JPH07309902A - アシル化ヒアルロン酸の製造法 - Google Patents
アシル化ヒアルロン酸の製造法Info
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- JPH07309902A JPH07309902A JP6124738A JP12473894A JPH07309902A JP H07309902 A JPH07309902 A JP H07309902A JP 6124738 A JP6124738 A JP 6124738A JP 12473894 A JP12473894 A JP 12473894A JP H07309902 A JPH07309902 A JP H07309902A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ヒアルロン酸の水酸基に低分子化を伴わずに、
最良の可溶化溶媒であると共に環境保全に適した、環境
に優しい水系において、簡便な操作および精製法により
任意の数のアシル基を均一に導入する方法、それらを主
体とした応用性及び汎用性のあるＤＤＳ素材、および光
架橋性ヒアルロン酸をエンドトキシンフリーの状態で、
医療用材料として提供する。 【構成】 ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単
独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル
化触媒存在下、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン
化物と反応させ、アシル化することを特徴とするアシル
化ヒアルロン酸の製造法、で得られたアシル化ヒ
アルロン酸のアシル基を部分ケン化することにより任意
の数のアシル基が導入されたアシル化ヒアルロン酸を得
ることを特徴とするアシル化ヒアルロン酸の製造法。
最良の可溶化溶媒であると共に環境保全に適した、環境
に優しい水系において、簡便な操作および精製法により
任意の数のアシル基を均一に導入する方法、それらを主
体とした応用性及び汎用性のあるＤＤＳ素材、および光
架橋性ヒアルロン酸をエンドトキシンフリーの状態で、
医療用材料として提供する。 【構成】 ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単
独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル
化触媒存在下、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン
化物と反応させ、アシル化することを特徴とするアシル
化ヒアルロン酸の製造法、で得られたアシル化ヒ
アルロン酸のアシル基を部分ケン化することにより任意
の数のアシル基が導入されたアシル化ヒアルロン酸を得
ることを特徴とするアシル化ヒアルロン酸の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は高分子ヒアルロン酸の水
酸基のアシル化法に関する。ヒアルロン酸は動物組織中
に天然に存在し生体再吸収性を有すると共に毒物学的お
よび免疫学的作用が存在しないためそれ自体が薬剤、化
粧品として利用されているが、これらをアシル化等の化
学修飾を施すことによりさらなる用途が期待できる。例
えばヒアルロン酸に医薬品や生理活性ペプチドを結合さ
せたものは優れたドラッグデリバリーシステム（以下、
ＤＤＳという）の薬剤となる。またヒアルロン酸にケイ
皮酸やウラシル誘導体を結合させたものに紫外線を照射
すると分子間架橋反応により三次元網目構造を有し不溶
性の架橋ヒアルロン酸が得られ、生物分解性を有し生体
適合性にすぐれた医療用材料となる。
酸基のアシル化法に関する。ヒアルロン酸は動物組織中
に天然に存在し生体再吸収性を有すると共に毒物学的お
よび免疫学的作用が存在しないためそれ自体が薬剤、化
粧品として利用されているが、これらをアシル化等の化
学修飾を施すことによりさらなる用途が期待できる。例
えばヒアルロン酸に医薬品や生理活性ペプチドを結合さ
せたものは優れたドラッグデリバリーシステム（以下、
ＤＤＳという）の薬剤となる。またヒアルロン酸にケイ
皮酸やウラシル誘導体を結合させたものに紫外線を照射
すると分子間架橋反応により三次元網目構造を有し不溶
性の架橋ヒアルロン酸が得られ、生物分解性を有し生体
適合性にすぐれた医療用材料となる。
【０００２】
【従来の技術】従来、水溶性多糖類のアシル化法として
は、ヒアルロン酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、ＤＭＦという）に懸濁させピリジンを触媒とし酸塩
化物と反応させる方法（Eur.J.Biochem.,1,46-50(196
7)、Chem.Express,6(9),647-650(1991)）、グリコサミ
ノグリカンのナトリウム塩を４級または３級アンモニウ
ム塩に置換しＤＭＦに可溶にした後、ジメチルアミノピ
リジンを触媒とし酸無水物と反応させる方法（Carbohyd
r.Res.,236,107-119(1992)）、プルランをＤＭＦ中ピリ
ジンを触媒として塩化ベンゾイルと共に加熱する方法
（特開昭５２ー７８２８６）等が知られている。
は、ヒアルロン酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、ＤＭＦという）に懸濁させピリジンを触媒とし酸塩
化物と反応させる方法（Eur.J.Biochem.,1,46-50(196
7)、Chem.Express,6(9),647-650(1991)）、グリコサミ
ノグリカンのナトリウム塩を４級または３級アンモニウ
ム塩に置換しＤＭＦに可溶にした後、ジメチルアミノピ
リジンを触媒とし酸無水物と反応させる方法（Carbohyd
r.Res.,236,107-119(1992)）、プルランをＤＭＦ中ピリ
ジンを触媒として塩化ベンゾイルと共に加熱する方法
（特開昭５２ー７８２８６）等が知られている。
【０００３】しかしながらヒアルロン酸は通常ナトリウ
ム塩の形で入手されるが、このものは有機溶媒に不溶で
あるため、ヒアルロン酸ナトリウムを原料として使用す
ると不均一系反応となりアシル化反応は非常に遅く、ア
シル基の導入数のコントロールが難しく、導入位置にむ
らを生じ易い。また、ヒアルロン酸のカルボキシル基と
酸塩化物とが反応して酸無水物を形成し、これが水酸基
と位置非特異的に分子内または分子間エステル結合を生
じるなどの好ましくない副反応を伴う。
ム塩の形で入手されるが、このものは有機溶媒に不溶で
あるため、ヒアルロン酸ナトリウムを原料として使用す
ると不均一系反応となりアシル化反応は非常に遅く、ア
シル基の導入数のコントロールが難しく、導入位置にむ
らを生じ易い。また、ヒアルロン酸のカルボキシル基と
酸塩化物とが反応して酸無水物を形成し、これが水酸基
と位置非特異的に分子内または分子間エステル結合を生
じるなどの好ましくない副反応を伴う。
【０００４】また、ヒアルロン酸のナトリウム塩を４級
または３級アンモニウム塩に置換しＤＭＦに可溶にした
後、ジメチルアミノピリジンを触媒とし酸無水物と反応
させる方法（Carbohydr.Res.,236,107-119(1992)）があ
るが、この塩交換操作は非常に煩雑である上、多量のＤ
ＭＦ廃液を生じるため、環境的、工業的にも問題があ
る。 さらにこれらの方法は、そのほとんどが溶解度や
反応速度を上げるために加熱を必要とするが、高分子量
のヒアルロン酸の場合はそれにより速やかに低分子化を
起こす。
または３級アンモニウム塩に置換しＤＭＦに可溶にした
後、ジメチルアミノピリジンを触媒とし酸無水物と反応
させる方法（Carbohydr.Res.,236,107-119(1992)）があ
るが、この塩交換操作は非常に煩雑である上、多量のＤ
ＭＦ廃液を生じるため、環境的、工業的にも問題があ
る。 さらにこれらの方法は、そのほとんどが溶解度や
反応速度を上げるために加熱を必要とするが、高分子量
のヒアルロン酸の場合はそれにより速やかに低分子化を
起こす。
【０００５】また粘性の高い高分子量のヒアルロン酸の
化学修飾では、高希釈条件での反応と濃縮を繰り返す必
要があるため従来の合成法、精製法ではその操作の煩雑
さにより処理中にエンドトキシンが混入し易く医用材料
を提供するには適さない。
化学修飾では、高希釈条件での反応と濃縮を繰り返す必
要があるため従来の合成法、精製法ではその操作の煩雑
さにより処理中にエンドトキシンが混入し易く医用材料
を提供するには適さない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は第１にヒアルロン酸の水酸基に低分子化を伴わずに、
最良の可溶化溶媒であると共に、環境保全に適した、環
境に優しい水系において、簡便な操作および精製法によ
り任意の数のアシル基を均一に導入する方法を提供する
ことであり、第２にそれらを主体とした応用性及び汎用
性のあるＤＤＳ素材、および光架橋性ヒアルロン酸をエ
ンドトキシンフリーの状態で、医療用材料として提供す
ることである。
は第１にヒアルロン酸の水酸基に低分子化を伴わずに、
最良の可溶化溶媒であると共に、環境保全に適した、環
境に優しい水系において、簡便な操作および精製法によ
り任意の数のアシル基を均一に導入する方法を提供する
ことであり、第２にそれらを主体とした応用性及び汎用
性のあるＤＤＳ素材、および光架橋性ヒアルロン酸をエ
ンドトキシンフリーの状態で、医療用材料として提供す
ることである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは鋭意研究
の結果、上記課題を以下の構成によって達成することに
成功した。すなわち、この発明は、以下の通りである。 １） ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単独また
は水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル化触媒
存在下、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン化物と
反応させ、アシル化することを特徴とするアシル化ヒア
ルロン酸の製造法。
の結果、上記課題を以下の構成によって達成することに
成功した。すなわち、この発明は、以下の通りである。 １） ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単独また
