JP6738337B2 - ヒアルロン酸ナトリウム塩の酪酸エステルの調製のための水中における方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ）の酪酸エステルの調製方法に、及び前記方法により製造されるヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ）の酪酸エステルを含有する医薬製剤、化粧品製剤又は医療機器に関する。
本発明は、驚くべきことに酪酸エステルの高い置換度（ＤＳ）を生じ、分子分解から未変性ヒアルロン酸の多糖鎖を保護する、水性環境での合成によるヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ）の酪酸エステルの調製方法について記載する。前記方法によって調製されたヒアルロン酸の酪酸エステルは、化粧品分野で許容されない及び／又は禁止されている不純物を含まず、抗炎症及び抗刺激特性を有し、したがって、医薬品及びダーマコスメティック（ｄｅｒｍｏｃｏｓｍｅｔｉｃ）分野並びに医療機器において有利に使用できる。
種々の置換度を有する、ヒアルロン酸のヒドロキシル基が酪酸残基によってエステル化されているヒアルロン酸ブチラート（ＨＡＢｕｔ）は、皮膚弾性付与剤及び保湿剤として、抗炎症特性、抗増殖特性及び皮膚保護特性を有することが既知である。
ヒアルロン酸及びその塩は、多糖鎖のグリコシド結合の加水分解により分子量の低下を非常に受けやすい。前記加水分解がｐＨ、イオン強度及び温度条件によって著しく影響されることが、文献から既知である。
したがって、ＨＡの誘導体化条件は、多糖鎖の長さを保存するためにきわめて重要である。理想的な条件は、反応媒体中の水の存在を最小限に抑え、あまり高くない温度及び中性に近い５〜８のｐＨを含む条件である。
欧州特許第０９４１２５３号は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシド（ＤＭＦ、ＤＭＳＯ）などの非プロトン性有機溶媒中、ピリジン及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの塩基性活性化剤の存在下での、酪酸無水物による置換度が低い（ｍａｘ ＤＳ＝０．２５）ヒアルロン酸の酪酸エステルの調製について記載している。有機溶媒への可溶化の方法は、多糖水溶液を２Ｎ ＨＣｌによって酸性化して、溶媒をロータリーエバポレータで蒸発させることにより、多糖の酸形態を調製することによって得られる、ヒアルロン酸コリジニウム塩の調製を含み、これは、ＨＡの分子量の低下を引き起こす方法である。
国際公開第２００５／０９２９２９号には、置換度が低い（ＤＳ≦０．１）ヒアルロン酸酪酸エステルの調製が記載されている。均質条件下での合成は、非プロトン性有機溶媒に可溶性のヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩を、強カチオン交換樹脂（Amberlite IR-120-plus）を用いたイオン交換カラムを通過させることによって調製することを含み、前記通過によって分子量の分解が起こる。
国際公開第２００９／０６８２１５号は、皮膚保護活性及び抗炎症活性を有する、ヒアルロン酸の酪酸−蟻酸混合エステルの調製並びにダーマコスメティック（ｄｅｒｍｏｃｏｓｍｅｔｉｃ）におけるその使用について記載している。混合エステルは、ホルムアミド（ＦＡ）中、塩基性ＤＭＡＰ活性化剤と共に酪酸無水物を用いて調製する。
記載した方法は、Regulation (EC) no.1223/2009により、化粧品製剤で禁止されている物質として挙げられている、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ホルムアミド又はジメチルスルホキシドなどの非プロトン性及びプロトン性有機溶媒を使用する。高毒性（数十ppmのＬＤ５０）の特徴を有する、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの有機塩基も使用される。溶媒、試薬及び活性化剤の残留物は、精製方法の間に定量的に除去することができない。
ヒアルロン酸の誘導体化のための水中での反応は、欧州特許第０４１６２５０号に記載され、この特許により、カルボジイミド又はビスカルボジイミドとの反応による、ヒアルロン酸のカルボキシル基でのＮ−アシル尿素及びＯ−イソアシル尿素の形成が報告されている。反応は、多糖を分解しない制御されたｐＨにて、水中で行われる。
米国特許第５８７４４１７号は、温和な条件下、ヒドラジドによる水中でのヒアルロン酸のカルボキシルの官能化について記載している。
A. Mero et al. (Polymer 2014, 6,3 46-369)は、ＨＡを水中で誘導体化できることを報告している。しかし水相では、多くの反応は、ＨＡ鎖の著しい分解を伴う酸性又はアルカリ性条件下で行う必要がある。この文献は、カルボキシル基におけるアミド結合の形成をもたらす、水中でのカルボジイミドとの反応について報告している。
本発明による方法はまた、溶媒としての水及び塩基性活性化剤としての炭酸ナトリウムのみを使用して、置換度の高いＨＡＢｕｔを生成する。得られた生成物は、特定の安全性の問題を引き起こすであろういずれの溶媒又は塩基性活性化剤残基も与えない。
本発明は、医薬品若しくは化粧品での使用に、又は医療機器としての使用に許容される、ヒアルロン酸ブチラート又はその塩の調製方法であって、水溶液中、好ましくはナトリウム又は他のアルカリ金属との塩としたヒアルロン酸を、炭酸ナトリウムの存在下で、ブチリルイミダゾリドと反応させることを含む方法に関する。
本発明による方法は、好ましくは、ヒアルロン酸ブチラートナトリウム塩を調製するために使用される。
この方法で使用されるヒアルロン酸ナトリウム塩は、好ましくは、１０３〜１０６ダルトンの範囲に及ぶ重量平均分子量（ＭＷ）を有する。
ヒアルロン酸塩を脱塩水に溶解させ、生じた溶液に炭酸ナトリウム、続いてブチリルイミダゾリドを添加する。
反応混合物を、２０℃〜３０℃の範囲に及ぶ温度に６０分間以上維持する。
反応のｐＨは、ｐＨ１１〜９の範囲に及ぶ。
