JPH07303491A

JPH07303491A - 光学活性な酸アミドの製造法

Info

Publication number: JPH07303491A
Application number: JP7030360A
Authority: JP
Inventors: Kazumasa Otsubo; 一政大坪; Keizo Yamamoto; 敬三山本
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1994-03-16
Filing date: 1995-02-20
Publication date: 1995-11-21

Abstract

(57)【要約】【構成】一般式（２）【化１】（式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は各々異なり、水素原
子、ハロゲン原子、置換されてもよいアミノ基、アルキ
ル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、
シクロアルキル基または複素環式基を示すか、またはＲ
¹とＲ²とＲ³のうち２つが結合して脂環式環を形成し
てもよい。ｎは０〜３の整数を示す）で表されるラセミ
体のニトリル化合物に、該ラセミ体のニトリル化合物の
ニトリル基を光学選択的に水和し得る能力を有するロド
コッカス属などに属する微生物またはその処理物を作用
させ、対応する光学活性な酸アミド化合物の製造法であ
る。【効果】医薬品およびその製造中間体として有用な光
学活性な酸アミド化合物を、ラセミ体のニトリル化合物
に光学選択的に水和する能力を有する微生物またはその
処理物を作用させることにより、効率よく、且つ高純度
に製造することが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物の使用による、
不整脈用剤、動脈硬化治療剤等の医薬品またはその中間
体として重要な光学活性な酸アミドの製造法に関する。
さらに詳しくは、本発明は、微生物を用いてラセミのニ
トリルから対応する光学活性な酸アミドの製造法および
新規な微生物ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９
（ＦＥＲＭＰ−１３９４７）株に関する。

【０００２】

【従来の技術】光学活性の酸アミドの製造に関しては、
光学活性な分割剤を用いる方法や不斉合成法、微生物を
用いる方法が知られている。例えば、（１）ラセミ体の
α−｛２−〔ビス（１−メチルエチル）アミノ〕エチ
ル｝−α−フェニル−２−ピリジルアセトアミドを無水
エタノール中、（＋）−酒石酸、無水１，１’−オキシ
ビスエタンにより結晶化させ、再結晶して（−）−α−
｛２−〔ビス（１−メチルエチル）アミノ〕エチル｝−
α−フェニル−２−ピリジルアセトアミドを得る方法
（特公昭６３−５４６８７号公報）、

【０００３】（２）ラセミ体の２，２−ジメチルシクロ
プロパンカルボキサミド中のＲ体のみをＲ−（−）−
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸に変換し、
残ったＳ体を取得する方法が報告されている（特開平５
−７６３９１号公報）。

【０００４】微生物による不斉炭素を分子内に持つラセ
ミ体のニトリルからの光学活性の酸アミドの生産に関し
ては、例えば、（３）ラセミ体のαーアミノニトリルに
バチルス属、バクテリジューム属、ミクロコッカス属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物を作用させて
Ｌ−α−アミノ酸とＤ−α−アミノアミドの混合物を製
造する方法（特表昭５６−５０００３１号公報）、

【０００５】（４）ラセミ体のαーアミノニトリルにシ
ュードモナス属、ロドコッカス属またはノカルディア属
に属する微生物を作用させてＬ−α−アミノ酸とＤ−α
−アミノアミドの混合物を製造する方法（特開平２−３
１６９４号公報）、（５）ラセミ体のマンデロニトリル
にロドコッカス属に属する微生物を作用させてα位に水
酸基を有するＳ−（＋）−マンデルアミド類を製造する
方法（特開平４−２２２５９１号公報）、

【０００６】（６）ラセミ体の２−アリールアルカンニ
トリル類にシュードモナス属、セラチア属またはモラキ
セラ属に属する微生物を作用させてα位に水酸基または
低級アルキル基を有する光学活性なアミドを製造する方
法（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０５２７５号明細書）、
（７）ラセミ体の２−アリールアルカンニトリル類にシ
ュードモナス属する微生物を作用させてα位に低級アル
キル基を有する光学活性なアミド、例えば２−フェニル
プロピオンアミドを製造する方法（特開平５−２５２９
９０号公報）等が挙げられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】先行文献（１）の光学
分割法は、比較的高価な光学分割剤が必要な上、医薬品
として一般的に必要とされる光学純度９８％ｅ．ｅ．に
するためには、何回も溶媒中で再結晶を繰り返す必要が
ある。さらに、不要な（＋）−体が半分量残ってしまう
が、酸アミド化合物のラセミ化は困難であるため、経済
的に極めて不利である。

【０００８】先行文献（２）はアミダーゼを用いる方法
であるが、生成した不要なＲ−カルボン酸は廃棄する
か、ラセミ化、アミド化して再使用しなければならず、
工程が複雑である。先行文献（３）および（４）の方法
では、ラセミ体のα−アミノニトリルからアミダーゼの
光学選択性を利用して、Ｌ−α−アミノ酸とＤ−α−ア
ミノアミドの両者が生成されること、両者の混合物から
両者を分離、精製する工程が必要であること、目的とす
る光学活性なアミドが半量しか得られず、経済的に不利
である。

【０００９】先行文献（５）の方法では、反応に用いる
ニトリル濃度が約０．２％と低く、工業的レベルとは程
遠い。先行文献（６）の方法は、何れの微生物もアミド
生成活性が低く、反応に用いるニトリル濃度が約０．２
〜０．８％と低いため、工業的に不利である。先行文献
（７）の方法では生成した光学活性アミドの光学純度が
３０％ｅ．ｅ．程度と極めて低く、光学活性アミドとし
ての工業的価値が低い。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記の通り、公知の光学
活性な酸アミドの製造法にはいずれも種々の欠点を有し
ている。そこで、本発明者らは、上記の欠点を解決すべ
く、光学活性な酸アミド化合物を効率よく製造する方法
について鋭意検討を行った結果、後記一般式（２）で表
される光学活性な酸アミド化合物に変換する光学選択的
なニトリルヒドラターゼ活性を有するが、生成された後
記一般式（１）で表される光学活性な酸アミド化合物を
対応するカルボン酸に変換するアミダーゼ活性は著しく
弱く、且つラセミ化しない能力を有する微生物が存在し
ていることを見出し、この微生物を利用することにより
ラセミ体のニトリル化合物から効率よく光学活性な酸ア
ミド化合物が製造できることを知り、本発明を完成させ
たものである。

