JPH07236476A - 新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ並びにネコ免疫不全ウイルスワクチン - Google Patents
新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ並びにネコ免疫不全ウイルスワクチンInfo
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- JPH07236476A JPH07236476A JP6030193A JP3019394A JPH07236476A JP H07236476 A JPH07236476 A JP H07236476A JP 6030193 A JP6030193 A JP 6030193A JP 3019394 A JP3019394 A JP 3019394A JP H07236476 A JPH07236476 A JP H07236476A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ネコ免疫不全ウイルスのワクチンを得るもの
である。 【構成】 ネコ免疫不全ウイルスの新規な株を得、その
外被膜蛋白質の遺伝子塩基配列を決定し、それによりネ
コ免疫不全ウイルスの新規なワクチンを作製するもので
ある。
である。 【構成】 ネコ免疫不全ウイルスの新規な株を得、その
外被膜蛋白質の遺伝子塩基配列を決定し、それによりネ
コ免疫不全ウイルスの新規なワクチンを作製するもので
ある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、塩基配列が公知のもの
と異なっているネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ
ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＦＩ
Ｖ）静岡株とそれらより作製されたワクチン、またそれ
らの外被膜（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ｅ
ｎｖ）遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡ、それらのＤＮＡ
の遺伝子組み換えにより作製された発現ベクター、それ
らベクターを含む菌あるいは動物の細胞等を培養するこ
とにより得られる外被膜蛋白質、それらを用いて作製さ
れた遺伝子組み換え型ワクチンに関する。
と異なっているネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ
ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＦＩ
Ｖ）静岡株とそれらより作製されたワクチン、またそれ
らの外被膜（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ｅ
ｎｖ）遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡ、それらのＤＮＡ
の遺伝子組み換えにより作製された発現ベクター、それ
らベクターを含む菌あるいは動物の細胞等を培養するこ
とにより得られる外被膜蛋白質、それらを用いて作製さ
れた遺伝子組み換え型ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】現在世界的な規模において、ヒト後天性
免疫不全症候群（エイズ）が猛威をふるい、現代のペス
トと言われるほどの脅威となっている。この病気はヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって伝染され、未だに
有効な治療法やワクチンが開発されていない。一方、１
９８６年アメリカ、カリフォルニア州ペタルマにおいて
免疫不全症の病状を持ったネコからＨＩＶとよく似たウ
イルスがＰｅｄｅｒｓｅｎらにより発見されて（Ｓｃｅ
ｉｅｎｃｅ、２３５巻、ｐ７９０、１９８７）大きな話
題となった。
免疫不全症候群（エイズ）が猛威をふるい、現代のペス
トと言われるほどの脅威となっている。この病気はヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって伝染され、未だに
有効な治療法やワクチンが開発されていない。一方、１
９８６年アメリカ、カリフォルニア州ペタルマにおいて
免疫不全症の病状を持ったネコからＨＩＶとよく似たウ
イルスがＰｅｄｅｒｓｅｎらにより発見されて（Ｓｃｅ
ｉｅｎｃｅ、２３５巻、ｐ７９０、１９８７）大きな話
題となった。
【０００３】このウイルスはネコ免疫不全ウイルス（Ｆ
ＩＶ）と命名され、それ以降日本も含めて世界中で多数
の報告例を見るに至った。その後ネコ免疫不全ウイルス
の全塩基配列が決定されて（Ｔａｌｂｏｔｔら、Ｐｒ
ｏ、Ｎ．Ａ．Ｓ、８６巻、ｐ５７４３、１９８９）ＨＩ
Ｖの遺伝子構成と良く類似していることが示された。ま
た感染を受けたネコの病状の経過観察などから、この病
気は基本的にはヒトのエイズに相当するものであること
が判明し、ヒトエイズの動物実験モデルとして有用であ
ると考えられている。
ＩＶ）と命名され、それ以降日本も含めて世界中で多数
の報告例を見るに至った。その後ネコ免疫不全ウイルス
の全塩基配列が決定されて（Ｔａｌｂｏｔｔら、Ｐｒ
ｏ、Ｎ．Ａ．Ｓ、８６巻、ｐ５７４３、１９８９）ＨＩ
Ｖの遺伝子構成と良く類似していることが示された。ま
