JPH07255497A - 凝固パラメーターの測定方法 - Google Patents
凝固パラメーターの測定方法Info
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- JPH07255497A JPH07255497A JP7011647A JP1164795A JPH07255497A JP H07255497 A JPH07255497 A JP H07255497A JP 7011647 A JP7011647 A JP 7011647A JP 1164795 A JP1164795 A JP 1164795A JP H07255497 A JPH07255497 A JP H07255497A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】トロンビンにより触媒されるフィブリン凝固の
生成が起こり、そのフィブリン凝固の生成を測定する、
カスケード反応による試料中の凝固パラメーターの測定
方法において、ＦXIIIの阻害剤を添加する。 【効果】この方法によって、反応容器を数回、凝固試験
に使用することができる。
生成が起こり、そのフィブリン凝固の生成を測定する、
カスケード反応による試料中の凝固パラメーターの測定
方法において、ＦXIIIの阻害剤を添加する。 【効果】この方法によって、反応容器を数回、凝固試験
に使用することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、第XIII因子（ＦXIII）
の活性化の阻害剤、活性化XIII因子（ＦXIII A）の阻害
剤、またはＦXIIIA のフィブリン架橋活性の阻害剤を添
加する、凝固パラメーターの測定方法に関する。
の活性化の阻害剤、活性化XIII因子（ＦXIII A）の阻害
剤、またはＦXIIIA のフィブリン架橋活性の阻害剤を添
加する、凝固パラメーターの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】試料における凝固パラメーター測定は、
通常、カスケード反応を包含する（Haemostasis 20（補
遺１）14-29, 1990 参照）。多くの測定法において、そ
の最終段階は、トロンビンによって触媒されるフィブリ
ン凝固の生成である。かかる方法において、例えば、プ
ロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラス
チン時間（ＰＴＴａ）、フィブリノーゲン、第II、V、V
II、VIII、IX、X、XI、XII因子、プロテインＣ、プロテ
インＳおよびＡＰＣ耐性を測定することが可能である
（例えば、Bergmeyer(編)(1988): Methods of Enzymolo
gy, 第Ｖ巻、第３版; GuglumoneおよびVides (1992): T
hromb Haemostas 67, 46-9; Predaら、(1990): Thromb
Res. 60, 19-32、または Dahlbackら、(1993): Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 90, 1004-8 参照）。生成したフ
ィブリン凝固は、相当の手作業無しには事実上測定容器
から取り除くことができないため、凝固パラメーターの
測定に際しては、測定容器は通例１回だけしか使用され
ず、その後廃棄される。それによるコストに加えて、こ
のような試験は、キュベットを繰り返し使用する機器に
適用することができない。使い捨てのキュベットを備え
た専用の凝固分析器は、少数しか製造されていないため
かなり高価である。
通常、カスケード反応を包含する（Haemostasis 20（補
遺１）14-29, 1990 参照）。多くの測定法において、そ
の最終段階は、トロンビンによって触媒されるフィブリ
ン凝固の生成である。かかる方法において、例えば、プ
ロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラス
チン時間（ＰＴＴａ）、フィブリノーゲン、第II、V、V
II、VIII、IX、X、XI、XII因子、プロテインＣ、プロテ
インＳおよびＡＰＣ耐性を測定することが可能である
（例えば、Bergmeyer(編)(1988): Methods of Enzymolo
gy, 第Ｖ巻、第３版; GuglumoneおよびVides (1992): T
hromb Haemostas 67, 46-9; Predaら、(1990): Thromb
Res. 60, 19-32、または Dahlbackら、(1993): Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 90, 1004-8 参照）。生成したフ
ィブリン凝固は、相当の手作業無しには事実上測定容器
から取り除くことができないため、凝固パラメーターの
測定に際しては、測定容器は通例１回だけしか使用され
ず、その後廃棄される。それによるコストに加えて、こ
のような試験は、キュベットを繰り返し使用する機器に
適用することができない。使い捨てのキュベットを備え
た専用の凝固分析器は、少数しか製造されていないため
かなり高価である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の欠点
を取り除く。
を取り除く。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、トロンビンに
より触媒されるフィブリン凝固の生成が起こり、そのフ
ィブリン凝固の生成を測定する、カスケード反応による
試料中の凝固パラメーターの測定方法を含んでなり、そ
