JPH07324100A - アポリポタンパク質（ａ）の免疫反応性ペプチド - Google Patents
アポリポタンパク質（ａ）の免疫反応性ペプチドInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 抗アポリポタンパク質（ａ）抗体に対して免
疫反応性のペプチド、モノクローナル及びポリクローナ
ル抗体の誘発におけるその使用、イムノアッセイにおけ
るその使用、並びに核酸技術でプローブ及びプライマー
として有用なその対応するオリゴヌクレオチドを提供す
る。 【構成】 ヒト及び旧世界ザルアポリポタンパク質
（ａ）（ａｐｏ（ａ））に存在するアミノ酸配列に対応
する少なくとも５個のアミノ酸の配列からなり、ヒト及
び旧世界ザルプラスミノーゲンにおける対応する位置と
異なる少なくとも１個のアミノ酸を有しており、抗ａｐ
ｏ（ａ）抗体に対して免疫反応性であるが抗プラスミノ
ーゲン抗体に対しては非免疫反応性であり、ａｐｏ
（ａ）の完全アミノ酸配列よりも短い配列を含む単離及
び精製ペプチド、又は該ペプチドの類似体。
疫反応性のペプチド、モノクローナル及びポリクローナ
ル抗体の誘発におけるその使用、イムノアッセイにおけ
るその使用、並びに核酸技術でプローブ及びプライマー
として有用なその対応するオリゴヌクレオチドを提供す
る。 【構成】 ヒト及び旧世界ザルアポリポタンパク質
（ａ）（ａｐｏ（ａ））に存在するアミノ酸配列に対応
する少なくとも５個のアミノ酸の配列からなり、ヒト及
び旧世界ザルプラスミノーゲンにおける対応する位置と
異なる少なくとも１個のアミノ酸を有しており、抗ａｐ
ｏ（ａ）抗体に対して免疫反応性であるが抗プラスミノ
ーゲン抗体に対しては非免疫反応性であり、ａｐｏ
（ａ）の完全アミノ酸配列よりも短い配列を含む単離及
び精製ペプチド、又は該ペプチドの類似体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗アポリポタンパク質
（ａ）抗体に対して免疫反応性のペプチド、モノクロー
ナル及びポリクローナル抗体の誘発におけるその使用、
イムノアッセイにおけるその使用、並びに核酸技術でプ
ローブ及びプライマーとして有用なそれに対応するオリ
ゴヌクレオチドに係る。
（ａ）抗体に対して免疫反応性のペプチド、モノクロー
ナル及びポリクローナル抗体の誘発におけるその使用、
イムノアッセイにおけるその使用、並びに核酸技術でプ
ローブ及びプライマーとして有用なそれに対応するオリ
ゴヌクレオチドに係る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】乳状脂
粒、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポ
タンパク質（ＬＤＬ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤ
Ｌ）を含むリポタンパク質は血漿コレステロールの主担
体である。これらの粒子は種々の割合のトリグリセリ
ド、コレステロール、コレステロールエステル、リン脂
質及びタンパク質から構成される。これらの粒子はアポ
リポタンパク質として知られており、リポタンパク質の
代謝において主要な役割を果たす。アポリポタンパク質
には、脂質の共有結合的修飾及びリポタンパク質サブフ
ラクションの改変に重要な酵素を活性化するものと、夫
々の脂質成分が貯蔵又は使用される特定組織部位に改変
リポタンパク質をターゲットするレセプターリガンドと
して機能するものがある。
粒、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポ
タンパク質（ＬＤＬ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤ
Ｌ）を含むリポタンパク質は血漿コレステロールの主担
体である。これらの粒子は種々の割合のトリグリセリ
ド、コレステロール、コレステロールエステル、リン脂
質及びタンパク質から構成される。これらの粒子はアポ
リポタンパク質として知られており、リポタンパク質の
代謝において主要な役割を果たす。アポリポタンパク質
には、脂質の共有結合的修飾及びリポタンパク質サブフ
ラクションの改変に重要な酵素を活性化するものと、夫
々の脂質成分が貯蔵又は使用される特定組織部位に改変
リポタンパク質をターゲットするレセプターリガンドと
して機能するものがある。
【０００３】リポタンパク質（ａ）はＬＤＬに類似する
リポタンパク質粒子の１類であるが、プラスミノーゲン
との間に有意な相同を有する糖タンパク質であるアポリ
ポタンパク質（ａ）（ａｐｏ（ａ））とａｐｏ Ｂ１０
０との共有結合により区別される。高濃度の血漿中Ｌｐ
（ａ）は、間欠性跛行、大動脈瘤、冠動脈狭窄症、心筋
梗塞及び脳梗塞を含むアテローム性動脈硬化症の危険の
増加に結び付けられる。じゅく腫形成におけるＬｐ
（ａ）の役割に関する研究は、Ｌｐ（ａ）と内皮細胞及
びマクロファージ並びに細胞外血漿タンパク質（例えば
フィブリン）との結合に集中していた。ヒト繊維芽細胞
及び単核細胞に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の結果、Ｌ
ｐ（ａ）はＬＤＬレセプターにより取り込まれることが
立証された。更に、Ｌｐ（ａ）は脂質過酸化の結果、マ
クロファージ上のスカベンジャーレセプターにより取り
込まれる。スカベンジャーレセプターはＬＤＬレセプタ
ーと構造的に異なり、アテロームへの脂質過酸化物改変
ＬＤＬ取り込みにおいて役割を果たすと考えられる。免
疫組織化学によりａｐｏ（ａ）及びａｐｏ Ｂが動脈壁
斑内に存在することが立証された。Ｌｐ（ａ）様粒子を
斑から分離することができる。更に、血清中Ｌｐ（ａ）
濃度と動脈壁中のａｐｏ（ａ）の量との相関が報告され
ている。
リポタンパク質粒子の１類であるが、プラスミノーゲン
との間に有意な相同を有する糖タンパク質であるアポリ
ポタンパク質（ａ）（ａｐｏ（ａ））とａｐｏ Ｂ１０
０との共有結合により区別される。高濃度の血漿中Ｌｐ
（ａ）は、間欠性跛行、大動脈瘤、冠動脈狭窄症、心筋
梗塞及び脳梗塞を含むアテローム性動脈硬化症の危険の
増加に結び付けられる。じゅく腫形成におけるＬｐ
（ａ）の役割に関する研究は、Ｌｐ（ａ）と内皮細胞及
びマクロファージ並びに細胞外血漿タンパク質（例えば
フィブリン）との結合に集中していた。ヒト繊維芽細胞
及び単核細胞に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の結果、Ｌ
ｐ（ａ）はＬＤＬレセプターにより取り込まれることが
立証された。更に、Ｌｐ（ａ）は脂質過酸化の結果、マ
クロファージ上のスカベンジャーレセプターにより取り
込まれる。スカベンジャーレセプターはＬＤＬレセプタ
ーと構造的に異なり、アテロームへの脂質過酸化物改変
ＬＤＬ取り込みにおいて役割を果たすと考えられる。免
疫組織化学によりａｐｏ（ａ）及びａｐｏ Ｂが動脈壁
斑内に存在することが立証された。Ｌｐ（ａ）様粒子を
斑から分離することができる。更に、血清中Ｌｐ（ａ）
濃度と動脈壁中のａｐｏ（ａ）の量との相関が報告され
ている。
【０００４】ａｐｏ（ａ）とプラスミノーゲンとの相同
によりアテローム性血栓症におけるａｐｏ（ａ）の役割
も研究されている。Ｌｐ（ａ）はフィブリンとの結合に
関してプラスミノーゲンと競合する。Ｌｐ（ａ）は酵素
的にフィブリンを分解しないので、フィブリン凝塊溶解
を阻止することができる。冠動脈内における血栓形成
は、心筋梗塞の主要な原因であると考えられる。従っ
て、Ｌｐ（ａ）はじゅく腫形成において多様な機序を有
し得る。
によりアテローム性血栓症におけるａｐｏ（ａ）の役割
も研究されている。Ｌｐ（ａ）はフィブリンとの結合に
関してプラスミノーゲンと競合する。Ｌｐ（ａ）は酵素
的にフィブリンを分解しないので、フィブリン凝塊溶解
を阻止することができる。冠動脈内における血栓形成
は、心筋梗塞の主要な原因であると考えられる。従っ
て、Ｌｐ（ａ）はじゅく腫形成において多様な機序を有
し得る。
【０００５】ａｐｏ（ａ）は寸法が著しく不均一であ
り、１９〜３４の異なる対立遺伝子が報告されている
（Ｌａｃｋｎｅｒ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，８７：２１５８−６１（１９９１）； Ｋａｍｂ
ｏｈ，Ｍ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４
９：１０６３−７４（１９９１）； Ｍａｒｃｏｖｉｎ
ａ，Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍ．，１９１：１１９２−６（１９９
３））。Ｕｔｅｒｍａｎｎら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．８０：４５８−６７（１９８７）及びＳａｎｄｈ
ｏｌｚｅｒら（Ａｒｔｅｒｉｏａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂ．
１２：１２１４−２６（１９９２））は６種の異なるア
イソフォームを報告しており、Ｍａｒｃｏｖｉｎａら
（Ａｒｔｅｒｉｏ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂ．１３：１０
３７−４５（１９９３））はａｐｏ Ｂの電気泳動移動
度との比較に基づき、第７のアイソフォームを追加し
た。各種に割り当てられた分子量概数値を下記表１に示
す。ａｐｏ（ａ）多形性は、（プラスミノーゲンにおけ
るクリングル４に構造的に類似する）クリングル４ドメ
インの数が異なるアイソフォームを各々コードする一連
の対立遺伝子に起因する。ａｐｏ（ａ）は図１に示すよ
うに、５〜３７個のクリングル４反復ドメインと、１個
のクリングル５ドメインと、プラスミノーゲンに対して
９４％の相同を有する不活性セリンプロテアーゼ領域と
を含む。従って、ａｐｏ（ａ）表現型の寸法の相違はａ
ｐｏ（ａ）におけるクリングル４反復単位の数に主に起
因するが、グリコシル化の相違にも起因し得る。
り、１９〜３４の異なる対立遺伝子が報告されている
（Ｌａｃｋｎｅｒ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
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ｏｈ，Ｍ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４
９：１０６３−７４（１９９１）； Ｍａｒｃｏｖｉｎ
ａ，Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍ．，１９１：１１９２−６（１９９
３））。Ｕｔｅｒｍａｎｎら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．８０：４５８−６７（１９８７）及びＳａｎｄｈ
ｏｌｚｅｒら（Ａｒｔｅｒｉｏａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂ．
１２：１２１４−２６（１９９２））は６種の異なるア
イソフォームを報告しており、Ｍａｒｃｏｖｉｎａら
（Ａｒｔｅｒｉｏ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂ．１３：１０
３７−４５（１９９３））はａｐｏ Ｂの電気泳動移動
度との比較に基づき、第７のアイソフォームを追加し
た。各種に割り当てられた分子量概数値を下記表１に示
す。ａｐｏ（ａ）多形性は、（プラスミノーゲンにおけ
るクリングル４に構造的に類似する）クリングル４ドメ
インの数が異なるアイソフォームを各々コードする一連
の対立遺伝子に起因する。ａｐｏ（ａ）は図１に示すよ
うに、５〜３７個のクリングル４反復ドメインと、１個
のクリングル５ドメインと、プラスミノーゲンに対して
９４％の相同を有する不活性セリンプロテアーゼ領域と
を含む。従って、ａｐｏ（ａ）表現型の寸法の相違はａ
ｐｏ（ａ）におけるクリングル４反復単位の数に主に起
因するが、グリコシル化の相違にも起因し得る。
【０００６】
【表１】
【０００７】遺伝子寸法多形性は血漿中Ｌｐ（ａ）濃度
に関連付けられる。低分子量アイソフォーム（Ｆ、Ｂ、
Ｓ１及びＳ２）は高Ｌｐ（ａ）濃度に関連付けられ、高
分子量アイソフォーム（Ｓ３、Ｓ４及びＳ５）は低Ｌｐ
（ａ）血漿中濃度に関連付けられる（Ｇａｕｂａｔｚ，
Ｊ．ら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１：６０３−１３
（１９９０））。従って、Ｌｐ（ａ）濃度は遺伝的に調
節されると考えられる。更に、高Ｌｐ（ａ）濃度はアテ
ローム性動脈硬化症の危険の増加に結び付けられるの
で、ａｐｏ（ａ）アイソフォームと冠動脈疾患の危険と
の関連が報告されている。
に関連付けられる。低分子量アイソフォーム（Ｆ、Ｂ、
Ｓ１及びＳ２）は高Ｌｐ（ａ）濃度に関連付けられ、高
分子量アイソフォーム（Ｓ３、Ｓ４及びＳ５）は低Ｌｐ
（ａ）血漿中濃度に関連付けられる（Ｇａｕｂａｔｚ，
Ｊ．ら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１：６０３−１３
（１９９０））。従って、Ｌｐ（ａ）濃度は遺伝的に調
節されると考えられる。更に、高Ｌｐ（ａ）濃度はアテ
ローム性動脈硬化症の危険の増加に結び付けられるの
で、ａｐｏ（ａ）アイソフォームと冠動脈疾患の危険と
の関連が報告されている。
【０００８】過去数十年間にＬｐ（ａ）を測定するため
に数種の方法が開発されている。まず最初にＬｐ（ａ）
は非変性条件下で澱粉又は寒天ゲル内の電気泳動により
同定され、脂質結合染色を使用して可視化された。しか
しながら、この方法は定性的であり、定量的ではなかっ
た。精製抗体が市販されるようになると、放射状免疫拡
散（ＲＩＤ）、電気免疫拡散（ＥＩＤ）及び免疫電気泳
動（ＩＥＰ）法が開発された。ＲＩＤは全血清及び血漿
サンプル中でＬｐ（ａ）を測定するために必要な感度を
欠いており、更に重要な点として、Ｌｐ（ａ）の粒度差
に左右された。他方、Ｌｐ（ａ）の増加と心臓血管疾患
の危険を関連付ける研究の大多数で使用されたＥＩＤ及
びＩＥＰはいずれも高精度且つ高感度である。しかしな
がら、これらの方法は手間と時間がかかり、多数のサン
プルを用いる試験にはあまり適していない。更に、どち
らの方法も自動化に適していない。免疫比濁分析法は高
トリグリセリド濃度及びサンプルの凍結の影響を受け
る。更に、比濁分析法は光散乱性の相違により、測定さ
れるＬｐ（ａ）粒子の粒度差にも高感受性である。ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）は感受性且つ特異的である
が、放射性成分は貯蔵寿命が限られており、専用装置と
特殊操作を必要とする。
に数種の方法が開発されている。まず最初にＬｐ（ａ）
は非変性条件下で澱粉又は寒天ゲル内の電気泳動により
同定され、脂質結合染色を使用して可視化された。しか
しながら、この方法は定性的であり、定量的ではなかっ
た。精製抗体が市販されるようになると、放射状免疫拡
散（ＲＩＤ）、電気免疫拡散（ＥＩＤ）及び免疫電気泳
動（ＩＥＰ）法が開発された。ＲＩＤは全血清及び血漿
サンプル中でＬｐ（ａ）を測定するために必要な感度を
欠いており、更に重要な点として、Ｌｐ（ａ）の粒度差
に左右された。他方、Ｌｐ（ａ）の増加と心臓血管疾患
の危険を関連付ける研究の大多数で使用されたＥＩＤ及
びＩＥＰはいずれも高精度且つ高感度である。しかしな
がら、これらの方法は手間と時間がかかり、多数のサン
プルを用いる試験にはあまり適していない。更に、どち
らの方法も自動化に適していない。免疫比濁分析法は高
トリグリセリド濃度及びサンプルの凍結の影響を受け
る。更に、比濁分析法は光散乱性の相違により、測定さ
れるＬｐ（ａ）粒子の粒度差にも高感受性である。ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）は感受性且つ特異的である
が、放射性成分は貯蔵寿命が限られており、専用装置と
特殊操作を必要とする。
【０００９】これらの方法に伴う問題を解決するため
に、サンドイッチＥＬＩＳＡとして知られるイムノアッ
セイが開発された。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は粒度
及び密度の異なるＬｐ（ａ）粒子の固有の分子特徴を把
握して適用しなければならない。市販のＬｐ（ａ）ＥＬ
ＩＳＡアッセイの１例は、捕獲抗体としてマウスモノク
ローナル抗ａｐｏ（ａ）抗体を使用し、検出システムと
してヒツジポリクローナル抗ａｐｏ Ｂ−ペルオキシダ
ーゼ複合体を使用する。
に、サンドイッチＥＬＩＳＡとして知られるイムノアッ
セイが開発された。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は粒度
及び密度の異なるＬｐ（ａ）粒子の固有の分子特徴を把
握して適用しなければならない。市販のＬｐ（ａ）ＥＬ
ＩＳＡアッセイの１例は、捕獲抗体としてマウスモノク
ローナル抗ａｐｏ（ａ）抗体を使用し、検出システムと