た感染を受けたネコの病状の経過観察などから、この病
気は基本的にはヒトのエイズに相当するものであること
が判明し、ヒトエイズの動物実験モデルとして有用であ
ると考えられている。
【０００４】この免疫不全症候群に対する有効な予防対
策となるワクチンの開発等に関してはどの様な状況であ
るかというと、ヒトの場合にはワクチンを作製しても逃
避変異株がすぐ生ずるためにワクチンが効かなくなると
考えられており、ワクチン開発の大きな障害となってい
る。また、ワクチンの有効性を確認するための適切で簡
便な実験系が存在しない。
策となるワクチンの開発等に関してはどの様な状況であ
るかというと、ヒトの場合にはワクチンを作製しても逃
避変異株がすぐ生ずるためにワクチンが効かなくなると
考えられており、ワクチン開発の大きな障害となってい
る。また、ワクチンの有効性を確認するための適切で簡
便な実験系が存在しない。
【０００５】このような変異に関しての状況はネコの場
合においても同様と考えられる実験成績がすでにＳｉｅ
ｂｅｌｉｎｋらにより報告されているが（Ｊ．ｖｉｒｏ
ｌ．、６７巻、ｐ２２０２、１９９３）、ネコの場合に
おいては感染実験を簡単に行うことができるので試作さ
れたワクチンが有効か否かを実験によって検証すること
が可能という非常に有利な側面を持っている。
合においても同様と考えられる実験成績がすでにＳｉｅ
ｂｅｌｉｎｋらにより報告されているが（Ｊ．ｖｉｒｏ
ｌ．、６７巻、ｐ２２０２、１９９３）、ネコの場合に
おいては感染実験を簡単に行うことができるので試作さ
れたワクチンが有効か否かを実験によって検証すること
が可能という非常に有利な側面を持っている。
【０００６】試作ワクチンによるネコ免疫不全ウイルス
感染に対する防御効果を調べた研究に関してはＹａｍａ
ｍｏｔｏらにより報告されている（Ｊ．ｖｉｒｏｌ、６
７巻、ｐ６０１、１９９３）。この報告によれば、ペタ
ルマ株を使用して作製されたワクチンで免疫されたネコ
は、ペタルマ株のウイルスやウイルス感染の成立に直接
関与していると考えられている外被膜蛋白質のアミノ酸
配列の相違度が約１０％程度のウイルス株を感染させた
場合、ペタルマ株ワクチンの投与により感染防御効果を
示したという結果が得られている。
感染に対する防御効果を調べた研究に関してはＹａｍａ
ｍｏｔｏらにより報告されている（Ｊ．ｖｉｒｏｌ、６
７巻、ｐ６０１、１９９３）。この報告によれば、ペタ
ルマ株を使用して作製されたワクチンで免疫されたネコ
は、ペタルマ株のウイルスやウイルス感染の成立に直接
関与していると考えられている外被膜蛋白質のアミノ酸
配列の相違度が約１０％程度のウイルス株を感染させた
場合、ペタルマ株ワクチンの投与により感染防御効果を
示したという結果が得られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは同様にし
て作製したペタルマ株ワクチンが、アミノ酸配列の相違
度において、約２０％異なった静岡株ウイルスの感染に
対しては防御できないという実験結果を得ており、従っ
て、新たなネコ免疫不全ウイルスワクチンの開発が望ま
れている。
て作製したペタルマ株ワクチンが、アミノ酸配列の相違
度において、約２０％異なった静岡株ウイルスの感染に
対しては防御できないという実験結果を得ており、従っ
て、新たなネコ免疫不全ウイルスワクチンの開発が望ま
れている。
【０００８】上記したように、後天性免疫不全症候群の
ワクチンを使用する場合は、天然痘、麻疹等のように単
一のウイルス株で作製されたワクチンでは不充分である
と考えられた。ワクチンの作製法はむしろ現行のインフ
ルエンザワクチンのように複数ウイルス株の混合された
ものの方が適当であると思われる。この場合混合される
べきウイルス株は感染に関与する外被膜蛋白質のアミノ
酸配列の相違性が大きいものを含むほどより広範な有効
性を持つものとなる。
ワクチンを使用する場合は、天然痘、麻疹等のように単
一のウイルス株で作製されたワクチンでは不充分である
と考えられた。ワクチンの作製法はむしろ現行のインフ
ルエンザワクチンのように複数ウイルス株の混合された
ものの方が適当であると思われる。この場合混合される
べきウイルス株は感染に関与する外被膜蛋白質のアミノ
酸配列の相違性が大きいものを含むほどより広範な有効
性を持つものとなる。
【０００９】これまで我が国において分離されたネコ免
疫不全ウイルスの塩基配列に関しては槙らにより報告さ
れたＴＭ２株の塩基配列しか決定されておらず（Ａｒｃ
ｈ、Ｖｉｒｏｌ、１２３巻、ｐ２９、１９９２）、この
株は上記した米国のペタルマ株に代表される欧米タイプ
の外被膜蛋白質アミノ酸配列とは２０％以上異なってい
る。
疫不全ウイルスの塩基配列に関しては槙らにより報告さ
れたＴＭ２株の塩基配列しか決定されておらず（Ａｒｃ
ｈ、Ｖｉｒｏｌ、１２３巻、ｐ２９、１９９２）、この
株は上記した米国のペタルマ株に代表される欧米タイプ
の外被膜蛋白質アミノ酸配列とは２０％以上異なってい
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは日本国内に
おいて分離された１０株近くのネコ免疫不全ウイルスの
外被膜遺伝子塩基配列を決定して解析を行った。その結
果ＴＭ２株、あるいはまたペタルマ株等の欧米タイプと
もアミノ酸配列が２０％以上異なるネコ免疫不全ウイル
ス株が存在することが明らかとなった。このような結果
と前記した試験結果より我が国で有効なワクチンを作製
しようとするならば静岡株、ペタルマ株、ＴＭ２株等を
混合した多価ワクチンにすることが望ましい。
