JPH07242681A - リン脂質誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アミノ基などとの反応性に富むカルボキシル
基を（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に有し、リポソ
ームなどの膜形成成分として用いた場合、リポソーム表
面でポリオキシアルキレン鎖の先端に機能性物質を容易
に共有結合させることができる新規なリン脂質誘導体を
得る。 【構成】 下式で表わされるリン脂質誘導体。 【化１】 〔Ｒ¹、Ｒ²は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシル残基、Ａ
Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは１〜１０
００、ｍは１〜４、Ｍ¹、Ｍ²はＨまたはアルカリ金属〕

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規かつ有用なリン脂
質誘導体に関する。さらに詳しくは医薬の運搬体、検査
薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バイオリアクタ
ー、バイオエレクトロニクス素子、マイクロカプセル代
替品など、種々の機能性リポソームまたは脂肪乳剤等の
小胞体の製造などに用いられるリン脂質誘導体に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】リポソームはリン脂質の二分子膜からな
る小胞体であり、多分野での応用が試みられている。特
に、医薬運搬体、診断・検出用のセンサーなどへの応用
が注目されているが、リポソーム表面上または膜中に機
能性物質を固定して各種機能をもたせること、およびリ
ポソームの血中濃度を維持することなどが大きな課題と
なっている。

【０００３】従来、リポソーム表面上または膜中への機
能性物質の固定化に関しては、プルラン誘導体で被覆し
たリポソームの表面上の多糖上に置換したアミノエチル
カルバミルメチル基にγ−マレイミドブチルオキシサク
シニミジルを介して抗体フラグメントを結合させる方法
（Biochem. Biophys. Acta., 898, 323(1987)）、ある
いはあらかじめリポソーム膜形成成分中に糖脂質を加え
ておき、リポソーム形成後過よう素酸酸化を行い、生じ
たアルデヒド基と抗体とを反応させて固定化する方法
（J. Biol. Chem., 255, 10509(1980)）などがある。

【０００４】しかし、これらの従来法では、リポソーム
調製後にリポソーム膜表面上での多段階の化学反応を行
う必要があり、このため目的とする機能性物質の導入量
が低く制限され、また反応による副生成物や不純物が混
入し、リポソーム膜へのダメージが大きいなどの問題点
がある。

【０００５】一方、リポソームを生体内へ投与したと
き、その多くは肝臓、脾臓などの網内系器官で捕捉され
るため、十分な効果が得られないことが指摘されている
（Cancer Res., 43, 5328(1983)）。そこで、この網内
系器官で捕捉されてしまう問題点や、あるいはリポソー
ム自身の崩壊性・凝集性など安定性の低さに関する問題
点を改善する方法として、リポソームの表面にポリエチ
レングリコール鎖を導入することが試みられている（例
えば、特開平１−２４９７１７号公報、FEBS letters,
268, 235(1990)）。また、ポリエチレングリコールで修
飾されたリポソームは、長期間にわたり血液中濃度を維
持できることが明らかになっている（Biochem. Biophy
s. Acta., 1066, 29-36(1991)）。しかし、このような
方法により得られるポリエチレングリコール鎖の導入さ
れたリポソームは機能性物質と反応しないので、リポソ
ーム表面上に機能性物質を固定化することはできない。

【０００６】また特表平５−５０８３８８号公報には、
α−ステアリル−ω−プロピオン酸−ポリオキシエチレ
ンに代表されるようなアニオン基を有するポリエチレン
グリコール誘導体からなるリポソーム製剤が開示されて
いる。しかし、このポリエチレングリコール誘導体は、
疎水部がモノアルキル基であるためリポソーム膜から脱
離しやすく、このためこのようなポリエチレングリコー
ル誘導体を膜形成成分として含むリポソームは長期間の
安定性に劣るという問題点がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、（ポ
リ）オキシアルキレン鎖の先端に、簡単にかつ効率よく
種々の機能性物質を電気的にまたは共有結合により固定
化することができる新規かつ有用なリン脂質誘導体を提
供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記一般式
〔１〕で表わされるリン脂質誘導体である。