【００１１】すなわち、本発明は、一般式（２）

【００１２】

【化３】

【００１３】（式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は各々異な
り、水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよいア
ミノ基、置換されていてもよいアルキル基、置換されて
いてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアリー
ル基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換さ
れていてもよいシクロアルキル基または置換されていて
もよい複素環式基を示すか、またはＲ¹とＲ²とＲ³の
うち２つが結合して脂環式環を形成してもよい。ｎは０
〜３の整数を示す）で表されるラセミ体のニトリル化合
物〔以下、単に「ラセミ体のニトリル（２）」と称す
る〕に、ロドコッカス属、アルカリゲネス属、ロドシュ
ードモナス属、コリネバクテリウム属、バチルス属、マ
イコバクテリウム属、ノカルディア属、アルスロバクタ
ー属、クレブシエラ属、ブレビバクテリウム属、アクレ
モニウム属またはキャンディダ属に属し、ラセミ体のニ
トリル（２）のニトリル基を光学選択的に水和し得るニ
トリルヒドラターゼ活性を有する微生物またはその処理
物を作用させることを特徴とする一般式（１）

【００１４】

【化４】

【００１５】（式中、^*Ｃは不斉炭素原子を示し、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびｎは前記と同じ意味を有する）
で表される光学活性な酸アミド化合物〔以下、単に「光
学活性な酸アミド（１）」と称する〕の製造法であり、
新規な微生物ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９
（ＦＥＲＭＰ−１３９４７）株である。

【００１６】上記一般式（２）において定義される
Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は各々同一または異なり、それぞ
れ任意に、水素原子、ハロゲン原子、置換されていても
よいアミノ基、置換されていてもよいアルキル基、置換
されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよい
アリール基、置換されていてもよいアリールオキシ基、
置換されていてもよいシクロアルキル基または置換され
ていてもよい複素環式基を示す。

【００１７】ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原
子、塩素原子、ヨウ素原子、臭素原子が挙げられる。ア
ミノ基は置換されていてもよく、望ましい置換基は、例
えばアセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジル
オキシカルボニル基である。アルキル基としては、炭素
数１〜８個の分鎖を有していてもよいアルキル基が望ま
しく、特に炭素数１〜４個の分鎖を有していてもよいア
ルキル基が好ましい。例えば、メチル基、エチル基、プ
ロピル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、イソブチル
基等が挙げられる。アルコキシ基としては、炭素数１〜
８個の分鎖を有していてもよいアルコキシ基が望まし
く、特に炭素数１〜４個の分鎖を有していてもよいアル
コキシ基が好ましい。例えば、メトキシ基、エトキシ
基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔ−ブトキシ
基、イソブトキシ基等が挙げられる。

【００１８】アリール基およびアリールオキシ基におけ
るアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル
基が挙げられる。シクロアルキル基としては、炭素数３
〜８個のシクロアルキル基が望ましく、炭素数５〜７個
のシクロアルキル基が好ましい。例えば、シクロペンチ
ル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等が挙げられる。
複素環式基としては、異種原子として、窒素原子、酸素
原子、硫黄原子の少なくとも１種を１個から３個含み、
３〜１５個の炭素原子から構成される複素環からなるも
のが好ましい。このような複素環としては、例えば、チ
オフェン、インドール、ピリジン、ピロリジン等が挙げ
られる。

【００１９】上記のアルキル基、アリール基、アリール
オキシ基および複素環式基は、炭素原子および／または
窒素原子に結合した水素原子は適当な置換基で置換され
ていてもよい。かかる置換基としては、例えば、フッ素
原子、塩素原子、ヨウ素原子、臭素原子等のハロゲン原
子、チオール基、ニトロ基、アミノ基、低級アルキル
基、低級アルコキシ基、炭素数１〜１０個のアシル基、
フェニル基やナフチル基のようなアリール基、フェニル
オキシ基やナフチルオキシ基のようなアリールオキシ基
等が挙げられる。これらの置換基中の炭素原子および窒
素原子に結合した水素が、更に上記の置換基で置換され
ていてもよい。

【００２０】Ｒ¹とＲ²とＲ³のうち２つが結合して脂
環式環を形成する場合の脂環式環としては炭素数３〜８
個の脂環式環が望ましく、炭素数４〜７個の脂環式環が
好ましい。例えば、シクロプロパン、シクロペンタン、
シクロヘキサン、シクロヘプタン環が挙げられる。

【００２１】本発明により製造できる光学活性な酸アミ
ド（１）の代表例を示すと、例えば次の通りである。α
−｛２−〔ビス（１−メチルエチル）アミノ〕エチル｝
−α−フェニル−２−ピリジルアセトアミド、α−｛２
−〔（１−メチルエチル）アミノ〕エチル｝−α−フェ
ニル−２−ピリジルアセトアミド、２，２−ジメチルシ
クロプロパンカルボキサミド、１−（２，３−メチレン
ジオキシフェニル）−ヘキサンカルボキサミド、２−
〔２，３−（メチレンジオキシ）フェニル〕−バレルア
ミド、α−〔（１−オキソブチル）アミノ〕−β−フェ
ニルプロピオンアミド、

【００２２】Ｎ−［１−（アミノカルボニル）−３−
（メチルチオ）プロピル］−４−クロロ−α−（メルカ
プトメチル）−β−フェニルプロピオンアミド、１−ベ
ンジル−２−ピロリジンカルボキサミド、１−ヘキシル
ピロリジン−２−カルボキサミド、α−メトキシ−α−
トリフルオロメチル−フェニルアセトアミド、α−シア
ノ−α−メチル−ヒドロキシシンナマミド、イブプロフ
ェンアミド、

【００２３】ナプロキセンアミド、プラノプロフェンア
ミド、ケトプロフェンアミド、フェノプロフェンアミ
ド、チアプロフェン酸アミド、ロキソプロフェンアミ
ド、

【００２４】α−フェニルプロピオンアミド、スプロフ
ェンアミド、インドプロフェンアミド、プロチジン酸ア
ミド、アルミノプロフェンアミド、ベノキサプロフェン
アミド、

【００２５】ミロプロフェンアミド、フルノキサプロフ
ェンアミド、２−フェニル酪酸アミド、４−クロロ−α
−（１−メチルエチル）−フェニルアセトアミド、２−
フェノキシプロピオンアミド、２−（２−メチル−４−
クロロフェノキシ）−プロピオンアミド、

【００２６】２−（２，４−ジクロロフェノキシ）−プ
ロピオンアミド、２−フェニル−３−メチル酪酸アミ
ド、α−プロピル−フェニルアセトアミド、２−フェニ
ル−２−ブチルアセトアミド、β，β，β−トリフルオ
ロ−α−フェニルプロピオンアミド、α−フェニル−β
−フェニルプロピオンアミド、

【００２７】α−エチル−フェニルアセトアミド、α−
（１，１−ジメチルエチル）−フェニルアセトアミド、
α−ホルミル−フェニルアセトアミド、α−（２−メチ
ルプロピル）−フェニルアセトアミド、α−フェニル−
δ−フェニルバレルアミド、３−エチル−２−フェニル
−バレルアミド、α−フェニル−γ−フェニル酪酸アミ
ド、２−フェニル−デカンアミド、β，β−ジフェニル
−α−フェニルプロピオンアミド、α−シクロヘキシル
−フェニルアセトアミド、２，２−ジメチルシクロプロ
パンカルボキサミド２−アミノカルボニル−２−ベンジルオキシカルボニル
コハク酸ジエチルエステル、１，２，２−トリフェニル
プロピオンアミドのＲまたはＳ体、もしくは（＋）また
は（−）体。

