RU2708994C2 - Проводимый в воде способ получения сложных эфиров масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты - Google Patents
Проводимый в воде способ получения сложных эфиров масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2708994C2 RU2708994C2 RU2017124364A RU2017124364A RU2708994C2 RU 2708994 C2 RU2708994 C2 RU 2708994C2 RU 2017124364 A RU2017124364 A RU 2017124364A RU 2017124364 A RU2017124364 A RU 2017124364A RU 2708994 C2 RU2708994 C2 RU 2708994C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- salt
- product
- allowed
- butyrate
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/728—Hyaluronic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
- A61K8/73—Polysaccharides
- A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/20—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
- A61L31/04—Macromolecular materials
- A61L31/042—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
- C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/34—Materials or treatment for tissue regeneration for soft tissue reconstruction
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Birds (AREA)
- Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к фармацевтической или косметической промышленности. Способ получения бутирата гиалуроновой кислоты или его соли с щелочным металлом, приемлемой для фармацевтического и косметического использования или использования в медицинском устройстве, включающий взаимодействие гиалуроновой кислоты, возможно в виде соли с натрием или другим щелочным металлом, в водном растворе с бутирил-имидазолидом в присутствии карбоната натрия. Применение в качестве косметического средства композиции, содержащей бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для косметического использования, получаемые вышеописанным способом, и по меньшей мере один эксципиент и/или носитель, приемлемый для косметического использования. Применение медицинского устройства, содержащего бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для использования в медицинском устройстве, получаемые вышеописанным способом, в качестве адъюванта в лечении поражений кожи, таких как воспаления, язвы и поражения, вызываемые гипертермией, индуцированной излучением, например UV (ультрафиолетовым), рентгеновским или гамма-излучением. Изобретение позволяет получить бутират гиалуроновой кислоты, который не содержит остатки какого-либо растворителя или основного активатора. 3 н. и 9 з.п.ф-лы, 4 ил., 18 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к способу получения сложных эфиров масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты (НА) и к фармацевтическим композициям, косметическим композициям или медицинским устройствам, содержащим сложные эфиры масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты (НА), полученные указанным способом.
В настоящем изобретении описан способ получения сложных эфиров масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты (НА) путем синтеза в водной среде, который неожиданно приводит к высоким степеням замещения (DS) в сложных эфирах масляной кислоты и защищает полисахаридную цепь нативной гиалуроновой кислоты от молекулярной деградации. Сложные эфиры масляной кислоты и гиалуроновой кислоты, полученные указанным способом, не содержат примесей, которые не допускаются и/или запрещены в косметической области, обладают противовоспалительными и противораздражающими свойствами, и, таким образом, могут благоприятно использоваться в фармацевтической области и дермокосметической области, а также в медицинских устройствах.
Предшествующий уровень техники
Известно, что бутират гиалуроновой кислоты (HABut), где гидроксильные группы гиалуроновой кислоты этерифицированы остатками масляной кислоты, имеющими различные степени замещения, обладает противовоспалительными, антипролиферативными и дерматопротекторными свойствами в качестве эластификатора и увлажнителя.
Гиалуроновая кислота и ее соли в высокой степени подвержены уменьшению молекулярной массы за счет гидролиза гликозидных связей полисахаридной цепи. В литературе известно, что на указанный гидролиз в значительной степени влияет рН, ионная сила и температурные условия.
Таким образом, условия дериватизации НА являются критическими для сохранения длины полисахаридной цепи. Идеальные условия представляют собой условия, которые минимизируют присутствие воды в реакционной среде и включают температуры, которые не являются очень высокими, и значение рН, близкое к нейтральному, составляющему от 5 до 8.
В ЕР 0941253 описано получение сложных эфиров масляной кислоты и гиалуроновой кислоты, имеющих низкую степень замещения (макс. DS составляет 0,25), с использованием ангидрида масляной кислоты в апротонных органических растворителях, таких как N,N-диметилформамид и диметилсульфоксид (DMF, DMSO) в присутствии основных активаторов, таких как пиридин и N,N-диметиламинопиридин (DMAP). Способ солюбилизации в органических растворителях включает получение коллидиновой соли гиалуроновой кислоты путем приготовления кислой формы полисахарида путем подкисления водного раствора полисахарида с использованием 2 н HCl и упаривания растворителя с использованием ротационного испарителя, причем этот способ приводит к уменьшению молекулярной массы НА.
В WO 2005/092929 описано получение сложных эфиров масляной кислоты и гиалуроновой кислоты с низкой степенью замещения (DS меньше или равно 0,1). Этот синтез в гомогенных условиях включает получение тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (ТВА), растворимой в апротонных органических растворителях, путем ее пропускания через ионообменную колонку с использованием сильной катионообменной смолы (Amberlite IR-120-plus), где указанное пропускание приводит к уменьшению молекулярной массы.
