CN107106694B - 在水中用于制备透明质酸钠盐的丁酸酯类的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备药物或化妆品用途或作为医疗装置的可接受的透明质酸丁酸酯或其盐的方法，其包含与钠或另一种碱金属成盐的透明质酸与丁酰基‑咪唑交酯在碳酸钠存在下在水溶液中反应。本发明还涉及包含由所述方法生产的透明质酸钠盐(HA)丁酸酯类的药物制剂、化妆品制剂或医疗装置。

Description

在水中用于制备透明质酸钠盐的丁酸酯类的方法
本发明涉及制备透明质酸钠盐(HA)的丁酸酯的方法以及包含由所述方法生产的透明质酸钠盐(HA)的丁酸酯的药物制剂、化妆品制剂或医疗装置。
本发明描述了通过在水性环境中合成来制备透明质酸钠盐(HA)的丁酸酯的方法，其令人惊奇地在丁酸酯中产生高度取代度(DS)并保留抵抗分子降解的天然透明质酸的多糖链。通过所述方法制备的透明质酸的丁酸酯不含在化妆品领域不耐受和/或禁止的杂质，具有抗炎和抗刺激特性，且由此可以有利地用于药物和皮肤美容领域和医疗装置中。
本领域的状态
已知透明质酸丁酸酯(HABut)(其中透明质酸的羟基被具有不同取代度的丁酸残基酯化)作为皮肤弹性增进剂和增湿剂具有抗炎、抗增殖和皮肤保护特性。
透明质酸及其盐通过多糖链的糖苷键的水解而高度倾向于分子量降解。从文献中已知，所述水解显著地受到pH、离子强度和温度条件的影响。
因此，HA的衍生条件对于保持多糖链的长度至关重要。理想的条件是使反应介质中水的存在最小化并且牵涉不是很高的温度和pH接近中性即介于5到8之间的条件的那些。
EP 0941253描述了在碱性活化剂例如吡啶和N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)的存在下，在无质子有机溶剂例如N，N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜(DMF，DMSO)中用丁酸酐制备具有低取代度(max DS＝0.25)的透明质酸的丁酸酯。在有机溶剂中溶解的方法牵涉透明质酸可力丁鎓盐的制备，其通过用2N HCI酸化多糖水溶液并用旋转蒸发器蒸发溶剂而制备多糖的酸形式而获得，这是一种导致HA的分子量降解的方法。
WO 2005/092929描述了具有低取代度(DS≤0.1)的透明质酸丁酸酯的制备。在均匀条件下的合成牵涉通过使用强阳离子-交换树脂(Amberlite IR-120-plus)使其通过离子-交换柱来制备可溶于无质子有机溶剂的透明质酸四丁基铵(TBA)盐，所述通道导致分子量降解。
WO2009/068215描述了透明质酸的混合丁酸-甲酸酯的制备及其在皮肤化妆品中的用途以及皮肤保护和抗炎活性。混合的酯类使用丁酸酐在甲酰胺(FA)中与碱性DMAP活化剂一起制备。
所述方法使用无质子和质子有机溶剂，例如N，N二甲基甲酰胺、甲酰胺或二甲亚砜，这些有机溶剂列在根据Regulation(EC)no.1223/2009的化妆品制剂禁忌物质中。也可以使用有机碱，例如N，N二甲氨基吡啶，其具有高毒性特征(数十个ppm的LD50)。溶剂、试剂和活化剂的残留物在纯化过程中不能被定量消除。
EP0416250中报道了在水中用于透明质酸衍生化的反应，该文献报道了由于与碳二亚胺或双-碳二亚胺的反应而在透明质酸的羧基上形成N-酰基脲和O-异酰基脲。该反应发生在水中、在不降解多糖的受控pH下进行。
US5874417描述了在适度条件下用在水中的酰肼使透明质酸的羧基官能化。
A.Mero等人(Polymer 2014，6，346-369)报道HA可以在水中被衍生。然而，在水相中，需要在涉及HA链的明显降解的酸性或碱性条件下进行许多反应。该论文报道了在水中与碳二亚胺的反应，导致在羧基上形成酰胺键。
本发明的方法还产生具有高取代度的HABut，仅使用水作为溶剂和碳酸钠作为碱性活化剂。得到的产物不存在会引起特定安全问题的任何溶剂或碱性活化剂残留物。
本发明的描述
本发明涉及制备用于药物或化妆品用途或作为医疗装置可接受的透明质酸丁酸酯或其盐的方法，包含使透明质酸，优选与钠或另一种碱金属成盐的透明质酸在水溶液中在碳酸钠的存在下与丁酰基-咪唑交酯(imidazolide)反应。
本发明的方法优选用于制备透明质酸丁酸酯钠盐。
该方法中使用的透明质酸钠盐优选具有在103-106道尔顿之间的重均分子量(MW)。
将透明质酸盐溶于去矿质水，向所得溶液中加入碳酸钠，然后加入丁酰基-咪唑交酯。
将该反应混合物维持在20℃至30℃的温度下不少于60分钟。
反应的pH范围介于pH 11-9之间。
当反应完成时，将该混合物调节至中性pH，并通过在适合的溶剂中沉淀回收产物。然后将如此获得的产物纯化，例如通过用适合的溶剂连续洗涤并过滤。
本发明的方法产生具有不同取代度的透明质酸丁酸酯。定义为每个透明质酸的GlcNAc-GlcUA二糖单位中的丁酸残基数之比的取代度(DS)可以在例如0.01-2.5之间。
通过改变透明质酸和丁酰基-咪唑交酯之比可以获得不同的取代度。
通过本发明方法获得的透明质酸丁酸酯不含溶剂残留物或毒性试剂，并且可用于药物制剂、化妆品制剂和医疗装置。
因此，本发明的主题包括包含透明质酸丁酸酯或其盐以及至少一种药物或化妆品用途可接受的赋形剂和/或载体的药物和化妆品制剂，所述透明质酸丁酸酯或其盐为药物或化妆品用途可接受的，其通过上述报道的方法得到。
通过报道的方法获得的透明质酸丁酸酯由于不存在管理化妆品成分的立法禁止的溶剂和试剂而被报道而可以用于皮肤美容领域的局部应用，在高安全性的制剂中具有水化、弹性、调色、抗衰老或抗-痤疮的活性，其适合于例如低变应原产品或敏感性皮肤。