【化２】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシ
ル残基を表わし、同一でも異なっていてもよい。Ｒ³は
水素原子またはメチル基、ＡＯは炭素数２〜４のオキシ
アルキレン基、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル
数で、１〜１０００の正数を表わす。ｎが２以上の場
合、オキシアルキレン基は同一でも異なっていてもよ
く、またランダム状に付加していても、ブロック状に付
加していてもよい。ｍは１または４の整数、Ｍ¹および
Ｍ²は水素原子またはアルカリ金属原子を表わす。〕

【０００９】本発明において、「（ポリ）オキシアルキ
レン」はｎが１のオキシアルキレンまたはｎが２以上の
ポリオキシアルキレンを意味する。また「（ポリ）アル
キレン」も上記と同様にアルキレンまたはポリアルキレ
ンを意味する。

【００１０】一般式〔１〕においてＲ¹またはＲ²で表わ
される脂肪酸のアシル残基は、炭素数３〜３０、好まし
くは８〜２０のアシル残基である。このようなアシル残
基の具体的なものとしては、プロピオン酸、酪酸、カプ
ロン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウン
デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、
ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン
酸、ソロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、２−エチル
ヘキサン酸等の飽和脂肪酸のアシル残基；オレイン酸、
リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、２，４−オクタデ
カジエン酸等の不飽和脂肪酸のアシル残基；イソステア
リン酸等の分岐脂肪酸のアシル残基；リシノール酸、１
２−ヒドロキシステアリン酸等のアルキル基中に水酸基
を有する脂肪酸のアシル残基などがあげられる。

【００１１】本発明のリン脂質誘導体をリポソームまた
は脂肪乳剤などの製造に用いる場合は、Ｒ¹またはＲ²で
表わされる脂肪酸のアシル残基は、安定なリポソームま
たは脂肪乳剤が形成できるという理由から、ミリスチン
酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、２，４
−オクタデカジエン酸のアシル残基が好ましく、特にパ
ルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸のアシル残基が
好ましい。Ｒ¹とＲ²とは同一であってもよいし、異なっ
ていてもよい。

【００１２】一般式〔１〕のＡＯで表わされるオキシア
ルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であ
り、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシト
リメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ
−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン
基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、
エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、
１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒド
ロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基
である。一般式〔１〕のｎはオキシアルキレン基の平均
付加モル数であり、１〜１０００、好ましくは１０〜５
００、さらに好ましくは２０〜３００の正数である。

【００１３】ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の
種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場
合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加し
ていてもよい。親水性を付与する場合、ＡＯとしてはエ
チレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この
場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異な
るアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオ
キシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付
加しているのが望ましい。（ポリ）オキシアルキレン鎖
に親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付加
モル数を多くする。

【００１４】一般式〔１〕のｍは１〜４の整数である。
本発明のリン脂質誘導体をリポソームまたは脂肪乳剤な
どの製造に用いる場合、ｍは２または３が好ましい。一
般式〔１〕のＭ¹およびＭ²は水素原子またはナトリウム
もしくはカリウム等のアルカリ金属原子であり、同一で
も異なっていてもよい。

【００１５】一般式〔１〕で表わされるリン脂質誘導体
は、例えば次のような２段階の反応により、容易に製造
することができる。第１段階目の反応では、ホスホリパ
ーゼＤ酵素の存在下に、リン脂質またはそのアルカリ金
属塩とポリアルキレングリコールとを反応させ、ホスフ
ァチジル＝ポリアルキレングリコールを合成する。この
とき使用するホスホリパーゼＤとしては、市販品または
「J.Biol.Chem.,242,477-484(1967)」に記載されている
方法などにより抽出・精製したものであってもよい。ま
たリン脂質またはそのアルカリ金属塩としては、ホスフ
ァチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホ
スファチジルグリセロール、ホスファチジン酸およびこ
れらのアルカリ金属塩などが使用できる。ホスホリパー
ゼＤの使用量は、特に限定されないが、リン脂質１ｇに
対して５〜５００単位とするのが好ましい。また、リン
脂質とポリアルキレングリコールとの仕込モル比は、リ
ン脂質１モルに対してポリアルキレングリコール２〜１
００モルとするのが好ましい。

