JPH07502649A - ノイラミニダーゼの調製のためのプロセス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ノイラミニダーゼの調製のためのプロセス本発明の背景 本発明は、生物学的探求、細胞の面に関する研究及び糖タンパク質の酵素解析の ための手段として主要な役割を果す酵素である、ノイラミニダーゼの調製のため の改良されたプロセスに関する。

従来の技術 先行する実験的研究は、ノイラミニダーゼが細胞外酵素であって、タンパク質を 変異させることができかっ、特に、糖脂質とりわけスフィンゴ糖脂質の末端位置 に局在する、／アル酸の残基を加水分解できることがら非常に重要であることを 示した。

ノイラミニダーゼは、ウィルス及び微生物の間に広く分布している。実際にこの 酵素は、混合ウィルス群の全てのウィルスの中に含まれ、また、アルトロバクチ ル・／アラフィルス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｌｅｒ　５ｉａｌａｐｈｌｌｕｓ）、 ビブリオ・コレラル（ＶｌｂｒｉＯｃｈｏｌｅｒａｌ）、クロストリディウム・ ウェルキイ（パーフリノゲン）　（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｌｕ＠　ｖｅｌｃｈｉｉ（ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、／ニードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ　ｆｌｕ。

ｒｅｓｃｅｎｓ）、ビーニス・ストウシエリ（Ｐｓ、　５ｔｕｚｅｒｉ）、ビー ニス・ビオシアネウス（Ｐｓ、　ｐｙｏｃｙａｎｅｕｓ）、ラクトバチラス・ビ フィダス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｉｆｉｄｕｓ）、ニューモコノカス （Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、ジフテロイド・バチリ（Ｄｉｐｈｔｅｒｏｉｄ 　ｂａｃｉｌｌｉ）、タレブ／エラ・アエロゲン（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ａｅ ｒｏｇｅｎｅｓ）等の細菌の中に含まれる。

しかしながら、前記ウィルス及び細菌から開始されるノイラミニダーゼの調製は 、複雑な培地と復雑な操作条件を必要とするため、僅がな酵素しが得られない。

概要 本出願人は、ノイラミニダーゼの工業的調製を可能にする改良されたプロセスを 見出した。すなわち、そのようなプロセスは、安価な培地において急速に好気性 成長を行う細菌株の利用により、毒素又はタフバク貫分解酵素のいずれも検出さ れる程存在することなく高収率を得るものである。

前記プロセスは、細菌株として、アルトロバクチル・ウレフェイ／エンス（Ａｒ ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　Ｕｒｅｆａｅｉｅｎｓ）Ａ　Ｔ　ＣＣ７５６２の変異に より得られたアルトロバクチル／アラフィルを用いており、以下の特徴を有する 。

ａ）アルトロバクチル・／アラフィルスの細菌培養は、カゼイン氷解物を含む培 地中の低濃度のＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）へ曝すれる。

ｂ）恒成分培養槽の条件下における連続的培養での細菌成長が生じるようにする 。

Ｃ）上記で得られた酵素は、培地から回収され、そしてろ過、濃縮、限外ろ過、 透析、及びイオノ交換樹脂へのフローによって精製される。

本発明の詳細な説明 本発明による、細菌株としてアルトロバクチル・／アラフィルスを用いるノイラ ミニダーゼの調製プロセスの特徴及び有用性は、以下の詳細な説明においてさら に広転に示される。

試験において用いられた元の微生物は、アルトロバクチル・ウレフェイノエンス ＡＴＣＣ７５６２であり、アメリカン・タイプ・カルチャ・コレク／ｇン（ｔｈ ｅＡ＠ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から 購入した。

この微生物は、カゼイ／氷解物（０，１％）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡ ＮＡ）及び寒天からなる固体培地における成長により変異させられた。

ＮＡＮＡの存在下での微生物の成長は、いくつかの過程を用いて行われ、それに よって小さな光沢のある輝きをもつコロニーからなるアゼニックが得られる。

このアゼニックは、アルトロバクチル・／アラフィルスであることが示され、低 ；ｌ［のＮＡＮＡ　（０，１−１％）が存在する液体培地中で成長するときノイ ラミニダーゼを高収率で生成するという特徴を示す。