如体外对中性白细胞模型(多形核白细胞或PMN)所验证的，该分子还具有比透明质酸(HA)和丁酸钠(NaBut)更显著的抗刺激和抗炎活性，从而影响急性炎症应答。作为所述特征的结果，通过所述方法生产的透明质酸丁酸酯可用作药物制剂、化妆品制剂或医疗装置中的活性成分，作为用于治疗皮肤损伤例如由过热引起的炎症、溃疡和损伤的皮肤损伤的佐剂，所述过热通过例如紫外线、X射线和γ射线的辐射诱导。
实施例
所用的仪器：
●安装有具有用于测定取代度(DS)的z梯度的5mm多核反向探针的Bruker Avance400MHz光谱仪；
●安装有用于测定分子量分布和重均分子量(MW)的三重检测器(90℃和7℃的光散射，折射率和粘度计)。
取代度(DS)的测定
通过NMR光谱法定量透明质酸衍生物上丁酸酯的取代度。用安装有具有z梯度的5mm多核反向探针的Bruker Avance 400MHz光谱仪在D2O中得到1H NMR光谱。通过将测量探头恒温至300°K进行测试。
该测试包括扩散有序光谱(DOSY)分析，其验证聚合物和丁酸之间共价键的存在。
丁酸酯中DS的定量直接在NMR管中用NaOD彻底水解后进行。
水解物的1H NMR光谱允许整合可以归因于丁酸的信号(连位甲基和亚甲基质子)和可归因于透明质酸的信号(糖质子，不包括两个端基异头质子)；它们的比例决定了取代度。
方法
通过HP-SEC-TDA色谱法测定分子量和重均分子量(MW)分布
使用3个检测器(在90°和7°的光散射，折射率和粘度计)的组合对样品进行尺寸排阻色谱。色谱图的处理使分子量Mw(重均分子量)的分布得到确定。
色谱条件
仪器Viscotek 270max。
柱：A7000，A6000mx2，温度35℃。
流动相：PBS。
流速：0.750ml/min。
检测器：安装有折射计、毛细管粘度计和在90°和7°、温度35℃下的测量值的光散射的Viscotek TDA。
注射体积：100μl。
超氧阴离子产生评价
在包被纤维蛋白原(FBG)、胶原蛋白IV(CIV)、HA或HABut IV的微量滴定板孔中的中性白细胞活化后，以释放到培养基中的超氧阴离子(O2 -)的量来评价作为PMNs代谢活化指示剂的ROS的产生。使用分光光度法测定在板上温育期间被细胞产生的超氧阴离子减少的细胞色素c的量。
对生物表面的粘附的评价
通过测定PMNs的嗜苯胺蓝颗粒中包含的标记酶髓过氧化物酶(MPO)来评价代谢测定期间细胞对表面的粘附。使用Menegazzi等人(A new，one-step assay on whole cellsuspensions for peroxidase secretion by human neutrophils andeosinophils.Menegazzi R，Zabucchi G，Knowles A，Cramer R，Patriarca P.J Leukoc Biol.1992Dec；52(6)：619-24)所述的方案。通过定量比色酶试验测定髓过氧化物酶活性，所述定量比色酶试验测定在H2O2的存在下通过MPO酶对3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物的氧化。
实施例1：透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.3(BUT12103)
将100ml软化水导入1升反应器中，然后加入10.0g MW为280kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-1.6g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(2.6g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过在丙酮中沉淀分离产物，随后滗析。
通过在丙酮中连续洗涤来纯化该溶液，并通过负压过滤回收。
最后将产物悬浮在丙酮中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温下干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少16小时。
将10mg样品溶于0.7ml重水(D2O)并转入NMR试管。
将NMR光谱报道在图1中；通过应用仅保留归属于共价键合到聚合物上的化学基团的信号的DOSY序列获得下部光谱(a)。
另外2个1H NMR光谱分别在通过加入氘代氢氧化钠(NaOD)水解丁酸酯之前(b)和之后(c)得到。通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.30。
实施例2：分子量和重均分子量(MW)分布的测定
通过HP-SEC-TDA色谱法分析用于合成实施例1中所述的用280kDa的MW验证的丁酸酯的透明质酸钠盐样品。实验分子量的分布得到了300kDa的重均分子量(MW)。
通过HP-SEC-TDA色谱法分析如实施例1所述生产的透明质酸钠盐丁酸酯样品。实验分子量的分布得到360kDa的重均分子量(MW)。
实施例3：透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.3(BUT14014)
将1l软化水倾入15l反应器中，然后加入100.0g MW为290kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-15.9g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(25.9g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时；然后通过添加由盐酸(HCl)和氯化钠(NaCl)组成的水溶液使反应停止。