【００１６】反応は酢酸緩衝液、炭酸緩衝液等の水系溶
媒、またはこれらの水系溶媒とクロロホルム、ベンゼ
ン、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等
の有機溶媒との混合溶媒中で行うのが好ましい。反応温
度は０〜８０℃、好ましくは３０〜４０℃、反応時間は
１０分間〜１７０時間、好ましくは３０分間〜２４時間
とするのが望ましい。このようにして得られたホスファ
チジル＝ポリアルキレングリコールは、そのまま、また
は再沈殿、カラム処理、吸着剤処理、イオン交換、ゲル
濾過、限外濾過、透析、薄層クロマトグラフィーなどの
方法により単離・精製して、次の第２段階目の反応に供
する。

【００１７】第２段階目の反応では、第１段階目の反応
で得られたホスファチジル＝ポリアルキレングリコール
に炭素数３〜６のジカルボン酸無水物を反応させ、目的
とするリン脂質誘導体を合成する。ジカルボン酸無水物
としては、無水コハク酸、無水グルタル酸などがあげら
れる。両者の仕込モル比は特に限定されないが、ホスフ
ァチジル＝ポリアルキレングリコール１モルに対してジ
カルボン酸無水物０．５〜１００モル、好ましくは１〜
１０モルとするのが望ましい。

【００１８】反応は無溶媒で、またはクロロホルム、ベ
ンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、
アセトニトリル等の有機溶媒中で、ピリジン、トリエチ
ルアミンなどの触媒の存在下に行うのが好ましい。反応
温度は０〜１５０℃、好ましくは４０〜１００℃、反応
時間は３０分間〜４８時間、好ましくは１〜２４時間と
するのが望ましい。反応終了後は、蒸留、再結晶、再沈
澱、吸着剤処理、カラム処理、イオン交換、ゲル濾過、
限外濾過、透析などの方法により単離・精製することが
できる。

【００１９】ポリアルキレングリコールとしてポリエチ
レングリコール、ジカルボン酸無水物として無水コハク
酸を用いた場合の反応式を次に示す。なお、式中Ｒ¹、
Ｒ²、Ｍ¹、Ｍ²およびｎは前記と同じもの、ＰＬ−ＰＥ
Ｇはホスファチジル＝ポリエチレングリコールを示す。

【化３】

【００２０】このようにして得られたリン脂質誘導体
は、疎水性に富む２本の脂肪酸残基と、親水性に富むポ
リオキシアルキレン基とを有しているので、優れた界面
活性能を有している。このため、本発明のリン脂質誘導
体は、小胞体形成成分などとして使用することができ
る。ここで小胞体とは、小胞体形成成分の親水基が界面
の水相に向って配向した構造を有する粒子を意味する。
具体的なものとしては、二分子膜からなる閉鎖小胞であ
るリポソーム、植物油およびリン脂質などの混合物が乳
化された脂肪乳剤、またはミセルなどがあげられる。

【００２１】本発明のリン脂質誘導体は、末端に官能性
としてカルボキシル基を有しているので、アミノ基、水
酸基またはチオール基などの官能基、特に第１級アミノ
基に対して高い反応性を有している。このため、このよ
うな官能基を有する機能性物質と容易に反応し、共有結
合が形成される。またカルボキシル基がプラスの電荷を
有する機能性物質と容易に電気的に結合する。従って、
本発明のリン脂質誘導体を小胞体形成成分として用いる
ことにより、小胞体に（ポリ）オキシアルキレン鎖を導
入できるとともに、前記官能基を有する機能性物質また
はプラスの電荷を有する機能性物質に対する反応性を付
与することができ、反応性小胞体を製造することができ
る。