反応の完了時に、混合物を中性ｐＨに調整し、生成物を好適な溶媒中で沈殿させることによって回収する。このようにして得た生成物を次に、例えば好適な溶媒での連続洗浄及び濾過によって精製する。
本発明による方法は、種々の置換度を有するヒアルロン酸ブチラートを生成する。ヒアルロン酸のＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ二糖単位当たりの酪酸残基の数の間の比として定義される置換度（ＤＳ）は、例えば０．０１〜２．５の範囲に及ぶことがある。
ヒアルロン酸とブチリルイミダゾリドの間の比を変えることにより、種々の置換度が得られる。
本発明による方法によって得たヒアルロン酸ブチラートは、溶媒残留物又は毒性試薬を含有せず、医薬製剤、化粧品製剤及び医療機器に使用することができる。
したがって、本発明の主題は、上記の方法によって得られる、医薬品又は化粧品での使用に許容されるヒアルロン酸ブチラート又はその塩、並びに医薬品又は化粧品での使用に許容される少なくとも１つの賦形剤及び／又は担体（carrying agent）を含有する、医薬品又は化粧品製剤を含む。
記載した方法によって得られるヒアルロン酸ブチラートは、化粧品成分を規制する法律によって禁止された溶媒及び試薬が存在しないため、ダーマコスメティック（ｄｅｒｍｏｃｏｓｍｅｔｉｃ）分野において、水和活性、弾力活性、トーニング活性、アンチエイジング活性防止又は抗ニキビ活性を伴う局所使用のために、例えば低アレルギー性製品又は敏感肌に適した、高い安全性プロフィールを有する製剤中にて使用することができる。
前記分子は、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びナトリウムブチラート（ＮａＢｕｔ）より高い、顕著な抗刺激活性及び抗炎症活性も有し、インビトロ好中球モデル（多形核白血球、即ちＰＭＮ）で検証されたように、急性炎症応答に影響を及ぼす。前記の特徴の結果として、記載した方法によって製造したヒアルロン酸ブチラートは、皮膚損傷、例えば炎症、潰瘍、並びに紫外線、Ｘ線及びガンマ線などの放射により誘発された高熱により生じた損傷の処置における補助剤として、医薬製剤、化粧品製剤又は医療機器における有効成分として適用しうる。
実施例
使用した装置：
置換度（ＤＳ）の決定のための、ｚ勾配を有する５mm多核逆プローブを装備したBruker Avance 400 MHz分光計。
分子量の分布及び重量平均分子量（ＭＷ）を決定するための、３種の検出器（９０℃及び７℃での光散乱、屈折率及び粘度計）を装備した、Viscotek HP-SEC-TDA chromatograph model 270 max。
置換度（ＤＳ）の決定
ヒアルロン酸誘導体におけるブチラートエステルの置換度を、ＮＭＲ分光法により定量した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、５mm多核逆プローブを装備したBruker Avance 400 MHz分光計を用いて、Ｚ勾配をかけてＤ２Ｏ中で実施した。試験は、測定プローブを３００°Ｋにサーモスタット温調することによって行った。
試験には、ポリマーと酪酸の間の共有結合の存在を確認する拡散秩序化分光法（ＤＯＳＹ）分析が含まれる。
ブチラートエステルにおけるＤＳの定量は、ＮＭＲ管内で直接ＮａＯＤを用いて完全加水分解した後に行う。
加水分解物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、酪酸（ビシナルメチル及びメチレンプロトン）に起因するシグナル及びヒアルロン酸（２個のアノマープロトンを除く糖プロトン）に起因するシグナルの積分を可能にし、これらの比によって置換度が決まる。
方法
ＨＰ−ＳＥＣ−ＴＤＡクロマトグラフィーによる、分子量の分布及び重量平均分子量（ＭＷ）の測定
試料を、検出器３台（９０°及び７°における光散乱、屈折率及び粘度計）の組み合わせを使用するサイズ排除クロマトグラフィーに付した。クロマトグラムの処理により、分子量Ｍｗ（重量平均分子量）の分布を求めることができる。
クロマトグラフィー条件
計器Viscotek 270 max。
カラム：Ａ７０００、Ａ６０００ｍｘ２、温度３５℃。
移動相：ＰＢＳ。
流速：０．７５０ml／分
検出器：屈折率、キャピラリー粘度計、９０°及び７°、温度３５℃での光散乱を装備したViscotek TDA。
注入量：１００μl。
スーパーオキシドアニオン生成の評価
ＰＭＮの代謝活性化の指標であるＲＯＳの生成を、フィブリノゲン（ＦＢＧ）、コラーゲンＩＶ（ＣＩＶ）、ＨＡ又はＨＡＢｕｔでコーティングしたマイクロタイタープレートのウェル中の好中球の活性化後に、培地中に放出されるスーパーオキシドアニオン（Ｏ２ −）の量に換算して評価した。分光光度法を用いて、プレート上でのインキュベーション中に細胞によって生成されたスーパーオキシドアニオンによって還元されたシトクロムｃの量を測定した。
生体表面への接着性の評価
代謝アッセイ中の表面への細胞接着は、ＰＭＮのアズール親和性顆粒に含まれるマーカー酵素である、酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の活性をアッセイすることによって評価した。Menegazzi et alによって記載されたプロトコル（A new, one-step assay on whole cell suspensions for peroxidase secretion by human neutrophils and eosinophils.Menegazzi R, Zabucchi G, Knowles A, Cramer R, Patriarca P.J LeukocBiol.1992 Dec;52(6):619-24）を使用した。Ｈ２Ｏ２の存在下、ＭＰＯ酵素による３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質の酸化を測定する定量的比色酵素試験を用いて、ミエロペルオキシダーゼ活性をアッセイした。
実施例１：ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．３（ＢＵＴ１２１０３）の合成
