoso que os lipossomas contenham anticorpos na sua membrana, o que faz com que os anticorpos reconheçam epítopos específicos nas células alvo e se liguem selectivamente a essas mesmas células. Isto permite que os receptores mutantes atinjam o tecido a que se destinam podendo desenvolver ali o efeito desejado.
Prefere-se ainda um medicamento contendo o ou os receptores sob a forma de um ou de vários vectores retrovirais recombinantes. Os vectores recombinantes contêm fragmentos de ácido nucleico que codificam o ou os receptores. Após a administração do medicamento ao paciente os retrovírus infectam a célula 8
alvo e levam esta a exprimir os receptores mutantes. A administração de substâncias activas envolvidas em lipossomas constitui actualmente uma forma de administração corrente.
Um medicamento particularmente preferido contém os vectores retrovirais pNTK-HER-K7 2IA e/ou pNTK-HERCD-533 que codificam o receptor mutante, os quais se encontram depositados na Colecção Alemã de Microrganismos sob os números DSM 6678 ou DSM 6679.
Os receptores mutantes atrás descritos ou os medicamentos que os contêm são particularmente adequados no tratamento do cancro. Sucede que os tipos de cancro a que esta terapia se adequa particularmente bem são aqueles que são consequência de um sobrefuncionamento dos receptores do factor de crescimento. Contam-se entre estes tipos de cancro, em especial, os carcinomas da mama, dos ovários e dos pulmões. O papel desempenhado pelos receptores de superfície nestas doenças cancerosas é descrito em pormenor em Slamon, D.J. et al. (1987), em "Science", 235, 177 -182 e (1989) "Science", 244, 707 - 712, bem como por Kern, J.A. et al. (1990), em "Câncer Res.", 50, 5184 - 5191.
Sem se ficar preso a nenhuma teoria determinada, supõe-se que os receptores mutantes descritos desenvolvem o seu efeito nas células alvo, pelo facto dos mutantes serem incorporados juntamente com o receptor do tipo selvagem, na membrana das células alvo e o receptor mutante influenciar então a função do receptor do tipo selvagem. 0 presente invento será ilustrado mais pormenorizadamente tomando como modelo os mutantes do receptor EGF. 9 9
O receptor do factor de crescimento epidérmico (recep-tor EGF), descrito por Ullrich, A. et al. (1984), em "Nature", 309, 418 - 425, é uma glicoproteína 170 kD com actividade de tirosina-quinase. Os processos moleculares verificados na ligação dos ligandos até à estimulação da actividade da quinase são descritos detalhadamente por Ullrich, A. e Schlessinger, J. (1990), em "Cell", 61, 203 a 212. Enquanto o EGF provoca, normalmente, uma resposta mitógena nos fibroplastos, um sobrefun-cionamento da conversão de sinal através do receptor EGF, em consequência de receptores sobre-expressos, conduz a uma transformação das células de rato NIH 3T3 dependente dos ligandos, tal como é descrito por Riedel, H. et al. (1983), em "Proc. Natl. Acad. Sei", E.U.A., 85, 1477 - 1481 e por Di Fiore, P.P. et al. (1987), em "Cell", 51, 1063-1070. As investigações clínicas intensivas efectuadas corroboram a função deste receptor na formação dos diversos carcinomas, tais como os carcinomas das células da mama, dos ovários e dos pulmões, como descreve Slamon, D.J. et al. (1987), em "Science", 235, 177-182 e (1989), em "Science", 244, 707-712 e Kern, J.A. et al. (1990), em "Câncer Res.», 50, 5184-5191.
Descobriu-se surpreendentemente que a expressão dos receptores EGF mutantes, que deixaram de ter actividade de tirosina-quinase, podem anular o fenótipo transformado em células cancerosas transformadas que exprimem o receptor EGF de tipo selvagem.