【００２２】また本発明のリン脂質誘導体はＲ¹および
Ｒ²の２本の脂肪酸アシル残基を有しているため、小胞
体中、特にリポソーム膜中から脱離しにくい。このため
本発明のリン脂質誘導体を小胞体形成成分として含む小
胞体、特にリポソームは、１本の脂肪酸残基からなるノ
ニオン系界面活性剤を膜形成成分として含むリポソーム
に比べて、優れた安定性を有するものとなる。

【００２３】本発明のリン脂質誘導体を用いて反応性小
胞体を製造する場合、リン脂質誘導体は一種単独で、ま
たは二種以上組合せて、あるいは小胞体を形成しうる他
の小胞体形成成分、例えば大豆レシチン、卵黄レシチ
ン、その他のリン脂質類、コレステロール、イントラリ
ピッド（大塚製薬（株）、商標）、大豆油、サフラワー
油などと混合して使用することができ、反応性リポソー
ムをはじめ反応性脂肪乳剤、反応性ミセルなどの反応性
小胞体を形成することができる。この場合、小胞体は公
知の方法により製造することができる。

【００２４】本発明のリン脂質誘導体を用いて得られた
反応性小胞体は、一般式〔１〕で表わされる化合物中の
カルボキシル基が小胞体の表面に存在するので、この基
を官能基として利用して、水溶性の脱水縮合剤などを用
いることにより種々の機能性物質を共有結合により導入
することができる。また種々の機能性物質を電気的に固
定化することもできる。

【００２５】次に本発明のリン脂質誘導体を用いて製造
したそれぞれの反応性小胞体について詳しく説明する。
代表的な反応性小胞体である反応性リポソームは、本発
明のリン脂質誘導体を膜形成成分（小胞体形成成分）と
して含有するものである。リン脂質誘導体の含有量は、
リン脂質誘導体および他の膜形成成分の合計量に対して
０．１〜５０モル％、好ましくは０．５〜３０モル％で
あるのが望ましい。０．１モル％未満では期待される効
果が小さくなるため、一般的には使用されない。また５
０モル％を超えるとリポソームの安定性が低下するため
一般的には使用されない。全膜形成成分中に占める本発
明のリン脂質誘導体の割合を多くするほど、固定化する
機能性物質の量をより多くすることができる。リン脂質
誘導体は、一種単独で使用することもできるし、二種以
上のものを組合せて使用することもできる。

【００２６】リン脂質誘導体と混合して用いられる他の
膜形成成分としては、従来からリポソームの膜形成成分
として用いられているものが制限なく使用できる。具体
的には、ジホスファチジルグリセロール、カルジオリピ
ン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリ
ン、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチン、
卵黄レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジル
グリセロール等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和基を
有する重合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリセリ
ド、ジガラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグリセ
リド等の糖脂質類；コレステロール等の非極性脂質；そ
の他には、非イオン性界面活性剤、ホスファチジルポリ
エチレングリコール、「Biochem. Biophys. Acta., 106
6, 29-36(1991)」に記載されているホスファチジルエタ
ノールアミンとポリエチレングリコールとの反応物、お
よびこれらの混合物などがあげられる。

【００２７】反応性リポソームは、リン脂質誘導体およ
びレシチン、コレステロール、リン脂質等の他の膜形成
成分を、有機溶媒等の適当な溶媒に溶解し、エクスツル
ージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面
活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール注入法、プレベ
シクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン
法、アニーリング法、凍結融解法など、種々の公知の方
法によりリポソーム化することにより製造することがで
きる。また、これらの製造法を選択することにより、多
重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚
膜リポソームなど、種々の大きさや形態を有する反応性
リポソームを製造することができる。

