JP3684451B2 - 血小板凝集の測定法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は干渉するフィブリン凝塊の生成を防止するフィブリン凝集阻害剤の存在下で血小板凝集を測定する方法、およびトロンビン阻害剤の血小板凝集を阻害する作用を測定するための診断補助剤に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
トロンビン阻害剤の血小板凝集を阻害する作用を測定するため、例えば血小板に富む血漿（ＰＲＰ）のような血小板懸濁液およびトロンビンを含有する診断システムを使用することができ、トロンビンは血小板の凝集を引き起こす。凝集の比率または程度は濁り測定、または比濁法により測定されうる。トロンビン阻害剤の添加により、血小板の凝集は加えた量の関数として減速され、その結果、阻害効果の定量が濁り測定から可能である。
【０００３】
例えば血小板に富む血漿（ＰＲＰ）中でトロンビンにより引き起こされる血小板凝集の場合、トロンビンにより引き起こされたフィブリン凝塊は測定技術の障害となる。従来の方法においては、最大の血小板凝集に到達しないように非常に低い濃度のトロンビンだけを使用することができる。しかしながら、低濃度のトロンビンを用いても、干渉するフィブリン凝塊が一定時間後に生じる。にも関わらず、より良い検出信号を与えるより高い濃度のトロンビンを使用できるように、手の込んだ血小板洗浄工程を行う必要がある。
【０００４】
したがって、本発明の目的は実験的に引き起こされた血小板凝集の測定およびフィブリン凝塊の干渉作用のないトロンビン阻害剤の測定を可能にする方法を提供することである。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ配列で開始する短ペプチドはフィブリノーゲンと結合することが知られている（米国のNatl. Acad. Sci., 75, 3085〜3089（1978年）を参照）。さらに、ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは抗血小板試薬と組合せて血小板離解実験において使用されている（Pharmacology and Experimental Therapeutics, 259, 1371〜1378（1991年）を参照）。その上、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ2はフィブリン凝集阻害剤としてＦ XIIIａおよびフィブリノーゲンの測定法において使用できることが知られている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
今般、驚くべきことに、高いトロンビン濃度でも、また実験的に必要な血小板凝集に影響を及ぼすことなく、干渉するフィブリン凝塊の生成がフィブリン凝集阻害剤を加えることにより抑制されることを見い出した。
したがって、本発明はフィブリン凝集阻害剤の存在により干渉するフィブリン凝塊の生成を防止することを包含する、トロンビンにより引き起こされる血小板凝集の定性的または定量的測定法に関する。
好適なフィブリン凝集阻害剤はペプチドまたはペプチド誘導体であり、特にヒトのα−フィブリン鎖のアミノ末端と類似の構造を有するものである。このようなフィブリン凝集阻害剤は例えばA.P. LaudanoらのProc. Natl. Acad. Sci., 75, 3085〜3089（1978年）に記載されている。好ましいペプチドはＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＡｒｇまたはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの配列を含有するものである。
【０００６】
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＰｒｏまたはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓａｒの配列を有するペプチドまたはペプチド誘導体は特に好ましい。
さらに、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ2はとりわけ好ましい。
本発明はさらに、測定対象のトロンビン阻害剤およびフィブリン凝集阻害剤が同時に分析混合物に存在する、血小板阻害剤の血小板凝集を阻害する作用を測定するための上記の方法の使用に関する。驚くべきことに、この方法を用いて例えば血漿中に存在するトロンビン阻害剤を検出するだけでなく定量もまたすることができる。しかしながら、血漿以外の液体で本発明の方法を使用する定性的または定量的検出もまた可能である。