１ｌ反応器に、脱塩水１００ml、続いてＭＷが２８０kDAのヒアルロン酸ナトリウム１０．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−１．６ｇ）、続いて３０分撹拌した後、ブチリルイミダゾリド（２．６ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで生成物をアセトン中で沈殿させ、続いてデカンテーションによって単離する。
溶液をアセトン中で連続的に洗浄することにより精製し、負圧濾過によって回収する。
最後に、生成物をアセトン中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温で少なくとも３時間、次いで温度６０℃以下の真空オーブン中で少なくとも１６時間乾燥させる。
試料１０mgを重水（Ｄ２Ｏ）０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
ＮＭＲスペクトルを図１に示す。下のスペクトル（ａ）は、ポリマーに共有結合した化学基に起因するシグナルのみを保持するＤＯＳＹ系列を適用することによって得られる。
他の２つの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは各々、重水素化水酸化ナトリウム（ＮａＯＤ）の添加による酪酸エステルの加水分解の前（ｂ）及び後（ｃ）である。１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．３０のＤＳが決定される。
実施例２：分子量の分布及び重量平均分子量（ＭＷ）の測定
２８０kDaのＭＷを有することが確認された、実施例１に記載の酪酸エステルの合成に用いたヒアルロン酸ナトリウム塩試料をＨＰ−ＳＥＣ−ＴＤＡクロマトグラフィーで分析した。実験的な分子量の分布により、重量平均分子量（ＭＷ）３００kDaを得る。
実施例１に記載したように製造したヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステルの試料を、ＨＰ−ＳＥＣ−ＴＤＡクロマトグラフィーで分析した。実験的な分子量の分布により、重量平均分子量（ＭＷ）３６０kDaを得る。
実施例３：ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．３（ＢＵＴ１４０１４）の合成
１５ｌ反応器に、脱塩水１ｌ、続いてＭＷが２９０kDaのヒアルロン酸ナトリウム１００．０ｇを投入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−１５．９ｇ）、続いて３０分撹拌した後、ブチリルイミダゾリド（２５．９ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、塩酸（ＨＣｌ）及び塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）から成る水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をイソプロパノール中で沈殿させることによって回収する。
沈殿の完了時に、溶液を少なくとも１６時間撹拌下に放置し、混合物を移し、生成物を濾過により単離する。
次いで、生成物をイソプロパノール中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
最後に、生成物をイソプロパノール中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温で少なくとも３時間、次いで温度６０℃以下の真空オーブン中で少なくとも１６時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．３０のＤＳが決定される。
実施例４：ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．３（ＨＢｉｎｔ０５０１２０１４）の合成
１５ｌ反応器に、脱塩水２．５ｌ、続いてＭＷが２９０kDaのヒアルロン酸ナトリウム２５０．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−３９．８ｇ）、続いて３０分撹拌した後、ブチリルイミダゾリド（６４．８ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌ及びＮａＣｌから成る水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をアセトン中で沈殿させることによって回収する。
沈殿の完了時に、溶液を撹拌下に少なくとも３０分間放置する。次いで、生成物をデカンテーションにより単離する。
次いで生成物をアセトン中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
最後に、生成物をアセトン中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温で少なくとも１６時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも２４時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．３０のＤＳが決定される。
実施例５：ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．５８（ＢＵＴ１４０１７）の合成
１ｌ反応器に、１００mlの脱塩水、続いて２９０kDaのＭＷを有するヒアルロン酸ナトリウム１０．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−２．６ｇ）を添加し、続いて３０分間撹拌した後にブチリルイミダゾリド（９．２ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌ及びＮａＣｌから成る水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をイソプロパノール中で沈殿させることによって回収する。次いで、生成物をデカンテーションにより単離する。