【００２８】このようにして得られた反応性リポソーム
は、リポソーム膜の内外表面に（ポリ）オキシアルキレ
ンからなるスペーサーを介してカルボキシル基が結合し
ているので、アミノ基、水酸基、チオール基などの官能
基、特に第１級アミノ基を有する機能性物質を効率よく
かつ簡単に、リポソームの二分子膜上に（ポリ）オキシ
アルキレンからなるスペーサーを介して、アミド結合、
エステル結合またはチオールエステル結合により化学的
に固定化することができる。またカルボキシル基に、プ
ラスの電荷を有する機能性物質を電気的に固定化するこ
とができる。

【００２９】反応性リポソームに固定化できる機能性物
質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、
蛍光化合物、化学発光化合物、電極感応性化合物等の標
識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性
化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他
のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホル
モン等の生理活性物質；医薬などであって、分子中にア
ミノ基、水酸基またはチオール基を有するもの、または
プラスの電荷を有するものなどがあげられる。これらの
中では、アミノ基、特に第１級アミノ基を有する機能性
物質が好ましい。

【００３０】反応性リポソーム上への機能性物質の共有
結合による固定化反応は、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−
（２−モルホリノエチル）カルボジイミド＝メソ−ｐ−
トルエンスルホネート、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性
の脱水縮合剤の存在下、種々の緩衝液等の水系溶媒、ま
たはこれらの水系溶媒とアセトン、アセトニトリル、テ
トラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルアセタミド、ジメチルスルホキシ
ド、ピロリドン等の有機溶媒との混合溶媒中で、反応性
リポソームと前記官能基を有する機能性物質とを−１０
〜＋１００℃、アミノ基との反応の場合は好ましくは０
〜６０℃、さらに好ましくは０〜４０℃、水酸基または
チオール基との反応の場合は好ましくは３０〜８０℃
で、１０分間〜３００時間、好ましくは３０分間〜２４
時間攪拌下に反応させる方法などにより、一段階で容易
に行うことができる。これらの条件外では、リポソーム
の安定性が悪くなるため好ましくない。

【００３１】リポソーム表面上でのアミノ基を有する機
能性物質の固定化反応を模式的に示すと次のようにな
る。式中、ＡＯ、ｎ、ｍ、Ｍ²は前記と同じものを示
す。

【化４】

【００３２】機能性物質を電気的に固定化する場合は、
種々の緩衝液等の水系溶媒中で、反応性リポソームにプ
ラスの電荷を有する機能性物質を接触させることによ
り、一段階で容易に行うことができる。

【００３３】反応性リポソームの内部には、一般のリポ
ソームと同様に種々の物質を公知の方法により封入する
ことが可能である。被封入物質としては、例えば色素、
染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合
物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、
熱応答性化合物、電極感応性化合物等の外部刺激応答性
化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、
糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医
薬；ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ
エチレングリコール、ヒアルロン酸等の水溶性高分子類
などがあげられる。固定化反応または封入操作の終了後
は、必要によりゲル濾過、限外濾過、透析、遠心分離、
静置沈降分離等の方法により精製を行うことができる。

【００３４】機能性物質を固定化したリポソームは、
（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に機能性物質が固定
化されているので、（ポリ）オキシアルキレン鎖に邪魔
されることなく機能性物質の作用が十分に発揮される。
また、（ポリ）オキシアルキレン鎖が導入されているの
で、従来からの（ポリ）オキシアルキレン鎖導入の効
果、例えば長期間にわたる血液中濃度の維持、非免疫原
性、リポソーム内部に封入した物質の漏れ防止などの効
果も期待できる。このため反応性リポソームは、医薬の
運搬体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バイ
オリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイクロ
カプセル代替品など、種々の機能性リポソームとして利
用できる。