してヒツジポリクローナル抗ａｐｏ Ｂ−ペルオキシダ
ーゼ複合体を使用する。
【００１０】Ｌｐ（ａ）を定量するために使用するイム
ノアッセイ法は全アイソフォームを同等に良好に認識す
る抗体を使用すべきであり、従って、このようなアッセ
イではａｐｏ（ａ）分子内の非反復エピトープを認識し
且つプラスミノーゲン分子内に存在しない抗体のみを使
用すべきである。ａｐｏ（ａ）のクリングル４ドメイン
は高頻度反復性であるので、エピトープはクリングル５
又はプロテアーゼ様ドメインのいずれかに存在する筈で
ある。しかしながら、Ｊ．Ｅ．Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９５７−６５，
１９８９）によると、アカゲザルａｐｏ（ａ）はクリン
グル５ドメインを含まないので、この共通動物モデル及
び場合により他の旧世界ザル種（ヒヒ、アフリカミドリ
ザル及びマカクザル）におけるＬｐ（ａ）の定量用アッ
セイを開発するためには、使用する抗体はａｐｏ（ａ）
のプロテアーゼドメインにおいてのみ固有の非反復エピ
トープ、即ちプラスミノーゲン分子内には存在しないエ
ピトープを認識しなければならない。ヒトａｐｏ（ａ）
のプロテアーゼドメインはヒトプラスミノーゲンとの間
に９４％の相同を有するので、ａｐｏ（ａ）のみに固有
の非反復エピトープを認識する抗体を得る可能性は極め
て低い。
ノアッセイ法は全アイソフォームを同等に良好に認識す
る抗体を使用すべきであり、従って、このようなアッセ
イではａｐｏ（ａ）分子内の非反復エピトープを認識し
且つプラスミノーゲン分子内に存在しない抗体のみを使
用すべきである。ａｐｏ（ａ）のクリングル４ドメイン
は高頻度反復性であるので、エピトープはクリングル５
又はプロテアーゼ様ドメインのいずれかに存在する筈で
ある。しかしながら、Ｊ．Ｅ．Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９５７−６５，
１９８９）によると、アカゲザルａｐｏ（ａ）はクリン
グル５ドメインを含まないので、この共通動物モデル及
び場合により他の旧世界ザル種（ヒヒ、アフリカミドリ
ザル及びマカクザル）におけるＬｐ（ａ）の定量用アッ
セイを開発するためには、使用する抗体はａｐｏ（ａ）
のプロテアーゼドメインにおいてのみ固有の非反復エピ
トープ、即ちプラスミノーゲン分子内には存在しないエ
ピトープを認識しなければならない。ヒトａｐｏ（ａ）
のプロテアーゼドメインはヒトプラスミノーゲンとの間
に９４％の相同を有するので、ａｐｏ（ａ）のみに固有
の非反復エピトープを認識する抗体を得る可能性は極め
て低い。
【００１１】このような抗体は開発され、上記市販ＥＬ
ＩＳＡ Ｌｐ（ａ）アッセイで使用されている。しかし
ながら、このようなエピトープ又はペプチドを使用して
Ｌｐ（ａ）を検出するアッセイを開発するためには、反
応性エピトープの正確なアミノ酸配列を知ることが望ま
しい。これらのペプチドをコードするＤＮＡヌクレオチ
ドが複製されるならば、核酸に基づく検出及び増殖法を
使用してａｐｏ（ａ）を検出又は定量することができよ
う。また、このようなペプチドを適切な動物で抗原とし
て使用するならば、ａｐｏ（ａ）に対するモノクローナ
ル及びポリクローナル抗体を誘発することができよう。
ＩＳＡ Ｌｐ（ａ）アッセイで使用されている。しかし
ながら、このようなエピトープ又はペプチドを使用して
Ｌｐ（ａ）を検出するアッセイを開発するためには、反
応性エピトープの正確なアミノ酸配列を知ることが望ま
しい。これらのペプチドをコードするＤＮＡヌクレオチ
ドが複製されるならば、核酸に基づく検出及び増殖法を
使用してａｐｏ（ａ）を検出又は定量することができよ
う。また、このようなペプチドを適切な動物で抗原とし
て使用するならば、ａｐｏ（ａ）に対するモノクローナ
ル及びポリクローナル抗体を誘発することができよう。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明によると、アミノ
酸配列ＦＬＥＰＴＱＡＤＩＡＬ（配列番号２）を含むペ
プチドはａｐｏ（ａ）に対する抗体に結合し、これを免
疫学的に検出することが判明した。例えば、開発された
抗ａｐｏ（ａ）モノクローナル抗体の１種は配列番号１
のペプチドに対してのみならずＬｐ（ａ）におけるａｐ
ｏ（ａ）、単離ａｐｏ（ａ）及びａｐｏ（ａ）プロテア
ーゼドメインに対しても免疫反応性であるとして特徴付
けられる。この抗体はクリングル５ドメインとクリング
ル４ドメインの大きい配列、即ち高頻度反復性であるク
リングル４ドメインの３５番目の一部と３６番目及び３
７番目の全部に対して免疫反応性である。
酸配列ＦＬＥＰＴＱＡＤＩＡＬ（配列番号２）を含むペ
プチドはａｐｏ（ａ）に対する抗体に結合し、これを免
疫学的に検出することが判明した。例えば、開発された
抗ａｐｏ（ａ）モノクローナル抗体の１種は配列番号１
のペプチドに対してのみならずＬｐ（ａ）におけるａｐ
ｏ（ａ）、単離ａｐｏ（ａ）及びａｐｏ（ａ）プロテア
ーゼドメインに対しても免疫反応性であるとして特徴付
けられる。この抗体はクリングル５ドメインとクリング
ル４ドメインの大きい配列、即ち高頻度反復性であるク
リングル４ドメインの３５番目の一部と３６番目及び３
７番目の全部に対して免疫反応性である。
【００１３】上記抗ａｐｏ（ａ）抗体に対して免疫学的
に反応性であると思われる他の非反復ペプチドを以下に
示す。
に反応性であると思われる他の非反復ペプチドを以下に
示す。
【００１４】
【化１】
【００１５】配列番号２、４、６、８、１０、１２、１
４、１６及び１８のペプチド、免疫学的に機能的なその
フラグメント、これらの配列を含むより大きいペプチド
及びこれらのペプチドの類似体は、血清又は血漿試料に
おけるａｐｏ（ａ）又はＬｐ（ａ）の定量に関してこれ
らの試料中のａｐｏ（ａ）と競合するために抗体と結合
するイムノアッセイ（例えば競合阻害ＥＬＩＳＡイムノ
アッセイ）で有用である。これらのペプチドは、試験血
清又は血漿中のＬｐ（ａ）又はａｐｏ（ａ）濃度を検出
及び定量するイムノアッセイで使用されるａｐｏ（ａ）
に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体を誘発
する上でも有用である。これらのペプチドをコードする
ＤＮＡヌクレオチドは、核酸に基づく技術でプローブ又
はプライマーとして使用することができ、例えばＮＡＳ
ＢＡ（登録商標）（参考資料として本明細書の一部とす
るＫｉｅｖｉｔｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ，３５：２７３−２８６に所収のＮｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ ＳｅｑｕｅｎｃｅＢａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ参照）や、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の
任意の配列に基づく増幅技術で使用することができる。
４、１６及び１８のペプチド、免疫学的に機能的なその
フラグメント、これらの配列を含むより大きいペプチド
及びこれらのペプチドの類似体は、血清又は血漿試料に
おけるａｐｏ（ａ）又はＬｐ（ａ）の定量に関してこれ
らの試料中のａｐｏ（ａ）と競合するために抗体と結合
するイムノアッセイ（例えば競合阻害ＥＬＩＳＡイムノ
アッセイ）で有用である。これらのペプチドは、試験血
清又は血漿中のＬｐ（ａ）又はａｐｏ（ａ）濃度を検出
及び定量するイムノアッセイで使用されるａｐｏ（ａ）
に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体を誘発
する上でも有用である。これらのペプチドをコードする
ＤＮＡヌクレオチドは、核酸に基づく技術でプローブ又
はプライマーとして使用することができ、例えばＮＡＳ
ＢＡ（登録商標）（参考資料として本明細書の一部とす
るＫｉｅｖｉｔｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ，３５：２７３−２８６に所収のＮｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ ＳｅｑｕｅｎｃｅＢａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ参照）や、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の
任意の配列に基づく増幅技術で使用することができる。
【００１６】動物を免疫感作して抗体を誘発するため又
はモノクローナル抗体を開発するために固有のペプチド
を使用するには、たった５個のアミノ酸を含む上記ペプ
チドの一部のみを使用すればよい。これらの小さいペプ
チドはプラスミノーゲンに対して反応しない抗ａｐｏ
（ａ）抗体を誘発できるか否かという点のみが制限され
ているので、ａｐｏ（ａ）に固有のアミノ酸配列を含む
必要がある。例えば、プラスミノーゲンに比較した場合
にａｐｏ（ａ）に固有のアミノ酸が配列の中心に位置す
る以下のペプチドはこの要件を満たすが、本発明はこれ
らの例に制限されない。
はモノクローナル抗体を開発するために固有のペプチド
を使用するには、たった５個のアミノ酸を含む上記ペプ
チドの一部のみを使用すればよい。これらの小さいペプ
チドはプラスミノーゲンに対して反応しない抗ａｐｏ
（ａ）抗体を誘発できるか否かという点のみが制限され
ているので、ａｐｏ（ａ）に固有のアミノ酸配列を含む
必要がある。例えば、プラスミノーゲンに比較した場合
にａｐｏ（ａ）に固有のアミノ酸が配列の中心に位置す
る以下のペプチドはこの要件を満たすが、本発明はこれ
らの例に制限されない。
【００１７】
【化２】
【００１８】固有アミノ酸が中心以外に位置する他のペ
プチドも本発明で有用であると予想される。
プチドも本発明で有用であると予想される。
【００１９】「ペプチド」なる用語はペプチド結合によ
り結合した２個以上のアミノ酸から形成される化合物と
して定義され、分子に特定の寸法制限はない。更に、必
要に応じてペプチドは例えばグリコシル化、アミド化、
カルボキシル化又はリン酸化によりｉｎ ｖｉｖｏ又は
ｉｎ ｖｉｔｒｏ改変され得る。
り結合した２個以上のアミノ酸から形成される化合物と
して定義され、分子に特定の寸法制限はない。更に、必
要に応じてペプチドは例えばグリコシル化、アミド化、
カルボキシル化又はリン酸化によりｉｎ ｖｉｖｏ又は
ｉｎ ｖｉｔｒｏ改変され得る。
【００２０】ヒト血漿中のＬｐ（ａ）濃度を検出及び定
量するために開発された市販のＥＬＩＳＡアッセイの１
種は以下のように実施される。抗ａｐｏ（ａ）マウスモ
ノクローナル抗体（Ｍａｂ）で被覆したマイクロタイタ
ーウェルを血漿と接触させ、インキュベート及び洗浄す
る。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標
識ヒツジ抗ヒトａｐｏ Ｂをウェルに加え、インキュベ
ート及び洗浄する。テトラメチルベンジデン（ＴＭＢ）
基質を加えることにより発色させ、ウェルの吸光度を読
み取る。Ｌｐ（ａ）濃度が読み取れる場合には、これを
測定する。
量するために開発された市販のＥＬＩＳＡアッセイの１
種は以下のように実施される。抗ａｐｏ（ａ）マウスモ
ノクローナル抗体（Ｍａｂ）で被覆したマイクロタイタ
ーウェルを血漿と接触させ、インキュベート及び洗浄す
る。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標
識ヒツジ抗ヒトａｐｏ Ｂをウェルに加え、インキュベ
ート及び洗浄する。テトラメチルベンジデン（ＴＭＢ）
基質を加えることにより発色させ、ウェルの吸光度を読
み取る。Ｌｐ（ａ）濃度が読み取れる場合には、これを
測定する。
【００２１】このアッセイで使用されるモノクローナル
抗体２Ｄ１は、Ｌｐ（ａ）中のａｐｏ（ａ）、単離ａｐ
ｏ（ａ）、ａｐｏ（ａ）プロテアーゼドメインに対して
免疫反応性であるが、クリングル５ドメイン、クリング
ル４ドメインの大きい配列（即ち高頻度反復性であるク
リングル４ドメインの３５番目の一部と３６番目及び３
７番目の全部）に対しては免疫反応性でないとして特徴
付けられる。
抗体２Ｄ１は、Ｌｐ（ａ）中のａｐｏ（ａ）、単離ａｐ
ｏ（ａ）、ａｐｏ（ａ）プロテアーゼドメインに対して
免疫反応性であるが、クリングル５ドメイン、クリング
ル４ドメインの大きい配列（即ち高頻度反復性であるク
リングル４ドメインの３５番目の一部と３６番目及び３
７番目の全部）に対しては免疫反応性でないとして特徴
付けられる。
【００２２】２Ｄ１をより詳しく特徴付けるために、２
Ｄ１と免疫反応するａｐｏ（ａ）上のエピトープが発見
された。アミノ酸残基配列ＦＬＥＰＴＱＡＤＩＡＬ（配
列番号２）を有するペプチドは２Ｄ１に対して高反応性
であることが知見された。
Ｄ１と免疫反応するａｐｏ（ａ）上のエピトープが発見
された。アミノ酸残基配列ＦＬＥＰＴＱＡＤＩＡＬ（配
列番号２）を有するペプチドは２Ｄ１に対して高反応性
であることが知見された。
【００２３】このペプチドはａｐｏ（ａ）分子自体から
得ることができ、あるいは組換え手段により製造して単
離及び精製するか、化学的に合成することもできる。こ
のペプチドは例えば競合阻害ＥＬＩＳＡによる哺乳動物
の体液（例えば血漿及び血清）中のａｐｏ（ａ）の検出
や、体液（例えば血清又は血漿）中のａｐｏ（ａ）の検
出用イムノアッセイで特に使用可能な抗ａｐｏ（ａ）モ
ノクローナル及びポリクローナル抗体の開発に有用であ
る。
得ることができ、あるいは組換え手段により製造して単
離及び精製するか、化学的に合成することもできる。こ
のペプチドは例えば競合阻害ＥＬＩＳＡによる哺乳動物
の体液（例えば血漿及び血清）中のａｐｏ（ａ）の検出
や、体液（例えば血清又は血漿）中のａｐｏ（ａ）の検
出用イムノアッセイで特に使用可能な抗ａｐｏ（ａ）モ
ノクローナル及びポリクローナル抗体の開発に有用であ
る。
【００２４】配列番号２のペプチドは、いずれも参考資
料として本明細書の一部とするｖａｎ Ｇｒｕｎｓｖｅ
ｎ，Ｗ．Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９０８−
３９１６（１９９３）、米国特許第４，８３３，０９２
号及びＷＯ８４／０３５６４号に記載されているＰＥＰ
ＳＣＡＮ法により２Ｄ１の反応性エピトープを含むこと
が判明した。この方法によると、２つのオーバーラップ
する１２マーペプチドがモノクローナル抗体２Ｄ１と強
く反応した。これらのペプチドは、ＬＦＬＥＰＴＱＡＤ
ＩＡＬ（配列番号２０）及びＦＬＥＰＴＱＡＤＩＡＬＬ
（配列番号２２）である。これらの結果から、２Ｄ１の
エピトープはオーバーラップする部分、即ち配列番号２
のペプチドに含まれることが判明した。このペプチドは
プラスミノーゲン上の対応する位置におけるアミノ酸残
基とは異なるアミノ酸残基（アラニン）を含む。これ
は、２Ｄ１がａｐｏ（ａ）と反応し、プラスミノーゲン
とは反応しない理由を説明するものである。
料として本明細書の一部とするｖａｎ Ｇｒｕｎｓｖｅ
ｎ，Ｗ．Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９０８−
３９１６（１９９３）、米国特許第４，８３３，０９２
号及びＷＯ８４／０３５６４号に記載されているＰＥＰ
ＳＣＡＮ法により２Ｄ１の反応性エピトープを含むこと
が判明した。この方法によると、２つのオーバーラップ
する１２マーペプチドがモノクローナル抗体２Ｄ１と強
く反応した。これらのペプチドは、ＬＦＬＥＰＴＱＡＤ
ＩＡＬ（配列番号２０）及びＦＬＥＰＴＱＡＤＩＡＬＬ
（配列番号２２）である。これらの結果から、２Ｄ１の
エピトープはオーバーラップする部分、即ち配列番号２
のペプチドに含まれることが判明した。このペプチドは
プラスミノーゲン上の対応する位置におけるアミノ酸残
基とは異なるアミノ酸残基（アラニン）を含む。これ
は、２Ｄ１がａｐｏ（ａ）と反応し、プラスミノーゲン
とは反応しない理由を説明するものである。
【００２５】ａｐｏ（ａ）分子のプロテアーゼ領域のア
ミノ酸配列が決定され、プラスミノーゲンの対応領域と
整列後、本発明者らは、ａｐｏ（ａ）の定量用イムノア
ッセイで使用可能な抗体を誘発するのに有用であると思
われる数種のペプチドフラグメントを発見した。特に、
配列番号２のペプチドと同様に、これらのペプチドフラ
グメントは対応するプラスミノーゲン分子上のアミノ酸
残基とは異なるアミノ酸残基を各々含む。対応するプラ
スミノーゲンアミノ酸と異なるアミノ酸を含むという条
件下で５個のアミノ酸残基を含み得るこれらのペプチド
フラグメントは、当業者に公知の方法により動物を免疫
感作してポリクローナル抗体を誘発するため又はモノク
ローナル抗体を製造するために使用することができる。
このような小フラグメントは通常、免疫応答を誘発する
ために、より大きい担体タンパク質に結合される。ペプ
チドをより大きいタンパク質分子に結合する方法は当業
者に公知である（例えば参考資料として本明細書の一部
とするＡｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８参照）。ａｐｏ（ａ）に特
異的な抗体を誘発するのに特に有用であると思われるペ
プチドは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、
１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３
２、３４、３６、３８及び４０の配列を含む全ペプチド
である。
ミノ酸配列が決定され、プラスミノーゲンの対応領域と
整列後、本発明者らは、ａｐｏ（ａ）の定量用イムノア
ッセイで使用可能な抗体を誘発するのに有用であると思
われる数種のペプチドフラグメントを発見した。特に、
配列番号２のペプチドと同様に、これらのペプチドフラ
グメントは対応するプラスミノーゲン分子上のアミノ酸
残基とは異なるアミノ酸残基を各々含む。対応するプラ
スミノーゲンアミノ酸と異なるアミノ酸を含むという条
件下で５個のアミノ酸残基を含み得るこれらのペプチド
フラグメントは、当業者に公知の方法により動物を免疫
感作してポリクローナル抗体を誘発するため又はモノク
ローナル抗体を製造するために使用することができる。
このような小フラグメントは通常、免疫応答を誘発する
ために、より大きい担体タンパク質に結合される。ペプ
チドをより大きいタンパク質分子に結合する方法は当業
者に公知である（例えば参考資料として本明細書の一部
とするＡｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８参照）。ａｐｏ（ａ）に特
異的な抗体を誘発するのに特に有用であると思われるペ
プチドは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、
１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３
２、３４、３６、３８及び４０の配列を含む全ペプチド
である。
【００２６】本発明のペプチドの各々は、本明細書に示
す配列よりも短くてもよい（但し、各フラグメントはユ
ニークアミノ酸を含む少なくとも５個のアミノ酸を含
む）し、各ペプチドは各々の末端部分に付加的アミノ酸
を加えることにより指定配列よりも長いペプチド鎖を有
してもよい。これらの付加的アミノ酸はａｐｏ（ａ）分
子中のペプチドをフランキングするものでもよいし（但
しペプチドは反復エピトープが存在するａｐｏ（ａ）分
子内の点まで延びない）、異種アミノ酸でもよい。配列
番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、
２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３
６、３８及び４０の各々と実質的に同一アミノ酸残基を
有するが、ペプチドが抗ａｐｏ（ａ）モノクローナル抗
体に対して規定の反応性を維持しながら一部のアミノ酸
が保存的に置換された類似体も本発明の一部とみなされ
る。
す配列よりも短くてもよい（但し、各フラグメントはユ
ニークアミノ酸を含む少なくとも５個のアミノ酸を含
む）し、各ペプチドは各々の末端部分に付加的アミノ酸
を加えることにより指定配列よりも長いペプチド鎖を有
してもよい。これらの付加的アミノ酸はａｐｏ（ａ）分
子中のペプチドをフランキングするものでもよいし（但
しペプチドは反復エピトープが存在するａｐｏ（ａ）分
子内の点まで延びない）、異種アミノ酸でもよい。配列
番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、
２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３
６、３８及び４０の各々と実質的に同一アミノ酸残基を
有するが、ペプチドが抗ａｐｏ（ａ）モノクローナル抗
体に対して規定の反応性を維持しながら一部のアミノ酸
が保存的に置換された類似体も本発明の一部とみなされ
る。
【００２７】重要な点として、本発明の全ペプチドはａ
ｐｏ（ａ）分子の非反復エピトープを含み、プラスミノ
ーゲン分子中には存在せず、等モル基準でａｐｏ（ａ）
の全アイソフォームを認識する抗体を誘発するために使
用することができる。これらの全特性により、これらの
ペプチドに対して誘発された抗体をイムノアッセイで使
用してａｐｏ（ａ）を定量的に検出することができる。
ｐｏ（ａ）分子の非反復エピトープを含み、プラスミノ
ーゲン分子中には存在せず、等モル基準でａｐｏ（ａ）
の全アイソフォームを認識する抗体を誘発するために使
用することができる。これらの全特性により、これらの
ペプチドに対して誘発された抗体をイムノアッセイで使
用してａｐｏ（ａ）を定量的に検出することができる。
【００２８】本発明のペプチドの単離及び検出は、新た
に得たヒト血漿から順次等密度超遠心分離によりＬｐ
（ａ）を単離することにより開始した。Ｌｐ（ａ）フラ
クションをゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、
透析した。Ｂｕｔｍａｎら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４：１５６４−６９（１
９８８））の方法の変法を使用して抗ａｐｏ（ａ）モノ
クローナル抗体を誘発した。
に得たヒト血漿から順次等密度超遠心分離によりＬｐ
（ａ）を単離することにより開始した。Ｌｐ（ａ）フラ
クションをゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、
透析した。Ｂｕｔｍａｎら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４：１５６４−６９（１
９８８））の方法の変法を使用して抗ａｐｏ（ａ）モノ
クローナル抗体を誘発した。
【００２９】Ｌｐ（ａ）には反応するが、プラスミノー
ゲン又はＬＤＬには反応しないハイブリドーマ上清をス
クリーニング後に２種のＩｇＧ1 Ｍａｂ細胞系２Ｄ１
及び１２Ｃ１１を得た。２Ｄ１及び１２Ｃ１１の特異性
をウェスタンブロット分析により評価した。ヒト、アカ
ゲザル、イヌ、ネコ、ウサギ及びラットを含む数種の種
（このうち、ヒト及びアカゲザルのみがＬｐ（ａ）を含
むことが報告されている）からの血清をアガロースゲル
電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移行させた後、２
Ｄ１及び１２Ｃ１１でプローブした。Ｍａｂ ２Ｄ１は
アカゲザル及びヒトＬｐ（ａ）の双方と反応したが、Ｍ
ａｂ １２Ｃ１１はヒトＬｐ（ａ）としか反応しなかっ
た。次に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニト
ロセルロースに移行させたヒト及びアカゲザル血清のブ
ロットをプローブするためにＭａｂ ２Ｄ１及び１２Ｃ
１１の両方を使用した。図３に示すように、２Ｄ１は３
００ｋＤ〜８００ｋＤのヒトａｐｏ（ａ）アイソフォー
ムと反応し、数種の異なるアカゲザルａｐｏ（ａ）アイ
ソフォームを区別することができた。図３中、上段ウェ
スタンブロットは血漿サンプル中のヒトａｐｏ（ａ）の
ブロットであり、レーン１はａｐｏ Ｂ−１００対照、
レーン２はａｐｏ（ａ）Ｆアイソフォーム、レーン３は
ａｐｏ（ａ）Ｂアイソフォーム、レーン４はａｐｏ
（ａ）Ｓ１アイソフォーム、レーン５はａｐｏ（ａ）Ｓ
１及びＳ２アイソフォーム、レーン６はａｐｏ（ａ）Ｓ
３アイソフォームである。下段のウェスタンブロットは
血漿サンプル中のアカゲザルａｐｏ（ａ）のブロットで
あり、レーン１はヒトａｐｏ Ｂ−１００対照、レーン
２〜７は種々のアカゲザル血漿サンプルである。更に、
この方法を使用した処、２Ｄ１はヒヒ、アフリカミドリ
ザル及びマカクザルａｐｏ（ａ）と反応した。図４ａ及
び図４ｂに示すように、１２Ｃ１１はどちらの種からの
還元変性Ｌｐ（ａ）とも反応しなかったが、アガロース
ゲルからの天然Ｌｐ（ａ）の全アイソフォームと反応し
た。
ゲン又はＬＤＬには反応しないハイブリドーマ上清をス
クリーニング後に２種のＩｇＧ1 Ｍａｂ細胞系２Ｄ１
及び１２Ｃ１１を得た。２Ｄ１及び１２Ｃ１１の特異性
をウェスタンブロット分析により評価した。ヒト、アカ
ゲザル、イヌ、ネコ、ウサギ及びラットを含む数種の種
（このうち、ヒト及びアカゲザルのみがＬｐ（ａ）を含
むことが報告されている）からの血清をアガロースゲル
電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移行させた後、２
Ｄ１及び１２Ｃ１１でプローブした。Ｍａｂ ２Ｄ１は
アカゲザル及びヒトＬｐ（ａ）の双方と反応したが、Ｍ
ａｂ １２Ｃ１１はヒトＬｐ（ａ）としか反応しなかっ
た。次に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニト
ロセルロースに移行させたヒト及びアカゲザル血清のブ
ロットをプローブするためにＭａｂ ２Ｄ１及び１２Ｃ
１１の両方を使用した。図３に示すように、２Ｄ１は３
００ｋＤ〜８００ｋＤのヒトａｐｏ（ａ）アイソフォー
ムと反応し、数種の異なるアカゲザルａｐｏ（ａ）アイ
ソフォームを区別することができた。図３中、上段ウェ
スタンブロットは血漿サンプル中のヒトａｐｏ（ａ）の
ブロットであり、レーン１はａｐｏ Ｂ−１００対照、
レーン２はａｐｏ（ａ）Ｆアイソフォーム、レーン３は
ａｐｏ（ａ）Ｂアイソフォーム、レーン４はａｐｏ
（ａ）Ｓ１アイソフォーム、レーン５はａｐｏ（ａ）Ｓ
１及びＳ２アイソフォーム、レーン６はａｐｏ（ａ）Ｓ
３アイソフォームである。下段のウェスタンブロットは
血漿サンプル中のアカゲザルａｐｏ（ａ）のブロットで
あり、レーン１はヒトａｐｏ Ｂ−１００対照、レーン
２〜７は種々のアカゲザル血漿サンプルである。更に、
この方法を使用した処、２Ｄ１はヒヒ、アフリカミドリ
ザル及びマカクザルａｐｏ（ａ）と反応した。図４ａ及
び図４ｂに示すように、１２Ｃ１１はどちらの種からの
還元変性Ｌｐ（ａ）とも反応しなかったが、アガロース
ゲルからの天然Ｌｐ（ａ）の全アイソフォームと反応し
た。
【００３０】図４ａは、単離したリポタンパク質のアガ
ロースゲル電気泳動及びウェスタンブロット分析を示
す。リポタンパク質フラクションを天然アガロースゲル
電気泳動にかけた。ゲルの２分の１を脂質用Ｆａｔ Ｒ
ｅｄ ７Ｂで染色した（Ｂ）。残りの２分の１（Ａ）か
らのタンパク質をニトロセルロースに移行させ、２Ｄ１
（左側）又は１２Ｃ１１（右側）でプローブし、展開さ
せた。レーンは１）リポタンパク質を含まないプール血
漿（＞１．２１ｇ／ｍｌ）、２）ＨＤＬ／Ｌｐ（ａ）
（１．０６３〜１．２１ｇ／ｍｌ）、３）ＬＤＬ（１．
０３〜１．０５ｇ／ｍｌ）、及び４）ＶＬＤＬ（１．０
０６〜１．０１９ｇ．ｍｌ）である。
ロースゲル電気泳動及びウェスタンブロット分析を示
す。リポタンパク質フラクションを天然アガロースゲル
電気泳動にかけた。ゲルの２分の１を脂質用Ｆａｔ Ｒ
ｅｄ ７Ｂで染色した（Ｂ）。残りの２分の１（Ａ）か
らのタンパク質をニトロセルロースに移行させ、２Ｄ１
（左側）又は１２Ｃ１１（右側）でプローブし、展開さ
せた。レーンは１）リポタンパク質を含まないプール血
漿（＞１．２１ｇ／ｍｌ）、２）ＨＤＬ／Ｌｐ（ａ）
（１．０６３〜１．２１ｇ／ｍｌ）、３）ＬＤＬ（１．
０３〜１．０５ｇ／ｍｌ）、及び４）ＶＬＤＬ（１．０
０６〜１．０１９ｇ．ｍｌ）である。
【００３１】図４ｂは変性／還元ａｐｏ（ａ）に対する
抗体反応性をウェスタンブロット分析により比較したも
のである。血漿サンプルを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（３％スタッキング、５％泳動ゲル）にかけた。タン
パク質をニトロセルロースに移行させ、Ａ）クローン４
Ｆ３、Ｂ）クローン２Ｄ１、及びＣ）クローン１２Ｃ１
１の抗ａｐｏ（ａ）Ｍａｂでプローブし、展開させた。
レーンは、１）ａｐｏ（ａ）Ｆアイソフォーム、２）ａ
ｐｏ（ａ）Ｂアイソフォーム、３）ａｐｏ（ａ）Ｓ１ア
イソフォーム、４）ａｐｏ（ａ）Ｓ２アイソフォーム、
５）ａｐｏ（ａ）Ｓ３アイソフォーム、及び６）ａｐｏ
（ａ）Ｓ４アイソフォームである。
抗体反応性をウェスタンブロット分析により比較したも
のである。血漿サンプルを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（３％スタッキング、５％泳動ゲル）にかけた。タン
パク質をニトロセルロースに移行させ、Ａ）クローン４
Ｆ３、Ｂ）クローン２Ｄ１、及びＣ）クローン１２Ｃ１
１の抗ａｐｏ（ａ）Ｍａｂでプローブし、展開させた。
レーンは、１）ａｐｏ（ａ）Ｆアイソフォーム、２）ａ
ｐｏ（ａ）Ｂアイソフォーム、３）ａｐｏ（ａ）Ｓ１ア
イソフォーム、４）ａｐｏ（ａ）Ｓ２アイソフォーム、
５）ａｐｏ（ａ）Ｓ３アイソフォーム、及び６）ａｐｏ
（ａ）Ｓ４アイソフォームである。
【００３２】ＨＲＰ標識ポリクローナル抗ａｐｏＢ抗体
を複合体として使用して、２Ｄ１及び１２Ｃ１１の両方
を捕獲抗体として評価した。最適濃度で被覆した場合に
精製Ｌｐ（ａ）又は血漿サンプル中のＬｐ（ａ）の種々
のヒトａｐｏ（ａ）アイソフォームを捕獲する能力にお
いて２種の抗体間に有意な相違は認められなかった。２
Ｄ１及び１２Ｃ１１が反復エピトープと反応したか否か
を決定するために、これら抗体をＨＲＰと結合した後、
サンドイッチＥＬＩＳＡで検出用抗体として使用した。
を複合体として使用して、２Ｄ１及び１２Ｃ１１の両方
を捕獲抗体として評価した。最適濃度で被覆した場合に
精製Ｌｐ（ａ）又は血漿サンプル中のＬｐ（ａ）の種々
のヒトａｐｏ（ａ）アイソフォームを捕獲する能力にお
いて２種の抗体間に有意な相違は認められなかった。２
Ｄ１及び１２Ｃ１１が反復エピトープと反応したか否か
を決定するために、これら抗体をＨＲＰと結合した後、
サンドイッチＥＬＩＳＡで検出用抗体として使用した。
【００３３】まず最初にマイクロタイタープレートウェ
ルをａｐｏ（ａ）（２Ｄ１，１２Ｃ１１）、ａｐｏ Ｂ
１００（Ｍａｂ ２Ｂ４）又は無関係なリポタンパク質
抗原であるａｐｏ Ａ−ＩＩ（Ｍａｂ ４Ａ２）に対す
る種々のＭａｂで被覆した。血漿中のＬｐ（ａ）を抗原
として使用して上述のようにＥＬＩＳＡを実施した。図
５に示すように、ＨＲＰ標識２Ｄ１は固相１２Ｃ１１又
は２Ｂ４により捕獲されたＬｐ（ａ）とは結合したが、
それ自体により捕獲されたＬｐ（ａ）とは結合しなかっ
た。図５に示す実験は次のように実施した。ブロックし
たマイクロタイタープレートを１０ｍｇ／Ｌの２Ｄ１、
１２Ｃ１１、抗ａｐｏ Ｂ Ｍａｂ（２Ｂ４）又は抗ａ
ｐｏ Ａ−ＩＩ Ｍａｂ（４Ａ２）で被覆した。既知濃
度（０、２５０、５００及び１０００ｍｇ／Ｌ）のＬｐ
（ａ）血漿カリブレーターを加え、インキュベートした
後、洗浄した。ＨＲＰに結合したＭａｂ ２Ｄ１（１ｍ
ｇ／Ｌ，１００μｌ）を加え、１時間３７℃でインキュ
ベートした。ウェルを洗い、ＴＭＢ基質で発色させた。
結果を図５に示す。
ルをａｐｏ（ａ）（２Ｄ１，１２Ｃ１１）、ａｐｏ Ｂ
１００（Ｍａｂ ２Ｂ４）又は無関係なリポタンパク質
抗原であるａｐｏ Ａ−ＩＩ（Ｍａｂ ４Ａ２）に対す
る種々のＭａｂで被覆した。血漿中のＬｐ（ａ）を抗原
として使用して上述のようにＥＬＩＳＡを実施した。図
５に示すように、ＨＲＰ標識２Ｄ１は固相１２Ｃ１１又
は２Ｂ４により捕獲されたＬｐ（ａ）とは結合したが、
それ自体により捕獲されたＬｐ（ａ）とは結合しなかっ
た。図５に示す実験は次のように実施した。ブロックし
たマイクロタイタープレートを１０ｍｇ／Ｌの２Ｄ１、
１２Ｃ１１、抗ａｐｏ Ｂ Ｍａｂ（２Ｂ４）又は抗ａ
ｐｏ Ａ−ＩＩ Ｍａｂ（４Ａ２）で被覆した。既知濃
度（０、２５０、５００及び１０００ｍｇ／Ｌ）のＬｐ
（ａ）血漿カリブレーターを加え、インキュベートした
後、洗浄した。ＨＲＰに結合したＭａｂ ２Ｄ１（１ｍ
ｇ／Ｌ，１００μｌ）を加え、１時間３７℃でインキュ
ベートした。ウェルを洗い、ＴＭＢ基質で発色させた。
結果を図５に示す。
【００３４】他方、ＨＲＰ標識１２Ｃ１１は、固相２Ｄ
１及び２Ｂ４のみならず１２Ｃ１１自体により捕獲され
たＬｐ（ａ）とも結合することができた。この結果、１
２Ｃ１１は反復エピトープを認識するが、２Ｄ１は反復
エピトープを認識しないと予想された。上記知見及び旧
世界ザルＬｐ（ａ）との興味深い反応により、２Ｄ１を
Ａｐｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｌｐ（ａ）ＥＬＩＳＡ試験
システム（Ｄｕｒｈａｍ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎ
ａ，米国に所在のＯｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの商標）の捕獲用モノクローナル
抗体として選択した。
１及び２Ｂ４のみならず１２Ｃ１１自体により捕獲され
たＬｐ（ａ）とも結合することができた。この結果、１
２Ｃ１１は反復エピトープを認識するが、２Ｄ１は反復
エピトープを認識しないと予想された。上記知見及び旧
世界ザルＬｐ（ａ）との興味深い反応により、２Ｄ１を
Ａｐｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｌｐ（ａ）ＥＬＩＳＡ試験
システム（Ｄｕｒｈａｍ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎ
ａ，米国に所在のＯｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの商標）の捕獲用モノクローナル
抗体として選択した。
【００３５】上記知見を確認し、エピトープのアミノ酸
配列を決定するためにエピトープマッピング試験を行っ
た。２Ｄ１はａｐｏ（ａ）において非反復エピトープを
認識したので、分子のカルボキシル末端領域中の非反復
領域に焦点をおいた。セグメントＡ及びＢを含むａｐｏ
（ａ）分子の約７０％は実際に高頻度反復性であるとみ
なすことができる。更に、他のクリングルIV様ドメイン
＃１及び＃３０〜３７は高頻度反復性であるクリングル
IV様ドメインと同一ではないが、Ａ及びＢドメインに著
しく類似する。これらの広範な類似から、２Ｄ１の固有
のエピトープがこの領域に位置する可能性はプロテアー
ゼ又はクリングル５領域よりも著しく低いと予想され
た。他方、アカゲザルａｐｏ（ａ）はクリングル５ドメ
インを含まないので、エピトープが存在する可能性の最
も高い位置はプロテアーゼ様ドメインであった。
配列を決定するためにエピトープマッピング試験を行っ
た。２Ｄ１はａｐｏ（ａ）において非反復エピトープを
認識したので、分子のカルボキシル末端領域中の非反復
領域に焦点をおいた。セグメントＡ及びＢを含むａｐｏ
（ａ）分子の約７０％は実際に高頻度反復性であるとみ
なすことができる。更に、他のクリングルIV様ドメイン
＃１及び＃３０〜３７は高頻度反復性であるクリングル
IV様ドメインと同一ではないが、Ａ及びＢドメインに著
しく類似する。これらの広範な類似から、２Ｄ１の固有
のエピトープがこの領域に位置する可能性はプロテアー
ゼ又はクリングル５領域よりも著しく低いと予想され
た。他方、アカゲザルａｐｏ（ａ）はクリングル５ドメ
インを含まないので、エピトープが存在する可能性の最
も高い位置はプロテアーゼ様ドメインであった。
【００３６】周知ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使
用して図２に示すように該当遺伝子セグメントを増幅
し、クローニングに適切なフラグメントをフランキング
するＢａｍＨＩ制限部位を生成した。増幅反応の結果、
クリングル４ドメインの大きい配列（クリングル４ドメ
インの３５番目の一部と３６番目及び３７番目の全部）
を含むクリングル５ドメインの９５０ｂｐ（３５−
Ｖ）、プロテアーゼドメインの７００ｂｐ（Ｐ）、及び
クリングル５／プロテアーゼ結合ドメインの１０００ｂ
ｐ（Ｖ＋Ｐ）からなる適当な寸法の固有ＤＮＡフラグメ
ントが形成された。図２に示すように、増幅用に設計し
たオリゴヌクレオチドプライマー対は、１）３５−Ｖ、
対８１及び８２、２）Ｖ＋Ｐ、対９２及び９１、並びに
３）Ｐ、対９３及び９１とした。
用して図２に示すように該当遺伝子セグメントを増幅
し、クローニングに適切なフラグメントをフランキング
するＢａｍＨＩ制限部位を生成した。増幅反応の結果、
クリングル４ドメインの大きい配列（クリングル４ドメ
インの３５番目の一部と３６番目及び３７番目の全部）
を含むクリングル５ドメインの９５０ｂｐ（３５−
Ｖ）、プロテアーゼドメインの７００ｂｐ（Ｐ）、及び
クリングル５／プロテアーゼ結合ドメインの１０００ｂ
ｐ（Ｖ＋Ｐ）からなる適当な寸法の固有ＤＮＡフラグメ
ントが形成された。図２に示すように、増幅用に設計し
たオリゴヌクレオチドプライマー対は、１）３５−Ｖ、
対８１及び８２、２）Ｖ＋Ｐ、対９２及び９１、並びに
３）Ｐ、対９３及び９１とした。
【００３７】フラグメントをｐＥＴ １１ａ発現プラス
ミドにクローニングした。図６に示すように、適当な寸
法のタンパク質（３５−Ｖ約３５ｋＤ、Ｐ約２４ｋＤ、
Ｖ＋Ｐ約３６ｋＤ）を発現したクローンと２Ｄ１及び陽
性対照（Ｌｐ（ａ）に対するポリクローナル抗体）との
反応性をウェスタンブロット分析により試験した。図６
のレーンは、１）Ｖ＋Ｐ、２）Ｐ、３）及び４）非発現
組換えタンパク質、５）３５−Ｖクローン１、６）３５
−Ｖ、クローン２並びに７）高度に発現された無関係の
タンパク質の陰性対照である。Ｍａｂ ２Ｄ１はプロテ
アーゼドメイン単独（アミノ酸４３０９〜４５２９）に
相当するポリペプチドのみを認識した。２Ｄ１はクリン
グル５ドメインを含まないアカゲザルａｐｏ（ａ）と反
応し、反復エピトープ（即ちクリングル４ドメイン）と
は反応しないことが知られていたので、これは意外では
ない。予想通り、ポリクローナル抗体はアポリポタンパ
ク質（ａ）配列を含む全ポリペプチドを認識した。２Ｄ
１は３５−Ｖペプチドと全く結合しなかったので、２Ｄ
１の結合は大量のタンパク質との非特異的会合ではなか
った。従って、Ｍａｂ ２Ｄ１により認識されるエピト
ープはアポリポタンパク質（ａ）分子の非反復プロテア
ーゼ様領域内に位置する。
ミドにクローニングした。図６に示すように、適当な寸
法のタンパク質（３５−Ｖ約３５ｋＤ、Ｐ約２４ｋＤ、
Ｖ＋Ｐ約３６ｋＤ）を発現したクローンと２Ｄ１及び陽
性対照（Ｌｐ（ａ）に対するポリクローナル抗体）との
反応性をウェスタンブロット分析により試験した。図６
のレーンは、１）Ｖ＋Ｐ、２）Ｐ、３）及び４）非発現
組換えタンパク質、５）３５−Ｖクローン１、６）３５
−Ｖ、クローン２並びに７）高度に発現された無関係の
タンパク質の陰性対照である。Ｍａｂ ２Ｄ１はプロテ
アーゼドメイン単独（アミノ酸４３０９〜４５２９）に
相当するポリペプチドのみを認識した。２Ｄ１はクリン
グル５ドメインを含まないアカゲザルａｐｏ（ａ）と反
応し、反復エピトープ（即ちクリングル４ドメイン）と
は反応しないことが知られていたので、これは意外では
ない。予想通り、ポリクローナル抗体はアポリポタンパ
ク質（ａ）配列を含む全ポリペプチドを認識した。２Ｄ
１は３５−Ｖペプチドと全く結合しなかったので、２Ｄ
１の結合は大量のタンパク質との非特異的会合ではなか
った。従って、Ｍａｂ ２Ｄ１により認識されるエピト
ープはアポリポタンパク質（ａ）分子の非反復プロテア
ーゼ様領域内に位置する。
【００３８】Ｍａｂ ２Ｄ１と反応するエピトープを更
に定義するために、所謂ＰＥＰＳＣＡＮ法を使用した。
要約すると、ａｐｏ（ａ）のプロテアーゼドメインの完
全アミノ酸配列を使用して、プロテアーゼドメインの各
位置で開始する１２マーペプチドを生成した。これらの
ペプチドの各１個を液／液型のハイブリダイゼーション
で２Ｄ１と反応させ、比色反応により陽性反応を検出し
た。この方法により、２Ｄ１のエピトープは配列番号２
を有する１１マーペプチドに含まれることが判明した。
に定義するために、所謂ＰＥＰＳＣＡＮ法を使用した。
要約すると、ａｐｏ（ａ）のプロテアーゼドメインの完
全アミノ酸配列を使用して、プロテアーゼドメインの各
位置で開始する１２マーペプチドを生成した。これらの
ペプチドの各１個を液／液型のハイブリダイゼーション
で２Ｄ１と反応させ、比色反応により陽性反応を検出し
た。この方法により、２Ｄ１のエピトープは配列番号２
を有する１１マーペプチドに含まれることが判明した。
【００３９】２Ｄ１は全旧世界ザルａｐｏ（ａ）及びヒ
トａｐｏ（ａ）と反応するが、ヒト又は旧世界ザルプラ
スミノーゲンとは反応しないので、図７に示すようにア
ミノ酸配列を比較し、旧世界ザル及びヒトに共通である
がプラスミノーゲンには共通でない約８個の付加的非反
復アミノ酸配列が知見された。
トａｐｏ（ａ）と反応するが、ヒト又は旧世界ザルプラ
スミノーゲンとは反応しないので、図７に示すようにア
ミノ酸配列を比較し、旧世界ザル及びヒトに共通である
がプラスミノーゲンには共通でない約８個の付加的非反
復アミノ酸配列が知見された。
【００４０】
【化３】
【００４１】これらのペプチド（又はその適当なフラグ
メント）に対して誘発又は開発された抗体が天然ａｐｏ
（ａ）と反応するか否かを決定する１方法は、ドットブ
ロット分析の使用であり、ａｐｏ（ａ）の種々のアイソ
フォームをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で再構成し、数
種の濃度でニトロセルロース膜に移行させ、乾燥させた
後、ブロッキング後に抗体でプローブする。特に全アイ
ソフォームに対して陽性反応を与える抗体が試験サンプ
ルの定量イムノアッセイで有用であると思われる。
メント）に対して誘発又は開発された抗体が天然ａｐｏ
（ａ）と反応するか否かを決定する１方法は、ドットブ
ロット分析の使用であり、ａｐｏ（ａ）の種々のアイソ
フォームをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で再構成し、数
種の濃度でニトロセルロース膜に移行させ、乾燥させた
後、ブロッキング後に抗体でプローブする。特に全アイ
ソフォームに対して陽性反応を与える抗体が試験サンプ
ルの定量イムノアッセイで有用であると思われる。
【００４２】本発明のペプチドはメリーフィールド法の
ような標準化学合成技術により合成することもできる
し、上述のような組換え核酸技術により合成し、ペプチ
ドを最終的に適切な微生物中で発現させることもでき
る。
ような標準化学合成技術により合成することもできる
し、上述のような組換え核酸技術により合成し、ペプチ
ドを最終的に適切な微生物中で発現させることもでき
る。
【００４３】ペプチド合成のための有機化学法では、均
質相内又は固相を用いて縮合反応により必要なアミノ酸
を結合する。
質相内又は固相を用いて縮合反応により必要なアミノ酸
を結合する。
【００４４】縮合反応は次のように実施することができ
る。ａ）遊離カルボキシル基及び他の保護反応基を有す
る化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び
他の保護反応基（保護基の１個は（誘導体化）固体支持
体でもよい）を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と
縮合剤の存在下で縮合させる。ｂ）活性化カルボキシル
基及び他の遊離又は保護反応基を有する化合物（アミノ
酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び他の遊離又は保護
反応基（保護基の１個は（誘導体化）固体支持体でもよ
い）を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合させ
る。
る。ａ）遊離カルボキシル基及び他の保護反応基を有す
る化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び
他の保護反応基（保護基の１個は（誘導体化）固体支持
体でもよい）を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と
縮合剤の存在下で縮合させる。ｂ）活性化カルボキシル
基及び他の遊離又は保護反応基を有する化合物（アミノ
酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び他の遊離又は保護
反応基（保護基の１個は（誘導体化）固体支持体でもよ
い）を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合させ
る。
【００４５】カルボキシル基の活性化は例えばカルボキ
シル基を酸ハロゲン化物、アジド、無水物、イミダゾリ
ド又は活性化エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシン
イミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニト
ロフェニル、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−
オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＯＤｈｂｔ）
又はペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）エステル）に
変換することにより実施することができる。
シル基を酸ハロゲン化物、アジド、無水物、イミダゾリ
ド又は活性化エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシン
イミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニト
ロフェニル、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−
オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＯＤｈｂｔ）
又はペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）エステル）に
変換することにより実施することができる。
【００４６】上記縮合反応の最も一般的な方法は、カル
ボジイミド法、ＢＯＰ法［ベンゾトリアゾリルオキシト
リス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホ
スフェート］、ＴＢＴＵ法［２−（１Ｈ−ベンゾトリア
ゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウ
ロニウムテトラフルオロボレート］、アジド法、混合無
水物法及び、例えばＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖ
ｏｌ．１−３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．及びＭｅｉｅｎｈｏｆ
ｅｒ，Ｊ．編）１９７９，１９８０及び１９８１（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載されている
ような活性化エステルを使用する方法である。
ボジイミド法、ＢＯＰ法［ベンゾトリアゾリルオキシト
リス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホ
スフェート］、ＴＢＴＵ法［２−（１Ｈ−ベンゾトリア
ゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウ
ロニウムテトラフルオロボレート］、アジド法、混合無
水物法及び、例えばＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖ
ｏｌ．１−３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．及びＭｅｉｅｎｈｏｆ
ｅｒ，Ｊ．編）１９７９，１９８０及び１９８１（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載されている
ような活性化エステルを使用する方法である。
【００４７】特に適切な固相は例えば、Ｗａｎｇ（１９
７４） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５，１３２８
に記載されているｐ−アルコキシベンジルアルコール樹
脂（４−ヒドロキシメチル−、フェノキシメチルコポリ
スチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）や、Ａｔｈｅｒ
ｔｏｎ （１９８１） Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈ
ｅｍ．Ｃｏｍｍ．１１５１により記載されているように
不活性大孔質珪藻土のマトリックスにより支持された
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、アクリロイルサルコ
シンメチルエステル及びビスアクリロイルエチレンジア
ミンの同様に機能化されたコポリマーである。合成後、
温和な条件下でこの固相からペプチドを分離することが
できる。他の適切な支持体は、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｐ．Ｎ．
Ａ．Ｓ．，８１，３９９８（１９８４）及びＰ．Ｎ．
Ａ．Ｓ．８２，１７８（１９８５）により記載されてい
るような誘導体化架橋ポリスチレン、ポリエチレン又は
ポリプロピレンロッドである。
７４） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５，１３２８
に記載されているｐ−アルコキシベンジルアルコール樹
脂（４−ヒドロキシメチル−、フェノキシメチルコポリ
スチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）や、Ａｔｈｅｒ
ｔｏｎ （１９８１） Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈ
ｅｍ．Ｃｏｍｍ．１１５１により記載されているように
不活性大孔質珪藻土のマトリックスにより支持された