の測定方法は、ＦXIII活性化の阻害剤、ＦXIII Aの阻害
剤、またはＦXIIIAのフィブリン架橋活性阻害剤の存在
下で測定されるという特徴を有する。
より触媒されるフィブリン凝固の生成が起こり、そのフ
ィブリン凝固の生成を測定する、カスケード反応による
試料中の凝固パラメーターの測定方法を含んでなり、そ
の測定方法は、ＦXIII活性化の阻害剤、ＦXIII Aの阻害
剤、またはＦXIIIAのフィブリン架橋活性阻害剤の存在
下で測定されるという特徴を有する。
【０００５】凝固パラメーターの測定を上記のような阻
害剤の存在下で行なう場合、測定後に、フィブリン分子
相互の親和性をなくすような条件下でフィブリン凝固を
溶解し、それを、再度の凝固パラメーター測定に悪影響
を及ぼさないすすぎ工程によって、測定容器から除去す
ることが可能である。あらゆるＦXIII活性化の阻害剤、
ＦXIIIAそれ自体の阻害剤、またはＦXIIIAのフィブリン
架橋活性阻害剤が、適用可能である。これらの阻害剤に
は、例えば、ヒドロキシルアミン、ベンゾチオフェン、
ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミド、ランタニドイオ
ン、セフロキシム、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、ＦXI
IIAまたはフィブリンのペプチドフラグメント、並びに
抗体がある。上記阻害剤の例は、以下の学術報告に記載
されている： Feddersen J., Gormsen J. (1976): Thromb. Haemostas
is 36 Achyuthan, E. A., Enghild, J. J., Greenberg C. S.,
(1991): Thromb. Haem.65, 901 Achyuthan, E. A., Maryおよび C. S. Greenberg (198
9): Biochem. J. 257: 331-8 Glover C. J., L. V. McIntire, C. H. Brown および
E. A. Natelson (1975):J. Lab. Clin. Med. 86: 644-5
6 Jiang, S. T.および J. J. Lee (1992): J. Agr. Food.
Chem. 40: 1101-7 Lee, K. N., L. Fesus, S. T. Yanbcey, J. E. Girard
および S. I. Chung (1985): J. Biol. Chem. 260: 14
689-94 Samara M., J. Soria, C. Soria, M. Maamerおよび A.
M. Otero (1979): Prog.Chem. Fibrinnolysis Thrombol
ysis 4: 235-40 Lukacova, D., Matsueda, G. R., Haber, E.および Ree
d, G. L. (1991): Biochemistry 30: 10164-70 Coysne C. P., Smith, J. E.および De Bowers R. M.
(1992): Am. J. Vet. Res53: 695-705 Achyuthan, K. E., Slaughter, T. F., Santiago, M.
A., Enghild, J. J. および Greenberg, C. S. (1993):
J. Biol. Chem. 268: 21284-92 フィブリン分子の相互の親和性を失わせるようなあらゆ
る溶液が、凝固物の溶解に適している。
害剤の存在下で行なう場合、測定後に、フィブリン分子
相互の親和性をなくすような条件下でフィブリン凝固を
溶解し、それを、再度の凝固パラメーター測定に悪影響
を及ぼさないすすぎ工程によって、測定容器から除去す
ることが可能である。あらゆるＦXIII活性化の阻害剤、
ＦXIIIAそれ自体の阻害剤、またはＦXIIIAのフィブリン
架橋活性阻害剤が、適用可能である。これらの阻害剤に
は、例えば、ヒドロキシルアミン、ベンゾチオフェン、
ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミド、ランタニドイオ
ン、セフロキシム、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、ＦXI
IIAまたはフィブリンのペプチドフラグメント、並びに
抗体がある。上記阻害剤の例は、以下の学術報告に記載
されている： Feddersen J., Gormsen J. (1976): Thromb. Haemostas
is 36 Achyuthan, E. A., Enghild, J. J., Greenberg C. S.,
(1991): Thromb. Haem.65, 901 Achyuthan, E. A., Maryおよび C. S. Greenberg (198
9): Biochem. J. 257: 331-8 Glover C. J., L. V. McIntire, C. H. Brown および
E. A. Natelson (1975):J. Lab. Clin. Med. 86: 644-5
6 Jiang, S. T.および J. J. Lee (1992): J. Agr. Food.
Chem. 40: 1101-7 Lee, K. N., L. Fesus, S. T. Yanbcey, J. E. Girard
および S. I. Chung (1985): J. Biol. Chem. 260: 14
689-94 Samara M., J. Soria, C. Soria, M. Maamerおよび A.