【００３５】なお、反応性リポソームを製造する際、他
の膜形成成分として重合性リン脂質を配合することによ
り、重合性の反応性リポソームとすることができる。重
合性のリン脂質としては、公知の重合性リン脂質を使用
することができるが、例えば１，２−ジ（２，４−オク
タデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンの他、
野島庄七、砂本順三、井上圭三編集、１９８８年南江堂
発行の「リポソーム」ｐ３１３〜３１５に記載のものな
どがあげられる。これらの中では、１，２−ジ（２，４
−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリン
が好ましい。

【００３６】重合性リポソームは、リポソーム調製後
に、光重合開始剤の存在下または非存在下でＵＶ、γ
線、電子線などの光照射を行うことにより、あるいはレ
ドックス開始剤系により、あるいはアゾ系開始剤または
有機過酸化物などの存在下で加熱を行うことにより、容
易に重合を行うことができる。このようにして得られた
重合後のリポソームは、優れた安定性を有しているの
で、水溶液に分散させたままで、あるいは凍結乾燥等に
より粉末状に調製し、安定して使用することができる。

【００３７】他の反応性小胞体としての反応性脂肪乳剤
は、本発明のリン脂質誘導体と、大豆油、サフラワー油
等の植物油と、大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂
質と、必要により添加される他の添加剤、例えばイント
ラリピッド（大塚製薬（株）製、商標）、乳化補助剤、
安定化剤、等張化剤、脂溶性医薬、脂溶性生理活性物質
などを含む油脂混合物が乳化されたものである。油脂混
合物中に占めるリン脂質誘導体の含有量は、０．１〜５
０モル％、好ましくは０．５〜３０モル％であるのが望
ましい。

【００３８】反応性脂肪乳剤は、公知の方法により製造
することができる。例えば、本発明のリン脂質誘導体、
植物油、他のリン脂質および必要により配合する添加剤
を混合、加熱し、水を加えてホモミキサー等で粗乳化
し、次にマントン−ガウリン型の加圧噴射式ホモジナイ
ザー等で均質化する方法などにより製造することができ
る。

【００３９】このようにして得られた反応性脂肪乳剤に
は、反応性リポソームの場合と同様にして、同様の機能
性物質を容易に固定化することができる。このため反応
性脂肪乳剤は、医薬の運般体、検査薬、診断薬、センサ
ー、固定化触媒などとして利用できる。

【００４０】上記以外の反応性小胞体である反応性ミセ
ルは、本発明のリン脂質誘導体だけからなるものであっ
ても、レシチン、コレステロール、リン脂質等の他の成
分が含有されているものであってもよい。反応性ミセル
も反応性脂肪乳剤と同様にして機能性物質を固定化する
ことができ、同様の用途に利用できる。

【００４１】

【発明の効果】本発明のリン脂質誘導体は新規かつ有用
である。本発明のリン脂質誘導体を小胞体形成成分とし
て用いることにより、小胞体に（ポリ）オキシアルキレ
ン鎖を導入できるとともに、この（ポリ）オキシアルキ
レン鎖の先端に、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質
を共有結合により、または電気的に固定化することがで
き、しかも機能性物質の導入量を多くすることができ
る。この場合、小胞体は長期間の保存安定性に優れてい
る。また本発明のリン脂質誘導体を小胞体形成成分とし
て用いることにより、（ポリ）オキシアルキレン鎖導入
の効果、例えば長期間にわたる血液中濃度の維持、非免
疫原性、小胞体に内包した物質の漏れ防止などの効果も
期得できる。

【００４２】

【実施例】以下、実施例により、さらに詳細な説明を行
うが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ ジパルミトイルホスファチジルコリン０．５ｇ（０．６
８ｍｍｏｌ）およびポリエチレングリコール（Ｍｗ≒１
０００、ｎ≒２３）５ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を溶解させ
たクロロホルム溶液４０ｍｌに、ホスホリパーゼＤ（旭
化成（株）製）４０単位を溶解させた１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．６）２０ｍｌを加え、４０℃で１２時間攪拌
して反応させた。次に、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液で中和した後、有機層を減圧下で濃縮した。得られた
反応混合物をシリカゲルカラム（２０％メタノール／ク
ロロホルム）を用いて分画し、濃縮した後、少量のクロ
ロホルムに溶解させ、これをヘキサンに再沈殿すること
により、ジパルミトイルホスファチジル＝ポリエチレン
グリコールを得た（収率３０％）。