次いで生成物をイソプロパノール中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
最後に、生成物をイソプロパノール中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温で少なくとも３時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも２４時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．５８のＤＳが決定される。
実施例６：ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．８５（ＢＵＴ１４０１９）の合成
１ｌ反応器に、１００mlの脱塩水、続いて２９０kDaのＭＷを有するヒアルロン酸ナトリウム１０．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−５．３ｇ）を添加し、続いて３０分間撹拌した後にブチリルイミダゾリド（９．２ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌ及びＮａＣｌの水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をイソプロパノール中で沈殿させることによって回収する。次いで、生成物をデカンテーションにより単離する。
次いで生成物をイソプロパノール中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
最後に、生成物をイソプロパノール中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温で少なくとも３時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも２４時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．８５のＤＳが決定される。
実施例７：ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝１．３０（ＨＢｉｎｔ０４０４２０１４−ＢＵＴ１４０２３）の合成
１ｌ反応器に、１００mlの脱塩水、続いて２９０kDaのＭＷを有するヒアルロン酸ナトリウム１０．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−１３．２ｇ）を添加し、続いて３０分間撹拌した後にブチリルイミダゾリド（２３．１ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌの水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をイソプロパノール中で沈殿させることによって回収する。次いで、生成物をデカンテーションにより単離する。
次いで生成物をイソプロパノール中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
最後に、生成物をイソプロパノール中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温の空気流中で少なくとも３時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも２４時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、１．３０のＤＳが決定される。
実施例８：高分子量ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．２４（ＨＢｉｎｔ０１０４２０１４−ＢＵＴ１４０２５）の合成
５ｌ反応器に、脱塩水１ｌ、続いてＭＷが１２７０kDaのヒアルロン酸ナトリウム５０．０ｇを投入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−１０．６ｇ）を添加し、続いてブチリルイミダゾリド（２５．９ｇ）を９０分間撹拌した後に添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌ及びＮａＣｌから成る水溶液３６０mlを添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をアセトン中で沈殿させることによって回収する。沈殿の完了時に、溶液を撹拌下に少なくとも１６時間放置する。次いで、生成物をデカンテーションにより単離する。
次いで生成物をアセトン中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
最後に、生成物をアセトン中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温で少なくとも１６時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも２４時間乾燥させる。
固体３mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
固体１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．２４のＤＳが決定される。
実施例９：高分子量ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．５１（ＨＢｉｎｔ０３０４２０１４−ＢＵＴ１４０３２）の合成