【００２８】上記化合物において、上記一般式（２）お
よび一般式（１）において、式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ
³は各々異なり、水素原子、置換されていてもよいアル
キル基、置換されていてもよいアリール基または置換さ
れていてもよいシクロアルキル基であり、ｎが０である
ラセミ体のニトリル化合物および光学活性な酸アミド化
合物が好ましい。さらに好適には、一般式（１）におけ
る光学活性な酸アミド化合物がＳ−２−フェニル−３−
メチル酪酸アミド、Ｓ−α−（１，１−ジメチルエチ
ル）−フェニルアセトアミド、Ｓ−α−シクロヘキシル
−フェニルアセトアミド、Ｓ−１，２，２−トリフェニ
ルプロピオンアミドであり、これらの光学活性な酸アミ
ド化合物に該当する一般式（２）で表されるラセミ体の
ニトリル化合物を用いるものである。

【００２９】本発明における出発物質であるラセミ体の
ニトリル化合物（２）は、例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，７９，３４６７−３４６９（１９５
７）、特開昭５１−７０７４４号公報、特開昭５１−１
２２０３６号公報、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，８，６４５
（１９８６）等の公知の方法に従って製造することがで
きる。また、市販カタログに記載の出発物質は購入して
使用してもよい。

【００３０】本発明におけるラセミ体のニトリル（２）
とは、２つの光学異性体の混合物を意味し、その混合比
は特に限定されず、一方の光学異性体の比が著しく多い
場合も含まれる。

【００３１】本発明においては、ラセミ体のニトリル
（２）に反応媒体中、ラセミ体のニトリル（２）のニト
リル基を光学選択的に水和し得るニトリルヒドラターゼ
活性を有する微生物またはその処理物を作用させること
により行われる。

【００３２】本発明に用いられる微生物としては、ロド
コッカス属、アルカリゲネス属、ロドシュウドモナス
属、コリネバクテリウム属、バチルス属、マイコバクテ
リウム属、ノカルディア属、アルスロバクター属、ブレ
ビバクテリウム属、クレブシエラ属、アクレモニウム属
またはキャンディダ属に属し、ラセミ体のニトリル
（２）のニトリル基を光学選択的に水和し得るニトリル
ヒドラターゼ活性を有するものである限り、いずれの微
生物でもよいが、生成された光学活性な酸アミド（１）
に対応するカルボン酸に変換するアミダーゼ活性が著し
く弱く、且つラセミ化しない能力を有する微生物である
ことが望ましい。例えば、

【００３３】ロドコッカス・エスピーＫＰＯ−２２８
７（ＦＥＲＭＰ−１３９４２）、ロドコッカス・エス
ピーＰＰ−２９（ＦＥＲＭＰ−１３９４５）、ロド
コッカス・エスピーＰＰ−１２１（ＦＥＲＭＰ−１
３９４６）、ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９
（ＦＥＲＭＰ−１３９４７）、ロドコッカス・エスピ
ーＫＰＯ−２０２８（ＦＥＲＭＰ−１３９４３）、
ロドコッカス・エスピーＰＰ−２５（ＦＥＲＭＰ−
１３９４４）、

【００３４】ロドコッカス・エスピーＨＰ−７８（Ｆ
ＥＲＭＰ−１３９４８）、ロドコッカスエスピー
ＫＰＯ−２０１９（ＦＥＲＭＰ−１３９４１）、ロド
コッカス・エスピーＡＫ３２（ＦＥＲＭＢＰ−１０
４６）、アルカリゲネス・エスピーＨＰ−４５８（Ｆ
ＥＲＭＰ−１２６３２）、アルカリゲネス・エスピー
ＨＰ−６１１（ＦＥＲＭＰ−１２６３３）、アルカ
リゲネス・エスピーＨＰ−７９７（ＦＥＲＭＰ−１
２６３４）、

【００３５】ロドシュードモナス・スフェロイデスＡ
ＴＣＣ１１１６７、コリネバクテリウム・エスピー
ＨＰ−２２６８（ＦＥＲＭＰ−１２６３１）、コリネ
バクテリウム・エスピーＫＯ−２−４（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２３５３）、コリネバクテリウム・エスピーＨＰ
−６４３（ＦＥＲＭＰ−１２６３０）、コリネバクテ
リウム・エスピーＣ５（ＦＥＲＭＰ−８９３１）、
コリネバクテリウム・エスピーＡ６８（ＦＥＲＭＰ
−１０２２４）、

【００３６】バチルス・サブチリスＰＰ−１１６−１
５（ＦＥＲＭＰ−１３９４９）、マイコバクテリウム
・エスピーＡＣ７７７（ＦＥＲＭＢＰ−２３５
２）、ノカルディア・グロベルラＡＴＣＣ２１５０
５、アルスロバクター・エスピーＡ７（ＦＥＲＭＰ
−８９２７）、ブレビバクテリウム・エスピーＰＰ−
１３３−７（ＦＥＲＭＰ−１３９５０）、クレブシエ
ラ・エスピーＤ５Ｂ（ＦＥＲＭＰ−８９３２）、

【００３７】アクレモニウム・エスピーＤ９Ｋ（ＦＥ
ＲＭＰ−８９３０）、キャンディダ・トロピカリス
ＡＴＣＣ２０３１１等の菌株が挙げられる。本発明に
おいてはこれらの菌株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の公知の変異剤によ
り処理して得た変異株や遺伝子工学的手法により改変し
た菌株を使用することもできる。

【００３８】ロドコッカスエスピー・ＡＫ３２（ＦＥＲ
ＭＢＰ−１０４６）、アルカリゲネス・エスピーＨ
Ｐ−４５８（ＦＥＲＭＰ−１２６３２）、アルカリゲ
ネス・エスピーＨＰ−６１１（ＦＥＲＭＰ−１２６
３３）、アルカリゲネス・エスピーＨＰ−７９７（Ｆ
ＥＲＭＰ−１２６３４）、コリネバクテリウム・エス
ピーＨＰ−２２６８（ＦＥＲＭＰ−１２６３１）、
コリネバクテリウム・エスピーＫＯ−２−４（ＦＥＲ
ＭＢＰ−２３５３）、コリネバクテリウム・エスピー
ＨＰ−６４３（ＦＥＲＭＰ−１２６３０）、コリネ
バクテリウム・エスピーＣ５（ＦＥＲＭＰ−８９３
１）、コリネバクテリウム・エスピーＡ６８（ＦＥＲＭ
Ｐ−１０２２４）、マイコバクテリウム・エスピー
ＡＣ７７７（ＦＥＲＭＢＰ−２３５２）、アルスロバ
クター・エスピーＡ７（ＦＥＲＭＰ−８９２７）、
クレブシエラ・エスピーＤ５Ｂ（ＦＥＲＭＰ−８９
３２）およびアクレモニウム・エスピーＤ９Ｋ（ＦＥ
ＲＭＰ−８９３０）の菌学的性質については、特開平
２−８４１９８号公報、特開昭６３−２０９５９２号公
報、特開平３−２２４４９６号公報、特開平５−１９２
１９０号公報、特開昭６３−１２９９８８号公報、特開
昭６３−２０９５９２号公報、特開昭６３−２９４７９
３号公報、特開平３−１９６９５号公報に記載されてい
る。