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、アクリロイルサルコ
シンメチルエステル及びビスアクリロイルエチレンジア
ミンの同様に機能化されたコポリマーである。合成後、
温和な条件下でこの固相からペプチドを分離することが
できる。他の適切な支持体は、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｐ．Ｎ．
Ａ．Ｓ．，８１，３９９８（１９８４）及びＰ．Ｎ．
Ａ．Ｓ．８２，１７８（１９８５）により記載されてい
るような誘導体化架橋ポリスチレン、ポリエチレン又は
ポリプロピレンロッドである。
【００４８】ペプチドを一旦合成及び精製したら、より
大きい分子（例えばウシ血清アルブミン）に結合する
と、免疫原として使用することができる。適切な周知方
法を使用して結合すると、マウス、ラット又はウサギの
ような動物に導入することができ、これらの結合ペプチ
ドに対する抗体が産生される。周知方法を使用して免疫
感作した動物からモノクローナル又はポリクローナル抗
体を誘発することができる。参考資料として本明細書の
一部とする前出の文献Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌを参照されたい。
大きい分子（例えばウシ血清アルブミン）に結合する
と、免疫原として使用することができる。適切な周知方
法を使用して結合すると、マウス、ラット又はウサギの
ような動物に導入することができ、これらの結合ペプチ
ドに対する抗体が産生される。周知方法を使用して免疫
感作した動物からモノクローナル又はポリクローナル抗
体を誘発することができる。参考資料として本明細書の
一部とする前出の文献Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【００４９】これらのペプチドは、精製すると、試験サ
ンプル中のａｐｏ（ａ）の存在を検出又は定量するため
のイムノアッセイでも有用である。試験サンプルは通常
血清又は血漿サンプルである。例えば、競合阻害イムノ
アッセイでは、（本発明のペプチドに対して反応性にな
った）非標識抗ａｐｏ（ａ）抗体を固相又は固体支持体
（例えばマイクロタイターウェルの壁）、プラスチック
支持体（例えばディップスティック）、又は任意数の材
料（例えばラテックス、シリカ、セラミック材料及び金
属）から製造されたビーズに結合する。精製ペプチドを
多数の方法のいずれかで標識し、例えばＨＲＰ、放射性
同位体、金ゾル、アルカリホスファターゼ又は、基質の
添加後に検出可能な他の酵素、及び蛍光化学物質（例え
ばフルオレセイン及びローダミン）を使用できる。これ
らの標識したペプチドを、未知量の抗原ａｐｏ（ａ）を
含有する試験サンプルと混合する。この混合物を結合抗
ａｐｏ（ａ）抗体に加える。試験サンプル中の抗原は結
合抗体との結合を標識ａｐｏ（ａ）ペプチドと競合す
る。固相をインキュベートし、洗浄し、標識ペプチドを
検出した後、試験サンプル中のａｐｏ（ａ）を測定又は
定量することができる。
ンプル中のａｐｏ（ａ）の存在を検出又は定量するため
のイムノアッセイでも有用である。試験サンプルは通常
血清又は血漿サンプルである。例えば、競合阻害イムノ
アッセイでは、（本発明のペプチドに対して反応性にな
った）非標識抗ａｐｏ（ａ）抗体を固相又は固体支持体
（例えばマイクロタイターウェルの壁）、プラスチック
支持体（例えばディップスティック）、又は任意数の材
料（例えばラテックス、シリカ、セラミック材料及び金
属）から製造されたビーズに結合する。精製ペプチドを
多数の方法のいずれかで標識し、例えばＨＲＰ、放射性
同位体、金ゾル、アルカリホスファターゼ又は、基質の
添加後に検出可能な他の酵素、及び蛍光化学物質（例え
ばフルオレセイン及びローダミン）を使用できる。これ
らの標識したペプチドを、未知量の抗原ａｐｏ（ａ）を
含有する試験サンプルと混合する。この混合物を結合抗
ａｐｏ（ａ）抗体に加える。試験サンプル中の抗原は結
合抗体との結合を標識ａｐｏ（ａ）ペプチドと競合す
る。固相をインキュベートし、洗浄し、標識ペプチドを
検出した後、試験サンプル中のａｐｏ（ａ）を測定又は
定量することができる。
【００５０】本発明のペプチドに対して反応性であり、
ペプチドを使用して誘発又は展開された（モノクローナ
ル又はポリクローナル）抗体をａｐｏ（ａ）のイムノア
ッセイで使用することもできる。例えば、抗体はサンド
イッチＥＬＩＳＡで使用することができ、（参考資料と
して本明細書の一部とする前出の文献Ａｎｔｉｂｏ ｄｉ
ｅｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌに記
載されているように当業者に公知のラベルで適切に標識
した）捕獲抗体及び検出抗体として使用することがで
き、あるいは、抗体を捕獲抗体として使用し、抗ａｐｏ
Ｂ−ペルオキシダーゼ複合体を検出抗体として使用す
ることができる。サンドイッチＥＬＩＳＡを実施するた
めの方法は当業者に公知であり、本発明は特定のイムノ
アッセイに限定されない。
ペプチドを使用して誘発又は展開された（モノクローナ
ル又はポリクローナル）抗体をａｐｏ（ａ）のイムノア
ッセイで使用することもできる。例えば、抗体はサンド
イッチＥＬＩＳＡで使用することができ、（参考資料と
して本明細書の一部とする前出の文献Ａｎｔｉｂｏ ｄｉ
ｅｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌに記
載されているように当業者に公知のラベルで適切に標識
した）捕獲抗体及び検出抗体として使用することがで
き、あるいは、抗体を捕獲抗体として使用し、抗ａｐｏ
Ｂ−ペルオキシダーゼ複合体を検出抗体として使用す
ることができる。サンドイッチＥＬＩＳＡを実施するた
めの方法は当業者に公知であり、本発明は特定のイムノ
アッセイに限定されない。
【００５１】本発明は更に、配列番号２、４、６、８、
１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２
６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０の配
列を含むペプチドとその免疫反応性フラグメント、並び
にその相補的（アンチセンス）鎖をコードするＤＮＡの
フラグメントから構成される。ヌクレオチド配列は、核
酸コードの縮重又は突然変異に起因する塩基置換を加え
られ且つ上記ペプチドをコードする変異体も本発明に含
まれる。
１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２
６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０の配
列を含むペプチドとその免疫反応性フラグメント、並び
にその相補的（アンチセンス）鎖をコードするＤＮＡの
フラグメントから構成される。ヌクレオチド配列は、核
酸コードの縮重又は突然変異に起因する塩基置換を加え
られ且つ上記ペプチドをコードする変異体も本発明に含
まれる。
【００５２】これらのヌクレオチド配列は当業者に周知
の化学的又は組換え法により合成することができる。こ
うして合成したオリゴヌクレオチドを上述のように標識
するとプライマー又はプローブとして使用することがで
き、あるいは適当な発現ベクターに組み込んで組換えに
よりペプチドを製造することかできる。これらのプライ
マー又はプローブをアッセイで使用し、ＮＡＳＢＡ、Ｐ
ＣＲ又は他の増幅技術により増幅された配列を検出し、
ａｐｏ（ａ）核酸を検出又は定量することができる。上
述のように、ａｐｏ（ａ）分子のこのセグメントは遺伝
子の高度保存領域であるので、全ヒト及び旧世界ザル種
アイソフォームに見いだされる分子の固有セグメントで
ある。この保存は、ヒト及びじゅく腫形成のモデルシス
テムである旧世界ザルの双方でａｐｏ（ａ）を検出する
ために上記プローブ及びプライマーのような同一試薬を
開発することができるので、特に重要である。
の化学的又は組換え法により合成することができる。こ
うして合成したオリゴヌクレオチドを上述のように標識
するとプライマー又はプローブとして使用することがで
き、あるいは適当な発現ベクターに組み込んで組換えに
よりペプチドを製造することかできる。これらのプライ
マー又はプローブをアッセイで使用し、ＮＡＳＢＡ、Ｐ
ＣＲ又は他の増幅技術により増幅された配列を検出し、
ａｐｏ（ａ）核酸を検出又は定量することができる。上
述のように、ａｐｏ（ａ）分子のこのセグメントは遺伝
子の高度保存領域であるので、全ヒト及び旧世界ザル種
アイソフォームに見いだされる分子の固有セグメントで
ある。この保存は、ヒト及びじゅく腫形成のモデルシス
テムである旧世界ザルの双方でａｐｏ（ａ）を検出する
ために上記プローブ及びプライマーのような同一試薬を
開発することができるので、特に重要である。
【００５３】本発明の範囲に含まれるＤＮＡフラグメン
トのいくつかの配列を以下に示す。
トのいくつかの配列を以下に示す。
【００５４】
【化４】
【００５５】遺伝子コードの縮重により、配列番号２、
４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２
２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８
及び４０のペプチドのいずれかをコードするオリゴヌク
レオチドと、上記ＤＮＡフラグメントの各々の相補的オ
リゴヌクレオチドも本発明の一部と考える。更に、ペプ
チドの免疫学的に活性なフラグメントをコードする核酸
配列も本発明の一部と考える。
４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２
２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８
及び４０のペプチドのいずれかをコードするオリゴヌク
レオチドと、上記ＤＮＡフラグメントの各々の相補的オ
リゴヌクレオチドも本発明の一部と考える。更に、ペプ
チドの免疫学的に活性なフラグメントをコードする核酸
配列も本発明の一部と考える。
【００５６】本発明のペプチド、核酸及び抗体はキット
形態でパッケージ及び販売することができる。キットは
該当アッセイを実施するために必要な種々の試薬を含む
個々の容器から構成され得る。例えば、ａｐｏ（ａ）を
検出するための競合阻害イムノアッセイキットは抗ａｐ
ｏ（ａ）抗体で被覆したマイクロタイタープレート又は
ディップスティックのような固相と、上述のように標識
され得る本発明の少なくとも１種のペプチドを含む容器
とから構成され得る。増幅技術で使用するキットは、文
献に開示されているように標識され得る本発明の核酸プ
ローブを有する容器又は標識に使用される物質の分離容
器を含み得る。サンドイッチＥＬＩＳＡを実施するため
に使用可能な更に別のキットは、モノクローナルもしく
はポリクローナル抗体製剤、又は抗体で被覆されたディ
ップスティックもしくはマイクロタイタープレートのよ
うな固相を収容し得る容器を含み得る。任意の型のキッ
トの他の個々の容器は、標準又は対照物質、緩衝剤又は
水を収容し得る。例えば、対照はアッセイが適正に行わ
れているか否かを指示するために低濃度Ｌｐ（ａ）／ａ
ｐｏ（ａ）対照血清及び高濃度Ｌｐ（ａ）／ａｐｏ
（ａ）対照血清を含み得る。その後、個々の容器を箱の
ような外側容器に包装し、ａｐｏ（ａ）を検出するため
に使用可能なキットとして販売する。
形態でパッケージ及び販売することができる。キットは
該当アッセイを実施するために必要な種々の試薬を含む
個々の容器から構成され得る。例えば、ａｐｏ（ａ）を
検出するための競合阻害イムノアッセイキットは抗ａｐ
ｏ（ａ）抗体で被覆したマイクロタイタープレート又は
ディップスティックのような固相と、上述のように標識
され得る本発明の少なくとも１種のペプチドを含む容器
とから構成され得る。増幅技術で使用するキットは、文
献に開示されているように標識され得る本発明の核酸プ
ローブを有する容器又は標識に使用される物質の分離容
器を含み得る。サンドイッチＥＬＩＳＡを実施するため
に使用可能な更に別のキットは、モノクローナルもしく
はポリクローナル抗体製剤、又は抗体で被覆されたディ
ップスティックもしくはマイクロタイタープレートのよ
うな固相を収容し得る容器を含み得る。任意の型のキッ
トの他の個々の容器は、標準又は対照物質、緩衝剤又は
水を収容し得る。例えば、対照はアッセイが適正に行わ
れているか否かを指示するために低濃度Ｌｐ（ａ）／ａ
ｐｏ（ａ）対照血清及び高濃度Ｌｐ（ａ）／ａｐｏ
（ａ）対照血清を含み得る。その後、個々の容器を箱の
ような外側容器に包装し、ａｐｏ（ａ）を検出するため
に使用可能なキットとして販売する。
【００５７】
【実施例】以下、実施例により本発明を非限定的に説明
する。
する。
【００５８】実施例１．Ｌｐ（ａ）の単離 臭化カリウムを使用して密度を１．０６３〜１．２１ｋ
ｇ／Ｌに調節し、新たに得たヒト血漿（ＥＤＴＡ含有）
から順次等密度超遠心分離によりＬｐ（ａ）を単離し
た。次にモノクローナル抗体を製造するために、Ｌｐ
（ａ）フラクションをゲル濾過クロマトグラフィーによ
り精製し、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含有するＥ
ＤＴＡ ０．１ｇ／Ｌで透析した。
ｇ／Ｌに調節し、新たに得たヒト血漿（ＥＤＴＡ含有）
から順次等密度超遠心分離によりＬｐ（ａ）を単離し
た。次にモノクローナル抗体を製造するために、Ｌｐ
（ａ）フラクションをゲル濾過クロマトグラフィーによ
り精製し、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含有するＥ
ＤＴＡ ０．１ｇ／Ｌで透析した。
【００５９】実施例２．ａｐｏ（ａ）に対するモノクロ
ーナル抗体の製造及び精製 ａｐｏ（ａ）特異的ハイブリドーマを作成した。８週齢
Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）を完全フロイン
トアジュバント中の精製Ｌｐ（ａ）１００μｇで皮下注
射により免疫感作し、１４、２８、５６及び１０５日目
にＰＢＳ中の精製Ｌｐ（ａ）１００μｇで皮下に追加免
疫した。次に、１６週目にマウスをＰＢＳ中の精製Ｌｐ
（ａ）１０μｇで３日間続けて静脈内及び腹膜内に追加
免疫し、４日目に得た脾細胞を融合に使用した。抗体産
生ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン耐性ハイ
ブリッドを精製Ｌｐ（ａ）、ＬＤＬ及びプラスミノーゲ
ン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ，
米国）に対してサンドイッチＥＬＩＳＡによりスクリー
ニングし、制限希釈により２回クローニングした。プロ
テインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを使
用することにより腹水から精製した２Ｄ１及び１２Ｃ１
１を含むＭａｂを二重免疫拡散法によりイソタイプ判定
した。モノクローナル抗体はいずれもＩｇＧ1である。
ーナル抗体の製造及び精製 ａｐｏ（ａ）特異的ハイブリドーマを作成した。８週齢
Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）を完全フロイン
トアジュバント中の精製Ｌｐ（ａ）１００μｇで皮下注
射により免疫感作し、１４、２８、５６及び１０５日目
にＰＢＳ中の精製Ｌｐ（ａ）１００μｇで皮下に追加免
疫した。次に、１６週目にマウスをＰＢＳ中の精製Ｌｐ
（ａ）１０μｇで３日間続けて静脈内及び腹膜内に追加
免疫し、４日目に得た脾細胞を融合に使用した。抗体産
生ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン耐性ハイ
ブリッドを精製Ｌｐ（ａ）、ＬＤＬ及びプラスミノーゲ
ン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ，
米国）に対してサンドイッチＥＬＩＳＡによりスクリー
ニングし、制限希釈により２回クローニングした。プロ
テインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを使
用することにより腹水から精製した２Ｄ１及び１２Ｃ１
１を含むＭａｂを二重免疫拡散法によりイソタイプ判定
した。モノクローナル抗体はいずれもＩｇＧ1である。
【００６０】実施例３．電気泳動法 これらの方法を使用してａｐｏ（ａ）及びそのフラグメ
ントを検出した。
ントを検出した。
【００６１】ｐＨ６．８の３％スタッキングゲル及びｐ
Ｈ８．８の５％泳動用ゲル中でドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を実施した。リットル当たり１２５ｍｍｏｌのＴｒ
ｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ６．８、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）４０２ｇ、グリセロール２００ｍＬ、２−メ