は水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル化触媒
存在下、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン化物と
反応させ、アシル化することを特徴とするアシル化ヒア
ルロン酸の製造法。
【０００８】２） 反応温度が約０〜５０℃であること
を特徴とする前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製
造法。 ３） アシル化触媒が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノピリ
ジン系触媒である前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸
の製造法。 ４） アシル化触媒が４−ジメチルアミノピリジンまた
は４−ピロリジノピリジンであることを特徴とする前記
１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
を特徴とする前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製
造法。 ３） アシル化触媒が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノピリ
ジン系触媒である前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸
の製造法。 ４） アシル化触媒が４−ジメチルアミノピリジンまた
は４−ピロリジノピリジンであることを特徴とする前記
１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【０００９】５） ヒアルロン酸またはその塩の平均分
子量が約１０万〜５００万であることを特徴とする前記
１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 ６） カルボン酸がアミノ酸、ペプチドもしくはそれら
の誘導体、ケイ皮酸もしくはそのフェニル基に置換基を
有する誘導体、オロチン酸、ウラシル−５−カルボン
酸、１−（カルボキシアルキル）チミン、サリチル酸ま
たはアセチルサリチル酸であることを特徴とする前記
１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
子量が約１０万〜５００万であることを特徴とする前記
１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 ６） カルボン酸がアミノ酸、ペプチドもしくはそれら
の誘導体、ケイ皮酸もしくはそのフェニル基に置換基を
有する誘導体、オロチン酸、ウラシル−５−カルボン
酸、１−（カルボキシアルキル）チミン、サリチル酸ま
たはアセチルサリチル酸であることを特徴とする前記
１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【００１０】７） アミノ酸またはペプチドの誘導体
が、アミノ保護基を有したものであることを特徴とする
前記６）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 ８） アシル化反応後、前記７）記載のアミノ保護基を
脱離することを特徴とするアシル化ヒアルロン酸の製造
法。 ９） アシル化反応が酸の中和剤存在下で行われ、酸の
中和剤として、３級アミンまたは無機塩基が用いられる
ことを特徴とする前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸
の製造法。
が、アミノ保護基を有したものであることを特徴とする
前記６）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 ８） アシル化反応後、前記７）記載のアミノ保護基を
脱離することを特徴とするアシル化ヒアルロン酸の製造
法。 ９） アシル化反応が酸の中和剤存在下で行われ、酸の
中和剤として、３級アミンまたは無機塩基が用いられる
ことを特徴とする前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸
の製造法。
【００１１】１０） 前記水溶液が、水混和性有機溶媒
を約０〜５０％の範囲で含むことを特徴とする前記１）
記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 １１） ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単独ま
たは水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル化触
媒存在下、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン化物
と反応させた後、得られたアシル化ヒアルロン酸のアシ
ル基を部分ケン化することにより任意の数のアシル基が
導入されたアシル化ヒアルロン酸を得ることを特徴とす
るアシル化ヒアルロン酸の製造法。
を約０〜５０％の範囲で含むことを特徴とする前記１）
記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 １１） ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単独ま
たは水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル化触
媒存在下、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン化物
と反応させた後、得られたアシル化ヒアルロン酸のアシ
ル基を部分ケン化することにより任意の数のアシル基が
導入されたアシル化ヒアルロン酸を得ることを特徴とす
るアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【００１２】１２） 部分ケン化して得られるアシル化
ヒアルロン酸のアシル基の導入数がヒアルロン酸構成二
糖単位当たり約０．００５〜０．５であることを特徴と
する前記１１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 １３） 水混和性有機溶媒水溶液に分子量約１０万〜５
００万のヒアルロン酸ナトリウムを溶解させた溶液に、
０℃以上、室温以下の範囲の温度において、無水ケイ皮
酸もしくはケイ皮酸クロリドと４−ジメチルアミノピリ
ジンもしくは４−ピロリジノピリジンと酸の中和剤とを
含む水混和性有機溶媒溶液を添加し、上記温度範囲にお
いて反応させ、分子量が約１０万〜５００万であり、水
酸基がケイ皮酸でエステル化されたヒアルロン酸を得る
ことを特徴とするシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
法。
ヒアルロン酸のアシル基の導入数がヒアルロン酸構成二
糖単位当たり約０．００５〜０．５であることを特徴と
する前記１１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 １３） 水混和性有機溶媒水溶液に分子量約１０万〜５
００万のヒアルロン酸ナトリウムを溶解させた溶液に、
０℃以上、室温以下の範囲の温度において、無水ケイ皮
酸もしくはケイ皮酸クロリドと４−ジメチルアミノピリ
ジンもしくは４−ピロリジノピリジンと酸の中和剤とを
含む水混和性有機溶媒溶液を添加し、上記温度範囲にお
いて反応させ、分子量が約１０万〜５００万であり、水
酸基がケイ皮酸でエステル化されたヒアルロン酸を得る
ことを特徴とするシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
法。
【００１３】１４） 水混和性有機溶媒が、ジオキサ
ン、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ア
セトアミドまたはピリジンであり、酸の中和剤がトリエ
チルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、
Ｎ−メチルモルホリンまたは炭酸水素ナトリウムである
ことを特徴とする前記１３）記載のシンナモイル化ヒア
ルロン酸の製造法。
ン、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ア
セトアミドまたはピリジンであり、酸の中和剤がトリエ
チルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、
Ｎ−メチルモルホリンまたは炭酸水素ナトリウムである
ことを特徴とする前記１３）記載のシンナモイル化ヒア
ルロン酸の製造法。
【００１４】以下、本発明につき、詳細に説明する。
【００１５】本発明に用いられるヒアルロン酸は由来、
分子量には限定されないが、一般的には天然物、好まし
くは脊椎動物または微生物由来で、平均分子量が約１０
万〜５００万、好ましくは約６０万〜２００万が挙げら
れ、またそのカルボキシル基は塩の形態でもよくアルカ
リ金属塩またはアルカリ土類金属塩いずれの形でも使用
できるが、特に水溶性塩が好ましく、このような塩とし
ては一般的には入手し易いナトリウム塩またはカリウム
塩が便利である。
分子量には限定されないが、一般的には天然物、好まし
くは脊椎動物または微生物由来で、平均分子量が約１０
万〜５００万、好ましくは約６０万〜２００万が挙げら
れ、またそのカルボキシル基は塩の形態でもよくアルカ
リ金属塩またはアルカリ土類金属塩いずれの形でも使用
できるが、特に水溶性塩が好ましく、このような塩とし
ては一般的には入手し易いナトリウム塩またはカリウム
塩が便利である。
【００１６】本発明におけるアシル化反応は水単独また
は水混和性有機溶媒を含んだ水溶液に溶解させたヒアル
ロン酸溶液中に、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲ
ン化物をアシル化剤として添加することにより行われ
る。具体的には、水、または水混和性有機溶媒の約０〜
５０％を含む水溶液に溶解させたヒアルロン酸またはそ
の塩の溶液中に、攪拌しながら無水の該有機溶媒に溶解
したアシル化剤を添加することによって行われる。ここ