【００３９】ロドコッカス・エスピーＫＰＯ−２２８
７（ＦＥＲＭＰ−１３９４２）、ロドコッカス・エス
ピーＰＰ−２９（ＦＥＲＭＰ−１３９４５）、ロド
コッカス・エスピーＰＰ−１２１（ＦＥＲＭＰ−１
３９４６）、ロドコッカス・エスピーＢＰ−４７９−
９（ＦＥＲＭＰ−１３９４７）、ロドコッカス・エス
ピーＫＰＯ−２０２８（ＦＥＲＭＰ−１３９４
３）、ロドコッカス・エスピーＰＰ−２５（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３９４４）、ロドコッカス・エスピーＨＰ−
７８（ＦＥＲＭＰ−１３９４８）、ロドコッカス・エ
スピーＫＰＯ−２０１９（ＦＥＲＭＰ−１３９４
１）、ブレビバクテリウム・エスピーＰＰ−１３３−
７（ＦＥＲＭＰ−１３９５０）およびバチルス・サブ
チリスＰＰ−１１６−１５（ＦＥＲＭＰ−１３９４
９）は、新たに土壌中よりニトリル資化菌として分離し
たものであって、上記の寄託番号で工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されている。以下に、これらの菌
株の菌学的性質を示すと次の通りである。

【００４０】（１）ＫＰＯ−２２８７菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；有り運動性の有無；無し胞子の有無；無しグラム染色；陽性肉汁寒天平板培地におけるコロニーの状態；生育良好、
ピンク、不透明、円形、凸状、滑らかカタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陰性ＯＦテスト；− 細胞壁ジアミノ酸；ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸その他；ミコール酸を含む属；ロドコッカス属

【００４１】（２）ＰＰ−２９菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；有り運動性の有無；無し胞子の有無；無しグラム染色；陽性肉汁寒天平板培地におけるコロニーの状態；生育良好、
オフホワイト、半透明、円形、光沢、低い凸状カタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陰性ＯＦテスト；− 細胞壁ジアミノ酸；ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸その他；ミコール酸を含む属；ロドコッカス属

【００４２】（３）ＰＰ−１２１菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；有り運動性の有無；無し胞子の有無；無しグラム染色；陽性肉汁寒天平板培地におけるコロニーの状態；生育良好、
オフホワイト、半透明、円形、低い凸状、滑らかカタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陰性ＯＦテスト；− 細胞壁ジアミノ酸；ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸その他；ミコール酸を含む属；ロドコッカス属

【００４３】（４）ＫＰＯ−２０２８菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；有り運動性の有無；無し胞子の有無；無しグラム染色；陽性肉汁寒天平板培地におけるコロニーの状態；生育良好、
ピンク、不透明、円形、光沢、凸状、滑らかカタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陰性ＯＦテスト；− 細胞壁ジアミノ酸；ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸その他；ミコール酸を含む属；ロドコッカス属

【００４４】（５）ＰＰ−２５菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；有り運動性の有無；無し胞子の有無；無しグラム染色；陽性肉汁寒天平板培地におけるコロニーの状態；生育良好、
ピンク、不透明、円形、光沢、凸状、滑らかカタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陰性ＯＦテスト；− 細胞壁ジアミノ酸；ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸その他；ミコール酸を含む属；ロドコッカス属

【００４５】（６）ＨＰ−７８菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；有り運動性の有無；無し胞子の有無；無しグラム染色；陽性肉汁寒天平板培地におけるコロニーの状態；生育良好、
オフホワイト、半透明、円形、低い凸状、光沢、滑らかカタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陰性ＯＦテスト；− 細胞壁ジアミノ酸；ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸その他；ミコール酸を含む属；ロドコッカス属

【００４６】（７）ＫＰＯ−２０１９菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；有り運動性の有無；無し胞子の有無；無しグラム染色；陽性肉汁寒天平板培地におけるコロニーの状態；生育良好、
クリーム、不透明、円形、凸状カタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陰性ＯＦテスト；− 細胞壁ジアミノ酸；ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸その他；ミコール酸を含む属；ロドコッカス属

【００４７】（８）ＰＰ−１３３−７菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；有り運動性の有無；無し胞子の有無；無しグラム染色；陽性肉汁寒天平板培地におけるコロニーの状態；生育良好、
オフホワイト、半透明、円形、低い凸状、光沢、滑らかカタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陰性ＯＦテスト；− 細胞壁ジアミノ酸；ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸属；ブレビバクテリウム属

【００４８】（９）ＰＰ−１１６−１５菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；無し運動性の有無；有り胞子の有無；有りグラム染色；陽性肉汁寒天平板におけるコロニーの状態；生育良好、不透
明、若干不規則、表面に若干くぼみ、光沢カタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陽性ＯＦテスト；Ｆ

【００４９】胞子位置；ターミナルまたはサブターミナル胞子の形状；エリプティカルまたはシリンドリ
カル細胞内小球体；− 嫌気培養；＋７％ＮａＣｌ含有培地での生育；＋グルコースからの酸生成；＋ＶＰテスト；＋カゼイン分解；＋ゼラチン分解；＋デンプン加水分解；＋硝酸還元；− ウレアーゼ；＋ β−ガラクトシダーゼ；＋クエン酸の利用；＋属・種；バチルス・ズブチリス

【００５０】（１０）ＢＰ−４７９−９菌株細胞の形；かん状細胞の多形性の有無；有り運動性の有無；無し胞子の有無；無しグラム染色；陽性肉汁寒天平板培地におけるコロニーの状態；生育良好、
オフホワイト、不透明、円形、滑らか、凸状、光沢カタラーゼ；陽性オキシダーゼ；陰性ＯＦテスト；− 細胞壁ジアミノ酸；ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸

【００５１】その他の生理学的性質硝酸塩の還元；陽性ピラジンアミダーゼ；陽性システインアリルアミダーゼ；陰性バリンアリルアミダーゼ；陽性ピロリドニルアリルアミダーゼ；陰性アルカリフォスファターゼ；陽性 β−グルコロニガーゼ；陰性 β−ガラクトシダーゼ；陰性