M. Otero (1979): Prog.Chem. Fibrinnolysis Thrombol
ysis 4: 235-40 Lukacova, D., Matsueda, G. R., Haber, E.および Ree
d, G. L. (1991): Biochemistry 30: 10164-70 Coysne C. P., Smith, J. E.および De Bowers R. M.
(1992): Am. J. Vet. Res53: 695-705 Achyuthan, K. E., Slaughter, T. F., Santiago, M.
A., Enghild, J. J. および Greenberg, C. S. (1993):
J. Biol. Chem. 268: 21284-92 フィブリン分子の相互の親和性を失わせるようなあらゆ
る溶液が、凝固物の溶解に適している。
【０００６】このような溶液の例としては、酸または塩
基、ＫＳＣＮまたはサリチル酸ナトリウムのようなカオ
トロピックイオンの溶液、尿素、またはアルギニンがあ
る。例えば１Ｍ塩酸のような洗浄液の添加によって、最
長でも５−１０分以内に、測定容器から完全に除去でき
る程度に凝固物を溶解させることができるような濃度
で、阻害剤を添加する。ヒドロキシルアミン、ヨード酢
酸、Ｎ−エチルマレイミドを用いる場合には、その望ま
しい濃度範囲は、０．５から２０ｍｍｏｌ／ｌの間であ
る。
基、ＫＳＣＮまたはサリチル酸ナトリウムのようなカオ
トロピックイオンの溶液、尿素、またはアルギニンがあ
る。例えば１Ｍ塩酸のような洗浄液の添加によって、最
長でも５−１０分以内に、測定容器から完全に除去でき
る程度に凝固物を溶解させることができるような濃度
で、阻害剤を添加する。ヒドロキシルアミン、ヨード酢
酸、Ｎ−エチルマレイミドを用いる場合には、その望ま
しい濃度範囲は、０．５から２０ｍｍｏｌ／ｌの間であ
る。
【０００７】測定容器からフィブリン凝固を除去するた
めに、１０秒から１０分までの一定時間、酸性溶液（ｐ
Ｈ＜２、望ましくは≦１）とともにインキュベートする
ことが望ましい。これに使用するには、塩酸が優れてい
る。次に、１回から３回、水または水性緩衝液ですす
ぐ。続いて、次の凝固パラメーター測定の妨げにならな
い程度にまで、フィブリン凝固を除去する。
めに、１０秒から１０分までの一定時間、酸性溶液（ｐ
Ｈ＜２、望ましくは≦１）とともにインキュベートする
ことが望ましい。これに使用するには、塩酸が優れてい
る。次に、１回から３回、水または水性緩衝液ですす
ぐ。続いて、次の凝固パラメーター測定の妨げにならな
い程度にまで、フィブリン凝固を除去する。
【０００８】酸性溶液の代わりになるものとして、前記
の物質を単独で、あるいは組み合わせて用いることが可
能である。
の物質を単独で、あるいは組み合わせて用いることが可
能である。
【０００９】
【実施例】実施例１ 日立（Hitati）７１７型機器によるＰＴ測定のための方
法 試料：２０μｌクエン酸血漿（約５．５ｇ／ｌフィブリ
ノーゲンを含有する） 試薬１（Ｒ１）： ３００μｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌトリス緩衝液、ｐＨ
７．０ １０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム ２．５ｍｍｏｌ／ｌヒドロキシルアミン ３．７５ｍｇ／ｍｌウサギ脳トロンボプラスチン 試薬２（Ｒ２）： ３００μｌ、１ｍｏｌ／ｌＨＣｌ ２０μｌの血漿と３００μｌのＲ１を混合し、凝固形成
までの時間を測定することによって、ＰＴ測定を行な
う。凝固が形成された後、３００μｌのＲ２を添加し、
３７℃で混合し、さらに１００秒後、１０分間吸引す
る。これを１〜３回水洗する。測定を実施し、塩酸／水
で測定容器を洗浄した後、測定容器の吸光度をチェック
した結果、測定前後のブランクの吸光度に特に差はない
ことが示された（５０測定につき最大で約０．１ｍ
Ａ）。
法 試料：２０μｌクエン酸血漿（約５．５ｇ／ｌフィブリ
ノーゲンを含有する） 試薬１（Ｒ１）： ３００μｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌトリス緩衝液、ｐＨ
７．０ １０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム ２．５ｍｍｏｌ／ｌヒドロキシルアミン ３．７５ｍｇ／ｍｌウサギ脳トロンボプラスチン 試薬２（Ｒ２）： ３００μｌ、１ｍｏｌ／ｌＨＣｌ ２０μｌの血漿と３００μｌのＲ１を混合し、凝固形成