ルカプトエタノール１００ｍＬ及びブロムフェノールブ
ルー５０ｍｇから構成される等量のサンプル緩衝液で血
漿サンプルを希釈した後、５分間煮沸した。サンプルが
泳動用ゲルに侵入するまで１００Ｖ、その後、染料前端
がゲルから離れるまで１８０Ｖの定電圧で電気泳動を実
施した。リットル当たり２５ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ、１９
２ｍｍｏｌグリシン、ｐＨ８．３及びメタノール２００
ｍＬからなる緩衝液中で孔径０．４５μｍニトロセルロ
ース膜にタンパク質をゲルから電気泳動により移動させ
た。電気泳動による移動は３０Ｖの定電圧で１０℃で２
４時間実施した。
Ｈ８．８の５％泳動用ゲル中でドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を実施した。リットル当たり１２５ｍｍｏｌのＴｒ
ｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ６．８、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）４０２ｇ、グリセロール２００ｍＬ、２−メ
ルカプトエタノール１００ｍＬ及びブロムフェノールブ
ルー５０ｍｇから構成される等量のサンプル緩衝液で血
漿サンプルを希釈した後、５分間煮沸した。サンプルが
泳動用ゲルに侵入するまで１００Ｖ、その後、染料前端
がゲルから離れるまで１８０Ｖの定電圧で電気泳動を実
施した。リットル当たり２５ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ、１９
２ｍｍｏｌグリシン、ｐＨ８．３及びメタノール２００
ｍＬからなる緩衝液中で孔径０．４５μｍニトロセルロ
ース膜にタンパク質をゲルから電気泳動により移動させ
た。電気泳動による移動は３０Ｖの定電圧で１０℃で２
４時間実施した。
【００６２】Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ，米国に所在のＣｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＥｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを製造業者の指示
に従って使用してアガロースゲル電気泳動を実施し、天
然Ｌｐ（ａ）に対する抗ａｐｏ（ａ）Ｍａｂの反応性を
評価した。次に、分離したリポタンパク質種を４時間室
温で受動的拡散により０．４５μｍニトロセルロースに
移動させた。
ａ，米国に所在のＣｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＥｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを製造業者の指示
に従って使用してアガロースゲル電気泳動を実施し、天
然Ｌｐ（ａ）に対する抗ａｐｏ（ａ）Ｍａｂの反応性を
評価した。次に、分離したリポタンパク質種を４時間室
温で受動的拡散により０．４５μｍニトロセルロースに
移動させた。
【００６３】誘導細胞培養のタンパク質産物を可視化す
ることにより、所望の組換えタンパク質の産生を測定し
た。ＯＤ600が約１に達するまでインサート含有クロー
ンを培養し、その後、イソプロピルチオガラクトシド
（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで加えた。１〜２時間
後、分析のためにサンプルを取り出した。ＮｏｖｅｘＣ
ｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ ＤＩｅｇｏ，ＣＡ）のミニゲル
システムを使用してサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析した。大きいポリペプチド（例えばクリングル５及
びプロテアーゼ領域）には、１２％分離用ゲルを使用し
た。製造業者Ｎｏｖｅｘの推奨に従ってゲルの調製及び
電気泳動を実施した。クーマシーブリリアントブルー染
色（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して
タンパク質を検出した。製造業者Ｎｏｖｅｘの指示に従
ってＮｏｖｅｘトランスファーシステムを使用して分画
タンパク質の移動を行った。
ることにより、所望の組換えタンパク質の産生を測定し
た。ＯＤ600が約１に達するまでインサート含有クロー
ンを培養し、その後、イソプロピルチオガラクトシド
（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで加えた。１〜２時間
後、分析のためにサンプルを取り出した。ＮｏｖｅｘＣ
ｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ ＤＩｅｇｏ，ＣＡ）のミニゲル
システムを使用してサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析した。大きいポリペプチド（例えばクリングル５及
びプロテアーゼ領域）には、１２％分離用ゲルを使用し
た。製造業者Ｎｏｖｅｘの推奨に従ってゲルの調製及び
電気泳動を実施した。クーマシーブリリアントブルー染
色（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して
タンパク質を検出した。製造業者Ｎｏｖｅｘの指示に従
ってＮｏｖｅｘトランスファーシステムを使用して分画
タンパク質の移動を行った。
【００６４】この実験に基づき、その後の分析で使用さ
れる所望のペプチドがどのクローンにより発現されるか
を決定した。
れる所望のペプチドがどのクローンにより発現されるか
を決定した。
【００６５】実施例４．ａｐｏ（ａ）アイソフォーム及
びクローン化ａｐｏ（ａ）配列のウェスタ ンブロット分
析 血漿中のａｐｏ（ａ）アイソフォームを同定し、抗ａｐ
ｏ（ａ）Ｍａｂの特異性を確認するために、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ又はアガロースゲル電気泳動後に電気泳動により
移行したタンパク質を含むニトロセルロース膜を、脱脂
粉乳５０ｇ／Ｌを含有するダルベッコの変性ＰＢＳであ
る“Ｂｌｏｔｔｏ”で１時間３７℃でブロックした後、
振盪しながら２０分間かけてＰＢＳで５回洗浄した。ウ
シ血清アルブミン１０ｇ／Ｌを含有する１００ｍｍｏｌ
／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ
ｌ，ｐＨ７．２で希釈したマウス抗ヒトａｐｏ（ａ）、
クローン２Ｄ１ １０μｇ／ｍＬと共に膜を一晩４℃で
インキュベートした。上述と同様にＴｗｅｅｎ ２０
（０．５ｍＬ／Ｌ）を含有するＰＢＳでブロットを洗浄
した後、ヤギ血清を含有するＢｌｏｔｔｏ１００ｍＬ／
Ｌで０．５ｍｇ／Ｌまで希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ、Ａ及びＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）と共に１時間３
７℃でインキュベートした。Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．５
ｍＬ／Ｌを含有するＰＢＳで上述と同様に膜を洗浄し
た。次にＰＢＳリットル当たりジアミノベンジジン（Ｄ
ＡＢ）０．６ｇ、ＣｏＣｌ2 ０．６ｇ及びＨ2Ｏ2
３．０ｍｌからなる溶液で室温でブロットを２〜５分間
発色させた。脱イオン水で反応を停止した。
びクローン化ａｐｏ（ａ）配列のウェスタ ンブロット分
析 血漿中のａｐｏ（ａ）アイソフォームを同定し、抗ａｐ
ｏ（ａ）Ｍａｂの特異性を確認するために、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ又はアガロースゲル電気泳動後に電気泳動により
移行したタンパク質を含むニトロセルロース膜を、脱脂
粉乳５０ｇ／Ｌを含有するダルベッコの変性ＰＢＳであ
る“Ｂｌｏｔｔｏ”で１時間３７℃でブロックした後、
振盪しながら２０分間かけてＰＢＳで５回洗浄した。ウ
シ血清アルブミン１０ｇ／Ｌを含有する１００ｍｍｏｌ
／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ
ｌ，ｐＨ７．２で希釈したマウス抗ヒトａｐｏ（ａ）、
クローン２Ｄ１ １０μｇ／ｍＬと共に膜を一晩４℃で
インキュベートした。上述と同様にＴｗｅｅｎ ２０
（０．５ｍＬ／Ｌ）を含有するＰＢＳでブロットを洗浄
した後、ヤギ血清を含有するＢｌｏｔｔｏ１００ｍＬ／
Ｌで０．５ｍｇ／Ｌまで希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ、Ａ及びＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）と共に１時間３
７℃でインキュベートした。Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．５
ｍＬ／Ｌを含有するＰＢＳで上述と同様に膜を洗浄し
た。次にＰＢＳリットル当たりジアミノベンジジン（Ｄ
ＡＢ）０．６ｇ、ＣｏＣｌ2 ０．６ｇ及びＨ2Ｏ2
３．０ｍｌからなる溶液で室温でブロットを２〜５分間
発色させた。脱イオン水で反応を停止した。
【００６６】場合によってはウサギ抗ヒトＬｐ（ａ）抗
血清（ＢｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅＡＧ，Ｍａｒｂｕｒ
ｇ，ドイツ）を一次抗体（Ｂｌｏｔｔｏで１：５００に
希釈）として使用した。洗浄後、Ｂｌｏｔｔｏで２ｍｇ
／Ｌに希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＫＰ
Ｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と共にブロット
をインキュベートした。
血清（ＢｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅＡＧ，Ｍａｒｂｕｒ
ｇ，ドイツ）を一次抗体（Ｂｌｏｔｔｏで１：５００に
希釈）として使用した。洗浄後、Ｂｌｏｔｔｏで２ｍｇ
／Ｌに希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＫＰ
Ｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と共にブロット
をインキュベートした。
【００６７】ａｐｏ Ｂ−１００に対する電気泳動移動
度を決定するために、ブロッキング後、各ブロットから
のストリップをＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトａｐｏ Ｂ（Ｂ
ｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ，Ｍ
Ｅ，米国）５μｇ／ｍＬと共に一晩４℃でインキュベー
トし、結果を上述のように発色した。ａｐｏ（ａ）アイ
ソフォームを上述のようにＵｔｅｒｍａｎｎらの方法に
従って割り当てた。
度を決定するために、ブロッキング後、各ブロットから
のストリップをＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトａｐｏ Ｂ（Ｂ
ｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ，Ｍ
Ｅ，米国）５μｇ／ｍＬと共に一晩４℃でインキュベー
トし、結果を上述のように発色した。ａｐｏ（ａ）アイ
ソフォームを上述のようにＵｔｅｒｍａｎｎらの方法に
従って割り当てた。
【００６８】ウェスタンブロットの結果を図３、４ａ、
４ｂ及び６に示す。
４ｂ及び６に示す。
【００６９】実施例５．Ｌｐ（ａ）サンドイッチＥＬＩ
ＳＡ 重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）０．０５ｍｏｌ
／Ｌ中で一晩４℃でインキュベートすることにより平底
ＥＬＩＳＡマイクロプレートのウェルをＭａｂ２Ｄ１
（１０μｇ／ｍＬ）で被覆した。被覆用緩衝液の除去
後、ブロッキング緩衝液３００μＬを加え、１時間室温
でインキュベートした。血漿カリブレーターをサンプル
希釈剤で使用濃度範囲（６．２５〜２００μｇ／Ｌ）に
希釈した。血漿サンプル及び較正対照をサンプル希釈剤
で５０００倍に希釈した。ブロックしたウェルにカリブ
レーター、対照及びサンプル（１００μＬ）を加え、１
時間３７℃でインキュベートした。ウェルをリットル当
たりグリセロール１０ｍＬ及びＴｗｅｅｎ２０ ０．５
ｍＬからなる洗浄用緩衝液３００μＬで５回洗った。洗
浄後、結合用希釈剤（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆ
ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で５０００倍に希釈した
ＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトａｐｏ Ｂ（Ｏｒｇａｎｏｎ
Ｔｅｋｎｉｋａ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，ＭＤ）１００μＬを各ウェルに加え、１時間３７℃
でインキュベートした。ウェルを洗浄し、ＴＭＢで発色
させた。Ｌｐ（ａ）濃度に対する４５０ｎｍの吸光度を
線形回帰によりプロットすることにより、標準曲線を作
成した。標準曲線から吸光度を補間することによりサン
プル濃度の値を得た。Ｍａｂ ２Ｄ１及び１２Ｃ１１は
捕獲抗体として同等に良好に機能した。一方、２Ｄ１の
みが旧世界ザルａｐｏ（ａ）を認識し、従って、これら
の種におけるＬｐ（ａ）を定量するために使用すること
ができた。
ＳＡ 重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）０．０５ｍｏｌ
／Ｌ中で一晩４℃でインキュベートすることにより平底
ＥＬＩＳＡマイクロプレートのウェルをＭａｂ２Ｄ１
（１０μｇ／ｍＬ）で被覆した。被覆用緩衝液の除去
後、ブロッキング緩衝液３００μＬを加え、１時間室温
でインキュベートした。血漿カリブレーターをサンプル
希釈剤で使用濃度範囲（６．２５〜２００μｇ／Ｌ）に
希釈した。血漿サンプル及び較正対照をサンプル希釈剤
で５０００倍に希釈した。ブロックしたウェルにカリブ
レーター、対照及びサンプル（１００μＬ）を加え、１
時間３７℃でインキュベートした。ウェルをリットル当
たりグリセロール１０ｍＬ及びＴｗｅｅｎ２０ ０．５
ｍＬからなる洗浄用緩衝液３００μＬで５回洗った。洗
浄後、結合用希釈剤（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆ
ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で５０００倍に希釈した
ＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトａｐｏ Ｂ（Ｏｒｇａｎｏｎ
Ｔｅｋｎｉｋａ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，ＭＤ）１００μＬを各ウェルに加え、１時間３７℃
でインキュベートした。ウェルを洗浄し、ＴＭＢで発色
させた。Ｌｐ（ａ）濃度に対する４５０ｎｍの吸光度を
線形回帰によりプロットすることにより、標準曲線を作
成した。標準曲線から吸光度を補間することによりサン
プル濃度の値を得た。Ｍａｂ ２Ｄ１及び１２Ｃ１１は
捕獲抗体として同等に良好に機能した。一方、２Ｄ１の
みが旧世界ザルａｐｏ（ａ）を認識し、従って、これら
の種におけるＬｐ（ａ）を定量するために使用すること
ができた。
【００７０】２Ｄ１の結合特徴を決定するために、マイ
クロタイタープレートを１０μｇ／ｍｌ ２Ｄ１又は別
のＭａｂで被覆した。プレートに既知濃度（０、２５
０、５００又は１０００ｍｇ／Ｌ）のＬｐ（ａ）血漿カ
リブレーターを加え、インキュベートした後、上述のよ
うに洗浄した。ＨＲＰに結合したＭａｂ ２Ｄ１（１μ
ｇ／ｍｌ，１００μＬ）を加え、１時間３７℃でインキ
ュベートした。ウェルを上述のように洗浄及び発色させ
た。
クロタイタープレートを１０μｇ／ｍｌ ２Ｄ１又は別
のＭａｂで被覆した。プレートに既知濃度（０、２５
０、５００又は１０００ｍｇ／Ｌ）のＬｐ（ａ）血漿カ
リブレーターを加え、インキュベートした後、上述のよ
うに洗浄した。ＨＲＰに結合したＭａｂ ２Ｄ１（１μ
ｇ／ｍｌ，１００μＬ）を加え、１時間３７℃でインキ
ュベートした。ウェルを上述のように洗浄及び発色させ
た。
【００７１】Ｍａｂ ２Ｄ１は非反復エピトープを認識
し、１２Ｃ１１は反復又は別のエピトープを認識する。
図５は２Ｄ１の結合親和性を示す。
し、１２Ｃ１１は反復又は別のエピトープを認識する。
図５は２Ｄ１の結合親和性を示す。
【００７２】実施例６．ＭａｂとＨＲＰの結合 常法を使用してＭａｂ ２Ｄ１及び１２Ｃ１１を１：７