Material e métodos
Preparação de retrovírus recombinantes
Os vectores de expressão retrovirais pN2, pNTK2 e pNTK-HERc são descritos em pormenor por Keller, G. et al.,
X X' (1985), em "Nature", 318, 149-154; por Stewàrt, C.L. et al., (1987), em "EMBO J.", 6, 383-388; por von Ruden, T. e Wagner, E.F. (1988), em "EMBO J.», 7, 2749-2756. 0 pNTK-HER-K 721A foi preparado por clonagem de um fragmento Bgl II de CMVHER-K72IA em pNTK-HERc. O pNTK-HERCD-53 3 foi obtido através da criação de um sítio-Clal em ambos os lados do fragmento Xbal/Xhol de dimensão 2 kb do pLXSNA 8, descrito por Livneh, E. et al., em "J. Biol. Chem.", 260, 12490-12497, por meio de um processo de clonagem usual, tal como é descrito por Sambrook, J. et al. (1989), em "Molecular Cloning", Cold Spring Harbour Laboratory Press, e seguidamente o fragmento 2 kb Ciai foi ligado com pNTK2 clivado com Ciai. A construção NTK-HERCD-566 foi preparada por clonagem de um fragmento CLal de CVNHERXCD no sítio Ciai de pNTK2. A construção foi depositada sob o ns DSM 6680. Foram preparados retrovírus recombinantes ecotróficos a partir da linha de produção GP+E-86 isenta de vírus auxiliares descritos por Markowitz, D. (1988), em "J. Virol.", 62, 1120-1124. As linhas de produção estáveis GP+E-86 foram criadas com o auxílio de um protocolo de infecção modificado, tal como vem descrito por Miller, A.D. e Buttimore, C. (1986), em "Mol. Cell. Biol.", 6, 2895-2902. 0 vírus amfotrófico com título reduzido foi obtido por transfecção transitória de plasmídeos de expressão retrovirais na linha de células de envolvimento PA317 isentas de vírus auxiliares, descrita por Miller, A.D. et al., (1985), em "Mol. Cell. Biol., 5, 431-437, e foi utilizado para infectar células de envolvimento secundárias GP+E-86, seguida de uma selecção de clones da linha de produção GP+E-86 em G418 (1 mg/ml). O título do vírus foi determinado através da infecção de células NIH 3T3 com séries de diluição de retrovírus contendo excedentes de GP+E-86 isento de células, e por determinação do número de colónias G418 resistentes. Blasband, A.J. (1990) descreveu em "Oncogene", 5, 1213-1221, um retrovírus (psi2TGFa) contendo o gene para o factor de crescimento de tumores a(TGFa).
Transferência de genes cor meio de retrovírus 5
As células subconfluentes NIH 3T3 (10 células/ placa de 6 cm) foram incubadas com excedentes de células GP+E-86, . _ 5 libertando elevadas concentrações de vírus NTK-HERc (5x10 unidades G418 formadoras de colónias por ml), durante 4a 12 horas na presença de 4 μ9/ιη1 de Polybrene (Aldrich) e, seguidamente, com um excedente de células GP+E-86, que libertam elevadas concentrações de vírus N2, NTK-HERK721A, NTK-HERCD-533 ou NTK-HERCD-566. 0 nível de expressão dos receptores foi aumentado através de várias séries de infecções, tal como foi descrito por Bordignon, C. et al. (1989), em "Proc. Natl. Acad. Sei.",EUA, 86, 6748-6752. Nas experiências descritas a infecção efectuou-se uma 5 vez com 1 ml de um excesso diluído (1,25x10 unidades formando colónia) ou uma a quatro vezes com o mesmo volume de excesso não . 5 diluído (5x10 unidades formando colónia) de células GP+E-86, libertando elevadas concentrações de vírus N2, NTK-HERK721A, NTK-HERCD-533 ou NTK-HERCD-566.