【０００７】
本発明はさらに、トロンビンおよびフィブリン凝集阻害剤を含有する診断補助剤に関する。このタイプの診断補助剤は液体、例えば血漿中に存在するトロンビン阻害剤の血小板凝集を阻害する作用の定性的または定量的測定のため本発明の方法を行うのに適している。
例えば緩衝液または患者の試料中の血小板凝集阻害剤の測定法を以下の実施例により説明する。分析は次の工程に従って行うことができる：
血小板に富む血漿（ＰＲＰ）の投入、
クエン酸塩溶液または血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）の添加、
フィブリン凝集阻害剤（場合によっては緩衝液中に溶解されている）の添加、
試験試料の添加；検出対象の阻害剤は例えば緩衝液またはＰＰＰ中に溶解させることができ、あるいは血漿中に存在させることができる；各種濃度（連続希釈）で分析される、
約３７℃で１〜２０分間のインキュベーション、
血小板凝集の誘引物質、例えばトロンビンの添加、
血小板凝集の測定。
【０００８】
この測定法に必要な量はほんの少しである：ＰＲＰ好ましくは３００μl、フィブリン凝集阻害剤溶液好ましくは２５μl；トロンビン阻害剤溶液、例えばＣＲＣ ２２０（４−メトキシ−２,３,６−トリメチルフェニルスルホニル−Ｌ−アスパルチル−Ｄ−４−アミジノフェニル−アラニルピペリジド ＥＰ ０ ５１３ ５４３）またはＰＰＰ好ましくは２５μl、全量は３００〜１０００μl、好ましくは５００μlである。所定量、例えば５００μlとするために、等張のＮａＣｌ溶液で１０倍に希釈された０.３８％濃度のクエン酸塩溶液からなる溶液を加えることができる。血小板凝集の測定は好ましくは例えばLAbor社（Laborgeraete und Analysesysteme Vertriebsgesellschaft mbH, ドイツ）製のＡＰＡＣＴ（自動化血小板凝集および凝固トレーサー）のような凝集計（aggregometer）を用いて１mlのクヴェット中、３７℃で撹拌しながら行われる。
【０００９】
ＰＲＰは公知の方法によりクエン酸塩溶液中で製造することができる。血小板の数は１０7〜１０9／ml、好ましくは２×１０8／mlである。最適な凝集のための血小板濃度は慣用の血小板アゴニスト、例えばコラーゲン、ＡＤＰまたはトロンボキサンＡ2を用いて測定することができる。
フィブリン凝集阻害剤の濃度は１〜２０mM、好ましくは１０mMである。
トロンビン濃度は好ましくは４〜７nMであり、トロンビンを用いて達成することのできる最大の血小板凝集の約８０％に相当する。
【００１０】
略語：
ＰＲＰ 血小板に富む血漿
ＰＰＰ 血小板に乏しい血漿
Ｇｌｙ グリシン
Ｐｒｏ Ｌ−プロリン
Ａｒｇ Ｌ−アルギニン
Ａｌａ Ｌ−アラニン
Ｓａｒ サルコシン
ＮＨ2 アミド
mM ミリモル／リットル
nM ナノモル／リットル
以下の実施例により本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【実施例】
〔実施例１〕 血小板凝集の測定
図１はフィブリン凝集阻害剤の存在下、トロンビン濃度（nM）の関数としてＰＲＰ中のトロンビンにより引き起こされる血小板凝集（非凝集血小板と凝集血小板の比率、％）を示す。これにより従来技術よりも明確に高い濃度のトロンビンを使用することができる。このように拡張される参照プロットは血小板凝集の正確な測定に相当寄与する。
図１から明らかなように、血小板凝集は４〜７nM（０.４〜０.７ＩＵ／ml）の濃度のトロンビンを加えると、達成できる最大血小板凝集の約１０〜８０％にわたり直線的に増加する。
【００１２】
〔実施例２〕 溶液Ａ（クエン酸塩溶液）の調製
次の物質を１００mlの水に溶解する：３８０mgのクエン酸三ナトリウム二水和物。場合によっては、溶液はさらに５００mgのＤ−（＋）−グルコースおよび３５０mgのアルブミンを含有してもよい。
溶液Ｂ（ＰＲＰ）の調製
ドナーからの９０mlの新鮮な全血をすでに１０mlの３.８％濃度（ｗ／ｖ）のクエン酸三ナトリウム二水和物溶液を含有するポリエチレン容器に入れる。この凝固防止された血液をすぐに２００ｇで２０分間遠心分離する。上澄液を新しいポリエチレン容器に移し、使用するまで０℃で保存する。
【００１３】
溶液Ｃ（フィブリン凝集阻害剤）の調製