おいて分離された１０株近くのネコ免疫不全ウイルスの
外被膜遺伝子塩基配列を決定して解析を行った。その結
果ＴＭ２株、あるいはまたペタルマ株等の欧米タイプと
もアミノ酸配列が２０％以上異なるネコ免疫不全ウイル
ス株が存在することが明らかとなった。このような結果
と前記した試験結果より我が国で有効なワクチンを作製
しようとするならば静岡株、ペタルマ株、ＴＭ２株等を
混合した多価ワクチンにすることが望ましい。
【００１１】本発明のネコ後天性免疫不全症候群ウイル
スワクチンを調製するに当たっては、先ず日本国内で分
離された多数のネコ免疫不全ウイルス株の外皮膜遺伝子
の塩基配列を決定する必要がある。そのための手段とし
てＤＮＡを増幅する有力な方法であるポリメレース連鎖
反応（ＰＣＲ）と自動塩基配列決定機が使用される。
スワクチンを調製するに当たっては、先ず日本国内で分
離された多数のネコ免疫不全ウイルス株の外皮膜遺伝子
の塩基配列を決定する必要がある。そのための手段とし
てＤＮＡを増幅する有力な方法であるポリメレース連鎖
反応（ＰＣＲ）と自動塩基配列決定機が使用される。
【００１２】本発明においては、先ず外被膜遺伝子の増
幅が行われる。ネコ免疫不全ウイルスは、青森、静岡、
仙台、福岡、旭川、横浜、名古屋、等の地域で飼育され
ているネコから分離した。ネコ免疫不全ウイルスのウイ
ルス粒子に含まれている遺伝子は１本鎖ＲＮＡである
が、ウイルスが感染している細胞中で増殖する過程にお
いては２本鎖ＤＮＡとなって染色体ＤＮＡに結合された
状態になる。
幅が行われる。ネコ免疫不全ウイルスは、青森、静岡、
仙台、福岡、旭川、横浜、名古屋、等の地域で飼育され
ているネコから分離した。ネコ免疫不全ウイルスのウイ
ルス粒子に含まれている遺伝子は１本鎖ＲＮＡである
が、ウイルスが感染している細胞中で増殖する過程にお
いては２本鎖ＤＮＡとなって染色体ＤＮＡに結合された
状態になる。
【００１３】これらのことはネコ免疫不全ウイルスが属
するレトロウイルス科レンチウイルス亜科に共通する性
質である。ネコ免疫不全ウイルスはＴリンパ球を加えれ
ば培養することが可能である。また、このウイルスの感
染を受けたネコから採取された血液中のＴリンパ球の染
色体ＤＮＡにはウイルスの遺伝子が含まれている。本発
明においてはこれらの染色体ＤＮＡ中に含まれたネコ免
疫不全ウイルス遺伝子を利用して実験が行われる。
するレトロウイルス科レンチウイルス亜科に共通する性
質である。ネコ免疫不全ウイルスはＴリンパ球を加えれ
ば培養することが可能である。また、このウイルスの感
染を受けたネコから採取された血液中のＴリンパ球の染
色体ＤＮＡにはウイルスの遺伝子が含まれている。本発
明においてはこれらの染色体ＤＮＡ中に含まれたネコ免
疫不全ウイルス遺伝子を利用して実験が行われる。
【００１４】即ち、ネコ免疫不全不全ウイルスに感染し
たネコの血液よりＴリンパ球を遠心分離で沈殿として採
取した後、細胞溶解用緩衝液（トリス塩酸（ｐＨ８．
３）１０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＫＣＬ ５０ｍ
Ｍ、ＭｇＣl2 ２ｍＭ，ＮＰ４０ ０．４５％，ツイー
ン２０ ０．４５％、プロテネースＫ ６０μg/ml）に
分散して、インキュベートし、フェノール抽出、クロロ
フォルム抽出後、エタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈
殿させ、少量の水を加えてＰＣＲ用のＤＮＡ溶液とす
る。インキュベートは５６℃で１時間が好ましい。
たネコの血液よりＴリンパ球を遠心分離で沈殿として採
取した後、細胞溶解用緩衝液（トリス塩酸（ｐＨ８．
３）１０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＫＣＬ ５０ｍ
Ｍ、ＭｇＣl2 ２ｍＭ，ＮＰ４０ ０．４５％，ツイー
ン２０ ０．４５％、プロテネースＫ ６０μg/ml）に
分散して、インキュベートし、フェノール抽出、クロロ
フォルム抽出後、エタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈
殿させ、少量の水を加えてＰＣＲ用のＤＮＡ溶液とす
る。インキュベートは５６℃で１時間が好ましい。
【００１５】ネコ免疫不全ウイルスペタルマ株の外被膜
遺伝子は２５６５塩基長であることがすでに明らかにな
っている（Ｔａｌｂｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６巻、ｐ５７４３、１９８９）。
ＰＣＲは、外被膜遺伝子ＤＮＡを境界部分を互いに重複
するような３つの領域に分けて行うのが好適である。Ｐ
ＣＲに必要な化学合成されたＤＮＡプライマーのＤＮＡ
５’末端側にはいずれも適当な制限酵素の切断認識配列
を含ませてＰＣＲの後で塩基配列決定用のベクターに容
易に結合できるようにするのがよい。増幅された遺伝子
断片は１％の低融点アガロース電気泳動により精製する
ことができる。
遺伝子は２５６５塩基長であることがすでに明らかにな
っている（Ｔａｌｂｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６巻、ｐ５７４３、１９８９）。
ＰＣＲは、外被膜遺伝子ＤＮＡを境界部分を互いに重複
するような３つの領域に分けて行うのが好適である。Ｐ
ＣＲに必要な化学合成されたＤＮＡプライマーのＤＮＡ
５’末端側にはいずれも適当な制限酵素の切断認識配列
を含ませてＰＣＲの後で塩基配列決定用のベクターに容