Fosforilacão de receptores em células intactas
As células infectadas tal como acima foi descrito foram cultivadas em placas de 10 cm até a uma confluência de 90%, células essas que foram depois lavadas e cultivadas durante 16 horas em DMEM (Gibco) isento de metionina e complementadas com 35 . . FCS a 1% contendo 50μΰι/ιη1 de s-ietionina (Amersham) . As células foram estimuladas durante 10 minutos com 20 ng/ml de EGF (Amgen Corp.) e lisadas em 0,5 ml de um tampão para lisar (50 mM Hepes pH 7,2, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% de glicerina 1% de Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 mg/ml de aprotina, 100μΜ de ortovanadato de sódio) a 4°C. Estes lisados (cerca de 12000 g) foram centrifugados numa centrifugadora Eppendorf durante 10 minutos a 4°C. Os excedentes foram então incubados 12 12
com um excesso de anticorpo monoclonal 108.1, descrito por Honegger, A.M., Ullrich, A. e Schlessinger, J. (1989), em "Proc. Natl. Acad. Sei.",EUA, 86, S. 925-929 e de sefarose de proteína A, durante 4 horas, a 4°C. Os precipitados imunizados foram lavados duas vezes com HNTG (20 mM Hepes pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,1% de Triton X-100 e 10% de glicerina). Essa massa foi ressus-pensa num tampão de ensaio, fervida durante 5 minutos e analisada com o auxílio de SDS-PAGE (7,5%). As proteínas foram transferidas por electroforese sobre nitrocelulose e incubadas seguidamente com um anticorpo monoclonal de rato contra a fosfotirosina (5 E2), descrito por Fendly et al. (1990), em "Câncer Research", 50, 1550-1558. A título comprovativo o filtro de nitrocelulose foi incubado com um anticorpo-anti-rato-cabra acoplado com peroxidase, seguido de uma reacção com substrato-ECL (Amersham). Após a detecção da reacção com substrato-ECL por meio da película Kodak X-Omat lavaram-se os filtros de nitrocelulose com PBS, contendo . . 35 0,2% de Tween 20. As proteínas marcadas com metionina S foram detectadas através de auto-radiografia. A densidade das bandas foi obtida por densitometria. 3 ...
Incorporação de Γ H-timidmal 5
As células subconfluentes NIH 3T3 (10 células/placas de 6 cm) foram co-infectadas, tal como se descreveu, com NTK-HERc, seguida de 4 séries de infecçóes com ou N2, ou NTK-HERK721A, ou NTK-HERCD-533, ou NTK-HERCD-566. As células foram divididas por placas Costar de 12 cavidades. Depois de atingida a confluência as monocamadas de células foram mantidas sem alimento durante 24 horas em 0,5 ml de DMEM e 0,5% de FCS e 18 horas após a adição de . . 3 EGF as células foram marcadas por 4 horas com 0,5 μΟχ metil-[ H]--timidina (Amersham). As células foram lavadas duas vezes com PBS e seguidamente com 10% de TCA durante 1 hora e precipitadas sobre gelo. O precipitado foi lavado com 10% de TCA e novamente 13 dissolvido em 200 μΐ de NaOH 0,2N / 0,2% de SDS. Os lisados foram neutralizados e a radioactividade incorporada foi calculada quantitativamente por contagem por cintilação.
Testes de transformação
Para se investigar a capacidade de formação de colónias em agar mole das células NIH 3T3, infectaram-se células subcon-fluentes NIH 3T3 (105 células/placas de 6 cm) com NTK-HERC, seguida de 4 séries de infecção com N2, ou NTK-HERK721A, ou NTK-HERCD-533, ou NTK-HERCD-566. Nos casos em que se pretendia criar uma estimulação autócrina, infectaram-se as células com
. 4 R vírus psi2TGFa (5 x 10 unidades de G418 formando colónias, por 5 ml). As células NIH 3T3 (10 ) que se colocaram em placas de 6 cm na presença ou ausência de 10 ng/ml de EGF em 3 ml de meio de cultura para cobrir as camadas de topo (top layer), constituído por MEM e contendo 10% de FCS e 0,2% de agar (Gibco). A camada de base continha MEM, 10% de FCS e 0,4% de agar. Passadas 4 semanas puderam contar-se as colónias visíveis.