５ｌ反応器に、０．７２ｌの脱塩水、続いて１２７０kDaのＭＷを有するヒアルロン酸ナトリウム３０．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−２３．８ｇ）を添加し、続いてブチリルイミダゾリド（６０．９ｇ）を６０分間撹拌した後に添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌの水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をアセトン中で沈殿させることによって回収する。沈殿の完了時に、溶液を撹拌下に少なくとも１６時間放置する。次いで、生成物をデカンテーションにより単離する。
次いで生成物をアセトン中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
最後に、生成物をアセトン中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温で少なくとも３０時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも２４時間乾燥させる。
試料３mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．５１のＤＳが決定される。
実施例１０：高分子量ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．９７（ＨＢｉｎｔ０２０４２０１４−ＢＵＴ１４０３１）の合成
５ｌ反応器に、０．８５ｌの脱塩水、続いて１２７０kDaのＭＷを有するヒアルロン酸ナトリウム３０．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−４７．６ｇ）を添加し、続いてブチリルイミダゾリド（１３８．３ｇ）を６０分間撹拌した後に添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌの水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をアセトン中で沈殿させることによって回収する。沈殿の完了時に、溶液を少なくとも１６時間撹拌下に放置し、生成物を濾過により単離する。
次いで生成物をアセトン中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
最後に、生成物をアセトン中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温で少なくとも１６時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも２４時間乾燥させる。
試料３mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．９７のＤＳが決定される。
実施例１１：低分子量ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．４６（ＢＵＴ１４０３７）の合成
０．５ｌフラスコに、脱塩水３５ml、続いてＭＷが４５kDaのヒアルロン酸ナトリウム５．０ｇを投入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−０．８ｇ）を添加し、続いて３０分間撹拌した後にブチリルイミダゾリド（１．３ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌ及びＮａＣｌの水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をイソプロパノール中で沈殿させることによって回収する。沈殿の完了時に、溶液を少なくとも１６時間撹拌下に放置し、混合物を移し、生成物を濾過により単離する。
次いで生成物をイソプロパノール中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
最後に、生成物をイソプロパノール中に懸濁させ、少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次に単離して、濾過により溶媒を除去する。
沈殿物を室温で少なくとも１６時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも１６時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．４６のＤＳが決定される。
実施例１２：低分子ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝１．６８（ＢＵＴ１４０３９）の合成
０．２５ｌフラスコに、脱塩水１２．５ml、続いてＭＷが４５kDaのヒアルロン酸ナトリウム５．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−６．６ｇ）を添加し、続いて３０分間撹拌した後にブチリルイミダゾリド（１１．９ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌの水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をイソプロパノール中で沈殿させることによって回収する。沈殿の完了時に、溶液を撹拌下に少なくとも１６時間放置する。次いで、生成物をデカンテーションにより単離する。
次いで生成物をイソプロパノール中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
沈殿物を室温で少なくとも１６時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも１６時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、１．６８のＤＳが決定される。
実施例１３：低分子ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝１．９０（ＢＵＴ１４０４２）の合成