易に結合できるようにするのがよい。増幅された遺伝子
断片は１％の低融点アガロース電気泳動により精製する
ことができる。
【００１６】次に、このようにして得られた外被膜遺伝
子の塩基配列が決定される。上記のようにして増幅され
たネコ免疫不全ウイルスの遺伝子ＤＮＡを切断認識配列
に対応した制限酵素で切断して、同じ制限酵素で切断さ
れたＭ１３ファージ２本鎖ＤＮＡにＴ４ＤＮＡライゲー
スで結合させ、カルシウムで処理された大腸菌ＪＭ１０
９株にＤＮＡ感染させて、外被膜遺伝子ＤＮＡ断片を１
本鎖ＤＮＡとして含むファージプラックを得る。このフ
ァージプラックを大腸菌に感染して増殖させ、１本鎖Ｄ
ＮＡを回収する。
子の塩基配列が決定される。上記のようにして増幅され
たネコ免疫不全ウイルスの遺伝子ＤＮＡを切断認識配列
に対応した制限酵素で切断して、同じ制限酵素で切断さ
れたＭ１３ファージ２本鎖ＤＮＡにＴ４ＤＮＡライゲー
スで結合させ、カルシウムで処理された大腸菌ＪＭ１０
９株にＤＮＡ感染させて、外被膜遺伝子ＤＮＡ断片を１
本鎖ＤＮＡとして含むファージプラックを得る。このフ
ァージプラックを大腸菌に感染して増殖させ、１本鎖Ｄ
ＮＡを回収する。
【００１７】またＴａｑポリメレースによるＤＮＡ誤合
成の可能性を避けるため、ＰＣＲで増幅された同一遺伝
子断片から得られた５個のファージ由来の１本鎖ＤＮＡ
を混合して塩基配列決定に用いるのがよい。以降の塩基
配列の決定は、例えばアプライドバイオシステム社（Ａ
ＢＩ）から市販されている塩基配列用のキット及び同社
の自動塩基配列決定機３７３Ａを使用することで行われ
る。
成の可能性を避けるため、ＰＣＲで増幅された同一遺伝
子断片から得られた５個のファージ由来の１本鎖ＤＮＡ
を混合して塩基配列決定に用いるのがよい。以降の塩基
配列の決定は、例えばアプライドバイオシステム社（Ａ
ＢＩ）から市販されている塩基配列用のキット及び同社
の自動塩基配列決定機３７３Ａを使用することで行われ
る。
【００１８】このようにして得られた塩基配列が決定さ
れた外被膜遺伝子を用いてネコ免疫不全ウイルス不活化
ワクチンの生産が行われる。ネコ免疫不全ウイルスは主
としてネコのＴリンパ球の中で増殖する。ネコ免疫不全
ウイルスを持続的に増殖しながら継代できるＴリンパ系
細胞株を樹立するためには、例えばＨＩＶの場合には、
米国のギャロのグループが樹立したＨＩＶ持続感染細胞
ＭＯＬＴ−４が良く知られている（Ｐｏｐｏｖｉｃら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４巻、ｐ４９７、１９８４）。
れた外被膜遺伝子を用いてネコ免疫不全ウイルス不活化
ワクチンの生産が行われる。ネコ免疫不全ウイルスは主
としてネコのＴリンパ球の中で増殖する。ネコ免疫不全
ウイルスを持続的に増殖しながら継代できるＴリンパ系
細胞株を樹立するためには、例えばＨＩＶの場合には、
米国のギャロのグループが樹立したＨＩＶ持続感染細胞
ＭＯＬＴ−４が良く知られている（Ｐｏｐｏｖｉｃら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４巻、ｐ４９７、１９８４）。
【００１９】ネコ免疫不全ウイルスに関しては、ペタル
マ株ウイルスを持続的に産生するＦＬ−４細胞が報告さ
れている（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏ
ｌ．，３２巻、ｐ３６１、１９９１）。本発明において
はこれらと同様な手法を用いることで、静岡株等のＴリ
ンパ球持続感染細胞系が樹立できる。これらを用いてワ
クチンを製造するには、上記のＹａｍａｍｏｔｏらによ
りすでに報告されている通り、ウイルス感染細胞そのも
のを使用する方法と、ウイルスを精製する方法を応用す
ることができる。
マ株ウイルスを持続的に産生するＦＬ−４細胞が報告さ
れている（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏ
ｌ．，３２巻、ｐ３６１、１９９１）。本発明において
はこれらと同様な手法を用いることで、静岡株等のＴリ
ンパ球持続感染細胞系が樹立できる。これらを用いてワ
クチンを製造するには、上記のＹａｍａｍｏｔｏらによ
りすでに報告されている通り、ウイルス感染細胞そのも
のを使用する方法と、ウイルスを精製する方法を応用す
ることができる。
【００２０】前者は感染細胞をパラフォルムアルデヒド
等で含まれているウイルスを固定不活化して適当なアジ
ュバントを加えて作製する。後者は持続感染細胞を除去
してウイルスを集めて不活化し、アジュバントを加えて
ワクチンとする。
等で含まれているウイルスを固定不活化して適当なアジ
ュバントを加えて作製する。後者は持続感染細胞を除去
してウイルスを集めて不活化し、アジュバントを加えて
ワクチンとする。
【００２１】別のワクチン製造法としては、遺伝子組み
換え法を用いたコンポーネントワクチンの作製が挙げら
れる。外被膜遺伝子の全部またはウイルスの感染に重要
な働きを持つ領域を部分的に含む組み替え遺伝子発現用
のベクターは既に公知となっている遺伝子組み換えの手
法を用いて作製することが可能である。本発明において
もそのような手段を静岡株ウイルスの外被膜遺伝子の全
部または感染に重要な部分の蛋白質を発現させることの
できるベクターが調製され得る。
換え法を用いたコンポーネントワクチンの作製が挙げら
れる。外被膜遺伝子の全部またはウイルスの感染に重要
な働きを持つ領域を部分的に含む組み替え遺伝子発現用
のベクターは既に公知となっている遺伝子組み換えの手
法を用いて作製することが可能である。本発明において