前駆体ｆｉＪ菌株であるアルトロバクチル・ウレフェイ／エンスＡＴＣＣ７５６ ２は、ＮＡＮＡに曝された場合にノイラミニダーゼを全く生成しないことを注記 する。

アルトロバクチル・／アラフィルスの成長のために用いられた培地は、水溶液中 に以下の成分を含む。すなわち、カゼイン水解物、酵母エキス、ＮＡＮＡ、二塩 基リン酸アンモニウム、（−塩基）リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）　、塩化ナ トリウム、硫酸マグネ／ラム、硫酸第一鉄である。

培養は、ｐｉ（７，３及び温度２６°Ｃにおいて、通気攪拌条件下で実施された 。

定常状態条件は、培養が汚染されるまで１４日間保持された。

細菌の質量が０．４ｇ／リットルに達すると、ＮＡＮＡｏ、５ｇ／リットルを含 みカゼイン氷解物を含まない新鮮な培地が、毎時０．１３に等しい希釈値（単位 時間当りの体積変化の値）に相当するフロー速度でいくらか追加される。

このような条件下で作用させることにより、極めて大量のノイラミニダーゼが生 成されブイヨン中に堆積される。

使用された機器が、図１に示されている。この機器は、連続フロー・システムか らなっており、二ニー・ブルノスウィノク・イノスソルメント・コーホレーンｗ 　ノ（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、　）により マイクロゲン・ゲンＩＩ−システム（ＭＩＣＲＯＧＥＮ−ＧＥＮ　ＩＩ　ＳＹＳ ＴＥＭ）として市販されている。図１中、Ａはリアクタ（又は培養容器）、Ｃは ｆｉｕな培地を入れた容器、Ｄは生成物を入れるタンク、そしてＢ（入）及びＢ （出）はそれぞれリアクタへ培地を供給し、またリアクタからタンクＤへ生成物 を引出すために設けられたボ／プである。

リアクタＡ（＋４リツトル）は、アルトロバクチル・／アラフィルスの初期培養 により播種される。細胞懸濁の吸光度は、０．１乃至０．２０Ｄ単位の間である 。５乃至７時間の誘導期の後、細胞分裂が始まる。１４時間後に成長が平均指数 期又は対数期に達し、細胞分裂の倍加時間は４．６時間となる。

細胞が吸光度３乃至４０Ｄ単位の間に達すると、即座に定常状態条件が確立され る。

培養の定常状聾は、反応フラスコ中へ新鮮な無菌培地を実質的に１．８リツトル ／ｈに等しいフロー速度で供給することにより保持される。以下の例は、単に説 明のためにのみ提示するものであり、いかなる場合も本発明の転回を限定するも のではない。

ＮＡＮＡＩ１１度０．１％による細菌成長アルトロバクチル・ノアラフィルスは 、カゼイン濃度０．１％及びＮＡＮＡＩ度０．１％である培地中で成長させられ た。

定常状態レベルに到達したとき、新鮮な培地がリアクタへ供給された。この培地 にはＮＡＮＡ及び塩が０．０５％含まれカゼインは含まれなかった。フロー速度 は３０ミリリフ）ル／分、及び希釈率は毎時０．１３に等しかった。

この調製の結果は図２に記録されており、定常状態において約７００単位／リッ トルに等しい酵素生成が可能であることを注記する（ここで１酵素単位とは、Ｇ ＤＩａを基板として用いたときｐＨ５，３及び温度３７℃においてＮＡＮＡを１ μｍｏｌ／分で加水分解するために十分な酵素の量である）。図２中、ライン９ は吸光度（ＯＤ）を表し、ライン２は酵素活性（Ｕ／Ｌ）を表す。