【００４３】次に、乾燥させたクロロホルム１０ｍｌ中
に、上記ジパルミトイルホスファチジル＝ポリエチレン
グリコール１００ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）、無水コハ
ク酸０．８６ｍｇ（０．８６ｍｍｏｌ）および触媒量の
ピリジンを加え、６０℃で６時間攪拌した。得られた反
応混合物をヘキサン中に再沈殿させ、さらに限外濾過
（分画分子量５００）したのち凍結乾燥し、目的の下記
反応性リン脂質誘導体を得た（収率８９％）。

【００４４】

【化５】

【００４５】精製物は、¹Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲスペク
トルにより確認した。結果は次の通りである。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃、ＴＭＳ、δ；
ｐｐｍ、Ｊ：Ｈｚ） ７．２６（ｋ；ｓ、１Ｈ） ５．２３（ｆ；ｍ、１Ｈ） ４．２７（ｉ；ｔ、２Ｈ、Ｊ＝４．６） ４．００（ｅ、ｇ；ｍ、４Ｈ） ３．６５（ｈ；ｍ、約９０Ｈ） ２．６４（ｊ；ｍ、４Ｈ） ２．３１（ｄ、ｄ′；ｍ、４Ｈ） １．６０（ｃ、ｃ′；ｍ、４Ｈ） １．２９（ｂ、ｂ′；ｍ、４８Ｈ） ０．９０（ａ、ａ′；ｍ、６Ｈ） ＩＲ；（ＫＢｒ、ｃｍ^-1） １７２８（エステル、Ｃ＝Ｏ伸縮） １５９８、１４２０（カルボン酸）

【００４６】実施例２ 実施例１と同様にして、ただしポリアルキレングリコー
ル誘導体として分子量約５０００（ｎ≒１１５）のもの
を用いて、目的の下記反応性リン脂質誘導体を得た。

【化６】

【００４７】精製物は、¹Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲスペク
トルにより確認した。結果は次の通りである。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃、ＴＭＳ、δ；
ｐｐｍ、Ｊ：Ｈｚ） ７．２６（ｋ；ｓ、１Ｈ） ５．２３（ｆ；ｍ、１Ｈ） ４．２７（ｉ；ｔ、２Ｈ、Ｊ＝４．６） ４．００（ｅ、ｇ；ｍ、４Ｈ） ３．６５（ｈ；ｍ、約４５５Ｈ） ２．６４（ｊ；ｍ、４Ｈ） ２．３１（ｄ、ｄ′；ｍ、４Ｈ） １．６０（ｃ、ｃ′；ｍ、４Ｈ） １．２９（ｂ、ｂ′；ｍ、４８Ｈ） ０．９０（ａ、ａ′；ｍ、６Ｈ） ＩＲ；（ＫＢｒ、ｃｍ^-1） １７２８（エステル、Ｃ＝Ｏ伸縮） １５９８、１４２０（カルボン酸）

【００４８】実施例３ 実施例１と同様にして、ただしポリアルキレングリコー
ル誘導体として（エチレングリコール）ｐ／（プロピレ
ングリコール）ｑ／（エチレングリコール）ｒの三元ラ
ンダム共重合体（ｐ≒２０、ｑ≒１０、ｒ≒２０）を用
いて、目的の下記反応性リン脂質誘導体を得た。