次の物質を１００mlの水に溶解する：１ｇのウシ血清アルブミンおよび１０ｇのＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ2。溶液を使用するまで−２０℃で保存する。
溶液Ｄ（トロンビン阻害剤）の調製
次の物質を１００mlの水に溶解する：１２７.６mgのトロンビン阻害剤 ＣＲＣ２２０（４−メトキシ−２,３,６−トリメチルフェニルスルホニル−Ｌ−アスパルチル−Ｄ−４−アミジノフェニルアラニルピペリジド）。生理食塩水で希釈されたＣＲＣ ２２０溶液を分析に使用するために調製する。すべての溶液を新しく作り、０℃まで冷却する。
【００１４】
溶液Ｅ（トロンビン）の調製
４.２μｇのヒトのα−トロンビンを１mlの水に溶解する（１０ＩＵ／ml）。生理食塩水で希釈されたトロンビン溶液を分析に使用するために調製する。すべての溶液を新しく作り、０℃まで冷却する。
分析手順
３００μｌの溶液Ｂ、１００μｌの溶液Ａ、２５μｌの溶液Ｃおよび２５μｌの溶液ＤをＡＰＡＣＴ凝集計（LAbor）の１ml容量の測定用クヴェット（１cmの長さ、連続撹拌）にピペットで移し、３７℃で１分間プレインキュベートする。次に、５０μｌの溶液Ｅを加え、光の透過率を時間の関数として記録する。測定を信号が一定になるまで継続し、それは通常５分後に到達する。増加する濃度のトロンビン阻害剤を各分析混合物に加える。トロンビン阻害剤の添加量を知ることにより、例えばトロンビン阻害剤についてのＩＣ50を定量的に測定することができる（図２）。本実施例のＩＣ50は１０nMであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】フィブリン凝集阻害剤の存在下、ＰＲＰ中のトロンビンにより引き起こされる血小板凝集を示すプロット。
【図２】ＰＲＰ中の血小板凝集におけるトロンビン阻害剤の効率（ＩＣ50）の測定結果を示すプロット。
【産業上の利用分野】
本発明は干渉するフィブリン凝塊の生成を防止するフィブリン凝集阻害剤の存在下で血小板凝集を測定する方法、およびトロンビン阻害剤の血小板凝集を阻害する作用を測定するための診断補助剤に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
トロンビン阻害剤の血小板凝集を阻害する作用を測定するため、例えば血小板に富む血漿（ＰＲＰ）のような血小板懸濁液およびトロンビンを含有する診断システムを使用することができ、トロンビンは血小板の凝集を引き起こす。凝集の比率または程度は濁り測定、または比濁法により測定されうる。トロンビン阻害剤の添加により、血小板の凝集は加えた量の関数として減速され、その結果、阻害効果の定量が濁り測定から可能である。
【０００３】
例えば血小板に富む血漿（ＰＲＰ）中でトロンビンにより引き起こされる血小板凝集の場合、トロンビンにより引き起こされたフィブリン凝塊は測定技術の障害となる。従来の方法においては、最大の血小板凝集に到達しないように非常に低い濃度のトロンビンだけを使用することができる。しかしながら、低濃度のトロンビンを用いても、干渉するフィブリン凝塊が一定時間後に生じる。にも関わらず、より良い検出信号を与えるより高い濃度のトロンビンを使用できるように、手の込んだ血小板洗浄工程を行う必要がある。
【０００４】
したがって、本発明の目的は実験的に引き起こされた血小板凝集の測定およびフィブリン凝塊の干渉作用のないトロンビン阻害剤の測定を可能にする方法を提供することである。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ配列で開始する短ペプチドはフィブリノーゲンと結合することが知られている（米国のNatl. Acad. Sci., 75, 3085〜3089（1978年）を参照）。さらに、ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは抗血小板試薬と組合せて血小板離解実験において使用されている（Pharmacology and Experimental Therapeutics, 259, 1371〜1378（1991年）を参照）。その上、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ2はフィブリン凝集阻害剤としてＦ XIIIａおよびフィブリノーゲンの測定法において使用できることが知られている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
今般、驚くべきことに、高いトロンビン濃度でも、また実験的に必要な血小板凝集に影響を及ぼすことなく、干渉するフィブリン凝塊の生成がフィブリン凝集阻害剤を加えることにより抑制されることを見い出した。