例２ ＮＡＮＡ濃度１％のときの細菌成長 アルトロバクチル・ンアラフィルスは、カゼイン加水物０．１％及びＮＡＮＡ１ ％を含む培地中で成長させられた。

細菌成長が定常状態に達したとき、リアクタに、カゼイン加水物を含まない新鮮 な培地（ＮＡＮＡ及び塩を０．０５％含む）が供給された。フロー速度は３０ミ リリットル／′分であった。

この結果は図３に記録されており、定常状態での生成が約１４００単位／リット ルであることを示している。ライン３は吸光度（ＯＤ）を表し、ライン４は酵素 活性（［１／Ｌ）を表している。

例３ ＮＡＮＡ涜度０．１％のときの細菌成長アルトロバクチル・シアラフィルスは、 カゼイン加水物０．５％及びＮＡＮＡＯ，１％を含む培地中で成長させられた。

細菌成長が定常状態に達したとき、リアクタに、カゼイン加水物を含まない新鮮 な培地（ＮＡＮＡ及び塩をＯ，ＯＳ％含む）が供給された。フロー速度は３０ミ リリットル／分であった。

この結果は図４に記録されており、定常状態に対応する酵素生成が約８ｏｏ単位 ／リットルであることを示している。

図４において、ライン５は吸光度（ＯＤ）を表し、ライン６は酵素活性（υ／Ｌ ）を表している。

ノイラミニダーゼの精製 上記の調製の間に採集された培地は、まず最初に微生物細胞を分離するためろ過 される。この分離は、ザルトコンＩ　Ｉ　（Ｓａｒｔｏｃｏｎ　１１）モジコー ル及びセルロース・アセテートからなる孔径０．２μｍのフィルタ膜を備えたザ ルトリウス・フィルタ（Ｓ訂ｔｏｒｉｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ＞を用いることにより 行われる。

その後、上層の流体は、ＤＣＩＯＬＡ又は５Ｐ２０フイルタ（いずれも米国アミ フン・コーホレーン９ン（Ａｓｉｃｏｎ　Ｃｏｒｌ＋−）により提供される）で 濃縮される。

セルロース・アセテートからなり、１０，０００ドルトンのカットオフ分子量を 示すＳ−１０ＹＩＯカートリツジ（Ａｍｉｃｏｎ提供）を通してろ過が行われる 。

次に、５ＩＹＩＯカートリツジを備えたアミコンＣＨ２（Ａｓｉｃｏｎ　ＣＨ２ ）フィルタによって限外ろ過が行われる。

アミコンＤＣ１０ＬＡフィルタを通過すると、ろ液２００すｙトルは約３リツト ルに減少し、そしてＣＨ２フィルタを通過すると、４ｏｏミリリ１トルに減少す る。

その後、ろ液は、ｐＨ５，３アセテート緩衝液（０，０２Ｍ）に対して以下の比 率に従って希釈される。すなわち、酵素体積ｌに対して、緩衝液体積６である。

本実施例においては、出願人は、酵素４００ミリリツトルを希釈するために緩衝 液２リツトルを用いた。

その次に、酢酸ナトリウム緩衝液（０，０２Ｍ）によりｐＨ５，３に平衡を保た れたＣＭ　Ｓ　ｅ　ｐｈ　ａ　ｄ　ｅ　ｘ　Ｃ−５０（Ｐｈａｒｍａｅｌａ）を 用いたイオン交換樹脂を通する過が行われる。各精製の後、イオン交換カラムは 、残存するタンパク質を除去するために４乃至５リツトルの１Ｍ酢酸アセテート を用いて再生される。

ノイラミニダーゼ活性試験 １、ＮＡＮＡ試験 水２００マイクロリットル中にＮＡＮＡを５．１０．１５，２０マイクログラム 含むブランク又は標準試料の少量溶液の各々が、１０マイクロリツトルの過ヨウ 素酸（０，１２５ＮのＨｚ　Ｓ　Ｏａ中に２５ｍＭ）により処理される。この混 合液は６０℃において５分間温室され、その間にヒ素ナトリウム１００マイクロ リットル（０，４ＮのＭＣＩ中）によって過剰な過ヨウ素酸塩が低減される。遊 離されたヨウ素の黄色い色が消えると（２分）、０．ＯＩＭのチオバルビッール 酸（ｐＨ９）を１ミリリツトル追加し、そして試料を覆って沸騰水浴中で７．５ 分加熱する。