【００５２】 α−グルコシダーゼ；陽性Ｎ−アセチルグルコサミダーゼ；陰性ウレアーゼ；陰性ゼラチン分解；陰性溶血性；陰性アデニン分解；陽性チロシン分解；陰性５％ＮａＣｌ存在下での生育；生育するリボースからの酸生成；陽性

【００５３】各単一炭素源での生育イノシトール；− マルトース；− マンニトール；− ラムノース；− ソルビトール；− ｍ−ヒドロキシ安息香酸；＋アジピン酸ナトリウム；−

【００５４】クエン酸ナトリウム；− グルタミン酸ナトリウム；＋Ｌ−チロシン；− グリセロール；− トレハロース；− アセトアミド；− Ｄ−ガラクトース；− 種・属；ロドコッカス・マリス

【００５５】上記の菌株の同定に際しては、バージェイ
ズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），第２
巻（１９８６）およびザ・プロカリオート（ＴｈｅＰ
ｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ），第２版（１９９２）に従って
分類した。

【００５６】本発明においては、先ず、本発明で使用さ
れる微生物が培養される。微生物の培養は、公知の方法
に準じて行うことができる。使用する培地は、一般微生
物の栄養源として公知のものが利用でき、グルコース、
グリセリン、エタノール、シュークロース、グルタミン
酸、酢酸、クエン酸、フマル酸等の炭素源、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、アンモニア、尿素等の窒素
源、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス等の
有機栄養源、リン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、コ
バルト、マンガン、ランタン等の無機栄養源を適宜組み
合わせて使用できる。また、本微生物の反応活性を上昇
させる物質として、アセトニトリル、イソブチロニトリ
ル等のシアノ化合物、カプロラクタム等のアミド化合物
を添加してもよい。培地のｐＨは５〜１０の範囲で選べ
ばよく、培養温度は１８〜５０℃、好ましくは２５〜４
０℃である。培養温度は１〜１０日の範囲で活性が最大
になるまで培養すればよい。

【００５７】上記の微生物の処理物とは、ラセミ体のニ
トリル（２）のニトリル基を光学選択的に水和し得るニ
トリルヒドラターゼ活性を有していれば、如何なる形態
であってもよいことを意味する。該酵素活性が主として
菌体内に存在するか、または菌体外に存在するかにより
その形態は異なり、該酵素活性が菌体内に存在する場合
には、前記微生物を培養した培養物、それから集めた菌
体、菌体処理物（例えば、該菌体の破砕物、これらの菌
体から分離、抽出した種々の精製段階での酵素活性
体）、菌体または菌体処理物を公知の適当な方法により
担体に固定化したものを示し、該活性が菌体内に存在す
る場合には、前記微生物を培養した培養物、培養濾液、
培養濾液から分離、抽出した酵素活性体、該酵素活性体
を公知の適当な方法により担体に固定化した固定化活性
体等を示す。

【００５８】上記の処理物において、酵素活性体として
使用する場合には、該微生物から公知の酵素精製手段を
用いて単離・精製することができる。例えば、該酵素が
菌体内酵素である場合には、微生物の培養物を遠心分離
等によって菌体を集め、超音波処理、ダイノミル等の機
械的手段によって菌体を破砕する。細胞片等の固形物を
遠心分離等によって除いて粗酵素液を得、超遠心分離分
画、塩析、有機溶媒沈澱、吸着クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー等を行うことにより精製される。酵素精製操作中、
酵素の失活を防ぐための安定剤として、一般的に使用す
る安定剤または１〜１００ｍＭ程度のイソブチルアミド
を添加してもよい。

【００５９】本発明においては、ラセミ体のニトリル
（２）を光学選択的に水和するニトリルヒドラターゼ活
性を有する微生物またはその処理物を用いて目的の光学
活性な酸アミド（１）を製造するためには、通常、得ら
れた微生物またはその処理物を反応媒体中適当な条件下
でラセミ体のニトリル（２）と接触させればよい。

【００６０】上記の反応媒体としては、水、緩衝液また
は培養液等の水性媒体、水性媒体とメタノール、ジメチ
ルスルホキシド、アセトン等の水溶性有機溶媒との混合
媒体、さらには水性媒体とヘキサン、酢酸エチル、ジエ
チルエーテル、トルエン等の水不溶性有機溶媒とからな
る二相系媒体（水で飽和した水不溶性有機溶媒を含む）
が使用できる。また、反応媒体に適当な界面活性剤を
０．０１〜２％程度添加してもよい。

【００６１】ラセミ体のニトリル（２）は、粉末もしく
は液状のままで、または適当な溶媒に溶かして反応媒体
に添加すればよい。添加濃度は、０．０１〜７０重量％
程度、好ましくは１．０〜５０重量％程度であり、反応
媒体中に完全に溶解しなくてもよい。

【００６２】上記反応において使用する微生物またはそ
の処理物の濃度は、該ニトリルヒドラターゼ活性の度合
いにより異なるが、通常、菌体の場合には０．０５〜２
０重量％の範囲でよい。反応温度は、５〜８０℃程度、
好ましくは１５〜６０℃程度、反応ｐＨは４〜１１程
度、好ましくは７〜１０程度である。反応時間は、通常
１〜１００時間の範囲で行えばよいが、反応経過は高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等によって追跡で
きるので、生成する光学活性な酸アミド化合物（２）の
光学純度が所望の光学純度より低下しない時間、望まし
くは８０％ｅ．ｅ．以上、特に望ましくは９２％ｅ．
ｅ．以上のときに反応を終了するのがよい。反応中、消
費されるニトリル（２）は上記の濃度範囲内に維持され
るように反応液に添加してもよい。

【００６３】上記の生成反応により得られた光学活性な
酸アミド（１）を反応液から採取するには、例えば、反
応終了後、ヘキサン、酢酸エチル等の溶媒で抽出分離す
る方法。シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー
にて分離する方法、あるいは生成した酸アミド（１）の
反応溶媒に対する溶解度が低い場合は、反応中に結晶が
析出するので、これを遠心分離等によって取得すること
ができる。

【００６４】本発明における反応機構は、ニトリルをア
ミドに変換する酵素ニトリルヒドラターゼがラセミ体の
ニトリルの一方の異性体にのみ選択的に作用すること、
即ち、該酵素による反応速度が光学異性体によって大き
く異なることに基づくと考えられる。さらに、酸アミド
を酸に変換するアミダーゼの活性がニトリルヒドラター
ゼ活性の１％以下と極めて低いため、生成した光学活性
な酸アミド（１）が酸に変換されることなく回収でき
る。