В WO 2009/068215 описано получение смешанных сложных эфиров масляной и муравьиной кислот с гиалуроновой кислотой и их применение в лечебно-косметических средствах для кожи, обладающих дерматопротекторным действием и противовоспалительным действием. Смешанные эфиры получают с использованием ангидрида масляной кислоты в формамиде (FA) с DMAP в качестве основного активатора.
В этих способах описано применение апротонных и протонных органических растворителей, таких как N,N-диметилформамид, формамид или диметилсульфоксид, которые перечислены среди веществ, запрещенных для применения в косметических композициях в соответствии с требованием (ЕС) №1223/2009. Также используются органические основания, такие как N,N-диметиламинопиридин, которые обладают характеристиками высокой токсичности (LD50 (средняя летальная доза) составляет десятки м.д. (миллионных долей)). Остатки растворителей, реагентов и активаторов не могут быть количественно исключены в процессе очистки.
О реакциях в воде для дериватизации гиалуроновой кислоты сообщается в ЕР 0416250, в котором описывается образование N-ацилмочевины и О-изоацилмочевины на карбоксильной группе гиалуроновой кислоты вследствие реакции с карбодиимидами или бис-карбодиимидами. Эта реакция проходит в воде при контролируемом рН, при котором не происходит деградация полисахарида.
В US 5874417 описана функционализация карбоксильной группы гиалуроновой кислоты гидразидом в воде в мягких условиях.
А. Mero et al. (Polymer 2014, 6, 346-369) сообщает о том, что НА может быть дериватизирована в воде. Тем не менее, в водной фазе необходимо провести множество реакций в кислых или щелочных условиях, что влечет за собой значительную деградацию цепи НА. В статье описываются реакции в воде с карбодиимидами, приводящие к образованию амидных связей на карбоксильных группах.
В способе по настоящему изобретению также получают HABut с высокими степенями замещения при использовании только воды в качестве растворителя и карбонат натрия в качестве основного активатора. Полученный продукт не содержит остатки какого-либо растворителя или основного активатора, которые могли бы привести к определенным проблемам безопасности.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения бутирата гиалуроновой кислоты или его соли, приемлемой для фармацевтического или косметического использования, или в качестве медицинского устройства, включающему взаимодействие гиалуроновой кислоты, предпочтительно в виде соли, образованной с натрием или другим щелочным металлом, в водном растворе с бутирил-имидазолидом в присутствии карбоната натрия.
Способ по изобретению предпочтительно используют для получения натриевой соли бутирата гиалуроновой кислоты.
Используемая в способе натриевая соль гиалуроновой кислоты предпочтительно имеет средневесовую молекулярную массу (MW), находящуюся в диапазоне от 103 до 106 Дальтон.
Соль гиалуроновой кислоты растворяют в деминерализованной воде, и в получающийся в результате раствор добавляют карбонат натрия, а затем бутирил-имидазолид.
Реакционную смесь поддерживают при температуре, находящейся в диапазоне от 20°С до 30°С, в течение не меньше чем 60 минут.
Значение рН реакционной смеси находится в диапазоне от 11 до 9.
После завершения реакции смесь доводят до нейтрального рН, и продукт выделяют путем осаждения в подходящем растворителе. Полученный таким образом продукт затем очищают, например, путем последовательных промываний подходящими растворителями и фильтрованием.
Способ по изобретению позволяет получать бутират гиалуроновой кислоты с различными степенями замещения. Степень замещения (DS), определяемая как соотношение между количеством остатков масляной кислоты на дисахаридную единицу GlcNAc-GlcUA гиалуроновой кислоты, может находиться в диапазоне, например от 0,01 до 2,5.
Различные степени замещения достигают путем варьирования отношения между гиалуроновой кислотой и бутирил-имидазолидом.
Бутират гиалуроновой кислоты, полученный способом по изобретению, не содержит остатков растворителей или токсичные реагенты, и может быть использован в фармацевтических композициях, косметических композициях и медицинских устройствах.
Таким образом, объект настоящего изобретения включает фармацевтические и косметические композиции, содержащие бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для фармацевтического или косметического использования, полученный способом, описанным выше, и по меньшей мере один эксципиент и/или носитель, приемлемый для фармацевтического или косметического использования.
Бутират гиалуроновой кислоты, полученный описанным способом, вследствие отсутствия растворителей и реагентов, запрещенных законодательными актами по косметическим ингредиентам, может быть использован в области лечебно-косметических средств для кожи для местного применения, обладающих гидратирующей, придающей эластичность, тонизирующей, антивозрастной или противоугревой активностью в композициях, обладающих высоким профилем безопасности, которые подходят, например, для гипоаллергенных продуктов или чувствительной кожи.