０．５ｌフラスコに、脱塩水２５．０ml、続いてＭＷが４５kDaのヒアルロン酸ナトリウム１０．０ｇを投入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−１３．２ｇ）を添加し、続いて３０分間撹拌した後にブチリルイミダゾリド（６８．２ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて２時間放置し、次いで、ＨＣｌの水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をイソプロパノール中で沈殿させることによって回収する。沈殿の完了時に、溶液を撹拌下に少なくとも１６時間放置する。次いで、生成物をデカンテーションにより単離する。
次いで生成物をイソプロパノール中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
沈殿物を室温で少なくとも１６時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも１６時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、１．９０のＤＳが決定される。
実施例１４：低分子量ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．０６（ＢＵＴ１４０４３）の合成
０．５ｌフラスコに、脱塩水５０．０ml、続いてＭＷが４５kDaのヒアルロン酸ナトリウム１０．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−０．２ｇ）を添加し、続いて３０分間撹拌した後にブチリルイミダゾリド（０．３ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて２時間放置し、次いで、ＨＣｌの水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をイソプロパノール中で沈殿させることによって回収する。沈殿の完了時に、生成物を負圧濾過により単離する。次いで生成物をイソプロパノール中で連続的に洗浄することにより精製し、その後、生成物を濾過によって回収する。
沈殿物を室温で少なくとも１６時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも７時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．０６のＤＳが決定される。
実施例１５：低分子ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル、ＤＳ＝０．０２（ＢＵＴ１４０４４）の合成
０．５ｌフラスコに、脱塩水５０．０ml、続いてＭＷが４５kDaのヒアルロン酸ナトリウム１０．０ｇを導入する。混合物を２５℃にサーモスタット温調し、撹拌しながら完全に溶解するまで一定温度に維持する。
次いで、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３−０．１ｇ）を添加し、続いて３０分間撹拌した後にブチリルイミダゾリド（０．１ｇ）を添加する。溶液を撹拌下２５℃にて１時間放置し、次いで、ＨＣｌ及びＮａＣｌの水溶液を添加することによって反応を停止させる。
溶液を少なくとも３０分間撹拌下に放置し、次いで生成物をイソプロパノール中で沈殿させることによって回収する。沈殿の完了時に、溶液を少なくとも１６時間撹拌下に放置し、次いで混合物を移し、生成物を濾過により単離する。
次いで生成物をイソプロパノール中で連続的に洗浄することによって精製し、その後、生成物を濾過により回収する。
沈殿物を室温で少なくとも１６時間、次いで温度６０℃以下で、真空下にて少なくとも１６時間乾燥させる。
試料１０mgをＤ２Ｏ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
試料１０mgをＮａＯＤ ０．７mlに溶解させ、ＮＭＲ試験管に移す。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのシグナルを積分することにより、０．０２のＤＳが決定される。
実施例１６：ＴＮＦによって活性化されたＰＭＮによるスーパーオキシドアニオンの生成
ＦＢＧ（フィブリノゲン；ＰＭＮ接着に対して許容性の表面）、ＣＩＶ（ＩＶ型コラーゲン−非許容性の表面）、ＨＡ：ヒアルロン酸、ＨＡＢｕｔ：ＤＳ＝０．３のヒアルロン酸ナトリウムブチラート（実施例４）でコーティングしたウェル内での、炎症誘発サイトカインＴＮＦを用いて４５分間刺激したＰＭＮによるスーパーオキシドアニオンの生成。
種々の基質でコーティングしたウェルに、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中、シトクロムｃ ０．１８mM及びＴＮＦ ０．１５ng／mlの溶液を充填する。このようにして調製したモジュールを、加湿インキュベーター内で３７℃にて１０分間加熱し、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中１．５×１０６ PMN／mlの細胞懸濁液を各ウェルに添加する。１５分間隔でプレートをインキュベーターから取り出し、５５０nm及び５４０nmの波長（５５０nm及び５４０nmは各々、還元シトクロムｃの吸収ピーク、並びに還元及び酸化シトクロムｃの吸収スペクトルの等吸収点に対応）にてマイクロプレートリーダーでの分光光度分析に供する。２つの波長で記録された吸光度値間の差は、還元シトクロムｃの量に比例する。１０６個の細胞によって生成されたＯ２ −量は、以下のように計算する：ナノモルＯ２ −／１０６ＰＭＮ＝ＯＤ×１０６／０．００３７×ｎ（式中、ｎは各ウェルに添加された細胞の数である）。
図２に示すヒストグラムは、ＨＡＢｕｔ（置換度０．３）でコーティングした表面上でインキュベートされたＰＭＮの、ＴＮＦに応答したスーパーオキシドアニオン生成における、ＨＡを用いた表面上でインキュベートしたものと比較しての有意な減少を示す（ｎ＝４としてＳｔｕｄｅｎｔの「ｔ」検定によって計算、ｐ＜０．００１）。
実施例１７：生体表面へのＰＭＮ接着の試験