将溶液搅拌至少30分钟，然后通过在异丙醇中沉淀回收产物。
当沉淀完成时，将该溶液保持搅拌至少16小时；将该混合物转移并通过过滤分离产物。
然后将产物通过在异丙醇中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
最终，将产物悬浮在异丙醇中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温下干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少16小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.30。
实施例4：透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.3(HBint05012014)
将2.5l软化水导入15l反应器中，然后加入250.0g MW为290kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-39.8g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(64.8g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时；然后通过添加由HCl和NaCl组成的水溶液使反应停止。
将溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在丙酮中沉淀回收产物。
当沉淀完成时，将该溶液保持搅拌至少30分钟。然后通过滗析分离产物。
然后将产物通过在丙酮中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
最终，将产物悬浮在丙酮中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少24小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.30。
实施例5：透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.58(BUT14017)
将100ml软化水导入1升反应器中，然后加入10.0g MW为290kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-2.6g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(9.2g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过添加由HCl和NaCl组成的水溶液使反应停止。
将溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在异丙醇中沉淀回收产物。然后通过滗析分离产物。
然后将产物通过在异丙醇中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
最终，将产物悬浮在异丙醇中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温下干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少24小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.58。
实施例6：透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.85(BUT14019)
将100ml软化水导入1升反应器中，然后加入10.0g MW为290kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-5.3g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(9.2g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过添加由HCl和NaCl组成的水溶液使反应停止。
将溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在异丙醇中沉淀回收产物。然后通过滗析分离产物。
然后将产物通过在异丙醇中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
最终，将产物悬浮在异丙醇中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温下干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少24小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.85。
实施例7：透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝1.30(HBint04042014-BUT14023)
将100ml软化水导入1升反应器中，然后加入10.0g MW为290kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-13.2g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(23.1g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过添加HCl水溶液使反应停止。
将溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在异丙醇中沉淀回收产物。然后通过滗析分离产物。
然后将产物通过在异丙醇中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
最终，将产物悬浮在异丙醇中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温在空气流中干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少24小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为1.30。
实施例8：高分子量透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.24(HBint01042014-BUT14025)
将1l软化水倾入5l反应器中，然后加入50.0g MW为1270kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-10.6g)，然后在搅拌90分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(25.9g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过添加由HCl和NaCl组成的360ml水溶液使反应停止。
将该溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在丙酮中沉淀回收产物。当沉淀完成时，将该溶液保持搅拌至少16小时。然后通过滗析分离产物。
然后将产物通过在丙酮中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
最终，将产物悬浮在丙酮中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少24小时。
将3mg固体溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
10mg固体溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.24。
实施例9：高分子量透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.51(HBint03042014-BUT14032)
将0.72l软化水导入5l反应器中，然后加入30.0g MW为1270kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-23.8g)，然后在搅拌60分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(60.9g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过添加HCl水溶液使反应停止。
将该溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在丙酮中沉淀回收产物。当沉淀完成时，将该溶液保持搅拌至少16小时。然后通过滗析分离产物。
然后将产物通过在丙酮中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
最终，将产物悬浮在丙酮中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温下干燥至少30h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少24小时。
将3mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.51。
实施例10：高分子量透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.97(HBint02042014-BUT14031)
将0.85l软化水导入5升反应器中，然后加入30.0g MW为1270kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-47.6g)，然后在搅拌60分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(138.3g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过添加HCl水溶液使反应停止。
将该溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在丙酮中沉淀回收产物。当沉淀完成时，将该溶液保持搅拌至少16小时，然后通过过滤分离产物。
然后将产物通过在丙酮中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
最终，将产物悬浮在丙酮中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少24小时。
将3mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.97。
实施例11：低分子量透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.46(BUT14037)