Para os testes de formação de focos co-infectaram-se 5 células subconfluentes NIH 3T3 (10 celulas/placas de 6 cm) com
4 R NTK-HERc (l x 10 unidades de G418 formando colonias, por ml), seguida de 4 séries de infecção com vírus N2, ou NTK-HERK721A, ou NTK-HERCD-533, ou NTK-HERCD-566. Em algumas experiências as . 3 células foram super-mfectadas vom vírus psi2TGFa (1 x 10 unidades de G418 formando colónias, por ml). As células infectadas foram cultivadas sobre placas de 6 cm com DMEM contendo 4% de FCS, na presença ou ausência de 10 ng/ml de EGF. O meio foi substituído de 3 em 3 dias. As placas foram tingidas com violeta cristal e os focos foram contados passados 18 dias. 14 14
Legendas das Figuras
Fig. 1: Representação esquemática do receptor EGF do tipo selvagem humano e de receptores EGF mutantes. É fornecida a posição dos domínios ricos em cisteína (cys), dos domínios da tirosina-quinase (TK) e da transmembrana (TM). O mutante HERK721A é portador de uma mutação pontual na posição 721 (uma troca da lisina pela alanina), enquanto que os HERCD-533 e HERCD-566 terminais são portadores de delecções dos aminoácidos 533 ou 566. Os mutantes são descritos em pormenor por Livneh, E. et al. (1986), em »J. Biol. Chem.", 260, 12490-12497 e por
Honegger, A.M., et al. (1987), em "Cell", 51, 199-209.
Fig. 2 (A): Fosforilação da tirosina dos receptores- -EGF do tipo selvagem e EGF mutante. As células que ou co-expri- mem somente o receptor do tipo selvagem ou o receptor do tipo selvagem e os receptores mutantes foram marcadas durante a noite 35 com [ S]-metionma e incubadas seguidamente na presença ou na ausência de 2 ng/ml de EGF durante 10 minutos. As células foram colocadas em solução e precipitadas com o anticorpo-anti-receptor--EGF (mAB 108), separadas através de SDS-PAGE e analisadas imunologicamente com anticorpos-anti-fosfotirosina (5E2), a que se seguiu uma reacção com substrato-ECL. (B): Expressão do receptor EGF sobre células NIH 3T3.
As células que ou co-exprimem somente o receptor do tipo selvagem ou o receptor do tipo selvagem e os receptores mutantes foram marcadas durante a noite com [ S]-metionina e incubadas seguida-mente na presença ou na ausência de 20 ng/ml de EGF durante 10 minutos. As células foram colocadas em solução e precipitadas com o anticorpo-anti-receptor-EGF (mAB 108), separadas através de SDS-PAGE e detectadas imunologicamente com um anticorpo-anti-fos-fotirosina (5E2), a que se seguiu uma reacção com substrato-ECL. 0 substrato-ECL foi lavado com PBS contendo 0,2%' de Tween 20 e as proteínas marcadas com [ S]-metionma foram detectadas por auto-radiograf ia. . _ 3 ...
Fig. 3: Incorporação de [ H]-timidma simulada com EGF. As células que co-exprimem ou somente o receptor do tipo selvagem (linha tracejada) ou este e os receptores mutantes, tal como em A: receptor-EGF-tipo selvagem + K721A, B: receptor-EGF--tipo selvagem + CD-533, C: receptor-EGF-tipo selvagem + CD-566, foram cultivadas até à confluência em placas Costar de 12 cavidades e deixadas 2 dias sem alimento em DMEM contendo 0,5% de FCS.
Foram, adicionados 10% de FCS ou diversas concentrações de EGF e . . . 3 ... 18 horas apos a adição de EGF adicionou-se [ H]-timidma (0,5 μ(2ΐ/cavidade) durante 4 horas e determinou-se a sua incorporação em DNA. A resposta mitógena foi registada a fim de mostrar a relação entre dose e resposta. Os valores foram corrigidos tomando como referência a incorporação básica de timidina e a resposta máxima observada para EGF foi definida como 100%. Os triângulos a cheio dão a incorporação da timidina que é metade da máxima.