で、水への有機溶媒の混和率（％）＝１００・有機溶媒
容量／混合水溶液容量である。
は水混和性有機溶媒を含んだ水溶液に溶解させたヒアル
ロン酸溶液中に、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲ
ン化物をアシル化剤として添加することにより行われ
る。具体的には、水、または水混和性有機溶媒の約０〜
５０％を含む水溶液に溶解させたヒアルロン酸またはそ
の塩の溶液中に、攪拌しながら無水の該有機溶媒に溶解
したアシル化剤を添加することによって行われる。ここ
で、水への有機溶媒の混和率（％）＝１００・有機溶媒
容量／混合水溶液容量である。
【００１７】本発明のアシル化反応における反応系は、
上記条件を満足すれば、特に制限はなく任意の方法を使
用し得るが、特に、ヒアルロン酸またはその塩は、初め
に水で溶解し、次いで有機溶媒を添加もしくは添加する
ことなく、この溶液にアシル化剤、酸の中和剤（塩
基）、およびアシル化触媒の有機溶媒溶液を約０〜５０
℃、好ましくは、０℃以上、室温以下の範囲、より好ま
しくは、氷冷下に滴下してアシル化反応を行うことが好
ましい。
上記条件を満足すれば、特に制限はなく任意の方法を使
用し得るが、特に、ヒアルロン酸またはその塩は、初め
に水で溶解し、次いで有機溶媒を添加もしくは添加する
ことなく、この溶液にアシル化剤、酸の中和剤（塩
基）、およびアシル化触媒の有機溶媒溶液を約０〜５０
℃、好ましくは、０℃以上、室温以下の範囲、より好ま
しくは、氷冷下に滴下してアシル化反応を行うことが好
ましい。
【００１８】本方法によれば従来の有機溶媒中での反応
の場合に必要であった、塩交換や溶媒置換といった煩雑
な操作を全く経ることなくヒアルロン酸のアシル化が達
成できることが大きな利点である。
の場合に必要であった、塩交換や溶媒置換といった煩雑
な操作を全く経ることなくヒアルロン酸のアシル化が達
成できることが大きな利点である。
【００１９】本発明におけるアシル化剤の添加の際、ア
シル化触媒としてＮ，Ｎ−ジアルキルアミノピリジン系
触媒、特に４ージメチルアミノピリジンまたは４ーピロ
リジノピリジンを用いることが好ましく、また反応によ
って生成する酸を中和する目的で酸の中和剤としてトリ
エチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジ
ン、Ｎ−メチルモルホリンのような３級アミンまたは炭
酸水素ナトリウムのような無機塩基を用いることが好ま
しい。これらはアシル化剤と共に添加されることが好ま
しいが、予めヒアルロン酸ナトリウム溶液中に加えてお
いても良い。
シル化触媒としてＮ，Ｎ−ジアルキルアミノピリジン系
触媒、特に４ージメチルアミノピリジンまたは４ーピロ
リジノピリジンを用いることが好ましく、また反応によ
って生成する酸を中和する目的で酸の中和剤としてトリ
エチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジ
ン、Ｎ−メチルモルホリンのような３級アミンまたは炭
酸水素ナトリウムのような無機塩基を用いることが好ま
しい。これらはアシル化剤と共に添加されることが好ま
しいが、予めヒアルロン酸ナトリウム溶液中に加えてお
いても良い。
【００２０】またアシル化反応温度は約０〜５０℃の
間、好ましくは０℃以上、室温（ＪＩＳ Ｋ００５０で
は５〜３５℃を室温という）以下、さらに好ましくは氷
冷下であり、反応時間は３分から２時間かけてアシル化
剤を滴下し、その後必要に応じた時間、例えば、３０分
から２時間攪拌してアシル化反応を行う。その後エタノ
ール沈殿法、透析などの公知の精製法を用いて低分子の
不純物を除去する。このように反応温度を低く抑えるこ
とにより低分子化を起こし易い高分子量ヒアルロン酸で
さえも、もとの分子量を保持したままでアシル化が可能
となった。
間、好ましくは０℃以上、室温（ＪＩＳ Ｋ００５０で
は５〜３５℃を室温という）以下、さらに好ましくは氷
冷下であり、反応時間は３分から２時間かけてアシル化
剤を滴下し、その後必要に応じた時間、例えば、３０分
から２時間攪拌してアシル化反応を行う。その後エタノ
ール沈殿法、透析などの公知の精製法を用いて低分子の
不純物を除去する。このように反応温度を低く抑えるこ
とにより低分子化を起こし易い高分子量ヒアルロン酸で
さえも、もとの分子量を保持したままでアシル化が可能
となった。
【００２１】アシル化されたヒアルロン酸の分子量は、
全てのアシル基をケン化により除去したのちゲル濾過法
（ＧＰＣ）等で決定できる。
全てのアシル基をケン化により除去したのちゲル濾過法
（ＧＰＣ）等で決定できる。
【００２２】反応溶媒は、水単独または水混和性有機溶
媒を含んだ水溶液であり、アシル化剤の滴下中すべての
成分を溶解させておく組成が好ましいが、反応の進行と
共に生成物が析出しても問題ない。ここで、水混和性有
機溶媒とは、水と自由な割合で均一に混ざる有機溶媒で
アシル化反応を阻害しないものを意味する。
媒を含んだ水溶液であり、アシル化剤の滴下中すべての
成分を溶解させておく組成が好ましいが、反応の進行と
共に生成物が析出しても問題ない。ここで、水混和性有
機溶媒とは、水と自由な割合で均一に混ざる有機溶媒で
アシル化反応を阻害しないものを意味する。
【００２３】本発明に使用される水混和性有機溶媒とし
ては、具体的にジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトアミド、
ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメ
チルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、Ｎ−メチルピロリ
ドン、ピリジン等が挙げられる。また、反応溶媒として
は、前記例示した水混和性有機溶媒のいずれかから選択
される１種以上の総計で約０〜５０％の範囲を含む水溶
液であって、かつアシル化剤の滴下中すべての成分を溶
解させておく組成が好ましい。なお、本発明の含水系で
の反応においては、反応の進行とともに疎水性のアシル
基導入率が高くなるとアシル化ヒアルロン酸が不溶化す
るため、アシル基の導入数が高くなりすぎないという効
果がある。さらに目的物を通常の固液分離手段で分離
し、水および／または有機溶媒で洗浄することによって
容易に精製することもできる。
ては、具体的にジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトアミド、
ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメ
チルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、Ｎ−メチルピロリ
ドン、ピリジン等が挙げられる。また、反応溶媒として
は、前記例示した水混和性有機溶媒のいずれかから選択
される１種以上の総計で約０〜５０％の範囲を含む水溶
液であって、かつアシル化剤の滴下中すべての成分を溶
解させておく組成が好ましい。なお、本発明の含水系で
の反応においては、反応の進行とともに疎水性のアシル
基導入率が高くなるとアシル化ヒアルロン酸が不溶化す
るため、アシル基の導入数が高くなりすぎないという効
果がある。さらに目的物を通常の固液分離手段で分離
し、水および／または有機溶媒で洗浄することによって
容易に精製することもできる。
【００２４】ヒアルロン酸に対するアシル化剤およびア
シル化触媒の量は、所望のアシル化ヒアルロン酸の種
類、すなわち、ヒアルロン酸の分子量あるいはアシル化
剤の種類およびアシル基の所望導入数等により適宜選定
され得るが、一般的には反応中の試薬の分解による損失
を考慮し過剰量用いるべきであろう。なお、アシル化ヒ
アルロン酸のアシル基の導入数（以下、ＤＳという）
は、ヒアルロン酸構成二糖単位当たりの導入数として定
義できる。ＤＳはプロトンＮＭＲの積分強度または２８
０ｎｍの吸光度の測定により決定できる（実施例１参
照）。
シル化触媒の量は、所望のアシル化ヒアルロン酸の種
類、すなわち、ヒアルロン酸の分子量あるいはアシル化
剤の種類およびアシル基の所望導入数等により適宜選定
され得るが、一般的には反応中の試薬の分解による損失
を考慮し過剰量用いるべきであろう。なお、アシル化ヒ
アルロン酸のアシル基の導入数（以下、ＤＳという）
は、ヒアルロン酸構成二糖単位当たりの導入数として定
義できる。ＤＳはプロトンＮＭＲの積分強度または２８
０ｎｍの吸光度の測定により決定できる（実施例１参
照）。
【００２５】本発明では、ＤＳを所望の値に制御できる
が、通常、約０．００５〜０．５、好ましくは約０．０
５〜０．５の範囲である。
が、通常、約０．００５〜０．５、好ましくは約０．０
５〜０．５の範囲である。
【００２６】アシル化反応中にアシル化生成物が析出し
てきた場合は、ガラスフィルター等を用いる濾過、遠心
分離、デカント等の固液分離手段により析出物を分離
し、重曹水、水、及びエタノール等の適当な溶媒で順次
洗浄するといった、より簡便な精製操作で目的物を精
製、単離することが出来る。一般にＤＳが高いと不溶化
するが、このようにして得たアシル化ヒアルロン酸を氷
冷下にて、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水
溶液等の希アルカリにより部分ケン化することで任意の
ＤＳ値を有する部分アシル化ヒアルロン酸を得ることも
出来る。
てきた場合は、ガラスフィルター等を用いる濾過、遠心
分離、デカント等の固液分離手段により析出物を分離
し、重曹水、水、及びエタノール等の適当な溶媒で順次
洗浄するといった、より簡便な精製操作で目的物を精
製、単離することが出来る。一般にＤＳが高いと不溶化
するが、このようにして得たアシル化ヒアルロン酸を氷
冷下にて、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水
溶液等の希アルカリにより部分ケン化することで任意の
ＤＳ値を有する部分アシル化ヒアルロン酸を得ることも
出来る。
【００２７】該ケン化の具体的方法としては、例えば不
溶性のアシル化ヒアルロン酸を水に懸濁させておき、得
たいＤＳとなるために必要量の水酸化ナトリウム水溶液
を０℃で滴下し、室温で溶解するまで攪拌する。この場
合、水酸化ナトリウムはケン化したいアシル基と等モル
が使用される。また、反応終了後も生成物が析出しない
場合は、通常のこの種の反応の後処理、すなわちエタノ
ール等を用いる有機溶媒沈澱、透析、塩析、更に所望に