もそのような手段を静岡株ウイルスの外被膜遺伝子の全
部または感染に重要な部分の蛋白質を発現させることの
できるベクターが調製され得る。
【００２２】多価ワクチンの作製は、一種のワクチンを
必要な種類だけ、例えば静岡株ワクチン、ペタルマ株ワ
クチン、ＴＭ２株ワクチンを調製し、これらを夫々等量
ずつ混合することにより３価の多価ワクチンを調製する
ことができる。
必要な種類だけ、例えば静岡株ワクチン、ペタルマ株ワ
クチン、ＴＭ２株ワクチンを調製し、これらを夫々等量
ずつ混合することにより３価の多価ワクチンを調製する
ことができる。
【００２３】表１に本発明者らにより日本国内で分離さ
れ、外被膜遺伝子の塩基配列が決定された静岡株および
公知となっている米国のペタルマ株、ディクソン株およ
び唯一の全塩基配列が決定された日本国内分離株である
ＴＭ２株、これら４種類の外被膜蛋白質のアミノ酸配列
の相違度を示す。
れ、外被膜遺伝子の塩基配列が決定された静岡株および
公知となっている米国のペタルマ株、ディクソン株およ
び唯一の全塩基配列が決定された日本国内分離株である
ＴＭ２株、これら４種類の外被膜蛋白質のアミノ酸配列
の相違度を示す。
【００２４】表１より本発明におけるネコ免疫不全ウイ
ルスの静岡株と公知のペタルマ株とは２０．３％、ＴＭ
２株とは２０．０％、ディクソン株は２１．０％、また
日本分離株と欧米分離株とでは全体として互いに約２０
％近く異なっていることが明らかである。またこれ以外
のデータでは、欧米株に類似したウイルスも数株分離さ
れており、これらは輸入されたネコにより国内に持ち込
まれたものと推定される。
ルスの静岡株と公知のペタルマ株とは２０．３％、ＴＭ
２株とは２０．０％、ディクソン株は２１．０％、また
日本分離株と欧米分離株とでは全体として互いに約２０
％近く異なっていることが明らかである。またこれ以外
のデータでは、欧米株に類似したウイルスも数株分離さ
れており、これらは輸入されたネコにより国内に持ち込
まれたものと推定される。
【００２５】
【表１】
【００２６】これまでに日本国内で分離されて塩基配列
が決定されたネコ免疫不全ウイルスとしては、槙らによ
るＴＭ１株、ＴＭ２株しかなく、これらは互いに極めて
類似しているが、欧米タイプとは２０％以上異なってい
る（Ｒｉｇｂｙら，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ.,７４巻、
ｐ４２５、１９９３）。
が決定されたネコ免疫不全ウイルスとしては、槙らによ
るＴＭ１株、ＴＭ２株しかなく、これらは互いに極めて
類似しているが、欧米タイプとは２０％以上異なってい
る（Ｒｉｇｂｙら，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ.,７４巻、
ｐ４２５、１９９３）。
【００２７】このことから、欧米で分離された多数のネ
コ免疫不全ウイルスに関しては一つのグループを形成
し、日本ではＴＭ２株タイプのネコ免疫不全ウイルスの
みが流行しているのではないかと考えられていた。しか
し、日本においてはＴＭ２株タイプだけではなく多様に
変異したネコ免疫不全ウイルスが存在し、また欧米タイ
プのウイルス株も持ち込まれていることが明らかとなっ
ている。
コ免疫不全ウイルスに関しては一つのグループを形成
し、日本ではＴＭ２株タイプのネコ免疫不全ウイルスの
みが流行しているのではないかと考えられていた。しか
し、日本においてはＴＭ２株タイプだけではなく多様に
変異したネコ免疫不全ウイルスが存在し、また欧米タイ
プのウイルス株も持ち込まれていることが明らかとなっ
ている。
【００２８】Ｙａｍａｍｏｔｏらはペタルマ株を用いた
試作ワクチンの免疫により同一のペタルマ株や外被膜蛋
白質のアミノ酸配列が１１％異なったディクソン株の感
染を防御できたことを報告している（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，６７巻、ｐ６０１、１９９３）。本発明において
は、例えばペタルマ株及び該ペタルマ株と外被膜蛋白質
のアミノ酸配列が２０％異なる静岡株の試作ワクチンを
作製し、これらのワクチンを用いてネコに夫々免疫して
おき、攻撃ウイルスとして夫々にペタルマ株及び静岡株
ウイルスを接種して防御効果を調べた。
試作ワクチンの免疫により同一のペタルマ株や外被膜蛋
白質のアミノ酸配列が１１％異なったディクソン株の感
染を防御できたことを報告している（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，６７巻、ｐ６０１、１９９３）。本発明において
は、例えばペタルマ株及び該ペタルマ株と外被膜蛋白質
のアミノ酸配列が２０％異なる静岡株の試作ワクチンを
作製し、これらのワクチンを用いてネコに夫々免疫して
おき、攻撃ウイルスとして夫々にペタルマ株及び静岡株
ウイルスを接種して防御効果を調べた。
【００２９】防御効果の結果を表２に示した。ペタルマ
株ワクチンで免疫されたネコはＹａｍａｍｏｔｏらの報
告通り同じペタルマウイルスの感染を防御することはで
きたが、静岡株の感染は防御できないことが判った。
株ワクチンで免疫されたネコはＹａｍａｍｏｔｏらの報
告通り同じペタルマウイルスの感染を防御することはで
きたが、静岡株の感染は防御できないことが判った。
【００３０】尚、本明細書および図面中において使用さ