【００６５】また、本発明により光学活性な酸アミド
（１）を製造すると、未反応の光学活性なニトリル化合
物が残存する。これは抽出、遠心分離、カラム分離等の
簡便な操作で回収できる。回収した光学活性ニトリル化
合物自体も、医薬品や光学分割剤として有用な光学活性
アミン化合物や光学活性カルボン酸に変換し使用でき
る。また、回収した光学活性ニトリル化合物は、例え
ば、メタノール等の溶媒存在下でアンモニアや水酸化ナ
トリウムにより容易にラセミ化でき、ラセミ体のニトリ
ル（２）として、本発明の原料として用いることができ
る。従って、光学活性な酸アミド（１）のみの製造を目
的とするならば、高収率で目的の光学活性酸アミド
（１）の製造を行うことができる。

【００６６】本発明においては、原料化合物およビ反応
生成物の光学純度は、例えば、キラルセルＯＤ−Ｒ、キ
ラルセルＯＪ、キラルＡＧＰ（ダイセル化学工業）、Ｃ
ｅｒａｍｏｓｐｅｒＣｈｉｒａｌＲＵ−１（資生
堂）、ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬＯＡ（住友化学分析センタ
ー）等の光学分割カラムを用いたＨＰＬＣ分析によって
測定することができる。

【００６７】

【実施例】次に、実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、これにより本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００６８】

【実施例１】（Ｓ）−２−フェニル−３−メチル酪酸アミドの製造フマル酸Ｎａ１％、酵母エキス１％、リン酸２カリウム
０．２％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム
・７水塩０．０２％、硫酸第一鉄・７水塩０．００３
％、ε−カプロラクタム０．０３％を含む液体培地（ｐ
Ｈを６．３）１００ｍｌを滅菌し、これに予め前記と同
一組成の培地で培養したロドコッカス・マリスＢＰ−
４７９−９（ＦＥＲＭＰ−１３９４７）の培養物を２
％植菌し、２８℃で３６時間振とう培養した。

【００６９】培養終了後、培養物を遠心分離にて菌体を
集め、これを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）４
０ｍｌに懸濁した後、油状の２−フェニル−３−メチル
ブチロニトリル２０ｇを加え、３５℃で攪拌しながら４
０時間反応させた。反応終了液の一部を下記のＨＰＬＣ
分析条件にて分析したところ、２−フェニル−３−メチ
ル酪酸アミドの生成率３４％、Ｓ体の光学純度は９２．
０％ｅ．ｅ．であった。尚、２−フェニル−３−メチル
酪酸は生成しなかった。

【００７０】反応終了液に６０ｍｌのヘキサンを加え３
０分攪拌した後、フィルター濾過したところ（Ｓ）−２
−フェニル−３−メチル酪酸アミド６．８９ｇを含んだ
固形物が単離した（光学純度９８．６％ｅ．ｅ．）。
尚、濾液中には、１２．５ｇのＲ体リッチの２−フェニ
ル−３−メチルブチロニトリルと０．６６ｇのラセミ体
の２−フェニル−３−メチル酪酸アミド（Ｓ：Ｒ＝１：
１）が含まれていた。

【００７１】次いで、上記の固形物にメタノールを１０
ｍｌ加え溶解後、活性炭０．７ｇを加え攪拌し濾過し
た。濾過したメタノール溶液を減圧濃縮、乾燥して表題
化合物の白色結晶６．３３ｇを得た。

【００７２】ＩＲ（ＮａＣｌ）：３４００，３１８０，
２９７０，１９６０，１８９０，１８０５，１７６０，
１６５０，１６００，１４５０，１４０５，１２５０，
７００ｃｍ^-1 ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．７１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝
６．７Ｈｚ），１．０８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈ
ｚ），２．２〜２．６（ｍ，１Ｈ），２．９２（ｄ，１
Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），５．５６（ｂｒ，２Ｈ），
７．１〜７．６（ｍ，５Ｈ）ＭＳ（ｍ／ｅ）：１７８（Ｍ＋１）⁺ 光学純度：９８．６％ｅ．ｅ．（下記の分析条件による
ＨＰＬＣ分析）

【００７３】＜ＨＰＬＣ分析条件−１（定量）＞カラム：ノバパックフェニル（ウォーターズ）溶離液：アセトニトリル：５０ｍＭリン酸一カリウム＝
４０：６０（ｐＨ３．５）流速：０．６ｍｌ／分検出：２６０ｎｍ保持時間：２．１分

【００７４】＜ＨＰＬＣ分析条件−２＞（光学純度測
定）カラム：キラルセルＯＤ−Ｒ（ダイセル化学工業）
０．４６×２５ｃｍ溶離液：アセトニトリル：５０ｍＭリン酸一カリウム＝
４０：６０（ｐＨ３．５）流速：１．５ｍｌ／分検出：ＵＶ２２０ｎｍ保持時間：Ｓ体；３．９分、Ｒ体；５．０分

【００７５】

【実施例２】酵素反応液からの（Ｒ）−２−フェニル−３−メチルブ
チロニトリルの回収およびラセミ化実施例１で得たＲ−リッチな２−フェニル−３−メチル
ブチロニトリルとラセミ体の２−フェニル−３−メチル
酪酸アミドを含むヘキサン溶液からヘキサンを減圧下留
去し、油状物質を得た。この油状物質１０ｇ（Ｒ−リッ
チな２−フェニル−３−メチルブチロニトリル９．５
ｇ、ラセミ体の２−フェニル−３−メチル酪酸アミド
０．５ｇを含有）に塩化チオニル３．３ｇを添加し、８
５℃で１．５時間還流した。得られた反応液を２０ｍｌ
の水で２回水洗し、分液してＲ−リッチな２−フェニル
−３−メチルブチロニトリル９．７ｇ（Ｒ：Ｓ＝７７：
２３）を得た。尚、２−フェニル−３−メチル酪酸アミ
ドは検出されなかった。

【００７６】次いで、Ｒ−リッチな２−フェニル−３−
メチルブチロニトリル９．７ｇにメタノール２．５ｍｌ
と６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．４ｍｌを加え、２５
℃で１時間攪拌した。次いで、得られた反応液を６Ｎ塩
酸でｐＨを７に調整した後、減圧濃縮してラセミ体の２
−フェニル−３−メチルブチロニトリル（Ｒ：Ｓ＝１：
１）を９．２ｇ得た。

【００７７】尚、２−フェニル−３−メチルブチロニト
リルの光学純度は以下に示すＨＰＬＣ条件にて測定し
た。カラム：Ｏｐｔｉ−ＰａｋＴａ（ウォーターズ）溶離液：イソプロパノール／ヘキサン＝２．５／９７．
５流速：１．０ｍｌ／分検出：ＵＶ２５４ｎｍ保持時間：Ｒ体；７．７分、Ｓ体；８．６分

【００７８】

【実施例３】Ｓ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキ
サミドの製造ロドコッカス・エスピーＰＰ−２５（ＦＥＲＭＰ−
１３９４４）株を実施例１と同様の培養条件で培養し
た。得られた培養物を遠心分離にて菌体を集菌、洗浄し
た後、１００ｍｌの蒸留水に懸濁させた。その中に２，
２−ジメチルシクロプロパンカルボニトリル１００ｍｇ
を加え、３０℃で１８時間反応させたところ、反応率２
１％でＳ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパンカ
ルボキサミドが生成していた。光学純度は９５．６％
ｅ．ｅ．であった。反応終了液から抽出によって未反応
のニトリル体を除去した後、ヘキサンにより結晶化して
表題化合物の結晶１５ｍｇを得た。