Resultados
As células exprimindo o receptor de tipo selvagem sozinho ou juntamente com os receptores mutantes foram marcadas 35 com [ S]-metionina e incubadas na presença ou na ausência de EGF durante 10 minutos, lisadas e imunoprecipitadas com um anticorpo de rato contra o receptor EGF humano (mAbl08). As provas foram separadas com SDS-Page, colocadas sobre filtros de nitrocelulose e a fosforilação da tirosina foi detectada com o auxílio do anticorpo de rato 5E2 (Fig. 2A) específico para a fosfotirosina. A quantidade de receptor existente no imunoprecipitado foi 16 16
detectada por auto-radiografia do próprio filtro'de nitrocelulose (Fig. 2B).
Tal como se pode ver na Fig. 2A, manchas b e c, a adição de EGF induz em células NIH 3T3 intactas que estão infectadas com o vírus contendo o receptor EGF de tipo selvagem uma forte tirosinofosforilação da banda 170 kD do receptor EGF. Através da fosforilação diminui a velocidade da migração do receptor EGF na SDS-PAGE, em comparação com o receptor EGF não-fosforilado, como é possível observar na Fig. 2B, manchas b e c. O nível da fosforilação do receptor de tipo selvagem estimulado pelo EGF não foi reduzido pela co-expressão do domínio extracelular solúvel do receptor EGF, tal como é codificado pelo genoma do vírus NTK-HERCD-566, mesmo quando o domínio extracelular foi expresso num excedente 4 vezes superior relativamente ao receptor de tipo selvagem (Fig. 2A, manchas d a f; Fig. 2A, manchas d a f).
Pelo contrário, numa experiência análoga em que se utilizou um vírus que suprimiu o mutante de delecção HERCD-533 do receptor EGF existente na membrana (Fig. 1), verificou-se uma forte inibição, dependente da dose, da fosforilação EGF-induzida do receptor EGF de tipo selvagem (Fig. 2A, manchas g a i), embora se mantivesse constante o nível 170 kD da proteína do receptor EGF (Fig. 2B, manchas g a i). A intensidade das bandas fosfori-ladas pela tirosina ficou reduzida de 100% para 71% ou para 30%. Nestas condições, o receptor EGF revelava as mesmas qualidades electroforéticas que um receptor não fosforilado (Fig. 2B, mancha i), o que está em concordância com a sua situação em relação à tirosinofosforilação e que é comprovado pelo mAb 5E2 (Fig. 2A, mancha i). \
Quando ο receptor do tipo selvagem foi co-expresso com o mutante quinase-negativo, verificou-se uma mais elevada tirosi-nofosforilação da banda 120 kD (Fig. 2A, manchas k a m). A intensidade do sinal da tirosinofosforilação do receptor cresceu de 251% para 337% ou 450%, de acordo com a análise densiométrica das auto-radiografias. Uma vez que o receptor de tipo selvagem e o mutante quinase-negativo têm a mesma dimensão, o sinal 170 kD mais elevado da Fig. 2B, manchas k a m, representa a soma da fosforilação dos dois receptores, dado que o receptor mutante pode ser transfosforilado através do receptor de tipo selvagem.
Inibição da taxa de divisão celular EGF-induzida 0 EGF estimula a divisão celular nos fibroblastos NIH 3T3 que exprimem o receptor EGF, tal como é descrito por Riedel, H. et al. (1938), em "Proc. Natl. Acad. Sei.", EUA, 85, 1477-1481, e por Prywot, R. et al. (1986), em "EMBO J.", 5, 2179-2190. A influência dos receptores mutantes sobre a divisão celular controlada pelo receptor EGF de tipo selvagem foi determinada pela indução da síntese do DNA. A síntese do DNA foi determinada em células que estavam infectadas com o vírus NTK-HERc e com o controlo do vírus N2, sob . 3 a forma de incorporação de [ H]-timidina e a síntese foi estimulada até a um máximo aos 2 ng/ml de EGF, com uma estimulação média (ED ) aos 0,66 ng/ml (Fig. 3). Do mesmo modo que em resultados anteriores, e tal como foi descrito por Honegger, A.M. et al., (1988), em "EMBO J.", 7, 3045-3052, e por Riedel, H. et al., (1988), em "Proc. Natl. Sei.", EUA, 1477-1481, as concentrações mais elevadas de EGF conduziram a níveis mais reduzidos de 3 . . . incorporação de [ H]-timidina, tal como se pode ver na Fig. 3. A co-expressão do receptor EGF com HERCD-533 e HERK721A conduziu, após quatro séries de infecção com os vírus correspondentes, a um 18 18
nítido desvio da curva dependente da dose para concentrações mais elevadas de EGF (Fig. 3A e B). Isto demonstra que as células se tornaram menos sensíveis relativamente ao factor de crescimento, quando comparadas com as células HERc/N2. Tanto o mutante de delecção HERCD-533 como o mutante pontual HERK721A (Fig. 1) revelaram efeitos idênticos sobre o sinal de divisão celular mediado pelo receptor EGF de tipo selvagem e deram origem a um aumento 10 vezes superior da ED 5Q para 6,6 ng/ml deEGF. Pelo contrário, a super-infecção com o vírus NTK-HERCD-566 não teve qualquer efeito significativo sobre a síntese do DNA por meio de EGF (Fig. 3) estimulada pelo receptor de tipo selvagem.