までの時間を測定することによって、ＰＴ測定を行な
う。凝固が形成された後、３００μｌのＲ２を添加し、
３７℃で混合し、さらに１００秒後、１０分間吸引す
る。これを１〜３回水洗する。測定を実施し、塩酸／水
で測定容器を洗浄した後、測定容器の吸光度をチェック
した結果、測定前後のブランクの吸光度に特に差はない
ことが示された（５０測定につき最大で約０．１ｍ
Ａ）。
【００１０】実施例２ ＦXIIIA活性の阻害剤としてどの様な物質が適している
かを調べるため、Ｈ．アメルンク・カンパニー（H. Ame
lung Company, Lemgo, Germany）製の凝固測定器（ＫＣ
４Ａ型）でＰＴ測定を行なう（１００μｌ血漿 ＋ ２
００μｌネオプラスチン（Neoplastin）（登録商標）プ
ラス（Plus）−試薬）。凝固を生じた２分後、２００μ
ｌの１ｍｏｌ／ｌ塩酸を添加し、凝固塊が再び遊離して
可動となるまでの時間を測定する。結果を表１に示す。
かを調べるため、Ｈ．アメルンク・カンパニー（H. Ame
lung Company, Lemgo, Germany）製の凝固測定器（ＫＣ
４Ａ型）でＰＴ測定を行なう（１００μｌ血漿 ＋ ２
００μｌネオプラスチン（Neoplastin）（登録商標）プ
ラス（Plus）−試薬）。凝固を生じた２分後、２００μ
ｌの１ｍｏｌ／ｌ塩酸を添加し、凝固塊が再び遊離して
可動となるまでの時間を測定する。結果を表１に示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】実施例３ 測定後、凝固物を溶解するのにどのような溶液が適して
いるかを調べるために、Ｈ．アメルンク・カンパニー
（H. Amelung Company, Lemgo, Germany）製の凝固測定
器（ＫＣ４Ａ型）でＰＴ測定を行なう（１００μｌ血漿
＋２００μｌネオプラスチン（Neoplastin）（登録商
標）プラス（Plus）−ヒドロキシルアミン，終濃度２．
５ｍＭ）。凝固が生じた２分後、２００μｌの溶解剤を
添加し、凝固塊が再び遊離して可動となるまでの時間を
測定する。結果を表２に示す。
いるかを調べるために、Ｈ．アメルンク・カンパニー
（H. Amelung Company, Lemgo, Germany）製の凝固測定
器（ＫＣ４Ａ型）でＰＴ測定を行なう（１００μｌ血漿
＋２００μｌネオプラスチン（Neoplastin）（登録商
標）プラス（Plus）−ヒドロキシルアミン，終濃度２．
５ｍＭ）。凝固が生じた２分後、２００μｌの溶解剤を
添加し、凝固塊が再び遊離して可動となるまでの時間を
測定する。結果を表２に示す。
【００１３】
【表２】
【００１４】実施例４ ＰＴＴａ測定のための方法 ＰＴ測定について得られたデータの適用可能性を、以下
のようにＫＣ−４Ａで確認した： １０μｌ １００ｍＭヒドロキシルアミン １００μｌ血漿 １００μｌ ＰＴＴａ試薬（ベーリンガーマンハイム(B
oehringer Mannheim GmbH)） ３分インキュベーション １００μｌ ＣａＣｌ2 凝固時間の測定 さらに２分インキュベーション ２００μｌ １Ｍ ＨＣｌ 凝固塊が再び遊離して可動となるまでの時間の測定 結果を表３に示す。
のようにＫＣ−４Ａで確認した： １０μｌ １００ｍＭヒドロキシルアミン １００μｌ血漿 １００μｌ ＰＴＴａ試薬（ベーリンガーマンハイム(B
oehringer Mannheim GmbH)） ３分インキュベーション １００μｌ ＣａＣｌ2 凝固時間の測定 さらに２分インキュベーション ２００μｌ １Ｍ ＨＣｌ 凝固塊が再び遊離して可動となるまでの時間の測定 結果を表３に示す。
【００１５】
【表３】
【００１６】実施例５ プロテインＣ測定のための方法 ＰＴ測定について得られたデータの適用可能性を、以下
のようにＫＣ−４Ａで確認した： １０μｌ １００ｍＭヒドロキシルアミン １０μｌ 血漿 ９０μｌ オ−レン（Owrens）緩衝液（ベーリンガーマ
ンハイム） １００μｌ Ｒ１ プロテインＣ試薬（ベーリンガーマ
ンハイム） １００μｌ Ｒ２ プロテインＣ試薬（ベーリンガーマ
ンハイム） ３分インキュベーション １００μｌ ＣａＣｌ2 溶液 凝固時間の測定 さらに２分インキュベーション ２００μｌ １Ｍ ＨＣｌ 凝固塊が再び遊離して可動となるまでの時間の測定 結果を表４に示す。