【化７】

【００４９】精製物は、¹Ｈ−ＮＭＲにより確認した。
結果は次の通りである。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃、ＴＭＳ、δ；
ｐｐｍ、Ｊ：Ｈｚ） ７．２６（ａ；ｓ、１Ｈ） ５．２３（６；ｍ、１Ｈ） ４．２６（ｄ；ｔ、２Ｈ、Ｊ＝４．６） ４．００（５、７；ｍ、４Ｈ） ３．６０（ｅ、ｆ、ｇ、ｋ；ｍ、約１９０Ｈ） ２．６４（ｂ、ｃ；ｍ、４Ｈ） ２．３１（４、４′；ｍ、４Ｈ） １．６０（３、３′；ｍ、４Ｈ） １．２６（２、２′；ｍ、４８Ｈ） １．１２（ｈ；ｍ、１５Ｈ） ０．８８（１、１′；ｔ、６Ｈ、Ｊ＝６．４） ＩＲ；（ＫＢｒ、ｃｍ^-1） １７３０（エステル、Ｃ＝Ｏ伸縮） １５９９、１４２０（カルボン酸）

【００５０】試験例１ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、
コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）および実施
例１で得られた化合物５ｍｇ（１．７μｍｏｌ）をナス
型フラスコに入れ、２ｍｌのベンゼンで溶解させた後、
凍結乾燥を行った。これに生理的食塩水１ｍｌを加え、
バス型超音波照射およびボルテックスミキサーによりリ
ポソーム化して多重層リポソームを得た。さらにエクス
ツルーダーにより３．０→１．０→０．２μｍのポリカ
ーボネートメンブランを順次通過させ、大きな単層リポ
ソームを得た。得られたリポソームの粒径をレーザー散
乱粒度分布計（ＮＩＣＯＭＰ社製、ＮＩＣＯＭＰ３７０
ＨＰＬ、商標）を用い測定したところ平均粒径２６２ｎ
ｍ（ＣＶ値１９％）であった。上記リポソームを５℃で
一か月静置した後、平均粒径を測定したところ、平均粒
径１９１ｎｍ、ＣＶ値１９％であり、安定性に優れてい
た。

【００５１】比較試験例１ 試験例１と同様にして、ただし実施例１で得られた化合
物の代わりに、α−ステアリル−ω−メトキシ−ポリオ
キシエチレン（平均付加モル数約１０）を用いてリポソ
ームを調製した。得られたリポソームの平均粒径は１８
６ｎｍ（ＣＶ値２３％）であった。このリポソームを５
℃で一週間静置した後、平均粒径を測定したところ、平
均粒径３７９ｎｍ、ＣＶ値６１％であり、凝集が見ら
れ、安定性が悪かった。

【００５２】試験例２ 試験例１で得られたリポソーム溶液（固形分量０．２５
％）の５００μｌに、１ｍｇ／１ｍｌの１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩水溶液（ｐＨ５）５００μｌを加え、５℃で３０分間
攪拌した。さらに１ｍｇ／ｍｌの西洋山葵ペルオキシダ
ーゼ（以下ＨＲＰと略す）／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）１００μｌを加え、５℃で２４時間攪拌し
て、リポソームにＨＲＰを固定化した。これをＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含リポソ
ーム分画を分取し、ＨＲＰ固定化リポソームを得た。こ
れに、ＨＲＰの基質である１，２−フェニレンジアミン
溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で
１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μ
ｌを加えたところ、褐色の呈色が見られた。

【００５３】比較試験例２ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、
およびコレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）のみ
により、試験例１と同様の操作により、固形分量２．５
％の多重層リポソームを得た。これを試験例２と同様に
して、ＨＲＰを作用させた。ゲル濾過により精製後、
１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）
０．１ｍｌを加え、３０℃で１０分間インキュベート
し、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたが、発色は見
られなかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式〔１〕で表わされるリン脂質
   誘導体。 【化１】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシ
   ル残基を表わし、同一でも異なっていてもよい。ＡＯは
   炭素数２〜４のオキシアルキレン基、 ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０
   ００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキ
   レン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状
   に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
   ｍは１〜４の整数、 Ｍ¹およびＭ²は水素原子またはアルカリ金属原子を表わ
   す。〕