れているアミノ酸の略号は下記の意味を有する。 Ａ：アラニン Ｃ：システイン Ｄ：アスパラギン酸 Ｅ：グルタミン酸 Ｆ：フエニルアラニン Ｇ：グリシン Ｈ：ヒスチジン Ｉ：イソロイシン Ｋ：リジン Ｌ：ロイシン Ｍ：メチオニン Ｎ：アスパラギン Ｐ：プロリン Ｑ：グルタミン Ｒ：アルギニン Ｓ：セリン Ｔ：スレオニン Ｖ：バリン Ｗ：トリプトフアン Ｙ：チロシン
れているアミノ酸の略号は下記の意味を有する。 Ａ：アラニン Ｃ：システイン Ｄ：アスパラギン酸 Ｅ：グルタミン酸 Ｆ：フエニルアラニン Ｇ：グリシン Ｈ：ヒスチジン Ｉ：イソロイシン Ｋ：リジン Ｌ：ロイシン Ｍ：メチオニン Ｎ：アスパラギン Ｐ：プロリン Ｑ：グルタミン Ｒ：アルギニン Ｓ：セリン Ｔ：スレオニン Ｖ：バリン Ｗ：トリプトフアン Ｙ：チロシン
【００３１】
【実施例】以下に本発明の実施例を具体的に説明する
が、本発明はこれにより制限されるものでないことはい
うまでもまない。 実施例１ （１）外被膜遺伝子の増幅 ネコ免疫不全ウイルスの感染を受けたネコから採取され
た血液中のＴリンパ球を遠心分離で沈殿させて、細胞溶
解用緩衝液（トリス塩酸（ｐＨ８．３）１０ｍＭ、Ｎａ
Ｃｌ １５０ｍＭ、ＫＣＬ ５０ｍＭ、ＭｇＣl2 ２ｍ
Ｍ，ＮＰ４００．４５％，ツイーン２０ ０．４５％、
プロテネースＫ ６０μg/ml）に分散して、５６℃で１
時間インキュベートし、フェノール抽出、クロロフォル
ム抽出後、エタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈殿さ
せ、水５０μｌを加えてＰＣＲ用のＤＮＡ溶液とした。
が、本発明はこれにより制限されるものでないことはい
うまでもまない。 実施例１ （１）外被膜遺伝子の増幅 ネコ免疫不全ウイルスの感染を受けたネコから採取され
た血液中のＴリンパ球を遠心分離で沈殿させて、細胞溶
解用緩衝液（トリス塩酸（ｐＨ８．３）１０ｍＭ、Ｎａ
Ｃｌ １５０ｍＭ、ＫＣＬ ５０ｍＭ、ＭｇＣl2 ２ｍ
Ｍ，ＮＰ４００．４５％，ツイーン２０ ０．４５％、
プロテネースＫ ６０μg/ml）に分散して、５６℃で１
時間インキュベートし、フェノール抽出、クロロフォル
ム抽出後、エタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈殿さ
せ、水５０μｌを加えてＰＣＲ用のＤＮＡ溶液とした。
【００３２】ネコ免疫不全ウイルスペタルマ株の外被膜
遺伝子は２５６５塩基長であることがすでに明らかにな
っている（Ｔａｌｂｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．，８６巻、ｐ５７４３、１９８９）。ＰＣＲを実施
するに当たっては、これを境界部分を互いに重複するよ
うな３つの領域に分けて行った。
遺伝子は２５６５塩基長であることがすでに明らかにな
っている（Ｔａｌｂｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．，８６巻、ｐ５７４３、１９８９）。ＰＣＲを実施
するに当たっては、これを境界部分を互いに重複するよ
うな３つの領域に分けて行った。
【００３３】ＰＣＲに必要な化学合成されたＤＮＡプラ
イマーは、ペタルマ株ウイルスにおける塩基番号では
５９０４〜５９２２（＋鎖）、６８５４〜６８７２（−
鎖）、６４９０〜６５１８（＋鎖）、７８４８〜７８
６７（−鎖）、７８０５〜７８２２（＋鎖）、８８２
７〜８８４５（−鎖）であった。
イマーは、ペタルマ株ウイルスにおける塩基番号では
５９０４〜５９２２（＋鎖）、６８５４〜６８７２（−
鎖）、６４９０〜６５１８（＋鎖）、７８４８〜７８
６７（−鎖）、７８０５〜７８２２（＋鎖）、８８２
７〜８８４５（−鎖）であった。
【００３４】これらプライマーＤＮＡの５’末端側には
いずれも適当な制限酵素の切断認識配列を含ませてＰＣ
Ｒの後で塩基配列決定用のベクターに容易に結合できる
ようにした。またそれらの塩基配列は以下の通りであ
る。
いずれも適当な制限酵素の切断認識配列を含ませてＰＣ
Ｒの後で塩基配列決定用のベクターに容易に結合できる
ようにした。またそれらの塩基配列は以下の通りであ
る。
【００３５】 ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴ （＋鎖） ＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣＡ （−鎖） ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＡＡＧ（＋鎖） ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＣＣＡＧＣＡ （−鎖） ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＴＴ （＋鎖） ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ （−鎖）
【００３６】ＰＣＲは５０μｌの反応溶液あたり、遺伝
子ＤＮＡを５μｌ、２．７５ユニットのＴａｑポリメレ
ース、各々２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ＴＴＰ混合液を１μｌ、前記〜のプライマーのいず
れかを＋鎖、−鎖それぞれ１μｌづつ加え、９４℃で１
分、５５℃で１分、７２℃で２分を１サイクルとして２
７回繰り返して遺伝子断片を増幅させた。増幅された遺
伝子断片は１％の低融点アガロースゲル電気泳動により
精製した。上記と同様の方法を用いて、ネコ免疫不全ウ
イルス静岡株の外被膜遺伝子を増幅し、精製した。
子ＤＮＡを５μｌ、２．７５ユニットのＴａｑポリメレ