その後、着色された溶液は氷水の浴により冷却され、アセトンペースのアセテー ト緩衝液（ＭＣＩが２．５％）２ミリリツトルとともに振り混ぜられる。吸光レ ベルは、分光光度計をもちいて（５５２ナノメートルにおいて）アセテ−ドプラ ／りとの比較により測定される。

２、酵素活性の分析 ノイラミニダーゼの酵素活性は、Ｋ、Ｓ値の５倍に相当する、基質１度の飽和レ ベルにおいて分析される。

遊離生成物は、比色技術（チオバルビッール酸法）を用いて測定される。例えば 、ノイラミニダーゼ酵素及びその基１ｊ（ＧＤｉａのようなンアロ糖脂１）が５ 乃至１０分間温置きれた後にその基質から加水分解されたＮ　Ａ　Ｎ　Ａを酵素 活性を評価するために用いる場合、その活性量を決定するために溶液中に遊離し ているＮＡＮＡが一連の反応を行う。

ＮＡＮＡはまた、ろ液を抽出する定常状態の細菌株培地を得るためにも用いられ るので、測定されたＮＡＮＡが酵素と基質との間の反応から生じたものであり元 の細菌株からの残留物から生じたものでないことを確認するために、２．３の検 査反応が行われる。

例えば、３本の試験管により以下に記載の２．３の試験が行われる。各試験管に は酢酸ナトリウム緩衝液を入れる。さらに第１の試験管にはＧＤＩａ基質のみを 入れ（Ｓ）、第２の試験管［ブランク（Ｂ）］には酵素のみを入れ、モして箪３ の試験管には基質と酵素の両方を入れる（Ｅ）。

ｓ　Ｂ　Ｅ 緩衝液　１５０’　１５０　１００マイクロリツトル基質　５０　−−−　５０ マイクロリツトル酵素　−５０５Ｑマイクロリットル ＊１の試験管（Ｓ）中にはＮＡＮＡは入っていないはずである。第２の試験管（ Ｂ）中にＮＡＮＡが検知されたならば、その分光光度針の測定値が、第３の試験 管（Ｅ）中の反応により得られる測定値から差引かれる。従って酵素活性は、ｐ Ｈ５，３及び３７℃において１分間に加水分解されるＮＡＮＡの量として間接的 に測定される。

その解析は以下のとおりである。

基質ＧＤＩａ（５０マイクロリツトル）及びノイラミニダーゼ酵素（５０マイク ロリツトル）が、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）とともに試験 管中に入れられ、そして５分間反応させられる。その後、０．１２５Ｎの過ヨウ 素酸Ｈ１０ａ　（Ｈ２ＳＯａ中に２５ｍＭ）を１００マイクロリツトル追加して 、さらに５分間加温浴（６０”Ｃ）中で反応をすすめさせられる。この時点でヒ 素ナトリウＡ（０，４ＮのＭＣＩ中に１．６％）１００フイクロリｙトル及び０ ．１Ｍのチオバルビッール酸（ＮａＯＨによりｐＨ９）１　ミリリットルを溶液 に追加シ、その追加後の溶液を１００℃の洛中で７．５分間加熱する。赤橙色が 現れる。この着色を安定化するために抽出溶液（アセトン及び塩酸）を２ミリリ ットル加える。ここで、分光光度計の測定値読取りを行うことができる。

酵素活性の計算 ノイラミニダーゼ１１位は、ＧＤｌａを基板として用い、３７℃にて１分間１ミ リリツトルあたり形成されたＮＡＮＡのマイクロモル（μｍｏｌ）として定義さ れる。従って、酵素溶液１ミリリツトルの活性は、次のように表される。