【００７９】融点：１３６〜１３９℃ 比旋光度：＋９６．５゜（Ｃ＝２、エタノール）

【００８０】

【実施例４】Ｒ−（−）−α−｛２−［ビス（１−メチルエチル）ア
ミノ］エチル｝−α−フェニル−２−ピリジルアセトア
ミドの製造エタノール１．５％、酵母エキス１％、リン酸２カリウ
ム０．２％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウ
ム・７水塩０．０２％、硫酸第１鉄・７水塩０．００３
％、塩化コバルト０．０１％、アセトニトリル０．１％
を含む液体培地（ｐＨ７）１Ｌを滅菌した後、これに予
め前記と同一組成の培地で培養したブレビバクテリウム
・エスピーＰＰ−１３３−７株の培養物を４％植菌
し、２８℃で４５時間培養した。培養終了後、菌体を遠
心分離にて集め、これを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）９０ｍｌとジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
１０ｍｌの混液に懸濁した後、これにα−｛２−［ビス
（１−メチルエチル）アミノ］エチル｝−α−フェニル
−２−ピリジルアセトニトリル１ｇを加え、３０℃で４
０時間反応させた。

【００８１】反応終了後、反応液に酢酸エチルを加え、
未反応のＳ体のニトリルを抽出除去し、さらにシリカゲ
ルクロマトグラフィーにより分離、精製を行って目的生
成物を得た。これをヘキサンにより結晶化して表題化合
物の結晶１５２ｍｇを得た。比旋光度：−１９．２（Ｃ＝５、メタノール）

【００８２】

【実施例５】（＋）−２−［２，３−（メチレンジオキシ）フェニ
ル］−バレルアミドの製造コリネバクテリウム・エスピーＫＯ−２−４株を実施
例４と同様の培養条件で培養した後、得られた培養物を
遠心分離により菌体を集めた。この菌体を蒸留水１００
ｍｌに懸濁した後、これに２−［２，３−（メチレンジ
オキシ）フェニル］バレロニトリル５００ｍｇを添加
し、３２℃で３６時間反応した。反応終了後、反応液を
ＨＰＬＣ分析した結果、反応率２４％で表題化合物が生
成しており、光学純度は９６％ｅ．ｅ．であった。

【００８３】

【実施例６】Ｓ−（＋）−α−（１，１−ジメチルエチル）−フェニ
ルアセトアミドの製造グルコース０．５％、フマル酸Ｎａ０．５％、リン酸２
カリウム０．２％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグ
ネシウム・７水塩０．０２％、硫酸第一鉄・７水塩０．
００３％、ε−カプロラクタム０．０３％、イソブチロ
ニトリル０．１％を含む液体培地（ｐＨ６．３）５０ｍ
ｌを滅菌した後、これに予め前記と同一組成培地で培養
した下記の各微生物の培養物を２％植菌し、２８℃で３
０時間振とう培養した。得られた培養物を各々遠心分離
にて各菌体を集め、これらを０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）１０ｍｌに懸濁した。これらに各々α−
（１，１−ジメチルエチル）フェニルアセトニトリル１
００ｍｇ添加し、２８℃で１０時間反応した。ＨＰＬＣ
で測定した表題化合物の生成率とＳ体の光学純度を表１
に示す。

【００８４】

【表１】

【００８５】

【実施例７】（Ｓ）−α−シクロヘキシル−フェニルアセトアミドの
製造ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９株を実施例１
と同様の培養条件で培養した。次いで、遠心分離にて菌
体を集菌、洗浄した後、１０ｍｌの蒸留水に懸濁させ
た。その中にα−シクロヘキシル−フェニルアセトニト
リル１００ｍｇを加え、３０℃で２４時間反応させたと
ころ、反応率１８％で（Ｓ）−α−シクロヘキシル−フ
ェニルアセトアミドが生成していた。Ｓ体の光学純度は
８１％ｅ．ｅ．であった。尚、α−シクロヘキシル−フ
ェニル酢酸は生成しなかった。

【００８６】定量および光学純度は、それぞれ次のＨＰ
ＬＣ条件で行った。＜ＨＰＬＣ分析条件−１（定量）＞カラム；ノバパックフェニル（ウォーターズ）溶離液：１３ｍＭリン酸２水素アンモニウム：アセトニ
トリル＝６２：３８流速：１．０ｍｌ／分検出：２６０ｎｍ保持時間：２．２分

【００８７】＜ＨＰＬＣ分析条件−２＞（光学純度測
定）カラム；キラルセルＯＤ−Ｒ（ダイセル化学工業）
０．４６×２５ｃｍ溶離液：水：アセトニトリル＝３０：７０流速：０．５ｍｌ／分検出：２６０ｎｍ保持時間：Ｓ体；９．５分、Ｒ体；１２．０分

【００８８】

【実施例８】（Ｓ）−１，２，２−トリフェニルプロピオンアミドの
製造エタノール１．５％、酵母エキス１％、リン酸２カリウ
ム０．２％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウ
ム・７水塩０．０２％、硫酸第１鉄・７水塩０．００３
％、アセトニトリル０．２％を含む液体培地（ｐＨ６．
３）１Ｌを殺菌した後、予め同培地で培養したブレビバ
クテリウム・エスピーＰＰ−１３３−７株を２％植菌
し、２８℃で４５時間培養した。

【００８９】培養終了後、菌体を遠心分離にて集め、こ
れを０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）９０ｍｌ
とＤＭＳＯ１０ｍｌの混合溶液に懸濁した後、１，２，
２−トリフェニルプロピオノニトリル０．１ｇを加え、
３０℃で４８時間反応させた。反応終了後、反応液を下
記の条件でＨＰＬＣ分析を行ったところ、表題化合物が
生成率１１％で生成しており、光学純度８２％ｅ．ｅ．
であった。

【００９０】＜ＨＰＬＣ分析条件−１（定量）＞カラム；ノバパックフェニル（ウォーターズ）溶離液：１３ｍＭリン酸２水素アンモニウム：アセトニ
トリル＝６２：３８流速：１．０ｍｌ／分検出：２６０ｎｍ保持時間：３．５分

【００９１】＜ＨＰＬＣ分析条件−２＞（光学純度測
定）カラム；キラルセルＯＤ−Ｒ（ダイセル化学工業）
０．４６×２５ｃｍ溶離液：水：アセトニトリル＝４０：６０流速：０．５ｍｌ／分検出：２６０ｎｍ保持時間：Ｓ体；１３．４分、Ｒ体；１５．０分