よりＧＰＣ、アフィニティー、イオン交換等の各種クロ
マトグラフィー等によりアシル化ヒアルロン酸を精製す
ることが可能である。
溶性のアシル化ヒアルロン酸を水に懸濁させておき、得
たいＤＳとなるために必要量の水酸化ナトリウム水溶液
を０℃で滴下し、室温で溶解するまで攪拌する。この場
合、水酸化ナトリウムはケン化したいアシル基と等モル
が使用される。また、反応終了後も生成物が析出しない
場合は、通常のこの種の反応の後処理、すなわちエタノ
ール等を用いる有機溶媒沈澱、透析、塩析、更に所望に
よりＧＰＣ、アフィニティー、イオン交換等の各種クロ
マトグラフィー等によりアシル化ヒアルロン酸を精製す
ることが可能である。
【００２８】本発明のアシル化反応に使用されるアシル
化剤は、カルボン酸の酸無水物（対称酸無水物、混合酸
無水物）または酸ハロゲン化物である。また、少なくと
もアシル化反応時に酸無水物または酸ハロゲン化物に変
化するものであってもよい。上記カルボン酸の種類は、
限定されないが、好ましい例として、ペプチドもしくは
それらの誘導体、ケイ皮酸もしくはそのフェニル基に置
換基を有する誘導体（例えば、ｐ−アミノケイ皮酸）、
オロチン酸、ウラシル−５−カルボン酸、１−（カルボ
キシアルキル）チミン（例えば、１−（カルボキシエチ
ル）チミン）、サリチル酸、アセチルサリチル酸等が挙
げられる。
化剤は、カルボン酸の酸無水物（対称酸無水物、混合酸
無水物）または酸ハロゲン化物である。また、少なくと
もアシル化反応時に酸無水物または酸ハロゲン化物に変
化するものであってもよい。上記カルボン酸の種類は、
限定されないが、好ましい例として、ペプチドもしくは
それらの誘導体、ケイ皮酸もしくはそのフェニル基に置
換基を有する誘導体（例えば、ｐ−アミノケイ皮酸）、
オロチン酸、ウラシル−５−カルボン酸、１−（カルボ
キシアルキル）チミン（例えば、１−（カルボキシエチ
ル）チミン）、サリチル酸、アセチルサリチル酸等が挙
げられる。
【００２９】ヒアルロン酸に結合させるべきアシル基
が、アミノ酸、ペプチドの残基である場合はそれらに含
まれるアミノ基をベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）、
ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）などのペプチド化
学において常用されるアミノ基の保護基（「生化学辞
典」第２版、１４７１〜１４７２頁、１９９０年１１月
２２日、（株）東京化学同人発行）で保護しておく必要
がある。得られた保護基を有するアシル化ヒアルロン酸
は、目的に応じで脱保護し、フリーのアミノ基とするこ
とができる。該フリーのアミノ基を有するアシル化ヒア
ルロン酸の該アミノ基と所望の薬剤、アミノ酸、あるい
はペプチド等を結合させ有用なＤＤＳ薬剤等を製造する
ことができる。
が、アミノ酸、ペプチドの残基である場合はそれらに含
まれるアミノ基をベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）、
ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）などのペプチド化
学において常用されるアミノ基の保護基（「生化学辞
典」第２版、１４７１〜１４７２頁、１９９０年１１月
２２日、（株）東京化学同人発行）で保護しておく必要
がある。得られた保護基を有するアシル化ヒアルロン酸
は、目的に応じで脱保護し、フリーのアミノ基とするこ
とができる。該フリーのアミノ基を有するアシル化ヒア
ルロン酸の該アミノ基と所望の薬剤、アミノ酸、あるい
はペプチド等を結合させ有用なＤＤＳ薬剤等を製造する
ことができる。
【００３０】上記カルボン酸は、カルボン酸の酸無水物
または酸ハロゲン化物のようなアシル化剤の形態で反応
に供されるが、カルボン酸の酸無水物を得るためのカル
ボキシル基の活性化方法はカルボジイミド類（例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−
（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド等）によ
る対称酸無水物法、あるいは塩化ジメチルホスフィノチ
オイル等による混合酸無水物法等から適宜選択できる。
または酸ハロゲン化物のようなアシル化剤の形態で反応
に供されるが、カルボン酸の酸無水物を得るためのカル
ボキシル基の活性化方法はカルボジイミド類（例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−
（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド等）によ
る対称酸無水物法、あるいは塩化ジメチルホスフィノチ
オイル等による混合酸無水物法等から適宜選択できる。
【００３１】例えば、対称酸無水物が好適なカルボン酸
は、ケイ皮酸無水物が、混合酸無水物が好適なものはｔ
−ブトキシカルボニル化グリシン、ベンジルオキシカル
ボニル化グリシン等が挙げられる。そして、得られたベ
ンジルオキシカルボニルグリシン化ヒアルロン酸のベン
ジルオキシ基を接触水素移動還元、または接触還元など
により脱保護し、フリーのアミノ基を有するグリシル化
ヒアルロン酸を製造することができる。
は、ケイ皮酸無水物が、混合酸無水物が好適なものはｔ
−ブトキシカルボニル化グリシン、ベンジルオキシカル
ボニル化グリシン等が挙げられる。そして、得られたベ
ンジルオキシカルボニルグリシン化ヒアルロン酸のベン
ジルオキシ基を接触水素移動還元、または接触還元など
により脱保護し、フリーのアミノ基を有するグリシル化
ヒアルロン酸を製造することができる。
【００３２】また、アシル基がシンナモイル基の場合は
ケイ皮酸クロリド及び無水ケイ皮酸が有効である。さら
にアシル基が１−カルボキシエチルチミン由来の場合に
は酸無水物による活性化が、オロチン酸由来の場合には
酸塩化物による活性化がより好ましい。本発明に使用さ
れるアシル化剤は、その他、任意のカルボン酸から選定
できる。該カルボン酸はカルボキシル基を少なくとも１
個有する有機化合物（脂肪族、芳香族、および複素環系
化合物を含む）であればよく、カルボキシル基を複数個
有したものでもよい。
ケイ皮酸クロリド及び無水ケイ皮酸が有効である。さら
にアシル基が１−カルボキシエチルチミン由来の場合に
は酸無水物による活性化が、オロチン酸由来の場合には
酸塩化物による活性化がより好ましい。本発明に使用さ
れるアシル化剤は、その他、任意のカルボン酸から選定
できる。該カルボン酸はカルボキシル基を少なくとも１
個有する有機化合物（脂肪族、芳香族、および複素環系
化合物を含む）であればよく、カルボキシル基を複数個
有したものでもよい。
【００３３】特に、カルボン酸としてサリチル酸、アセ
チルサリチル酸、メルファラン（４−〔ビス（２−クロ
ロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニルアラニン）等の有用
な薬剤を使用すれば、そのアシル化ヒアルロン酸はＤＤ
Ｓ製剤として使用可能である。
チルサリチル酸、メルファラン（４−〔ビス（２−クロ
ロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニルアラニン）等の有用
な薬剤を使用すれば、そのアシル化ヒアルロン酸はＤＤ
Ｓ製剤として使用可能である。
【００３４】なお、含水溶媒中で行われる本方法は従来
のグリコサミノグリカンのアシル化法に比べ操作が非常
に簡便であり、エンドトキシンフリーの水を使用するこ
とでエンドトキシンを実質的に含まない目的物を容易に
得ることができる。また工業的に問題となる有機廃液の
量を大幅に減らせるといった利点も併せ持つ。
のグリコサミノグリカンのアシル化法に比べ操作が非常
に簡便であり、エンドトキシンフリーの水を使用するこ
とでエンドトキシンを実質的に含まない目的物を容易に
得ることができる。また工業的に問題となる有機廃液の
量を大幅に減らせるといった利点も併せ持つ。
【００３５】
【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明する。
【００３６】実施例１ ジオキサン水溶液中でのシンナモイル化ヒアルロン酸の
製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム５００ｍ
ｇ（２糖単位として１．２５ミリモル）を２００ｍｌの
水に溶解した後、ジオキサン１００ｍｌを加えた。この
溶液にケイ皮酸無水物１．７ｇ（６．２５ミリモル）と
トリエチルアミン８６５μｌ（６．２５ミリモル）と４
−ジメチルアミノピリジン７６３ｍｇ（６．２５ミリモ
ル）の１０ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて３０分間で
滴下した後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶
液を１．７Ｌ（リットル）の酢酸ナトリウム飽和エタノ
ールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱
をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥
することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を
白色粉末として４１７ｍｇ得た。５００ＭＨｚのプロト
ンＮＭＲの測定の結果、ヒアルロン酸のアセチル基由来
のシグナル（δ＝２ｐｐｍ）とケイ皮酸ベンゼン環およ
び２重結合由来のシグナル（δ＝６．５−７．９ｐｐ
ｍ）の強度比（３：２．２）よりヒアルロン酸の２糖単
位あたりのシンナモイル基のＤＳは０．３７であった
（図１参照）。
製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム５００ｍ
ｇ（２糖単位として１．２５ミリモル）を２００ｍｌの
水に溶解した後、ジオキサン１００ｍｌを加えた。この
溶液にケイ皮酸無水物１．７ｇ（６．２５ミリモル）と
トリエチルアミン８６５μｌ（６．２５ミリモル）と４
−ジメチルアミノピリジン７６３ｍｇ（６．２５ミリモ
ル）の１０ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて３０分間で
滴下した後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶
液を１．７Ｌ（リットル）の酢酸ナトリウム飽和エタノ
ールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱
をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥
することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を
白色粉末として４１７ｍｇ得た。５００ＭＨｚのプロト
ンＮＭＲの測定の結果、ヒアルロン酸のアセチル基由来
のシグナル（δ＝２ｐｐｍ）とケイ皮酸ベンゼン環およ
び２重結合由来のシグナル（δ＝６．５−７．９ｐｐ
ｍ）の強度比（３：２．２）よりヒアルロン酸の２糖単
位あたりのシンナモイル基のＤＳは０．３７であった
（図１参照）。
【００３７】実施例２ 部分ケン化法によるシンナモイル化ヒアルロン酸の製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後、ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にケ
イ皮酸クロリド１４４μｌ（１．０ミリモル）とトリエ
チルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチ
ルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍ
ｌジオキサン溶液を氷冷下にて２５分間で滴下した後、
室温で３０分攪拌を続けた。生じた沈澱をガラスフィル
ター上に集め、エタノールにより十分に洗浄後乾燥し
た。得られた固体を微粉末とし２０ｍｌの水に懸濁させ
氷冷下０．０５規定水酸化ナトリウム溶液を２ｍｌ滴下
した。さらに氷冷下にて１時間４５分攪拌後得られた均
一な溶液を実施例１と同様のエタノール沈澱法にて精製
し、標記化合物を５５ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたシン
ナモイル基のＤＳは０．４６であった。
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後、ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にケ
イ皮酸クロリド１４４μｌ（１．０ミリモル）とトリエ
チルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチ
ルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍ
ｌジオキサン溶液を氷冷下にて２５分間で滴下した後、
室温で３０分攪拌を続けた。生じた沈澱をガラスフィル
ター上に集め、エタノールにより十分に洗浄後乾燥し
た。得られた固体を微粉末とし２０ｍｌの水に懸濁させ
氷冷下０．０５規定水酸化ナトリウム溶液を２ｍｌ滴下
した。さらに氷冷下にて１時間４５分攪拌後得られた均
一な溶液を実施例１と同様のエタノール沈澱法にて精製
し、標記化合物を５５ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたシン
ナモイル基のＤＳは０．４６であった。
【００３８】部分ケン化に供したシンナモイル化ヒアル
ロン酸の原料のヒアルロン酸と部分ケン化して得られた
シンナモイル化ヒアルロン酸の分子量変化をＧＰＣによ
り調べた結果を図２に示した。図２の（ａ）は、原料の
ヒアルロン酸、（ｂ）は、部分ケン化後のもので、図２
から該部分ケン化によりヒアルロン酸は加水分解されな
かったことを、ひいてはシンナモイル化においても低分
子化されなかったことを示している。
ロン酸の原料のヒアルロン酸と部分ケン化して得られた
シンナモイル化ヒアルロン酸の分子量変化をＧＰＣによ
り調べた結果を図２に示した。図２の（ａ）は、原料の
ヒアルロン酸、（ｂ）は、部分ケン化後のもので、図２
から該部分ケン化によりヒアルロン酸は加水分解されな
かったことを、ひいてはシンナモイル化においても低分
子化されなかったことを示している。
【００３９】尚、ＧＰＣ測定条件は次の通りである。 カラム温度：３５℃ カラム：東ソー ＴＳＫｇｅｌ−Ｇ６０００ＰＷＸＬ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ 検出波長：２１０ｎｍ サンプルインジェクション：３０μＬ 溶媒：０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液
【００４０】実施例３ ＤＭＦ水溶液中でのシンナモイル化ヒアルロン酸の製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後ＤＭＦ１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮酸
無水物２７８ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミ
ン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノ
ピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌＤＭＦ
溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後、室温で１時間
半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢酸ナト
リウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離し
た。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により
精製後、減圧乾燥することにより標記シンナモイル化ヒ
アルロン酸を白色粉末として４２ｍｇ得た。ＮＭＲより
求めたシンナモイル基のＤＳは０．４６であった。
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後ＤＭＦ１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮酸
無水物２７８ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミ
ン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノ
ピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌＤＭＦ
溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後、室温で１時間
半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢酸ナト
リウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離し
た。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により
精製後、減圧乾燥することにより標記シンナモイル化ヒ
アルロン酸を白色粉末として４２ｍｇ得た。ＮＭＲより
求めたシンナモイル基のＤＳは０．４６であった。
【００４１】実施例４ ピリジン水溶液中でのシンナモイル化ヒアルロン酸の製
造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後ピリジン１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮
酸無水物２７８ｍｇ（１．０ミリモル）と４−ジメチル
アミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌ
ピリジン溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後室温で
１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢
酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心
分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法
により精製後減圧乾燥することにより標記部分シンナモ
イル化ヒアルロン酸を白色粉末として６７ｍｇ得た。Ｎ
ＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．０９であっ
た。
造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後ピリジン１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮
酸無水物２７８ｍｇ（１．０ミリモル）と４−ジメチル
アミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌ
ピリジン溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後室温で
１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢
酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心
分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法
により精製後減圧乾燥することにより標記部分シンナモ
イル化ヒアルロン酸を白色粉末として６７ｍｇ得た。Ｎ
ＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．０９であっ
た。
【００４２】実施例５ 塩基としてジイソプロピルエチルアミンを用いたシンナ
モイル化ヒアルロン酸の製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）とトリエチルアミン
に代えてジイソプロピルエチルアミンを用いたほかは、
実施例３の方法に従ってシンナモイル化ヒアルロン酸を
合成した。精製後減圧乾燥することにより標記部分シン
ナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として７４ｍｇ得