ＯＤ　ＮＡＮＡｘ２０ｘ希釈因子 ここで、ＯＤは分光光度計により測定されたＮＡＮＡの吸光度である。０．０８ ７２は、ＮＡＮＡ　ｌマイクログラムから得られる樟準ＯＤである。３０９．２ ８はＮＡＳＡの分子量であり、２０は本発明において用いられたｍ準希釈因子で ある。さらに希釈が行われる場合は、その因子もまた式に含めなければならない 。

この酵素の特有の活性はタンパク質の単位／ミ１ノグラムとして定義される。

前述のように得られた酵素の特徴 本発明によるプロセスを用いて得られるノイラミニダーゼは、次のような特徴を 有する。

ｌ）機能的作用 Ｎ−アセチル・ノイラミン酸の残留物がＧＤＩａから遊離され、ＧＭＩを形成す る反応の触媒として働く。

２）基質特異性 ノイラミニダーゼ活性は、ＧＤＩａのアルファ配置に対して非常に特異的である 。しかしながら次の表に示すように、ノイラミニダーゼはまた、合成ＮＡＮＡ乳 糖からのＮＡＮＡの遊離と同様に、ノ〜及びトリー／アロ糖脂質のアルファ及び ベータの混合物からのＮＡＮＡの１ｌ１１の触媒にもなる。

基質　相対活性（％） ３）最適ｐＨ 最適活性のためのｐＨは、５分間３７°Ｃにおいて５．０である。

４）安定性 この酵素は、エタノール、メタ／−ル及びブタノール等の種々の有機溶媒中で安 定である。すなわち、水とｆ子機溶媒との混合物中で活性が増すことを示してい る。

５）（活性に対する）最適温度範囲 この酵素は、４０°Ｃから５０″Ｃまで安定である。酵素活性に対する最適温度 は３７℃である。

６）酵素活性及び抑制 この酵素は、＋ｏ−４Ｍにほぼ等しいに、値を有し、ＮＡＮＡの存在下では極度 に抑制される。ＮＡＮＡについてのに、は、約０．３ｍＭである。

７）分子量 ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００に関するゲル透過クロマトグラフィ及びゲル電気 泳動により決定される分子量は、この酵素が８０．０００の分子量を有すること を示している。

８）純度 ノイラミニダーゼは、毒性がなくかつタンパク質分解酵素による汚染らない。

ψ　寸　ｎ　〜　−〇 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年　６月　１４日固 持許庁長官　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＥＰ９２１０２８６８ ２、発明の名称 ノイラミニダーゼの調製のためのプロセス３、特許出頒人 住　所　イタリア国、アイ−３５０３トアバノ・テルメ、ヴイア・ポンチ・デラ ・ファブブリカ、３／ニ一名称　フィディア・ニス・ピー・エイ 国　籍　イタリア国 ４、代理人 住　所　１７０東京都豊島区東池袋１丁目２０番２号池袋ホワイトハウスビル４ 階　電話（３９８２１６８８１１９９３年　１２月　９日 定常状態レベルに到達したとき、新鮮な培地がリアクタへ供給された。この培地 にはＮＡＮＡ及び塩が０．０５％含まれカゼインは含まれなかった。フロー速度 は３０ミリリットル／分、及び希釈率は毎時０．１３に等しかった。

この調製の結果は図２に記録されており、定常状管において約７００単位／リッ トルに等しい酵素生成が可能であることを注記する（ここで１酵素率位とは、Ｇ ＤＩａを基板として用いたときｐＨ５，３及び温度３７℃においてＮＡＮＡを１ μｍｏｌ／分で加水分解するために十分な酵素の量である）。図２中、ライン上 は吸光度（ＯＤ）を表し、ライン２は酵素活性（Ｕ／Ｌ）を表す。

例２ ＮＡＮＡｍ度１％のときの細菌成長 アルトロバクチル・シアラフィルスは、カゼイン加水物０．　１％及びＮＡＮＡ １％を含む培地中で成長させられた。

細菌成長が定常状態に達したとき、リアクタに、カゼイン加水物を含まない新鮮 な培地（ＮＡＮＡ及び塩を０．０５％含む）が供給された。フロー速度は３０ミ リリットル／分であった。