Молекула также обладает значительными противораздражающей и противовоспалительной активностями больше чем активности гиалуроновой кислоты (НА) и бутирата натрия (NaBut), влияющими на острый воспалительный ответ, подтверждаемый на нейтрофильной модели in vitro (полиморфоядерные лейкоциты или PMN). Вследствие указанной характеристики бутират гиалуроновой кислоты, полученный описанным способом, применим в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях, косметических композициях или медицинских устройствах в качестве адъюванта при лечении поражений кожи, таких как воспаления, язвы и поражения, вызванные гипертермией, индуцированной излучением, таким как УФ (ультрафиолетовое) излучение, рентгеновское излучение и гамма-излучение.
ПРИМЕРЫ
Используемое оборудование:
• Спектрометр Bruker Avance 400 МГц, оснащенный 5 мм многоядерным обратным зондом с z градиентом для определения степени замещения (DS);
• Хроматограф Viscotek HP-SEC-TDA модель 270 max, оснащенный тройным детектором (рассеяние света 90°С и 7°С, коэффициент преломления и вискозиметр) для определения распределения молекулярных масс и средневесовой молекулярной массы (MW).
Определение степени замещения (DS)
Степень замещения в бутиратных эфирах производного гиалуроновой кислоты количественно определяли при помощи ЯМР (ядерный магнитный резонанс) спектроскопии. Спектры 1Н ЯМР получали в D2O при помощи спектрометра Bruker Avance 400 МГц, оборудованного 5 мм многоядерным обратным зондом с z градиентом. Тесты проводили путем термостатирования измерительного зонда до 300°K (26,85°С).
Этот тест включает анализ при помощи диффузно-упорядоченной спектроскопии (DOSY), который подтверждает присутствие ковалентной связи между полимером и масляной кислотой.
Количественное определение DS в сложном эфире масляной кислоты осуществляют после полного гидролиза с использованием NaOD непосредственно в пробирке для ЯМР.
Спектр 1Н ЯМР гидролизата дает возможность для интеграции сигналов, относящихся к масляной кислоте (вицинальный метил и метиленовые протоны), и сигналов, относящихся к гиалуроновой кислоте (сахаридные протоны за исключением двух аномерных протонов); их отношение определяет степень замещения.
Методы
Определение распределения молекулярной массы и средневесовой молекулярной массы (MW) при помощи хроматографии HP-SEC-TDA
Образцы подвергали эксклюзионной хроматографии с использованием комбинации трех детекторов (рассеяние света при 90° и 7°, коэффициент преломления и вискозиметр). Обработка хроматограммы дает возможность для определения распределения молекулярных масс Mw (средневесовая молекулярная масса).
Хроматографические условия:
Оборудование Viscotek 270 max.
Колонки: А7000, A6000mx2, температура 35°С.
Подвижная фаза: PBS (фосфатный буферный солевой раствор).
Скорость потока: 0,750 мл/мин
Детектор: Viscotek TDA, оснащенный показателем преломления, капиллярным вискозиметром и рассеянием света с измерением при 90° и 7°, температура 35°С.
Инжектируемый объем: 100 мкл.
Оценка продукции супероксид-аниона
Продукцию ROS (реактивные формы кислорода), представляющих собой показатель метаболической активации PMN, оценивали в отношении количества супероксид-аниона (О2 -), высвобождаемого в среду после активации нейтрофилов в лунках микротитровальных планшетов, покрытых фибриногеном (FBG), коллагеном IV (CIV), НА или HABut. Спектрофотометрический метод использовали для измерения количества цитохрома с, восстановленного супероксид-анионом, продуцированным клетками во время инкубации на планшете.
Оценка адгезии к биологическим поверхностям
Клеточную адгезию к поверхности во время метаболического анализа оценивали путем измерения активности фермента миелопероксидазы (МРО), представляющего собой ферментный маркер, содержащийся в азурофильных гранулах в PMN. Использовали протокол, описанный Menegazzi et al. (A new, one-step assay on whole cell suspensions for peroxidase secretion by human neutrophils and eosinophils. Menegazzi R, Zabucchi G, Knowles A, Cramer R, Patriarca P. J Leukoc Biol. 1992 Dec;52(6): 619-24). Миелопероксидазную активность измеряли при помощи количественного колориметрического ферментативного теста, в котором измеряют окисление 3,3',5,5'-тетраметилбензидинового (ТМВ) субстрата ферментом МРО в присутствии Н2О2.
Пример 1: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,3 (BUT12103)
100 мл деминерализованной воды и затем 10,0 г гиалуроната натрия с MW 280 кДа вводят в реактор объемом 1 л. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре вплоть до полного растворения.