【００９２】

【実施例９】（Ｓ）−２−アミノカルボキシ−２−ベンジルオキシカ
ルボニルコハク酸ジエチルエステルの製造ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９株を実施例１
と同様の培養条件で培養した後、遠心分離により菌体を
集めた。次いで、蒸留水９０ｍｌに懸濁させた後、これ
にエタノール１０ｍｌに溶解した２−ベンジルオキシカ
ルボニルアミノ−２−シアノコハク酸ジエチルエステル
２００ｍｇを添加し、３２℃で３６時間反応させた。反
応終了後、反応液を下記の条件でＨＰＬＣ分析を行った
ところ、表題化合物が生成率９％で生成しており、光学
純度８２％ｅ．ｅ．であった。

【００９３】＜ＨＰＬＣ分析条件−１（定量）＞カラム；ノバパックフェニル（ウォーターズ）溶離液：５０ｍＭリン酸１カリウム：アセトニトリル＝
６２：３８（ｐＨ３．５）流速：１．５ｍｌ／分検出：２６０ｎｍ保持時間：７．３分

【００９４】＜ＨＰＬＣ分析条件−２＞（光学純度測
定）カラム；キラルセルＡＳ（ダイセル化学工業）溶離液：ヘキサン：イソプロパノール＝８０：２０流速：１．０ｍｌ／分検出：２２０ｎｍ保持時間：Ｒ体；１３．４分、Ｓ体；２０．８分

【００９５】

【実施例１０】ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９株の生産する
ニトリルヒドラターゼの精製ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９株を実施例１
と同様にして２Ｌの液体培地で培養し、培養物を遠心分
離により菌体２６ｇを集めた。これを４０ｍＭイソブチ
ルアミドを含む３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．３）で洗浄後、同液６０ｍｌに懸濁し、９ＫＨｚに
おける超音波処理を氷冷下約１０分行い、菌体を破砕し
た。得られた破砕菌体を１８０００ｒｐｍ、２０分間の
遠心分離で除去し、無細胞抽出液を得た。該抽出液のニ
トリルヒドラターゼの比活性は０．１２６Ｕ／ｍｇであ
った。

【００９６】該抽出液を上記と同一の緩衝液２Ｌにて透
析し、得られた透析内液をＤＥＡＥ−セルロースのカラ
ムにチャージし、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の直線的濃
度勾配法により溶出した。酵素活性画分を集め、１５％
硫酸アンモニウムを添加した後、フェニルセファロース
ＣＬ−４Ｂのカラムにチャージし、４０ｍＭイソブチル
アミド含有５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
３）で溶出した。酵素活性画分を集め、６０％硫酸アン
モニウム飽和により塩析した。得られた沈澱物を少量の
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解
し、同緩衝液で透析して精製酵素を得た。

【００９７】本酵素の２−フェニル−３−メチルブチロ
ニトリルを基質としたニトリルヒドラターゼの比活性
は、０．７３８Ｕ／ｍｇ、生成した（Ｓ）−２−フェニ
ル−３−メチル酪酸アミドの光学純度は、生成率４０％
のとき、９４％ｅ．ｅ．であった。

【００９８】該精製酵素の性質および酵素活性の測定法
は次の通りである。１）酵素の性質作用ニトリル化合物１分子を水和し、酸アミド化合物１分子
を生成する反応を触媒する。ラセミ体の２−フェニル−
３−メチルブチロニトリルに対しては、そのＳ体に作用
する速度がＲ体より著しく速く、結果的に光学活性な
（Ｓ）−２−フェニル−３−メチル酪酸アミドを生成す
る。

【００９９】尚、２−フェニル−３−メチル酪酸アミド
を基質とするアミダーゼ活性は全くない。

【０１００】サブユニットの分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子
量２４０００、２５１００の２つのサブユニットが検出
された。

【０１０１】２）酵素活性の測定法１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．９
ｍｌ、２００ｍＭ２−フェニル−３−メチルブチロニト
リルのメタノール溶液０．０５ｍｌおよび適当量の酵素
液を加え、１ｍｌになるように調整し、３０℃で３０分
間反応させた後、メタノール１ｍｌを添加して反応を停
止させる。生成した２−フェニル−３−メチル酪酸アミ
ドの量と光学純度をＨＰＬＣにて測定する。分析条件は
前記の実施例１に記載する。

【０１０２】以上の通り、本酵素はニトリル化合物を酸
アミド化合物に変換するニトリルヒドラターゼであり、
また、２−フェニル−３−メチルブチロニトリルを基質
とすると、光学選択性を持って水和するという優れた効
果を有する新規酵素である。

【０１０３】

【発明の効果】本発明によれば、安価な原料であるラセ
ミ体のニトリル化合物から各種医薬品、医薬品中間体と
して有用な光学活性な酸アミド化合物を効率よく、しか
も光学純度の高い高品質製品が製造できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:72）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（２）【化１】（式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は各々異なり、水素原
子、ハロゲン原子、置換されていてもよいアミノ基、置
換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよい
アルコキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換
されていてもよいアリールオキシ基、置換されていても
よいシクロアルキル基または置換されていてもよい複素
環式基を示すか、またはＲ¹とＲ²とＲ³のうち２つが
結合して脂環式環を形成してもよい。ｎは０〜３の整数
を示す）で表されるラセミ体のニトリル化合物に、ロド
コッカス属、アルカリゲネス属、ロドシュードモナス
属、コリネバクテリウム属、バチルス属、マイコバクテ
リウム属、ノカルディア属、アルスロバクター属、クレ
ブシエラ属、ブレビバクテリウム属、アクレモニウム属
またはキャンディダ属に属し、一般式（２）で表される
ラセミ体のニトリル化合物のニトリル基を光学選択的に
水和し得るニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物ま
たはその処理物を作用させることを特徴とする一般式
（１）【化２】（式中、^*Ｃは不斉炭素原子を示し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³
およびｎは前記と同じ意味を有する）で表される光学活
性な酸アミド化合物の製造法。
【請求項２】請求項１における一般式（２）および一
般式（１）において、式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は各
々異なり、水素原子、置換されていてもよいアルキル
基、置換されていてもよいアリール基または置換されて
いてもよいシクロアルキル基であり、ｎが０である請求
項１記載の製造法。
【請求項３】請求項１における一般式（１）におい
て、光学活性な酸アミド化合物がＳ−２−フェニル−３
−メチル酪酸アミド、Ｓ−α−（１，１−ジメチルエチ
ル）−フェニルアセトアミド、Ｓ−α−シクロヘキシル
−フェニルアセトアミド、Ｓ−１，２，２−トリフェニ
ルプロピオンアミドであり、該光学活性な酸アミド化合
物に該当する請求項１における一般式（２）で表される
ラセミ体のニトリル化合物を用いてなる請求項１記載の
製造法。
【請求項４】ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−
９（ＦＥＲＭＰ−１３９４７）株。