ース、各々２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ＴＴＰ混合液を１μｌ、前記〜のプライマーのいず
れかを＋鎖、−鎖それぞれ１μｌづつ加え、９４℃で１
分、５５℃で１分、７２℃で２分を１サイクルとして２
７回繰り返して遺伝子断片を増幅させた。増幅された遺
伝子断片は１％の低融点アガロースゲル電気泳動により
精製した。上記と同様の方法を用いて、ネコ免疫不全ウ
イルス静岡株の外被膜遺伝子を増幅し、精製した。
【００３７】（２）外被膜遺伝子の塩基配列決定 上記（１）のようにして例えば、のプライマーのペア
を使用して増幅されたネコ免疫不全ウイルスの遺伝子Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列を決定する方法は次の通りである。
０．５μｇの遺伝子断片を制限酵素のＢａｍＨＩ（ＧＧ
ＡＴＣＣ）およびＨｉｎｄIII （ＡＡＧＣＴＴ）で末端
を切断しておき、同じ制限酵素で切断されたＭ１３ファ
ージ２本鎖ＤＮＡ０．２μｇにＴ４ＤＮＡライゲース
（宝酒造社製キツト）で１４℃で２時間以上反応させて
結合させ、カルシウムで処理した大腸菌ＪＭ１０９株に
ＤＮＡ感染させて、３７℃で一晩培養して外被膜遺伝子
ＤＮＡ断片を１本鎖ＤＮＡとして含むファージプラック
を得た。
を使用して増幅されたネコ免疫不全ウイルスの遺伝子Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列を決定する方法は次の通りである。
０．５μｇの遺伝子断片を制限酵素のＢａｍＨＩ（ＧＧ
ＡＴＣＣ）およびＨｉｎｄIII （ＡＡＧＣＴＴ）で末端
を切断しておき、同じ制限酵素で切断されたＭ１３ファ
ージ２本鎖ＤＮＡ０．２μｇにＴ４ＤＮＡライゲース
（宝酒造社製キツト）で１４℃で２時間以上反応させて
結合させ、カルシウムで処理した大腸菌ＪＭ１０９株に
ＤＮＡ感染させて、３７℃で一晩培養して外被膜遺伝子
ＤＮＡ断片を１本鎖ＤＮＡとして含むファージプラック
を得た。
【００３８】このファージプラックを大腸菌ＪＭ１０９
株菌液１ｍｌに感染させ、３７℃で６時間培養して増殖
させた。大腸菌を１２０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離
で除去した上清に２５％ＰＥＧ（ポリエチレングリコー
ル）、２．５Ｍ食塩水を１／１０量加えて２０℃で２０
分間放置後、１５０００ｒｐｍ、５分の遠心分離でファ
ージを沈澱させた。
株菌液１ｍｌに感染させ、３７℃で６時間培養して増殖
させた。大腸菌を１２０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離
で除去した上清に２５％ＰＥＧ（ポリエチレングリコー
ル）、２．５Ｍ食塩水を１／１０量加えて２０℃で２０
分間放置後、１５０００ｒｐｍ、５分の遠心分離でファ
ージを沈澱させた。
【００３９】ファージの沈澱を水に溶解させ、フェノー
ル抽出後エタノールを加えて１本鎖ＤＮＡを回収した。
また、ＴａｑポリメレースによるＤＮＡ誤合成を考慮し
て、ＰＣＲで増幅された同一遺伝子断片から得られた５
個のファージ由来の１本鎖ＤＮＡを混合して塩基配列決
定に用いた。
ル抽出後エタノールを加えて１本鎖ＤＮＡを回収した。
また、ＴａｑポリメレースによるＤＮＡ誤合成を考慮し
て、ＰＣＲで増幅された同一遺伝子断片から得られた５
個のファージ由来の１本鎖ＤＮＡを混合して塩基配列決
定に用いた。
【００４０】以降の塩基配列を決定する手段としては、
アプライドバイオシステム社（ＡＢＩ）から市販されて
いる塩基配列用のキットに記載された蛍光プライマー法
に従った。この方法は塩基配列の決定に繁用されるＳａ
ｎｇｅｒらによるジデオキシ法（Ｐｒｏ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．，７４巻、ｐ５４６３、１９７７）を基本として、
この方法で使用されるＭ１３プライマーをＡ、Ｃ、Ｇ、
Ｔを識別できるように蛍光標識させたものである。
アプライドバイオシステム社（ＡＢＩ）から市販されて
いる塩基配列用のキットに記載された蛍光プライマー法
に従った。この方法は塩基配列の決定に繁用されるＳａ
ｎｇｅｒらによるジデオキシ法（Ｐｒｏ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．，７４巻、ｐ５４６３、１９７７）を基本として、
この方法で使用されるＭ１３プライマーをＡ、Ｃ、Ｇ、
Ｔを識別できるように蛍光標識させたものである。
【００４１】標識されたＤＮＡを電気泳動にかけて塩基
配列を決定する際にはＡＢＩの自動塩基配列決定機３７
３Ａを使用して行った。上記と同様の方法に従ってネコ
免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子の塩基配列が図
１および図２に示すように決定された。
配列を決定する際にはＡＢＩの自動塩基配列決定機３７
３Ａを使用して行った。上記と同様の方法に従ってネコ
免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子の塩基配列が図
１および図２に示すように決定された。
【００４２】 （３）ネコ免疫不全ウイルス不活化ワクチンの生産 静岡株ウイルスを持続的に増殖する感染細胞をＰＢＳ
（０．１Ｍ リン酸緩衝生理食塩水）で５×１０7 細胞
／ｍｌとし、これに２．５％パラフォルムアルデヒドを
等量加えて、４℃で２４時間振とうさせて、含まれてい