Далее добавляют двухнатриевый карбонат (Na2CO3 - 1,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (2,6 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне и последующего декантирования.
Раствор очищают путем последовательных промываний в ацетоне, и восстанавливают путем фильтрования при отрицательном давлении.
Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакуумной печи при температуре меньшей или равной 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл дейтерированной воды (D2O) и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Спектры ЯМР приведены на Фиг. 1; нижний спектр (а) получен путем применения последовательности DOSY, которая сохраняет только сигналы, относящиеся к химическим группам, ковалентно связанным с полимером.
Два других спектра 1Н ЯМР соответственно получены до (b) и после (с) гидролиза сложного эфира масляной кислоты путем добавления дейтерированного гидроксида натрия (NaOD). Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,30.
Пример 2: Определение распределения молекулярной массы и средневесовой молекулярной массы (MW)
Образец натриевой соли гиалуроновой кислоты, используемый для синтеза сложного эфира масляной кислоты, описанного в примере 1, сертифицированного с MW 280 кДа, анализировали при помощи хроматографии HP-SEC-TDA. Распределение экспериментальных молекулярных масс дает средневесовую молекулярную массу (MW), равную 300 кДа.
Образец сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, полученный как описано в примере 1, анализировали при помощи хроматографии HP-SEC-TDA. Распределение экспериментальных молекулярных масс дает средневесовую молекулярную массу (MW), равную 360 кДа.
Пример 3: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,3 (BUT14014)
1 л деминерализованной воды вливают в реактор объемом 15 л с последующим добавлением 100,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре вплоть до полного растворения.
Далее добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 15,9 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (25,9 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С; реакцию затем гасят путем добавления водного раствора, состоящего из соляной кислоты (HCl) и хлорида натрия (NaCl).
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле.
После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов; смесь переносят, и продукт выделяют путем фильтрования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакуумной печи при температуре меньшей или равной 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,30.
Пример 4: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,3 (HBint05012014)
2,5 л деминерализованной воды вводят в реактор объемом 15 л с последующим добавлением 250,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 39,8 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (64,8 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора, состоящего из HCl и NaCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне.
После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут. Продукт затем выделяют путем декантирования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в ацетоне, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре меньшей или равной 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют величину DS, равную 0,30.
Пример 5: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,58 (BUT14017)
100 мл деминерализованной воды вводят в реактор объемом 1 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 2,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (9,2 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора, состоящего из HCl и NaCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. Продукт затем выделяют путем декантирования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,58.
Пример 6: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,85 (BUT14019)
100 мл деминерализованной воды вводят в реактор объемом 1 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 5,3 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (9,2 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl и NaCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. Продукт затем выделяют путем декантирования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,85.
Пример 7: Синтез сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=1,30 (HBint04042014-BUT14023)
100 мл деминерализованной воды вводят в реактор объемом 1 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 290 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 13,2 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (23,1 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. Продукт затем выделяют путем декантирования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат в воздушном потоке при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 1,30.
Пример 8: Синтез высокомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,24 (HBint01042014-BUT14025)
1 л деминерализованной воды вливают в реактор объемом 5 л с последующим добавлением 50,0 г гиалуроната натрия с MW 1270 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 10,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (25,9 г) после перемешивания в течение 90 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления 360 мл водного раствора, состоящего из HCl и NaCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов. Продукт затем выделяют путем декантирования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в ацетоне, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.
3 мг твердого вещества растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в пробирку для ЯМР.
10 мг твердого вещества растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,24.
Пример 9: Синтез высокомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,51 (HBint03042014-BUT14032)
0,72 л деминерализованной воды вводят в реактор объемом 5 л с последующим добавлением 30,0 г гиалуроната натрия с MW 1270 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 23,8 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (60,9 г) после перемешивания в течение 60 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов. Продукт затем выделяют путем декантирования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в ацетоне, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.
3 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,51.
Пример 10: Синтез высокомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,97 (HBint02042014-BUT14031)
0,85 л деминерализованной воды вводят в реактор объемом 5 л с последующим добавлением 30,0 г гиалуроната натрия с MW 1270 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 47,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (138,3 г) после перемешивания в течение 60 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в ацетоне. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов, и продукт выделяют путем фильтрования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в ацетоне, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Наконец, продукт суспендируют в ацетоне, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 24 часов.
3 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,97.
Пример 11: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,46 (BUT14037)
35 мл деминерализованной воды выливают в колбу объемом 0,5 л с последующим добавлением 5,0 г гиалуроната натрия с MW 45 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 0,8 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (1,3 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl и NaCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов; смесь переносят и продукт выделяют путем фильтрования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Наконец, продукт суспендируют в изопропаноле, оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут и затем выделяют, удаляя растворитель путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,46.