この結果は図３に記録されており、定常状態での生成が約１４００単位／リット ルであることを示している。ライン３は吸光度（ＯＤ）を表し、ライン４は酵素 活性（Ｕ／Ｌ）を表している。

例３ 請求の範囲 １．アルトロバクチル・ウレフェイ／エンス（＾ｒｔｈｒｏｂａｅＬｅｒυｒｅ ｆａｅｉｅｎｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ７５６２から得られるアルトロバクチル・７ア ラフイルス（＾ｒｔｈｒｏｂａｅｔｅｒ　５ｌａｌａｐｈｉｌｕｓ）を細菌株と して用いて、ノイラミニダーゼを調製するためのプロセスであって、 ａ）ＮＡＮＡとカゼイン加水物とを含む液体培地中において定常状態条件が得ら れるまでアルトロバクチル・／アラフィルスを培養するステップと、ｂ）低濃度 ＮＡＮＡを含みカゼイン加水物を含まない培地を前記アルトロバクチル・／アラ フィルスに供給することにより恒成分培養槽条件下において連続的培養が生じる べくノイラミニダーゼ生成を誘導するステップと、Ｃ）前記のように生成された 酵素を前記培地から回収し、さらにろ過、続いて濃縮、限外ろ過、希釈、及びイ オン交換樹脂へのフローによって精製するステップとを有することを特徴とする プロセス。

２、前記培養が、ｐＨ７，３かつ温度２６°Ｃである攪拌通気条件下において行 われる請求項１に記載のプロセス。

３、前記ＮＡＮＡの低濃度が、０．　１乃至１％である請求項１に記載のプロセ ス。

４、前記ステップｂ）において前記アルトロバクチル・ンアラフイルスが、０゜ １乃至０．２０Ｄ単位の細胞Ｖ濁の初期吸光度を有し、かつ前記細胞が３乃至４ ＯＤＩ１１位の吸光度に達するとき前記定常状態条件に達する請求項１に記載の プロセス。

５、細１１質量が０．４ｇｙリットルに達したときに０，０５％のＮＡＳＡを含 む新鮮な培地を毎時０．１３に等しい希釈値（単位時間当りの体積変化の値）に 相当するフロー速度で少量追加することにより、前記連続培養が実行される請求 項１に記載のプロセス。

、−−、ｌ＋＋＋、１１＝＝、−ＰＣＴ／Ｅρ　９２１０２１１６８フロントペ ージの続き ０．　ＮＺ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＡ、　ＵＳ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．アルトロバクテル・ウレフェイシェンス（Ａｒｔｈｍｂａｃｔｅｒ　Ｕｒｅ ｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ７５６２から得られるアルトロバクテル・シアラフィ ルス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｉａｌａＰｈｉｌｕｓ）を細菌株として用 いて、ノイラミニダーゼを調製するためのプロセスであって、 ａ）アルトロバクテル・シアラフィルス細菌培養が、カゼイン加水物を含培養培 地中の低濃度のＮ−アセチル・ノイラミン酸峨（ＮＡＮＡ）に曝され、ｂ）細菌 成長が、恒成分培養槽条件下において連続的培養で行われ、ｃ）前記のように生 成された酵素が培養地から回収され、さらにろ過、続いて濃縮、限外ろ過希釈、 及びイオン交換樹脂へのフローによって精製されることを特徴とするプロセス。
2. ２．前記アルトロバクテル・ンアラフィルスの初期培養が、０．１乃至０．２０ Ｄ単位の細胞態濁の吸光度を有する請求項１に記載のプロセス。
3. ３．前記培養が、ＰＨ７．３かつ温度２６℃である通気撹拌下において行われる 請求項１に記載のプロセス。
4. ４．前記ＮＡＮＡ濃度が、０．１乃至１．０％である請求項１に記載のプロセス
5. ５．細菌質量が０．４ｇ／リットルに達したときに０．０５％のＮＡＮＡを含む 新鮮な培地を毎時０．１３に等しい希釈値（単位時間当りの体積変化の値）に相 当するフロー速度で少量追加することにより、前記連続培養が実行される請求項 １に記載のプロセス。