将35ml软化水导入0.51烧瓶中，然后加入5.0g MW为45kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-0.8g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(1.3g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过添加HCl和NaCl的水溶液使反应停止。
将该溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在异丙醇中沉淀回收产物。当沉淀完成时，将该溶液保持搅拌至少16小时；将该混合物转移并且通过过滤分离产物。
然后将产物通过在异丙醇中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
最终，将产物悬浮在异丙醇中，保持搅拌至少30分钟，然后分离，通过过滤除去溶剂。
将沉淀物在室温下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少16小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.46。
实施例12：低分子量透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝1.68(BUT14039)
将12.5ml软化水导入0.25l烧瓶中，然后加入5.0g MW为45kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-6.6g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(11.9g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过添加HCl的水溶液使反应停止。
将该溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在异丙醇中沉淀回收产物。当沉淀完成时，将该溶液保持搅拌至少16小时。然后通过滗析分离产物。
然后将产物通过在异丙醇中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
将沉淀物在室温下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少16小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为1.68。
实施例13：低分子量透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝1.90(BUT14042)
将25.0ml软化水导入0.5l烧瓶中，然后加入10.0g MW为45kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-13.2g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(68.2g)。将该溶液在25℃下保持搅拌2小时，然后通过添加HCl的水溶液使反应停止。
将该溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在异丙醇中沉淀回收产物。当沉淀完成时，将该溶液保持搅拌至少16小时。然后通过滗析分离产物。
然后将产物通过在异丙醇中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
将沉淀物在室温下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少16小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为1.90。
实施例14：低分子量透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.06(BUT14043)
将50.0ml软化水导入0.5l烧瓶中，然后加入10.0g MW为45kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-0.2g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(0.3g)。将该溶液在25℃下保持搅拌2小时，然后通过添加HCl的水溶液使反应停止。
将该溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在异丙醇中沉淀回收产物。当沉淀完成时，通过负压过滤分离产物；然后将产物通过在异丙醇中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
将沉淀物在室温下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少7小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.06。
实施例15：低分子量透明质酸钠盐丁酸酯的合成，DS＝0.02(BUT14044)
将50.0ml软化水导入0.5l烧瓶中，然后加入10.0g MW为45kDa的透明质酸钠。将该混合物在25℃下恒温并维持在恒定温度下搅拌至完全溶解。
然后加入碳酸钠(Na2CO3-0.1g)，然后在搅拌30分钟后加入丁酰基-咪唑交酯(0.1g)。将该溶液在25℃下保持搅拌1小时，然后通过添加HCl和NaCl的水溶液使反应停止。