た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．５４
であった。
モイル化ヒアルロン酸の製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）とトリエチルアミン
に代えてジイソプロピルエチルアミンを用いたほかは、
実施例３の方法に従ってシンナモイル化ヒアルロン酸を
合成した。精製後減圧乾燥することにより標記部分シン
ナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として７４ｍｇ得
た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．５４
であった。
【００４３】実施例６ ケイ皮酸クロリドによるシンナモイル化ヒアルロン酸の
製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ
皮酸クロリド１４４μｌ（１．０ミリモル）とトリエチ
ルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチル
アミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌ
ジオキサン溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後、室
温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌ
の酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を
遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈
澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分シ
ンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として９８ｍｇ得
た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．２５
であった。
製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ
皮酸クロリド１４４μｌ（１．０ミリモル）とトリエチ
ルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチル
アミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌ
ジオキサン溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後、室
温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌ
の酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を
遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈
澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分シ
ンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として９８ｍｇ得
た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．２５
であった。
【００４４】実施例７ アシル化触媒として４−ピロリジノピリジンを用いたシ
ンナモイル化ヒアルロン酸の製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した。この溶液にケイ皮酸無水物２７８ｍｇ（１．０
ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリ
モル）と４−ピロリジノピリジン１４８ｍｇ（１．０ミ
リモル）の２ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて１５分間
で滴下した後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた
溶液に２５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注
ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。
ンナモイル化ヒアルロン酸の製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した。この溶液にケイ皮酸無水物２７８ｍｇ（１．０
ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリ
モル）と４−ピロリジノピリジン１４８ｍｇ（１．０ミ
リモル）の２ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて１５分間
で滴下した後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた
溶液に２５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注
ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。
【００４５】得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱
法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分シン
ナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として５５ｍｇ得
た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．９５
であった。
法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分シン
ナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として５５ｍｇ得
た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．９５
であった。
【００４６】実施例８ シンナモイル化ヒアルロン酸（分子量１５万）の製造 平均分子量１５万のヒアルロン酸ナトリウム８００ｍｇ
（２糖単位として２．０ミリモル）を２００ｍｌの水に
溶解した後、ジオキサン１００ｍｌを加えた。この溶液
にケイ皮酸無水物２．７８ｇ（１０ミリモル）とトリエ
チルアミン１．３８ｍｌ（１０ミリモル）と４−ジメチ
ルアミノピリジン１．２２ｇ（１０ミリモル）の２５ｍ
ｌジオキサン溶液を氷冷下にて１時間で滴下した後、室
温で１時間攪拌を続けた。得られた溶液に７５０ｍｌの
酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠
心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱
法により精製後、水溶液とすることにより標記部分シン
ナモイル化ヒアルロン酸の２．７ｇ／ｌ水溶液として３
００ｍｌ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳ
は０．６０であった。
（２糖単位として２．０ミリモル）を２００ｍｌの水に
溶解した後、ジオキサン１００ｍｌを加えた。この溶液
にケイ皮酸無水物２．７８ｇ（１０ミリモル）とトリエ
チルアミン１．３８ｍｌ（１０ミリモル）と４−ジメチ
ルアミノピリジン１．２２ｇ（１０ミリモル）の２５ｍ
ｌジオキサン溶液を氷冷下にて１時間で滴下した後、室
温で１時間攪拌を続けた。得られた溶液に７５０ｍｌの
酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠
心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱
法により精製後、水溶液とすることにより標記部分シン
ナモイル化ヒアルロン酸の２．７ｇ／ｌ水溶液として３
００ｍｌ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳ
は０．６０であった。
【００４７】実施例９ 有機溶媒を実質的に含まない水溶液中でのシンナモイル
化ヒアルロン酸の製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した。この溶液にトリエチルアミン１３９μｌ（１．
０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ
（１．０ミリモル）を氷冷下にて加え均一に攪拌した
後、ケイ皮酸クロリド１４４μｌを加え室温で１時間半
攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢酸ナトリ
ウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離し
た。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により
精製後、減圧乾燥することにより標記部分シンナモイル
化ヒアルロン酸を白色粉末として５８ｍｇ得た。ＮＭＲ
より求めたシンナモイル基のＤＳは０．２２であった。
化ヒアルロン酸の製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した。この溶液にトリエチルアミン１３９μｌ（１．
０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ
（１．０ミリモル）を氷冷下にて加え均一に攪拌した
後、ケイ皮酸クロリド１４４μｌを加え室温で１時間半
攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢酸ナトリ
ウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離し
た。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により