Actividade anti-oncogénica dos receptores EGF mutantes)
Sabe-se que a sobre-expressão do receptor EGF dã origem a uma transformação celular das células NIH 3T3 dependente de EGF, tal como foi descrito por Di Fiore, P.P. et al. (1978), em "Cell", 51, 1063-1070, por Velu, T.J. et al., (1987), em "Science”, 237, 1408-1410 e por Riedel, H. et al., (1988), em "Proc. Natl. Acad. Sei.", EUA, 85, 1477-1481. A fim de se investigar se o potencial de transformação do receptor EGF sobre-expresso pode ser inibido por meio de receptores EGF mutantes, o receptor EGF foi co-expresso com receptores mutantes e, seguidamente, investigou-se a sua capacidade de gerar colónias ou focos, em agar mole, numa cultura celular em monocamada. A estimulação do receptor EGF sobre-expresso foi obtida quer por adição de EGF ao meio, quer por infecção com um vírus (psi2TGFa), que é portador de TGF-α DNA, a fira de se criar um sistema de activação autócrino (no Quadro 1 são mostrados valores médios provenientes de quatro experiências).
Após a infecção com o vírus NTK-HERc e com o controlo N2, as células NIH 3T3 formaram cerca de 250 colónias em agar mole na presença de 10 ng/ml de EGF. Através da co-infecção com o vírus psi2TGFa conseguiu-se a formação de 148 colónias, em condições aliás idênticas (Quadro 1). Contudo, quando as células infectadas com o receptor EGF foram super-infectadas quer com o vírus NTK-HER-K7 21A, quer com o vírus NTK-HERCD-533, foi quase completamente suprimida a capacidade de formação de colónias. A co-expressão do receptor EGf com o domínio extracelular HERCD-566 reduziu a capacidade de formação de colónias em cerca de 50% quando foi efectuada a estimulação com 10 ng/ml de EGF na camada de agar, e em cerca de 33% quando foi efectuada a estimulação através do TGF autócrino após infecção com o vírus psi2TGFa.
Foi determinado de modo idêntico o potencial de formação de focos do vírus NTK-HERc em culturas NIH 3T3 em monocamada, quer na presença de 10 ng/ml de EGF, o que dava origem a 920 g focos por 10 vírus, ou após a co-infecção com vírus psi2TGFa, o que deu origem a 430 focos por 10^ de vírus NTK-HERc. A super--infecção com vírus NTK-HERK721A ou com NTK-HERCD-533 reduzia em 100% ou 90% o número dos focos, quando se verificava a estimulação com EGF e 75% ou 71% quando era feita a estimulação com vírus psi2TGFa. (Quadro 2)
As células co-exprimindo o receptor EGF de tipo selvagem e HERCD566 mostravam o mesmo número de focos do que as células que exprimiam o receptor EGF e que estavam infectadas com o vírus de controlo N2. Este resultado foi observado quer no caso da estimulação com EGF,quer também com o vírus psi2TGFa.