ＦＢＧ（ＰＭＮ接着に許容性である表面）；ＣＩＶ（非許容性の表面）；ＨＡ：ヒアルロン酸；ＨＡＢｕｔ：ＤＳ＝０．３のヒアルロン酸ナトリウムブチラート（実施例４）でコーティングした表面へのＰＭＮの接着。静止：ＴＮＦによって活性化されないＰＭＮ。ＴＮＦ：ＴＮＦによって活性化されたＰＭＮ；ＰＭＡ：ホルボール１２−ミリステート１３−アセタートによって活性化されたＰＭＮ。
Ｏ２ −生成の測定のための分光光度測定値を得た後、マイクロプレートウェルをＰＢＳで満たし、２００rpmにて５分間遠心分離して、表面に付着していない細胞を除去する。Ｈ２Ｏ２の存在下、ＭＰＯ酵素による３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質の酸化を測定することによって、ミエロペルオキシダーゼ活性をアッセイした。ＴＭＢ、セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）及び３−アミノ−１，２−４トリアゾール（ＡＭＴ）を含有する酢酸緩衝溶液を各ウェルに添加し、プレートを５分間撹拌して細胞溶解を促進し、顆粒からのＭＰＯの放出を進める。ＰＭＮ調製物に混入することがある好酸球からの好酸球ペルオキシダーゼの活性は、ＡＴＭによって阻害される。Ｈ２Ｏ２の添加２分後、反応をＨ２ＳＯ４で停止させ、各ウェルの吸光度を波長４０５nmにて測定する。付着細胞のパーセンテージは、各実験において、既知量の細胞について計算したペルオキシダーゼ活性値に基づいて構築された標準曲線を基準として計算する。
図３に示すヒストグラムは、ＨＡＢｕｔ（置換度０．３）でコーティングした表面に付着する活性化及び非活性化ＰＭＮの数の、ＨＡでコーティングした表面に付着するＰＭＮの数と比較しての有意な減少を示す（ｎ＝４としてＳｔｕｄｅｎｔの「ｔ」検定によって計算、ｐ＜０．００１）。
実施例１８：活性化及び非活性化ＰＭＦの接着に対する、ヒアルロン酸のブチラート置換度及び分子量の影響
ＨＡ及びＨＡＢｕｔでコーティングした表面への、ＴＮＦで刺激されたＰＭＮの接着。ＨＡＢｕｔ：ヒアルロン酸ナトリウムブチラート（ＤＳ＝０．３）、実施例Ｎｏ．４：ＨＡＢｕｔ試料Ｎｏ．１：ヒアルロン酸ナトリウムブチラート（ＤＳ＝１．３）、実施例Ｎｏ．７：ＨＡＢｕｔ試料Ｎｏ．２：ＨＭＷヒアルロン酸ナトリウムブチラート（ＤＳ＝０．２４）、実施例Ｎｏ．８：ＨＡＢｕｔ試料Ｎｏ．３：ＨＭＷヒアルロン酸ナトリウムブチラート（ＤＳ＝０．９７）、実施例Ｎｏ．１０。静止：陰性対照。ＰＭＡ：陽性対照。
黒色カラム：ＴＮＦで活性化されていないＰＭＮ。白色カラム：ＴＮＦで活性化されたＰＭＮ。
ＰＭＦの表面への付着は、実施例１８に記載したようにして評価する。
図４に報告されたヒストグラムは、ブチラートによる置換度が上昇すると、ＨＡＢｕｔが、ＰＭＮとの接着相互作用に対して許容性がより低い表面となるが、その分子量は無関係であると思われることを示している。
ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステル等の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。 ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステルでコーティングした表面上と、ＨＡを用いた表面上での、多形核白血球によるＴＮＦに応答したスーパーオキシドアニオン生成を比較するヒストグラムを示す図である。 ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステルでコーティングした表面上と、ＨＡを用いた表面上における、多形核白血球の付着数を比較するヒストグラムを示す図である。 ヒアルロン酸ナトリウム塩酪酸エステルの置換度及び分子量を変えた時の、多形核白血球の付着数を比較するヒストグラムを示す図である。

Claims (14)

  1. 医薬品若しくは化粧品での使用、又は医療機器としての使用に許容される、ヒアルロン酸ブチラート又はその塩を調製するための方法であって、水溶液中における、ナトリウム又は他のアルカリ金属との塩としたヒアルロン酸とブチリルイミダゾリドの、炭酸ナトリウム存在下での反応を含む、方法。
  2. ヒアルロン酸ブチラートナトリウム塩を調製するための、請求項１に記載の方法。
  3. ヒアルロン酸ナトリウム塩が、１０３〜１０６ダルトンの範囲に及ぶ重量平均分子量を有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ヒアルロン酸ブチラートが、０．０１〜２．５の範囲に及ぶ置換度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ヒアルロン酸ブチラートが、０．１〜２の範囲に及ぶ置換度を有する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記反応を２０℃〜３０℃の範囲に及ぶ温度で行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 反応を２５℃で行う、請求項６に記載の方法。
  8. 反応を１１〜９の範囲に及ぶｐＨで行う、請求項７に記載の方法。
  9. 化粧品での使用に許容される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって得られるヒアルロン酸ブチラート又はその塩、並びに化粧品での使用に許容される少なくとも１つの賦形剤及び／又は担体を含む製剤の、化粧品としての使用。
  10. 炎症、潰瘍、及び紫外線、Ｘ線若しくはガンマ線放射を用いた放射により誘発された高熱により生じた損傷からなる群より選択される皮膚損傷の処置における補助剤として使用するための、医療機器での使用に許容される、０．０１〜２．５の範囲に及ぶ置換度を有するヒアルロン酸ブチラート又はその塩を含む、医療機器。
  11. そのような使用が局所的である、請求項９に記載の使用。
  12. そのような使用が局所的である、請求項１０に記載の医療機器。
  13. 炎症、潰瘍、及び紫外線、Ｘ線若しくはガンマ線放射を用いた放射により誘発された高熱により生じた損傷からなる群より選択される皮膚損傷の処置における補助剤として使用するための、医薬品での使用に許容される、０．０１〜２．５の範囲に及ぶ置換度を有するヒアルロン酸ブチラート又はその塩を含む、医薬製剤。