のようにＫＣ−４Ａで確認した： １０μｌ １００ｍＭヒドロキシルアミン １０μｌ 血漿 ９０μｌ オ−レン（Owrens）緩衝液（ベーリンガーマ
ンハイム） １００μｌ Ｒ１ プロテインＣ試薬（ベーリンガーマ
ンハイム） １００μｌ Ｒ２ プロテインＣ試薬（ベーリンガーマ
ンハイム） ３分インキュベーション １００μｌ ＣａＣｌ2 溶液 凝固時間の測定 さらに２分インキュベーション ２００μｌ １Ｍ ＨＣｌ 凝固塊が再び遊離して可動となるまでの時間の測定 結果を表４に示す。
【００１７】
【表４】
【００１８】実施例６ トロンビン時間測定のための方法 ＰＴ測定について得られたデータの適用可能性を、以下
のようにＫＣ−４Ａで確認した： ２０μｌ １００ｍＭヒドロキシルアミン ２００μｌ血漿 ２分インキュベーション ２００μｌトロンビン試薬（ベーリンガーマンハイム、
製品番号１２６５９４） 凝固時間の測定 さらに２分インキュベーション ３００μｌ １Ｍ ＨＣｌ 凝固塊が再び遊離して可動となるまでの時間の測定 結果を表５に示す。
のようにＫＣ−４Ａで確認した： ２０μｌ １００ｍＭヒドロキシルアミン ２００μｌ血漿 ２分インキュベーション ２００μｌトロンビン試薬（ベーリンガーマンハイム、
製品番号１２６５９４） 凝固時間の測定 さらに２分インキュベーション ３００μｌ １Ｍ ＨＣｌ 凝固塊が再び遊離して可動となるまでの時間の測定 結果を表５に示す。
【００１９】
【表５】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラインハルト ヘルツ ドイツ連邦共和国 82343 ペッキング ／ポセンホーフェン， クルト−スティー ラー−シュトラーセ １番地
Claims (6)
- 【請求項１】トロンビンにより触媒されるフィブリン凝
固の生成が起こり、そのフィブリン凝固の生成を測定す
るが、その測定がＦXIII活性化の阻害剤、ＦXIIIAそれ
自体の阻害剤、またはＦXIIIAのフィブリン架橋活性阻
害剤の存在下で実施される、試料中の凝固パラメーター
の測定方法。 - 【請求項２】阻害剤としてヒドロキシルアミン、ヨード
酢酸またはＮ−エチルマレイミドを使用する、請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】阻害剤濃度が０．５から２０ｍｍｏｌ／ｌ
の間である、請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】少なくとも２つの異なる試料における凝固
パラメーターの測定方法であって、 ａ）トロンビンにより触媒されるフィブリン凝固の生成
が起こり、そのフィブリン凝固の生成を測定するが、 ｂ）その測定はＦXIII活性化の阻害剤、ＦXIIIAそれ自
体の阻害剤、またはＦXIIIAのフィブリン架橋活性阻害
剤の存在下で実施され、 ｃ）最初の測定後、フィブリン分子相互の親和性を失わ
せる溶液を測定容器に添加し、これを溶解した後測定容
器を空にし、１回または数回、望ましくは蒸留水で洗浄
し、 ｄ）当該測定容器に於て、次の試料の凝固パラメーター
を測定する方法。 - 【請求項５】溶解剤として、酸、塩基、サリチル酸ナト
リウム＋ＥＤＴＡをいずれか１つ、または組み合わせて
使用する、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】酸または塩基を単独で使用する場合、ｐＨ
が２より低いかまたは１３より高い、請求項４および５
に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4402631:5 | 1994-01-29 | ||
| DE4402631A DE4402631A1 (de) | 1994-01-29 | 1994-01-29 | Verfahren zur Bestimmung von Gerinnungsparametern |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07255497A true JPH07255497A (ja) | 1995-10-09 |
| JP2749276B2 JP2749276B2 (ja) | 1998-05-13 |
Family
ID=6508961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Patent Citations (1)
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