したがって、本発明はフィブリン凝集阻害剤の存在により干渉するフィブリン凝塊の生成を防止することを包含する、トロンビンにより引き起こされる血小板凝集の定性的または定量的測定法に関する。
好適なフィブリン凝集阻害剤はペプチドまたはペプチド誘導体であり、特にヒトのα−フィブリン鎖のアミノ末端と類似の構造を有するものである。このようなフィブリン凝集阻害剤は例えばA.P. LaudanoらのProc. Natl. Acad. Sci., 75, 3085〜3089（1978年）に記載されている。好ましいペプチドはＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＡｒｇまたはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの配列を含有するものである。
【０００６】
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＰｒｏまたはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓａｒの配列を有するペプチドまたはペプチド誘導体は特に好ましい。
さらに、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ2はとりわけ好ましい。
本発明はさらに、測定対象のトロンビン阻害剤およびフィブリン凝集阻害剤が同時に分析混合物に存在する、血小板阻害剤の血小板凝集を阻害する作用を測定するための上記の方法の使用に関する。驚くべきことに、この方法を用いて例えば血漿中に存在するトロンビン阻害剤を検出するだけでなく定量もまたすることができる。しかしながら、血漿以外の液体で本発明の方法を使用する定性的または定量的検出もまた可能である。
【０００７】
本発明はさらに、トロンビンおよびフィブリン凝集阻害剤を含有する診断補助剤に関する。このタイプの診断補助剤は液体、例えば血漿中に存在するトロンビン阻害剤の血小板凝集を阻害する作用の定性的または定量的測定のため本発明の方法を行うのに適している。
例えば緩衝液または患者の試料中の血小板凝集阻害剤の測定法を以下の実施例により説明する。分析は次の工程に従って行うことができる：
血小板に富む血漿（ＰＲＰ）の投入、
クエン酸塩溶液または血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）の添加、
フィブリン凝集阻害剤（場合によっては緩衝液中に溶解されている）の添加、
試験試料の添加；検出対象の阻害剤は例えば緩衝液またはＰＰＰ中に溶解させることができ、あるいは血漿中に存在させることができる；各種濃度（連続希釈）で分析される、
約３７℃で１〜２０分間のインキュベーション、
血小板凝集の誘引物質、例えばトロンビンの添加、
血小板凝集の測定。
【０００８】
この測定法に必要な量はほんの少しである：ＰＲＰ好ましくは３００μl、フィブリン凝集阻害剤溶液好ましくは２５μl；トロンビン阻害剤溶液、例えばＣＲＣ ２２０（４−メトキシ−２,３,６−トリメチルフェニルスルホニル−Ｌ−アスパルチル−Ｄ−４−アミジノフェニル−アラニルピペリジド ＥＰ ０ ５１３ ５４３）またはＰＰＰ好ましくは２５μl、全量は３００〜１０００μl、好ましくは５００μlである。所定量、例えば５００μlとするために、等張のＮａＣｌ溶液で１０倍に希釈された０.３８％濃度のクエン酸塩溶液からなる溶液を加えることができる。血小板凝集の測定は好ましくは例えばLAbor社（Laborgeraete und Analysesysteme Vertriebsgesellschaft mbH, ドイツ）製のＡＰＡＣＴ（自動化血小板凝集および凝固トレーサー）のような凝集計（aggregometer）を用いて１mlのクヴェット中、３７℃で撹拌しながら行われる。
【０００９】
ＰＲＰは公知の方法によりクエン酸塩溶液中で製造することができる。血小板の数は１０7〜１０9／ml、好ましくは２×１０8／mlである。最適な凝集のための血小板濃度は慣用の血小板アゴニスト、例えばコラーゲン、ＡＤＰまたはトロンボキサンＡ2を用いて測定することができる。
フィブリン凝集阻害剤の濃度は１〜２０mM、好ましくは１０mMである。
トロンビン濃度は好ましくは４〜７nMであり、トロンビンを用いて達成することのできる最大の血小板凝集の約８０％に相当する。
【００１０】
略語：
ＰＲＰ 血小板に富む血漿
ＰＰＰ 血小板に乏しい血漿