  14. そのような使用が局所的である、請求項１３に記載の医薬製剤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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IT202000001831A1 (it) * 2020-01-30 2021-07-30 Caprika Srl Composizione per applicazione rettale a base di sale di acido butirrico per il trattamento delle patologie proctologiche

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE171185T1 (de) * 1985-03-15 1998-10-15 Antivirals Inc Immunotestmittel für polynukleotid und verfahren
EP0416250A3 (en) * 1989-08-01 1991-08-28 The Research Foundation Of State University Of New York N-acylurea and o-acylisourea derivatives of hyaluronic acid
US5616568A (en) * 1993-11-30 1997-04-01 The Research Foundation Of State University Of New York Functionalized derivatives of hyaluronic acid
JP3563440B2 (ja) * 1994-05-16 2004-09-08 生化学工業株式会社 アシル化ヒアルロン酸の製造法
IT1286510B1 (it) * 1996-11-29 1998-07-15 Cooperativa Centro Ricerche Po Esteri butirrici ad attivita' antiproliferativa e composizioni farmaceutiche che li contengono
ITMI20022745A1 (it) * 2002-12-23 2004-06-24 Coimex Scrl United Companies Esteri misti dell'acido ialuronico ad attivita' citostatica e prodifferenziante e procedimento per la loro produzione.
ITMI20030043A1 (it) * 2003-01-14 2004-07-15 Coimex S C R L United Companies Uso di esteri retinoici dell'acido ialuronico in cellule
US7091191B2 (en) * 2003-12-19 2006-08-15 Ethicon, Inc. Modified hyaluronic acid for use in musculoskeletal tissue repair
ITMI20040605A1 (it) * 2004-03-29 2004-06-29 Coimex S C R L United Companie Esteri butirrici dell'acido ialuronico a basso grado di sostituzione procedimento per la loro preparazione ed uso
FR2908415B1 (fr) * 2006-11-10 2009-01-23 Abr Dev Sarl Acide hyaluronique reticule et son procede de preparation
EP1942117A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-09 Sigea S.R.L. Derivatives of acid polysaccharides
ITMI20072237A1 (it) * 2007-11-27 2009-05-28 Sigea Srl Esteri misti butirrico-formico di polisaccaridi acidi, loro preparazione ed uso come dermocosmetici
US20090143348A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-04 Ahmet Tezel Polysaccharide gel compositions and methods for sustained delivery of drugs
WO2012048283A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Board Of Regents, The University Of Texas System One-step processing of hydrogels for mechanically robust and chemically desired features
ITGE20120102A1 (it) * 2012-10-25 2014-04-26 Lipogems Internat S R L Procedimento di precondizionamento chimico di materiale cellulare per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l'espressione di pluripotenzialità

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