Пример 12: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=1,68 (BUT14039)
12,5 мл деминерализованной воды вводят в колбу объемом 0,25 л с последующим добавлением 5,0 г гиалуроната натрия с MW 45 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 6,6 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (11,9 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов. Продукт затем выделяют путем декантирования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 1,68.
Пример 13: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=1,90 (BUT14042)
25,0 мл деминерализованной воды выливают в колбу объемом 0,5 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 5 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 13,2 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (68,2 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 2 часов при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов. Продукт затем выделяют путем декантирования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 1,90.
Пример 14: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,06 (BUT14043)
50,0 мл деминерализованной воды вводят в колбу объемом 0,5 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 45 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 0,2 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (0,3 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 2 часов при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения продукт выделяют путем фильтрования при отрицательном давлении; продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 7 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,06.
Пример 15: Синтез низкомолекулярного сложного эфира масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты, DS=0,02 (BUT14044)
50,0 мл деминерализованной воды вводят в колбу объемом 0,5 л с последующим добавлением 10,0 г гиалуроната натрия с MW 45 кДа. Смесь термостатируют при 25°С и оставляют перемешиваться при постоянной температуре до полного растворения.
Затем добавляют динатрия карбонат (Na2CO3 - 0,1 г) и затем добавляют бутирил-имидазолид (0,1 г) после перемешивания в течение 30 минут. Раствор оставляют перемешиваться в течение 1 часа при 25°С, и реакцию затем гасят путем добавления водного раствора HCl и NaCl.
Раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 30 минут, и продукт затем выделяют путем осаждения в изопропаноле. После завершения осаждения раствор оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 16 часов; смесь затем переносят, и продукт выделяют путем фильтрования.
Продукт затем очищают путем последовательных промываний в изопропаноле, после чего продукт выделяют путем фильтрования.
Осадок сушат при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 ч и затем в вакууме при температуре не более 60°С в течение по меньшей мере 16 часов.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл D2O и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
10 мг образца растворяют в 0,7 мл NaOD и переносят в тестовую пробирку для ЯМР.
Путем интегрирования сигналов спектров 1Н ЯМР определяют DS, равную 0,02.
Пример 16: Продукция супероксид-аниона PMN, активированными TNF (фактор некроза опухоли)
Продукцию супероксид-аниона PMN стимулировали в течение 45 мин провоспалительным цитокином TNF в лунках, покрытых FBG (фибриноген; поверхность, пермиссивная для адгезии PMN); CIV (коллаген IV типа - непермиссивная поверхность); НА: гиалуроновая кислота; HABut: бутират гиалуроната натрия DS=0,3 Пример №4).
Лунки, покрытые различными субстратами, заполняют 0,18 мМ раствором цитохрома с и 0,15 нг/мл TNF в буфере Hepes. Полученные таким образом модули нагревают в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе; клеточную суспензию 1,5×106 PMN/мл в буфере Hepes добавляют в каждую лунку. С 15-минутными интервалами планшет извлекают из инкубатора и подвергают спектрофотометрическому анализу в микропланшетном ридере при длинах волн 550 нм и 540 нм, которые соответствуют пику поглощения восстановленного цитохрома с и изобестической точке спектров поглощения восстановленного и окисленного цитохрома с, соответственно. Разница между величинами поглощения, зарегистрированными при двух длинах волн, пропорциональна количеству восстановленного цитохрома с. Количество О2 -, продуцированного 106 клеток, рассчитывают следующим образом:
нмоль O2 -/ 106 PMN=OD × 106/ 0,0037 × n,
где n представляет собой количество клеток, добавляемое в каждую лунку.
Гистограмма, приведенная на Фиг. 2, демонстрирует значительное уменьшение продукции супероксид-аниона (р<0,001, рассчитанное в соответствии с “t” тестом Стьюдента с n=4) в ответ на TNF в PMN, инкубируемых на поверхности, покрытой HABut, со степенью замещения 0,3, по сравнению с PMN, инкубируемых на поверхности, покрытой НА.
Пример 17: Тест адгезии PMN к биологическим поверхностям Адгезия PMN к поверхности, покрытой FBG (поверхность, пермиссивная для адгезии PMN); CIV (непермиссивная поверхность); НА: гиалуроновая кислота; HABut: бутират гиалуроната натрия DS=0,3 Пример №4. Остальное: PMN, не активированные TNF. TNF: PMN, активированные TNF; РМА: PMN, активированные форбола 12-миристата 13-ацетатом.