のＩｇＧ：ＨＲＰモル比となるようにＨＲＰで標識し
た。
のＩｇＧ：ＨＲＰモル比となるようにＨＲＰで標識し
た。
【００７３】実施例７．ｃＤＮＡ鋳型の調製 オリゴｄＴでなくランダムプライマーを使用した以外
は、製造業者の指示に従ってＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ）のｃＤＮＡ合成システムを使用して正常
ヒト肝臓ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）５μｇからｃＤＮＡを調製した。こうして
調製したｃＤＮＡをその後のＰＣＲ増幅で使用した。
は、製造業者の指示に従ってＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ）のｃＤＮＡ合成システムを使用して正常
ヒト肝臓ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）５μｇからｃＤＮＡを調製した。こうして
調製したｃＤＮＡをその後のＰＣＲ増幅で使用した。
【００７４】実施例８．ＤＮＡセグメントの増幅 販売業者Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，
ＣＴ）の指示にほぼ従い、実施例７で調製したｃＤＮＡ
鋳型１〜３μｌ、下記各プライマー１００μｇを使用し
てＰＣＲ増幅反応（総容量５０〜１００μｌ）を実施し
た。サイクルパラメーターは、９４℃、４’１サイクル
及び９４℃、１’；５０℃、１’；７２℃、１’３０サ
イクルとした。増幅したＤＮＡ産物を標準方法に従って
分析した処、クローニングに十分な量であることが判明
した。
ＣＴ）の指示にほぼ従い、実施例７で調製したｃＤＮＡ
鋳型１〜３μｌ、下記各プライマー１００μｇを使用し
てＰＣＲ増幅反応（総容量５０〜１００μｌ）を実施し
た。サイクルパラメーターは、９４℃、４’１サイクル
及び９４℃、１’；５０℃、１’；７２℃、１’３０サ
イクルとした。増幅したＤＮＡ産物を標準方法に従って
分析した処、クローニングに十分な量であることが判明
した。
【００７５】カルボキシル末端マッピング（図２参照）
に使用したプライマーオリゴヌクレオチドは下記の通
り：
に使用したプライマーオリゴヌクレオチドは下記の通
り：
【００７６】
【化５】
【００７７】実施例９．ａｐｏ（ａ）フラグメントのク
ローニング 確立された手順に従ってクローニング実験を実施した。
ＢａｍＨＩを使用して増幅ＤＮＡフラグメント及びクロ
ーニング用ベクターｐＥＴ １１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を切断した。アルカリホスファ
ターゼを使用してベクターの脱リン酸化後、ベクターと
インサートを連結した。連結産物を使用してコンピテン
トＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を形質転換した。
ローニング 確立された手順に従ってクローニング実験を実施した。
ＢａｍＨＩを使用して増幅ＤＮＡフラグメント及びクロ
ーニング用ベクターｐＥＴ １１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を切断した。アルカリホスファ
ターゼを使用してベクターの脱リン酸化後、ベクターと
インサートを連結した。連結産物を使用してコンピテン
トＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を形質転換した。
【００７８】実施例１０．プロテアーゼドメインのＰＥ
ＰＳＣＡＮ分析 ＰＥＰＳＣＡＮ法を用いて図７に示すようなプロテアー
ゼドメインを分析した。プロテアーゼドメイン分子の各
位置で開始する１２マーペプチドを合成した。これらの
１２マーペプチドの各々をまず最初に液／液ハイブリダ
イゼーションシステムで２Ｄ１抗体（１／１００希釈
液）と反応させた。２Ｄ１と１２マーとの結合を検出す
るために、ペルオキシダーゼで標識したラット抗マウス
抗体である２Ｄ１に対する第２の抗体を反応混合物に加
えた。比色反応により陽性結果が示された。この結果、
２Ｄ１抗体と結合した２つの１２マー（配列番号２０及
び２２）が判明し、これらの１２マーはこのプロテアー
ゼドメインに沿って合成された他の１２マーの約１０倍
の相対吸光値を示した。これらのペプチドはいずれも同
程度に強く反応したので、２Ｄ１のエピトープはこれら
の２つのペプチドがオーバーラップするときに与えられ
る１１アミノ酸配列ペプチド、即ち配列番号２のペプチ
ドであると結論することができる。
ＰＳＣＡＮ分析 ＰＥＰＳＣＡＮ法を用いて図７に示すようなプロテアー
ゼドメインを分析した。プロテアーゼドメイン分子の各
位置で開始する１２マーペプチドを合成した。これらの
１２マーペプチドの各々をまず最初に液／液ハイブリダ
イゼーションシステムで２Ｄ１抗体（１／１００希釈
液）と反応させた。２Ｄ１と１２マーとの結合を検出す
るために、ペルオキシダーゼで標識したラット抗マウス
抗体である２Ｄ１に対する第２の抗体を反応混合物に加
えた。比色反応により陽性結果が示された。この結果、
２Ｄ１抗体と結合した２つの１２マー（配列番号２０及
び２２）が判明し、これらの１２マーはこのプロテアー
ゼドメインに沿って合成された他の１２マーの約１０倍
の相対吸光値を示した。これらのペプチドはいずれも同
程度に強く反応したので、２Ｄ１のエピトープはこれら
の２つのペプチドがオーバーラップするときに与えられ
る１１アミノ酸配列ペプチド、即ち配列番号２のペプチ
ドであると結論することができる。
【００７９】
配列番号：１ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源 生物名：ホモサピエンス 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３３ 配列 TTC TTG GAG CCC ACA CAA GCA GAT ATT GCC TTG 33 Phe Leu Glu Pro Thr Gln Ala Asp Ile Ala Leu 1 5 10 配列番号：２ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３９ 配列 ACC GCC AGG ACT GAA TGT TAC ATC ACT GGC TGG GGA GAA 39 Thr Ala Arg Thr Glu Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Glu 1 5 10 配列番号：４ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Thr Ala Arg Thr Glu Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Glu 1 5 10 配列番号：５ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３９ 配列 CCA GAC TAC ATG GTC ACC GCC AGG ACT GAA TGT TAC ATC 39 Pro Asp Tyr Met Val Thr Ala Arg Thr Glu Cys Tyr Ile 1 5 10 配列番号：６ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Pro Asp Tyr Met Val Thr Ala Arg Thr Glu Cys Tyr Ile 1 5 10 配列番号：７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３９ 配列 AAG AAA TGT CCT GGA AGC ATT GTA GGG GGG TGT GTG GCC 39 Lys Lys Cys Pro Gly Ser Ile Val Gly Gly Cys Val Ala 1 5 10 配列番号：８ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Lys Lys Cys Pro Gly Ser Ile Val Gly Gly Cys Val Ala 1 5 10 配列番号：９ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３９ 配列 CTC AGA ACA AGG TTT GGA AAG CAC TTC TGT GGA GGC ACC 39 Leu Arg Thr Arg Phe Gly Lys His Phe Cys Gly Gly Thr 1 5 10 配列番号：１０ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Leu Arg Thr Arg Phe Gly Lys His Phe Cys Gly Gly Thr 1 5 10 配列番号：１１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３９ 配列 CAC TGC TTG AAG AAG TCC TCA AGG CCT TCA TCC TAC AAG 39 His Cys Leu Lys Lys Ser Ser Arg Pro Ser Ser Tyr Lys 1 5 10 配列番号：１２ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 His Cys Leu Lys Lys Ser Ser Arg Pro Ser Ser Tyr Lys 1 5 10 配列番号：１３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３９ 配列 CAA GAA GTG AAC CTC GAA TCT CAT GTT CAG GAA ATA GAA 39 Gln Glu Val Asn Leu Glu Ser His Val Gln Glu Ile Glu 1 5 10 配列番号：１４ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gln Glu Val Asn Leu Glu Ser His Val Gln Glu Ile Glu 1 5 10 配列番号：１５ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３９ 配列 GCC TTG CTA AAG CTA AGC AGG CCT GCC GTC ATC ACT GAC 39 Ala Leu Leu Lys Leu Ser Arg Pro Ala Val Ile Thr Asp 1 5 10 配列番号：１６ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ala Leu Leu Lys Leu Ser Arg Pro Ala Val Ile Thr Asp 1 5 10 配列番号：１７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３９ 配列 GAG AAT GAA GTG TGC AAT CAC TAT AAG TAT ATT TGT GCT 39 Glu Asn Glu Val Cys Asn His Tyr Lys Tyr Ile Cys Ala 1 5 10 配列番号：１８ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Glu Asn Glu Val Cys Asn His Tyr Lys Tyr Ile Cys Ala 1 5 10 配列番号：１９ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３６ 配列 CTG TTC TTG GAG CCC ACA CAA GCA GAT ATT GCC TTG 36 Leu Phe Leu Glu Pro Thr Gln Ala Asp Ile Ala Leu 1 5 10 配列番号：２０ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：２１ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３６ 配列 TTC TTG GAG CCC ACA CAA GCA GAT ATT GCC TTG CTA 36 Phe Leu Glu Pro Thr Gln Ala Asp Ile Ala Leu Leu 1 5 10 配列番号：２２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：２３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１５ 配列 CCC ACA CAA GCA GAT 15 Pro Thr Gln Ala Asp 1 5 配列番号：２４ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：２５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１５ 配列 GAA TGT TAC ATC ACT 15 Glu Cys Tyr Ile Thr 1 5 配列番号：２６ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：２７ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１５ 配列 GTC ACC GCC AGG ACT 15 Val Thr Ala Arg Thr 1 5 配列番号：２８ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：２９ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１５ 配列 GGA AGC ATT GTA GGG 15 Gly Ser Ile Val Gly 1 5 配列番号：３０ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：３１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１５ 配列 TTT GGA AAG CAC TTC 15 Phe Gly Lys His Phe 1 5 配列番号：３２ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：３３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１５ 配列 AAG TCC TCA AGG CCT 15 Lys Ser Ser Arg Pro 1 5 配列番号：３４ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：３５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１５ 配列 CTC GAA TCT CAT GTT 15 Leu Glu Ser His Val 1 5 配列番号：３６ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：３７ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１５ 配列 CTA AGC AGG CCT GCC 15 Leu Ser Arg Pro Ala 1 5 配列番号：３８ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：３９ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１５ 配列 TGC AAT CAC TAT AAG 15 Cys Asn His Tyr Lys 1 5 配列番号：４０ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：４１ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列 AGCTAGGAAT CCGAATCGAG TGTCCTCACA ACT 33 配列番号：４２ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列 AGCTAGGGAT CCATTCATTG TGTAGCACCA GGGACC 36 配列番号：４３ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列 AGCTAGGGAT CCGTAGGTTG ATGCTTCACT CTG 33 配列番号：４４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列 AGCTAGGGAT CCCAAGACTG TATGTTTGGG AAT 33 配列番号：４５ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列 AGCTAGGGAT CCATTGTAGG GGGGTGTGTG GCC 33 配列番号：４６ 配列の長さ：２２２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：ＮＯ フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 起源 生物名：ホモサピエンス 配列