Através da presente descrição é possível concluir que os receptores EGF mutantes possuem um potencial nitidamente anti-proliferativo assim como um potencial anti-oncogénico, sendo por isso particularmente adequados para o tratamento do cancro. 20 20
- ί -
Quadro 1: Formação de colónias em aqar mole
Número de colónias /106 CFU
Infecção
+ 10 ng/ml EGF + 2 TGF N2 0 0 NTK-HERK7 2IA 0 0 NTK-HERCD-533 0 0 NTK-HERCD-566 0 0 NTK-HERc/N2 246 148 NTK-HERC/NTK-HERK7 2IA 8 2 NTK-HERc/NTK-HERCD-533 6 4 NTK-HERc/NTK-HERCD-566 128 100
As colónias foram contadas passadas 4 semanas. Os valores são os valores médios de quatro experiências independentes. CFU significa unidades de formação de colónias.
Quadro 2: Formação de focos NIH 3T3
Linha celular Número de /106 CFU +10 ng/ml EGF focos + 2 TGF N2 0 0 NTK-HERK7 2IA 0 0 NTK-HERCD-5 3 3 0 0 NTK-HERCD-566 0 0 NTK-HERC/N2 920 480 NTK-HERc/NTK-HERK7 21A 40 18 NTK-HERc/NTK-HERCD-533 90 14 NTK-HERc/NTK-HERCD-5 66 910 500
Os focos foram contados passados 14-16 dias. Os valores são os valores médios de quatro experiências independentes. CFU significa unidades de formação de colónias.
Lisboa, 4 de Setembro de 1992
J. PEREIRA DA CRUZ
Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3« 1200 USBOA
Claims (11)
- REIVINDICAÇÕES ia. - Receptor usado como medicamento, caracterizado por ser um receptor mutante do factor de crescimento. 2®. - Receptor mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por já não possuir a actividade da tirosina--quinase do receptor do tipo selvagem. 3â. - Receptor mutante, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por ser um mutante pontual do receptor do tipo selvagem. 4ã. - Receptor mutante, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por ser portador de uma delecção no domínio da tirosina-quinase.
- 53. - Receptor mutante, de acordo com uma das reivindicações 1, 2 ou 4, caracterizado por o domínio citoplasmático ser eliminado mas por se manter, no entanto, a região da transmem-brana.
- 63. - Receptor mutante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser uma tirosina-quinase recepto-ra mutante.
- 73. - Receptor mutante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ser um receptor-EGF mutante.
- 82. - Receptor mutante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser portador de uma mutação pontual na posição do aminoãcido 721 da sequência do receptor do tipo selvagem.
- 92. - Receptor mutante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por possuir na posição 721 um radical alanina.
- 102.- Receptor mutante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os aminoácidos C-terminais 533 do receptor do tipo selvagem serem eliminados.
- 112.- Medicamento, caracterizado por conter pelo menos um receptor mutante do factor de crescimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e os adjuvantes e suportes usuais.
- 122.- Medicamento de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por conter o ou os receptores envolvidos em lipos-somas.
- 132.- Medicamento de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado por conter o ou os receptores sob a forma de um ou mais vectores retrovirais recombinantes que são portadores de fragmentos de ácido nucleico que codificam o ou os receptores.
- 142.- Medicamento de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por conter os vectores retrovirais pNTK-HER-K721A e/ou pNTK-HERCD-533, depositados na Colecção Alemã de Microrganismos sob o nS DSM 6678 ou DSM 6679. 3 15^.- Medicamento de acordo com pelo menos uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado por se destinar ao tratamento do cancro. 16».- Utilização do receptor mutante de acordo com uma das reivindicações l a 10, caracterizada por o referido receptor ser empregado para o tratamento do cancro. 17a.- Utilização de acordo com reivindicação 16, caracterizada por se destinar ao tratamento de tipos de cancro que sejam consequência de um sobre-funcionamento dos receptores do factor de crescimento. 18a.- utilização de acordo com reivindicação 17, caracterizada por se destinar ao tratamento de carcinomas do peito, ovários e/ou pulmões. Lisboa, 4 de Setembro de 1992Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3.s 1200 USBOA
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