После проведения спектрофотометрических считываний для измерения продукции О2 - лунки микропланшетов заполняют PBS и центрифугируют при 200 об./мин в течение 5 минут для удаления клеток, которые не прикрепились к поверхности. Миелопероксидазную активность определяют путем измерения окисления 3',5,5'-тетраметилбензидинового (ТМВ) субстрата ферментом МРО (миелопероксидаза) в присутствии Н2О2. Ацетатный буфер, содержащий ТМВ, цетилтриметиламмоний (СТАВ) и 3-амино-1,2-4-триазол (АМТ), добавляют в каждую лунку, и планшет перемешивают в течение 5 мин для того, чтобы облегчить клеточный лизис и способствовать высвобождению МРО из гранул. Активность эозинофильной пероксидазы из эозинофилов, которая может загрязнять препарат PMN, ингибируют при помощи ATM. Через 2 минуты после добавления Н2О2 реакцию гасят H2SO4 и поглощение в каждой лунке измеряют при длине волны 405 нм. Процент прикрепившихся клеток рассчитывают относительно стандартной кривой, которую строят в каждом эксперименте на основе величин пероксидазной активности, рассчитанных для известных количеств клеток.
Гистограмма, приведенная на Фиг. 3, демонстрирует значительное уменьшение (р<0,001, рассчитанное в соответствии с Т тестом Стьюдента с n=4) количества активированных и не активированных PMN, прикрепившихся к поверхности, покрытой HABut, имеющим степень замещения 0,3, по сравнению с количеством PMN, прикрепившихся к поверхности, покрытой НА.
Пример 18: Влияние степени бутиратного замещения и молекулярной массы гиалуроновой кислоты на адгезию активированных и неактивированных PMN
Адгезия PMN, стимулированных TNF, к поверхности, покрытой НА и HABut. HABut: бутират гиалуроната натрия DS=0,3 Пример №4; образцы HABut №1: бутират гиалуроната натрия DS=1,3 Пример №7; образцы HABut №2: HMW (высокомолекулярный) бутират гиалуроната натрия DS=0,24 Пример №8; образцы HABut №3 HMW бутират гиалуроната натрия DS=0,97 Пример №10. Остальное: отрицательный контроль. РМА: положительный контроль.
Черная колонка: PMN, не активированные TNF. Белая колонка: PMN, активированные TNF.
Адгезию PMF к поверхностям оценивают в соответствии с описанным в примере 18.
Гистограмма, приведенная на Фиг. 4 демонстрирует то, что когда степень замещения бутиратом увеличивается, то HABut приводит к тому, что поверхность со все увеличивающейся степенью становится менее пермиссивной к адгезивному взаимодействию с PMN, причем его молекулярная масса, по видимому, не имеет значения.
Claims (12)
1. Способ получения бутирата гиалуроновой кислоты или его соли с щелочным металлом, приемлемой для фармацевтического и косметического использования или использования в медицинском устройстве, включающий взаимодействие гиалуроновой кислоты, возможно в виде соли с натрием или другим щелочным металлом, в водном растворе с бутирил-имидазолидом в присутствии карбоната натрия.
2. Способ по п. 1, где получают натриевую соль бутирата гиалуроновой кислоты.
3. Способ по п. 1 или 2, где натриевая соль гиалуроновой кислоты имеет средневесовую молекулярную массу, находящуюся в диапазоне от 103 до 106 Дальтон.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где бутират гиалуроновой кислоты имеет степень замещения, находящуюся в диапазоне от 0,01 до 2,5.
5. Способ по п. 4, где бутират гиалуроновой кислоты имеет степень замещения, находящуюся в диапазоне от 0,1 до 2.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где взаимодействие осуществляют при температуре, находящейся в диапазоне от 20°С до 30°С.
7. Способ по п. 6, где взаимодействие осуществляют при 25°С.
8. Способ по п. 7, где взаимодействие осуществляют при значении рН, находящемся в диапазоне от 11 до 9.
9. Применение в качестве косметического средства композиции, содержащей бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для косметического использования, получаемые способом по любому из пп. 1-8, и по меньшей мере один эксципиент и/или носитель, приемлемый для косметического использования.
10. Применение медицинского устройства, содержащего бутират гиалуроновой кислоты или его соль, приемлемую для использования в медицинском устройстве, получаемые способом по любому из пп. 1-8, в качестве адъюванта в лечении поражений кожи, таких как воспаления, язвы и поражения, вызываемые гипертермией, индуцированной излучением, например UV (ультрафиолетовым), рентгеновским или гамма-излучением.
11. Применение в качестве косметического средства по п. 9, где такое применение является местным.