【００８０】
【化６】
【００８１】配列番号：４７ 配列の長さ：２３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：ＮＯ フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 起源 生物名：ホモサピエンス 配列
【００８２】
【化７】
【００８３】配列番号：４８ 配列の長さ：１９７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：ＮＯ 配列
【００８４】
【化８】
【図１】Ｌｐ（ａ）及びａｐｏ Ｂの説明図である。
【図２】ａｐｏ（ａ）のカルボキシル末端地図である。
【図３】還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（電気泳動）後
の血漿サンプル中のヒト（上段）及びアカゲザル（下
段）ａｐｏ（ａ）のウェスタンブロット分析である。両
種からのサンプルを抗ａｐｏ（ａ）モノクローナル抗体
２Ｄ１と反応させた。
の血漿サンプル中のヒト（上段）及びアカゲザル（下
段）ａｐｏ（ａ）のウェスタンブロット分析である。両
種からのサンプルを抗ａｐｏ（ａ）モノクローナル抗体
２Ｄ１と反応させた。
【図４ａ】ａｐｏ（ａ）に対するモノクローナル抗体で
プローブした単離リポタンパク質の電気泳動及びウェス
タンブロット分析である。
プローブした単離リポタンパク質の電気泳動及びウェス
タンブロット分析である。
【図４ｂ】変性及び還元ａｐｏ（ａ）に対して反応性の
モノクローナル抗体のウェスタンブロットによる比較で
ある。Ａ＝反復エピトープを認識する抗体４Ｆ３；Ｂ＝
２Ｄ１；Ｃ＝反復エピトープを認識する１２Ｃ１１を表
す。
モノクローナル抗体のウェスタンブロットによる比較で
ある。Ａ＝反復エピトープを認識する抗体４Ｆ３；Ｂ＝
２Ｄ１；Ｃ＝反復エピトープを認識する１２Ｃ１１を表
す。
【図５】モノクローナル抗体２Ｄ１の結合分析である。
【図６】還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（電気泳動）に
かけて移動させた後にＬｐ（ａ）及びａｐｏ（ａ）に対
する抗体でプローブした組換えタンパク質のウェスタン
ブロット分析である。
かけて移動させた後にＬｐ（ａ）及びａｐｏ（ａ）に対
する抗体でプローブした組換えタンパク質のウェスタン
ブロット分析である。
【図７】ヒトａｐｏ（ａ）プロテアーゼドメイン（第１
列）及びヒトプラスミノーゲン（第３列）のアミノ酸配
列の比較である。第２列はａｐｏ（ａ）分子とプラスミ
ノーゲン分子との同一アミノ酸残基を示す。
列）及びヒトプラスミノーゲン（第３列）のアミノ酸配
列の比較である。第２列はａｐｏ（ａ）分子とプラスミ
ノーゲン分子との同一アミノ酸残基を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｗ Ｌ 33/531 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｎ
Claims (30)
- 【請求項１】 ヒト及び旧世界ザルアポリポタンパク質
（ａ）（ａｐｏ（ａ））に存在するアミノ酸配列に対応
する少なくとも５個のアミノ酸の配列からなり、ヒト及
び旧世界ザルプラスミノーゲンにおける対応する位置と
異なる少なくとも１個のアミノ酸を有しており、抗ａｐ
ｏ（ａ）抗体に対して免疫反応性であるが抗プラスミノ
ーゲン抗体に対しては非免疫反応性であり、ａｐｏ
（ａ）の完全アミノ酸配列よりも短い配列を含む単離及
び精製ペプチド、又は該ペプチドの類似体。 - 【請求項２】 配列番号２、４、６、１０、１２、１
４、１６、１８、２０及び２２からなる群から選択され
るアミノ酸配列を含み、ａｐｏ（ａ）と反応するが、プ
ラスミノーゲンとは反応しない抗体を誘発することが可
能なペプチド又はその部分。 - 【請求項３】 配列番号２４、２６、２８、３２、３
４、３６、３８及び４０からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を有する請求項２に記載のペプチド。 - 【請求項４】 配列番号２のアミノ酸配列を有してお
り、ａｐｏ（ａ）と反応するが、プラスミノーゲンとは
反応しない抗体を誘発することが可能な請求項１に記載
のペプチド又はその部分。 - 【請求項５】 配列番号２４のアミノ酸配列を有する請
求項４に記載のペプチド。 - 【請求項６】 請求項１に記載のペプチドに対して反応
性の抗体。 - 【請求項７】 配列番号２、４、６、１０、１２、１
４、１６、１８、２０及び２２からなる群から選択され
るアミノ酸配列を有するペプチドに対して反応性の請求
項６に記載の抗体。 - 【請求項８】 配列番号２４、２６、２８、３２、３
４、３６、３８及び４０からなる群から選択されるペプ
チドに対して反応性の請求項６に記載の抗体。 - 【請求項９】 ポリクローナル又はモノクローナル抗体
である請求項６に記載の抗体。 - 【請求項１０】 請求項１に記載のペプチドに対して反
応性の抗体を固体支持体に結合する段階と、イムノアッ
セイで事後検出できるように請求項１に記載の前記ペプ
チドをラベルする段階と、ラベルしたペプチドを流体サ
ンプルと接触させ、混合物を形成する段階と、結合した
抗体に混合物を加える段階と、混合物と抗体とを反応さ
せる段階と、免疫複合体が形成された場合にはこれを検
出し、こうして流体サンプル中のａｐｏ（ａ）の存在を
決定する段階とを含む、流体サンプル中のａｐｏ（ａ）
を検出するためのイムノアッセイ。 - 【請求項１１】 ラベルが西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、放射性同位体及び蛍光化
学物質からなる群から選択される請求項１０に記載のイ
ムノアッセイ。 - 【請求項１２】 請求項２に記載のペプチドに対して反
応性の抗体を固体支持体に結合する段階と、イムノアッ
セイで事後検出できるように請求項２に記載の前記ペプ
チドをラベルする段階と、ラベルしたペプチドを流体サ
ンプルと接触させ、混合物を形成する段階と、結合した
抗体に混合物を加える段階と、混合物と抗体とを反応さ
せる段階と、免疫複合体が形成された場合にはこれを検
出し、こうして流体サンプル中のａｐｏ（ａ）の存在を
決定する段階とを含む、流体サンプル中のａｐｏ（ａ）
を検出するためのイムノアッセイ。 - 【請求項１３】 ラベルが西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、放射性同位体及び蛍光化
学物質からなる群から選択される請求項１２に記載のイ
ムノアッセイ。 - 【請求項１４】 請求項３に記載のペプチドに対して反
応性の抗体を固体支持体に結合する段階と、イムノアッ
セイで事後検出できるように請求項３に記載の前記ペプ
チドをラベルする段階と、ラベルしたペプチドを流体サ
ンプルと接触させ、混合物を形成する段階と、結合した
抗体に混合物を加える段階と、混合物と抗体とを反応さ
せる段階と、免疫複合体が形成された場合にはこれを検
出し、こうして流体サンプル中のａｐｏ（ａ）の存在を
決定する段階とを含む、流体サンプル中のａｐｏ（ａ）
を検出するためのイムノアッセイ。 - 【請求項１５】 ラベルが西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、放射性同位体及び蛍光化
学物質からなる群から選択される請求項１４に記載のイ
ムノアッセイ。 - 【請求項１６】 請求項１に記載のペプチドをコードす
る核酸配列、その補体及び変異体を含むオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項１７】 配列番号２、４、６、１０、１２、１
４、１６、１８、２０及び２１からなる群から選択され
る配列を有するペプチドをコードする核酸分子、並びに
対応する同一ペプチドをコードするその補体及び変異体
を含むオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１８】 配列番号１、３、５、９、１１、１
３、１５、１７、１９及び２１からなる群から選択され
る核酸配列、並びに対応する同一ペプチドをコードする
その補体及び変異体を含む請求項１７に記載のオリゴヌ
クレオチド。 - 【請求項１９】 配列番号２３、２５、２７、３１、３
３、３５、３７、３９、４１及び４３からなる群から選
択される核酸配列、並びに対応する同一ペプチドをコー
ドするその補体及び変異体を含む請求項１７に記載のオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２０】 前記オリゴヌクレオチドがラベルされ
ている請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２１】 前記オリゴヌクレオチドがラベルされ
ている請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２２】 前記オリゴヌクレオチドがラベルされ
ている請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２３】 請求項１に記載のペプチドに対して反
応性の抗ａｐｏ（ａ）抗体で被覆した固相と、請求項１
に記載の前記ペプチドを有する容器とを含むキット。 - 【請求項２４】 請求項２に記載のペプチドに対して反
応性の抗ａｐｏ（ａ）抗体で被覆した固相と、請求項２
に記載の前記ペプチドを有する容器とを含むキット。 - 【請求項２５】 請求項１７に記載のオリゴヌクレオチ
ドを有する容器と、陽性対照を有する容器とを含むキッ
ト。 - 【請求項２６】 請求項１８に記載のオリゴヌクレオチ
ドを有する容器と、陽性対照を有する容器とを含むキッ
ト。 - 【請求項２７】 請求項１９に記載のオリゴヌクレオチ
ドを有する容器と、陽性対照を有する容器とを含むキッ
ト。 - 【請求項２８】 前記オリゴヌクレオチドがラベルされ
ている請求項２５に記載のキット。 - 【請求項２９】 前記オリゴヌクレオチドがラベルされ
ている請求項２６に記載のキット。 - 【請求項３０】 前記オリゴヌクレオチドがラベルされ
ている請求項２７に記載のキット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17246193A | 1993-12-21 | 1993-12-21 | |
| US172461 | 1993-12-21 | ||
| US08/266,407 US5786156A (en) | 1993-12-21 | 1994-06-27 | Immunoreactive peptides of APO(A) |
| US266407 | 1994-06-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07324100A true JPH07324100A (ja) | 1995-12-12 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6318892A Pending JPH07324100A (ja) | 1993-12-21 | 1994-12-21 | アポリポタンパク質（ａ）の免疫反応性ペプチド |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5597908A (ja) |
| EP (1) | EP0659765A3 (ja) |
| JP (1) | JPH07324100A (ja) |
| AU (1) | AU683508B2 (ja) |
| CA (1) | CA2138605A1 (ja) |
| FI (1) | FI945976A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009524404A (ja) * | 2002-12-20 | 2009-07-02 | アプレラ コーポレイション | 心筋梗塞に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用 |
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| CA2318578A1 (en) | 1998-01-20 | 1999-07-22 | Abbott Laboratories | Specific antibodies to kringle 5 of apoliprotein a and methods of use therefor |
| JP2001275677A (ja) * | 2000-03-30 | 2001-10-09 | Canon Inc | 核酸断片プライマーまたはプローブ、およびこれを用いたポリヒドロキシアルカノエート合成微生物の検出方法 |
| EP1978971A4 (en) | 2005-12-30 | 2012-03-28 | Revance Therapeutics Inc | ARGININE HETEROMERS FOR TOPICAL HARVESTING |
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| US5206086A (en) * | 1987-10-13 | 1993-04-27 | University Of Rochester | Particle-stabilized epitopes for standardization and control of immunoassays |
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| JP3018110B2 (ja) * | 1991-03-25 | 2000-03-13 | 第一化学薬品株式会社 | モノクローナル抗体 |
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| EP0621284A4 (en) * | 1992-08-14 | 1996-06-12 | Shino Test Corp | PEPTIDES CONTAINING SELECTED RESPECTIVE AMINO ACID SELECTED FROM LIPOPROTEIN (a) AND APOLIPOPROTEIN (a), ANTIBODIES RECOGNIZING THESE AMINO ACID SEQUENCES AND ANALYSIS METHOD USING THE SAME. |
-
1994
- 1994-12-16 EP EP94203653A patent/EP0659765A3/en not_active Ceased
- 1994-12-20 CA CA002138605A patent/CA2138605A1/en not_active Abandoned
- 1994-12-20 AU AU81606/94A patent/AU683508B2/en not_active Ceased
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-
1995
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- 1995-06-01 US US08/457,449 patent/US5708138A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-07-14 US US08/892,544 patent/US5874544A/en not_active Expired - Fee Related
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| US5708138A (en) | 1998-01-13 |
| EP0659765A2 (en) | 1995-06-28 |
| US5597908A (en) | 1997-01-28 |
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| AU683508B2 (en) | 1997-11-13 |
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| CA2138605A1 (en) | 1995-06-22 |
| EP0659765A3 (en) | 1995-09-27 |
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