精製後、減圧乾燥することにより標記部分シンナモイル
化ヒアルロン酸を白色粉末として５８ｍｇ得た。ＮＭＲ
より求めたシンナモイル基のＤＳは０．２２であった。
【００４８】実施例１０ ｔ−ブトキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸の製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後、ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にカ
ルボキシル基をジメチルホスフィノチオイル基で混合酸
無水物として活性化したｔ−ブトキシカルボニルグリシ
ン１７５ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１
３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリ
ジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）のジメチルホルムア
ミド溶液３ｍｌを氷冷下にて加えた後、室温で１時間半
攪拌を続けた。得られた溶液に１５０ｍｌの酢酸ナトリ
ウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離し
た。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により
精製後、減圧乾燥することにより標記部分ｔ−ブトキシ
カルボニルグリシル化ヒアルロン酸を白色粉末として７
５ｍｇ得た。ＮＭＲのヒアルロン酸アセチル基由来のシ
グナルと（δ＝２ｐｐｍ）と第３ブチル基由来のシグナ
ル（δ＝１．５ｐｐｍ）の強度比より求めたｔ−ブトキ
シカルボニルグリシンのＤＳは０．１１であった。
（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶
解した後、ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にカ
ルボキシル基をジメチルホスフィノチオイル基で混合酸
無水物として活性化したｔ−ブトキシカルボニルグリシ
ン１７５ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１
３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリ
ジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）のジメチルホルムア
ミド溶液３ｍｌを氷冷下にて加えた後、室温で１時間半
攪拌を続けた。得られた溶液に１５０ｍｌの酢酸ナトリ
ウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離し
た。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により
精製後、減圧乾燥することにより標記部分ｔ−ブトキシ
カルボニルグリシル化ヒアルロン酸を白色粉末として７
５ｍｇ得た。ＮＭＲのヒアルロン酸アセチル基由来のシ
グナルと（δ＝２ｐｐｍ）と第３ブチル基由来のシグナ
ル（δ＝１．５ｐｐｍ）の強度比より求めたｔ−ブトキ
シカルボニルグリシンのＤＳは０．１１であった。
【００４９】実施例１１ ベンジルオキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸の製
造 ｔ−ブトキシカルボニルグリシンに代えてベンジルオキ
シカルボニルグリシン（Ｚグリシンとも記す）２０９ｍ
ｇ（１．０ミリモル）を用い実施例１０と同様の方法に
従った。
造 ｔ−ブトキシカルボニルグリシンに代えてベンジルオキ
シカルボニルグリシン（Ｚグリシンとも記す）２０９ｍ
ｇ（１．０ミリモル）を用い実施例１０と同様の方法に
従った。
【００５０】精製後、減圧乾燥することにより標記部分
ベンジルオキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸を白
色粉末として７４ｍｇ得た。ＮＭＲのヒアルロン酸アセ
チル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とベンジルオ
キシカルボニルグリシンのベンジル基由来のシグナル
（δ＝７．５ｐｐｍ）の強度比より求めたベンジルオキ
シカルボニルグリシンのＤＳは０．１１であった。
ベンジルオキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸を白
色粉末として７４ｍｇ得た。ＮＭＲのヒアルロン酸アセ
チル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とベンジルオ
キシカルボニルグリシンのベンジル基由来のシグナル
（δ＝７．５ｐｐｍ）の強度比より求めたベンジルオキ
シカルボニルグリシンのＤＳは０．１１であった。
【００５１】実施例１２ グリシル化ヒアルロン酸の製造（ベンジルオキシカルボ
ニルグリシル化ヒアルロン酸の脱Ｚ化） 実施例１１で合成したＺグリシル化ヒアルロン酸６０ｍ
ｇ（０．１５ｍｍｏｌ／ｕｎｉｔ）を水５０ｍｌに溶解
し、アルゴン雰囲気下で１０％パラジウム（Ｐｄ）活性
炭１５ｍｇ、蟻酸アンモニウム１９ｍｇ（０．３ｍｍｏ
ｌ）加え、室温で６時間攪拌した後、再び同量のＰｄ活
性炭、蟻酸アンモニウムを加え攪拌した。６時間後、再
度同様の操作をした後、０．２２μｍのフィルターで活
性炭を消去し、溶液を２日間透析した後、凍結乾燥によ
り５１ｍｇの白色物を得た。ＮＭＲによりベンジル基由
来のピーク（δ＝７．５ｐｐｍ）の消失を確認した。
ニルグリシル化ヒアルロン酸の脱Ｚ化） 実施例１１で合成したＺグリシル化ヒアルロン酸６０ｍ
ｇ（０．１５ｍｍｏｌ／ｕｎｉｔ）を水５０ｍｌに溶解
し、アルゴン雰囲気下で１０％パラジウム（Ｐｄ）活性
炭１５ｍｇ、蟻酸アンモニウム１９ｍｇ（０．３ｍｍｏ
ｌ）加え、室温で６時間攪拌した後、再び同量のＰｄ活
性炭、蟻酸アンモニウムを加え攪拌した。６時間後、再
度同様の操作をした後、０．２２μｍのフィルターで活
性炭を消去し、溶液を２日間透析した後、凍結乾燥によ
り５１ｍｇの白色物を得た。ＮＭＲによりベンジル基由
来のピーク（δ＝７．５ｐｐｍ）の消失を確認した。
【００５２】実施例１３ ｔ−ブトキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸（分子
量１５万）の製造 平均分子量１５万のヒアルロン酸ナ
トリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を
２０ｍｌの水に溶解した後、ジオキサン１０ｍｌを加え
た。この溶液にｔ−ブトキシカルボニルグリシンのカル
ボキシル基をジメチルホスフィノチオイル基で混合酸無
水物として活性化したｔ−ブトキシカルボニルグリシン
１７５ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３
９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジ
ン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）のジメチルホルムアミ
ド溶液を氷冷下にて加えた後、室温で１時間半攪拌を続
けた。得られた溶液に１５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和
エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られ
た沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減
圧乾燥することにより標記ｔ−ブトキシカルボニルグリ
シル化ヒアルロン酸を白色粉末として５５ｍｇ得た。Ｎ
ＭＲより求めたｔ−ブトキシカルボニルグリシンのＤＳ
は０．０５であった。
量１５万）の製造 平均分子量１５万のヒアルロン酸ナ
トリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を
２０ｍｌの水に溶解した後、ジオキサン１０ｍｌを加え
た。この溶液にｔ−ブトキシカルボニルグリシンのカル
ボキシル基をジメチルホスフィノチオイル基で混合酸無
水物として活性化したｔ−ブトキシカルボニルグリシン
１７５ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３
９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジ
ン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）のジメチルホルムアミ
ド溶液を氷冷下にて加えた後、室温で１時間半攪拌を続
けた。得られた溶液に１５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和
エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られ
た沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減
圧乾燥することにより標記ｔ−ブトキシカルボニルグリ
シル化ヒアルロン酸を白色粉末として５５ｍｇ得た。Ｎ
ＭＲより求めたｔ−ブトキシカルボニルグリシンのＤＳ
は０．０５であった。
【００５３】実施例１４ 事実上エンドトキシンフリー
の水酸基の一部がシンナモイル化されたヒアルロン酸の
製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム５ｇ（２
糖単位として１２．５ミリモル）を乾熱滅菌した３Ｌの
三角フラスコに入れ、２Ｌの注射用水（エンドトキシン
フリー）に溶解した後、ジオキサン５００ｍｌを加え
た。この溶液にケイ皮酸無水物１７．４ｇ（６２．５ミ
リモル）とトリエチルアミン８．６５ｍｌ（６２．５ミ
リモル）と４−ジメチルアミノピリジン７．６３ｇ（６
２．５ミリモル）の２５０ｍｌジオキサン溶液を氷冷下
にて３０分間で滴下した後、室温で１時間攪拌を続け
た。得られた溶液を１１Ｌの酢酸ナトリウム飽和エタノ
ールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱
をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥
することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を
白色粉末として４．６３ｇ得た。５００ＭＨｚのプロト
ンＮＭＲの測定の結果、ヒアルロン酸のアセチル基由来
のシグナル（δ＝２ｐｐｍ）とケイ皮酸のベンゼン環お
よび２重結合由来のシグナル（δ＝６．５−７．９ｐｐ
ｍ）の強度比よりシンナモイル基のＤＳは０．３５であ
った。リムルステスト（トキシカラー、生化学工業
（株）製により測定）により求めたエンドトキシン含量
はシンナモイル化ヒアルロン酸１ｍｇ当たり２６．０ｐ
ｇであった。
の水酸基の一部がシンナモイル化されたヒアルロン酸の
製造 平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム５ｇ（２
糖単位として１２．５ミリモル）を乾熱滅菌した３Ｌの
三角フラスコに入れ、２Ｌの注射用水（エンドトキシン
フリー）に溶解した後、ジオキサン５００ｍｌを加え
た。この溶液にケイ皮酸無水物１７．４ｇ（６２．５ミ
リモル）とトリエチルアミン８．６５ｍｌ（６２．５ミ
リモル）と４−ジメチルアミノピリジン７．６３ｇ（６
２．５ミリモル）の２５０ｍｌジオキサン溶液を氷冷下
にて３０分間で滴下した後、室温で１時間攪拌を続け
た。得られた溶液を１１Ｌの酢酸ナトリウム飽和エタノ
ールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱
をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥
することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を
白色粉末として４．６３ｇ得た。５００ＭＨｚのプロト
ンＮＭＲの測定の結果、ヒアルロン酸のアセチル基由来
のシグナル（δ＝２ｐｐｍ）とケイ皮酸のベンゼン環お
よび２重結合由来のシグナル（δ＝６．５−７．９ｐｐ
ｍ）の強度比よりシンナモイル基のＤＳは０．３５であ
った。リムルステスト（トキシカラー、生化学工業
（株）製により測定）により求めたエンドトキシン含量
はシンナモイル化ヒアルロン酸１ｍｇ当たり２６．０ｐ
ｇであった。
【００５４】
【発明の効果】以上説明したように、本発明では生体適
合性、生体内分解性をもちＤＤＳや光架橋性医療材料の
素材として有用なアシル化ヒアルロン酸を分子量の低下
を伴う事なく、環境に悪影響を与えない水を溶媒とし
て、簡便な操作で、しかもエンドトキシンフリーの状態
で提供することができる。
合性、生体内分解性をもちＤＤＳや光架橋性医療材料の
素材として有用なアシル化ヒアルロン酸を分子量の低下
を伴う事なく、環境に悪影響を与えない水を溶媒とし
て、簡便な操作で、しかもエンドトキシンフリーの状態
で提供することができる。
【図１】実施例１におけるシンナモイル化ヒアルロン酸
（ＤＳ＝０．３７）の５００ＭＨｚプロトンＮＭＲスペ
クトルを示す。
（ＤＳ＝０．３７）の５００ＭＨｚプロトンＮＭＲスペ
クトルを示す。
【図２】実施例２において、ケン化処理後のシンナモイ
ル化ヒアルロン酸と原料ヒアルロン酸のＧＰＣ（ゲル濾
過法）による比較を示したクロマトグラムである。
ル化ヒアルロン酸と原料ヒアルロン酸のＧＰＣ（ゲル濾
過法）による比較を示したクロマトグラムである。
Claims (14)
- 【請求項１】 ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水
単独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシ
ル化触媒存在下、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲ
ン化物と反応させ、アシル化することを特徴とするアシ
ル化ヒアルロン酸の製造法。 - 【請求項２】 反応温度が約０〜５０℃であることを特
徴とする請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造
法。 - 【請求項３】 アシル化触媒が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルア
ミノピリジン系触媒である請求項１記載のアシル化ヒア
ルロン酸の製造法。 - 【請求項４】 アシル化触媒が４−ジメチルアミノピリ
ジンまたは４−ピロリジノピリジンであることを特徴と
する請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 - 【請求項５】 ヒアルロン酸またはその塩の平均分子量
が約１０万〜５００万であることを特徴とする請求項１
記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 - 【請求項６】 カルボン酸がアミノ酸、ペプチドもしく
はそれらの誘導体、ケイ皮酸もしくはそのフェニル基に
置換基を有する誘導体、オロチン酸、ウラシル−５−カ
ルボン酸、１−（カルボキシアルキル）チミン、サリチ
ル酸またはアセチルサリチル酸であることを特徴とする
請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 - 【請求項７】 アミノ酸またはペプチドの誘導体が、ア
ミノ保護基を有したものであることを特徴とする請求項
６記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 - 【請求項８】 アシル化反応後、請求項７記載のアミノ
保護基を脱離することを特徴とするアシル化ヒアルロン
酸の製造法。 - 【請求項９】 アシル化反応が酸の中和剤存在下で行わ
れ、酸の中和剤として、３級アミンまたは無機塩基が用
いられることを特徴とする請求項１記載のアシル化ヒア
ルロン酸の製造法。 - 【請求項１０】 前記水溶液が、水混和性有機溶媒を約
０〜５０％の範囲で含むことを特徴とする請求項１記載
のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 - 【請求項１１】 ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を
水単独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、ア
シル化触媒存在下、カルボン酸の酸無水物または酸ハロ
ゲン化物と反応させた後、得られたアシル化ヒアルロン
酸のアシル基を部分ケン化することにより任意の数のア
シル基が導入されたアシル化ヒアルロン酸を得ることを
特徴とするアシル化ヒアルロン酸の製造法。 - 【請求項１２】 部分ケン化して得られるアシル化ヒア
ルロン酸のアシル基の導入数がヒアルロン酸構成二糖単
位当たり約０．００５〜０．５であることを特徴とする
請求項１１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。 - 【請求項１３】 水混和性有機溶媒水溶液に分子量約１
０万〜５００万のヒアルロン酸ナトリウムを溶解させた
溶液に、０℃以上、室温以下の範囲の温度において、無
水ケイ皮酸もしくはケイ皮酸クロリドと４−ジメチルア
ミノピリジンもしくは４−ピロリジノピリジンと酸の中
和剤とを含む水混和性有機溶媒溶液を添加し、上記温度
範囲において反応させ、分子量が約１０万〜５００万で
あり、水酸基がケイ皮酸でエステル化されたヒアルロン
酸を得ることを特徴とするシンナモイル化ヒアルロン酸
の製造法。 - 【請求項１４】 水混和性有機溶媒が、ジオキサン、ジ
メチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトア
ミドまたはピリジンであり、酸の中和剤がトリエチルア
ミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メ
チルモルホリンまたは炭酸水素ナトリウムであることを
特徴とする請求項１３記載のシンナモイル化ヒアルロン
酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12473894A JP3563440B2 (ja) | 1994-05-16 | 1994-05-16 | アシル化ヒアルロン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12473894A JP3563440B2 (ja) | 1994-05-16 | 1994-05-16 | アシル化ヒアルロン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07309902A true JPH07309902A (ja) | 1995-11-28 |
| JP3563440B2 JP3563440B2 (ja) | 2004-09-08 |
Family
ID=14892898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12473894A Expired - Lifetime JP3563440B2 (ja) | 1994-05-16 | 1994-05-16 | アシル化ヒアルロン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3563440B2 (ja) |
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| JP2010106068A (ja) * | 2008-10-28 | 2010-05-13 | Mie Prefecture | 多糖類の新規化学修飾法 |
| WO2010051783A1 (en) | 2008-11-06 | 2010-05-14 | Cpn S.R.O. | Method of preparation of dtpa crosslinked hyaluronic acid derivatives and modification of said derivatives |
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- 1994-05-16 JP JP12473894A patent/JP3563440B2/ja not_active Expired - Lifetime
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