12. Применение по п. 10, где такое применение является местным.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ITMI20150017 | 2015-01-13 | ||
ITMI2015A000017 | 2015-01-13 | ||
PCT/EP2016/050268 WO2016113192A1 (en) | 2015-01-13 | 2016-01-08 | Process in water for the preparation of butyric esters of hyaluronic acid sodium salt |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017124364A RU2017124364A (ru) | 2019-02-14 |
RU2017124364A3 RU2017124364A3 (ru) | 2019-07-17 |
RU2708994C2 true RU2708994C2 (ru) | 2019-12-12 |
Family
ID=52574320
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017124364A RU2708994C2 (ru) | 2015-01-13 | 2016-01-08 | Проводимый в воде способ получения сложных эфиров масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10618982B2 (ru) |
EP (1) | EP3245233B1 (ru) |
JP (1) | JP6738337B2 (ru) |
KR (1) | KR102636528B1 (ru) |
CN (1) | CN107106694B (ru) |
BR (1) | BR112017014849B1 (ru) |
CA (1) | CA2973416C (ru) |
DK (1) | DK3245233T3 (ru) |
ES (1) | ES2704290T3 (ru) |
PL (1) | PL3245233T3 (ru) |
PT (1) | PT3245233T (ru) |
RU (1) | RU2708994C2 (ru) |
WO (1) | WO2016113192A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201704637B (ru) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT201900021693A1 (it) | 2019-11-20 | 2021-05-20 | Bmg Pharma S P A | Derivati butirrati o butirrati e formiati dell’acido ialuronico reticolati e loro procedimento di reticolazione |
IT202000001831A1 (it) * | 2020-01-30 | 2021-07-30 | Caprika Srl | Composizione per applicazione rettale a base di sale di acido butirrico per il trattamento delle patologie proctologiche |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005092929A1 (en) * | 2004-03-29 | 2005-10-06 | Sintofarm S.P.A. | Hyaluronic acid butyric esters with a low degree of substitution, procedure for their preparation and use |
WO2009068215A1 (en) * | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Sigea S.R.L. | Mixed butyric-formic esters of acid polysaccharides, and their preparation and use as skin cosmetics |
RU2456299C2 (ru) * | 2006-11-10 | 2012-07-20 | Стифел Лабораториес, Инк | Поперечносшитая гиалуроновая кислота и способ ее изготовления |
RU2472487C2 (ru) * | 2007-11-30 | 2013-01-20 | Аллерган, Инк. | Гелевые полисахаридные композиции и способы длительной доставки лекарственных средств |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU5698186A (en) | 1985-03-15 | 1986-10-13 | Summerton, J. | Polynucleotide assay reagent and method |
EP0416250A3 (en) | 1989-08-01 | 1991-08-28 | The Research Foundation Of State University Of New York | N-acylurea and o-acylisourea derivatives of hyaluronic acid |
US5616568A (en) * | 1993-11-30 | 1997-04-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Functionalized derivatives of hyaluronic acid |
JP3563440B2 (ja) * | 1994-05-16 | 2004-09-08 | 生化学工業株式会社 | アシル化ヒアルロン酸の製造法 |
IT1286510B1 (it) | 1996-11-29 | 1998-07-15 | Cooperativa Centro Ricerche Po | Esteri butirrici ad attivita' antiproliferativa e composizioni farmaceutiche che li contengono |
ITMI20022745A1 (it) * | 2002-12-23 | 2004-06-24 | Coimex Scrl United Companies | Esteri misti dell'acido ialuronico ad attivita' citostatica e prodifferenziante e procedimento per la loro produzione. |
ITMI20030043A1 (it) | 2003-01-14 | 2004-07-15 | Coimex S C R L United Companies | Uso di esteri retinoici dell'acido ialuronico in cellule |
US7091191B2 (en) * | 2003-12-19 | 2006-08-15 | Ethicon, Inc. | Modified hyaluronic acid for use in musculoskeletal tissue repair |
EP1942117A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-09 | Sigea S.R.L. | Derivatives of acid polysaccharides |
WO2012048283A1 (en) * | 2010-10-08 | 2012-04-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | One-step processing of hydrogels for mechanically robust and chemically desired features |
ITGE20120102A1 (it) | 2012-10-25 | 2014-04-26 | Lipogems Internat S R L | Procedimento di precondizionamento chimico di materiale cellulare per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l'espressione di pluripotenzialità |
-
2016
- 2016-01-08 PL PL16701095T patent/PL3245233T3/pl unknown
- 2016-01-08 DK DK16701095.8T patent/DK3245233T3/en active
- 2016-01-08 PT PT16701095T patent/PT3245233T/pt unknown
- 2016-01-08 RU RU2017124364A patent/RU2708994C2/ru active