将该溶液保持搅拌至少30分钟，然后通过在异丙醇中沉淀回收产物。当沉淀完成时，将该溶液保持搅拌至少16小时；然后将该混合物转移，并且通过过滤分离产物。
然后将产物通过在异丙醇中连续洗涤来纯化，此后通过过滤回收产物。
将沉淀物在室温下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的温度下干燥至少16小时。
将10mg样品溶于0.7ml D2O并转入NMR试管。
将10mg样品溶于0.7ml NaOD并转入NMR试管。
通过积分1H NMR光谱的信号，确定DS为0.02。
实施例16：被TNF活化的PMNs的超氧阴离子的产生。
在用如下包被的孔中用促炎细胞因子TNF刺激45min的PMNs的超氧阴离子的产生：FBG(纤维蛋白原；允许PMN粘附的表面)；CIV(IV型胶原蛋白-非允许表面)；HA：透明质酸；HABut：透明质酸钠丁酸酯DS＝0.3实施例4。
将被各种底物包被的孔中填充0.18mM细胞色素c溶液和0.15ng/ml TNF在Hepes缓冲液中的溶液。将由此制备的模块在加湿的温育箱中在37℃下加热10min；向每个孔中加入在Hepes缓冲液中1.5x106PMN/ml的细胞悬浮液。以15分钟的间隔将板从温育箱中取出，并在微孔板读数器中在550nm和540nm的波长处进行分光光度分析，其分别相当于还原的细胞色素c的吸收峰和还原和氧化的细胞色素c的吸收光谱的等吸收点。在两个波长处记录的吸光度值之差与减少的细胞色素c的量成正比。由106个细胞产生的O2 -的量计算如下：
nmoles O2 -/106PMN＝OD x 106/0.0037x n
其中n为加入到每个孔中的细胞数量。
图2中报告的柱状图显示，与在HA表面温育的那些相比，响应于在包被有HABut(具有取代度为0.3)的表面上温育的PMNs的TNF的超氧化物阴离子的产生显著减少(p＜0.001，通过斯氏“t”检验计算，n＝4)。
实施例17：PMN粘附生物表面的试验。
PMN粘附到包被有FBG(表面允许PMN粘附)；CIV(非许可表面)；HA：透明质酸；HABut：透明质酸钠丁酸酯DS＝0.3实施例4的表面。静止：PMN未被TNF活化。TNF：被TNF活化的PMN；PMA：被佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯活化的PMN。
在取得用于测量O2 -生产的分光光度读数后，将微孔板的孔用PBS填充，并以200rpm离心5分钟以除去不附着于表面的细胞。通过测定在H2O2存在下MPO酶对3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物的氧化来测定髓过氧化物酶活性。向每个孔中加入包含TMB、十六烷基三甲基铵(CTAB)和3-氨基-1，2，4-三唑(AMT)的乙酸盐缓冲液，并将板搅拌5min以促进细胞裂解并促进MPO从颗粒中释放。用ATM抑制来自可能污染PMN制备物的嗜酸细胞的嗜酸细胞过氧化物酶活性。在加入H2O2后2分钟，用H2SO4使反应停止，并且在405nm的波长处测定每个孔的吸光度。参考在每次实验中基于已知量的细胞计算的过氧化物酶活性值构建的标准曲线计算粘附细胞的百分比。
图3中报告的柱状图显示，与粘附至包被有HA的PMNs数量相比，粘附在包被有HABut(具有取代度为0.3)的表面上的活化和非活化PMNs的数量显著减少(p＝0.001，用斯氏“t”检验计算，n＝4)。
实施例18：丁酸酯的取代度和透明质酸的分子量对活化和未活化PMFs的粘附的影响
用TNF刺激的PMNs与包被有HA和HABut的表面的粘附。HABut：透明质酸钠丁酸酯DS＝0.3实施例4；HABut样品编号1：透明质酸钠丁酸酯DS＝1.3实施例7；HABut样品编号2：HMW透明质酸钠丁酸酯DS＝0.24实施例8；HABut样品编号3HMW透明质酸钠丁酸酯DS＝0.97实施例10。静止：阴性对照。PMA：阳性对照。
黑色柱：未被TNF活化的PMNs。白色柱：被TNF活化的PMNs。
如实施例18所述评价PMFs对表面的粘附。
图4中报道的直方图表明，当丁酸酯的取代度增加时，HABut表面逐渐变得较不易于与PMNs发生粘附相互作用，而其分子量似乎不相关。

Claims (10)

1.用于制备药物和化妆品用途或作为医疗装置用途可接受的透明质酸丁酸酯或其盐的方法，包含将与钠或另一种碱金属成盐的透明质酸与丁酰基-咪唑交酯在水溶液中在碳酸钠的存在下反应，其中透明质酸钠盐具有103-106道尔顿的重均分子量，且透明质酸丁酸酯具有0.01-2.5的取代度。
2.根据权利要求1的方法，其用于制备透明质酸丁酸酯钠盐。
3.根据权利要求1的方法，其中透明质酸丁酸酯具有0.1-2的取代度。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中该反应在20℃-30℃的温度下进行。
5.根据权利要求4的方法，其中该反应在25℃下进行。
6.根据权利要求5的方法，其中该反应在9-11的pH下进行。
7.包含通过权利要求1-6的任一项的方法得到的化妆品用途可接受的透明质酸丁酸酯或其盐和至少一种化妆品用途可接受的赋形剂和/或载体的制剂用于制备化妆品的用途。
8.包含通过权利要求1-6的任一项的方法得到的作为医疗装置可接受的透明质酸丁酸酯或其盐的医疗装置用于制备治疗皮肤损害的佐剂的用途，所述皮肤损害选自炎症、溃疡和因被UV、X-射线或γ-射线辐射照射诱发的过热导致的损害。
9.根据权利要求7的化妆品用途，其中这类用途是局部的。
10.根据权利要求8的用途，其中这类用途是局部的。
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