Ｇｌｙ グリシン
Ｐｒｏ Ｌ−プロリン
Ａｒｇ Ｌ−アルギニン
Ａｌａ Ｌ−アラニン
Ｓａｒ サルコシン
ＮＨ2 アミド
mM ミリモル／リットル
nM ナノモル／リットル
以下の実施例により本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【実施例】
〔実施例１〕 血小板凝集の測定
図１はフィブリン凝集阻害剤の存在下、トロンビン濃度（nM）の関数としてＰＲＰ中のトロンビンにより引き起こされる血小板凝集（非凝集血小板と凝集血小板の比率、％）を示す。これにより従来技術よりも明確に高い濃度のトロンビンを使用することができる。このように拡張される参照プロットは血小板凝集の正確な測定に相当寄与する。
図１から明らかなように、血小板凝集は４〜７nM（０.４〜０.７ＩＵ／ml）の濃度のトロンビンを加えると、達成できる最大血小板凝集の約１０〜８０％にわたり直線的に増加する。
【００１２】
〔実施例２〕 溶液Ａ（クエン酸塩溶液）の調製
次の物質を１００mlの水に溶解する：３８０mgのクエン酸三ナトリウム二水和物。場合によっては、溶液はさらに５００mgのＤ−（＋）−グルコースおよび３５０mgのアルブミンを含有してもよい。
溶液Ｂ（ＰＲＰ）の調製
ドナーからの９０mlの新鮮な全血をすでに１０mlの３.８％濃度（ｗ／ｖ）のクエン酸三ナトリウム二水和物溶液を含有するポリエチレン容器に入れる。この凝固防止された血液をすぐに２００ｇで２０分間遠心分離する。上澄液を新しいポリエチレン容器に移し、使用するまで０℃で保存する。
【００１３】
溶液Ｃ（フィブリン凝集阻害剤）の調製
次の物質を１００mlの水に溶解する：１ｇのウシ血清アルブミンおよび１０ｇのＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ2。溶液を使用するまで−２０℃で保存する。
溶液Ｄ（トロンビン阻害剤）の調製
次の物質を１００mlの水に溶解する：１２７.６mgのトロンビン阻害剤 ＣＲＣ２２０（４−メトキシ−２,３,６−トリメチルフェニルスルホニル−Ｌ−アスパルチル−Ｄ−４−アミジノフェニルアラニルピペリジド）。生理食塩水で希釈されたＣＲＣ ２２０溶液を分析に使用するために調製する。すべての溶液を新しく作り、０℃まで冷却する。
【００１４】
溶液Ｅ（トロンビン）の調製
４.２μｇのヒトのα−トロンビンを１mlの水に溶解する（１０ＩＵ／ml）。生理食塩水で希釈されたトロンビン溶液を分析に使用するために調製する。すべての溶液を新しく作り、０℃まで冷却する。
分析手順
３００μｌの溶液Ｂ、１００μｌの溶液Ａ、２５μｌの溶液Ｃおよび２５μｌの溶液ＤをＡＰＡＣＴ凝集計（LAbor）の１ml容量の測定用クヴェット（１cmの長さ、連続撹拌）にピペットで移し、３７℃で１分間プレインキュベートする。次に、５０μｌの溶液Ｅを加え、光の透過率を時間の関数として記録する。測定を信号が一定になるまで継続し、それは通常５分後に到達する。増加する濃度のトロンビン阻害剤を各分析混合物に加える。トロンビン阻害剤の添加量を知ることにより、例えばトロンビン阻害剤についてのＩＣ50を定量的に測定することができる（図２）。本実施例のＩＣ50は１０nMであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】フィブリン凝集阻害剤の存在下、ＰＲＰ中のトロンビンにより引き起こされる血小板凝集を示すプロット。
【図２】ＰＲＰ中の血小板凝集におけるトロンビン阻害剤の効率（ＩＣ50）の測定結果を示すプロット。
Claims (3)
- 実験的に必要な血小板凝集に影響を及ぼすことなく干渉するフィブリン凝塊の生成が、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＳａｒまたはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ 2 の配列からなるペプチドまたはペプチド誘導体群から選択されるフィブリン凝集阻害剤の存在により防止される、フィブリンを含有する血小板に富む血漿の存在下でトロンビンにより引き起こされる血小板凝集の定性的または定量的測定法。
- ４〜７nMのトロンビンが使用される請求項１記載の方法。
- トロンビン阻害剤およびフィブリン凝集阻害剤が同時に分析混合物中に存在する、トロンビン阻害剤の血小板凝集を阻害する作用の定性的または定量的測定に使用される請求項１記載の方法。
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