- 2016-01-08 JP JP2017536522A patent/JP6738337B2/ja active Active
- 2016-01-08 CN CN201680005346.8A patent/CN107106694B/zh active Active
- 2016-01-08 KR KR1020177019077A patent/KR102636528B1/ko active IP Right Grant
- 2016-01-08 WO PCT/EP2016/050268 patent/WO2016113192A1/en active Application Filing
- 2016-01-08 EP EP16701095.8A patent/EP3245233B1/en active Active
- 2016-01-08 BR BR112017014849-8A patent/BR112017014849B1/pt active IP Right Grant
- 2016-01-08 CA CA2973416A patent/CA2973416C/en active Active
- 2016-01-08 ES ES16701095T patent/ES2704290T3/es active Active
- 2016-01-08 US US15/542,443 patent/US10618982B2/en active Active
-
2017
- 2017-07-10 ZA ZA2017/04637A patent/ZA201704637B/en unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005092929A1 (en) * | 2004-03-29 | 2005-10-06 | Sintofarm S.P.A. | Hyaluronic acid butyric esters with a low degree of substitution, procedure for their preparation and use |
RU2456299C2 (ru) * | 2006-11-10 | 2012-07-20 | Стифел Лабораториес, Инк | Поперечносшитая гиалуроновая кислота и способ ее изготовления |
WO2009068215A1 (en) * | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Sigea S.R.L. | Mixed butyric-formic esters of acid polysaccharides, and their preparation and use as skin cosmetics |
RU2472487C2 (ru) * | 2007-11-30 | 2013-01-20 | Аллерган, Инк. | Гелевые полисахаридные композиции и способы длительной доставки лекарственных средств |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112017014849A2 (pt) | 2018-01-09 |
RU2017124364A (ru) | 2019-02-14 |
BR112017014849B1 (pt) | 2022-05-17 |
EP3245233A1 (en) | 2017-11-22 |
CA2973416A1 (en) | 2016-07-21 |
EP3245233B1 (en) | 2018-10-24 |
US20180273648A1 (en) | 2018-09-27 |
WO2016113192A1 (en) | 2016-07-21 |
PL3245233T3 (pl) | 2019-06-28 |
DK3245233T3 (en) | 2019-01-28 |
CA2973416C (en) | 2023-05-09 |
PT3245233T (pt) | 2019-01-16 |
ES2704290T3 (es) | 2019-03-15 |
ZA201704637B (en) | 2018-12-19 |
KR102636528B1 (ko) | 2024-02-15 |
RU2017124364A3 (ru) | 2019-07-17 |
CN107106694A (zh) | 2017-08-29 |
US10618982B2 (en) | 2020-04-14 |
JP2018501385A (ja) | 2018-01-18 |
JP6738337B2 (ja) | 2020-08-12 |
KR20170105010A (ko) | 2017-09-18 |
CN107106694B (zh) | 2020-09-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Liu et al. | Synthesis of carboxymethyl chitin in aqueous solution and its thermo-and pH-sensitive behaviors | |
Sabnis et al. | Improved infrared spectroscopic method for the analysis of degree of N-deacetylation of chitosan | |
EP2522337B1 (en) | Hyaluronic acid esters, their preparation and use in dermatology | |
Kogan et al. | Hyaluronic acid: A biopolymer with versatile physico-chemical and biological properties | |
EP2222713B1 (en) | Mixed butyric-formic esters of acid polysaccharides, and their preparation and use as skin cosmetics | |
JP4094059B2 (ja) | 低い多分散指数を有するヒアルロン酸分画の調整方法 | |
RU2708994C2 (ru) | Проводимый в воде способ получения сложных эфиров масляной кислоты и натриевой соли гиалуроновой кислоты | |
Fuchs et al. | Glycosaminoglycan degradation by selected reactive oxygen species | |
AU2002321225B2 (en) | Polysaccharidic esters of retinoic acid | |
Pavan et al. | A new potential spreading factor: Streptomyces koganeiensis hyaluronidase. A comparative study with bovine testes hyaluronidase and recombinant human hyaluronidase of the HA degradation in ECM | |
US8101733B1 (en) | Methods of evaluating mixtures of polysaccharides | |
EP1371666B1 (en) | Use of desulfated heparin | |
EP3398971A1 (en) | Sulfated heparin oligosaccharide and preparation method and application thereof | |
AU2002321225A1 (en) | Polysaccharidic esters of retinoic acid | |
Deschrevel et al. | Chain-length dependence of the kinetics of the hyaluronan hydrolysis catalyzed by bovine testicular hyaluronidase | |
Petit et al. | Controlled sulfatation of natural anionic bacterial polysaccharides can yield agents with specific regenerating activity in vivo | |
EP3119814B1 (en) | Chondroitin sulphate purification method | |
Pitarresi et al. | Preparation and characterization of new hydrogels based on hyaluronic acid and α, β-polyaspartylhydrazide | |
Karamanos et al. | Strategies for analysis and structure characterization of glycans/proteoglycans by capillary electrophoresis. Their diagnostic and biopharmaceutical importance | |
Zhao et al. | A novel crosslinking process for hyaluronan |