るウイルスを固定不活化した。
（０．１Ｍ リン酸緩衝生理食塩水）で５×１０7 細胞
／ｍｌとし、これに２．５％パラフォルムアルデヒドを
等量加えて、４℃で２４時間振とうさせて、含まれてい
るウイルスを固定不活化した。
【００４３】これを３０００ｒｐｍ、１５分で細胞を沈
澱させてパラフォルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳに再
浮遊させて、この操作を３回繰り返してＰＢＳに５×１
０7／ｍｌに浮遊させた。これにアジュバントとして５
００μｇ／ｍｌのＡ−ＭＤＰ（ａｄｅｎｙｌ−ｍｕｒａ
ｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｙｎｔｅｘ社製）（Ｂｙ
ａｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、５巻、２２３、１９８７）
を等量加えてワクチンを作製した。
澱させてパラフォルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳに再
浮遊させて、この操作を３回繰り返してＰＢＳに５×１
０7／ｍｌに浮遊させた。これにアジュバントとして５
００μｇ／ｍｌのＡ−ＭＤＰ（ａｄｅｎｙｌ−ｍｕｒａ
ｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｙｎｔｅｘ社製）（Ｂｙ
ａｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、５巻、２２３、１９８７）
を等量加えてワクチンを作製した。
【００４４】実施例２ 静岡株、ＴＭ株およびペタルマ株を含む多価ワクチンの
作製 ネコ免疫不全ウイルス静岡株、ＴＭ２株およびペタルマ
株単味のワクチンを個々に実施例１と同様にして作製し
た。これらを等量づつ混合して３価の多価ワクチンを調
製した。また、別に３倍の濃度の単味ワクチンを作製し
て、これらを等量混合することで各株について単味の場
合と同じ力価のワクチンを作製した。
作製 ネコ免疫不全ウイルス静岡株、ＴＭ２株およびペタルマ
株単味のワクチンを個々に実施例１と同様にして作製し
た。これらを等量づつ混合して３価の多価ワクチンを調
製した。また、別に３倍の濃度の単味ワクチンを作製し
て、これらを等量混合することで各株について単味の場
合と同じ力価のワクチンを作製した。
【００４５】実施例３ 遺伝子組み替え法を用いたコンポーネントワクチンの作
製 外被膜遺伝子の全部またはウイルスの感染に重要な働き
を持つ領域を部分的に含む組み替え遺伝子発現用のベク
ターは既に公知となっている手法たとえばバキュロウイ
ルス、ワクシニアウイルス、酵母等を用いて容易に作製
し得る。
製 外被膜遺伝子の全部またはウイルスの感染に重要な働き
を持つ領域を部分的に含む組み替え遺伝子発現用のベク
ターは既に公知となっている手法たとえばバキュロウイ
ルス、ワクシニアウイルス、酵母等を用いて容易に作製
し得る。
【００４６】本発明においては一例としてネコ免疫ウイ
ルスの外被膜遺伝子を部分的に発現させることのできる
カイコー多角体病（バキュロ）ウイルス系（前田進、日
本蚕糸学雑誌、５３巻、ｐ５４７、１９８４）における
組み換えウイルスの作製法について記載する。
ルスの外被膜遺伝子を部分的に発現させることのできる
カイコー多角体病（バキュロ）ウイルス系（前田進、日
本蚕糸学雑誌、５３巻、ｐ５４７、１９８４）における
組み換えウイルスの作製法について記載する。
【００４７】先ず、ネコ免疫不全ウイルス外被膜遺伝子
を増幅するためのプライマーＤＮＡを合成する。この場
合は外被膜蛋白質においてウイルスの感染に中心的な役
割を果たす領域を発現させる。また、蛋白質を発現させ
ることから、＋鎖プライマーは開始コドンＡＴＧ、−鎖
プライマーは終了コドンのＴＡＧをアミノ酸の読み取り
枠を合わせる配列で加え、発現ベクターに結合させるた
めにＢａｍＨＩ部位をも含ませる。これらの塩基配列お
よび図１および図２における塩基番号を以下に示す。
を増幅するためのプライマーＤＮＡを合成する。この場
合は外被膜蛋白質においてウイルスの感染に中心的な役
割を果たす領域を発現させる。また、蛋白質を発現させ
ることから、＋鎖プライマーは開始コドンＡＴＧ、−鎖
プライマーは終了コドンのＴＡＧをアミノ酸の読み取り
枠を合わせる配列で加え、発現ベクターに結合させるた
めにＢａｍＨＩ部位をも含ませる。これらの塩基配列お
よび図１および図２における塩基番号を以下に示す。
【００４８】 ＋鎖：ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＡＡＣ ＡＧＡ （５５０〜５６９） −鎖：ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＧＣＴＴＴＴＣＡＣＴＡＧＧＴＴＴＧＴ （１８１７〜１８３６）
【００４９】これらのプライマーを用いて、上記の実施
例１（１）に記載した方法と全く同様にして外被膜遺伝
子の断片（１２８７塩基長、４２９アミノ酸残基）を増
幅した。これをＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）で切断し、
図３に示すＢｇl II（ＡＧＡＴＣＴ、ＢａｍＨＩ部位に
結合できる）で切断した多角体病ウイルスの発現ベクタ
ーｐＢＭ０５０にＴ４ＤＮＡライゲースで結合させ、カ
ルシウムで処理した大腸菌ＪＭ１０５株に加えてクロー
ニングを行った。
例１（１）に記載した方法と全く同様にして外被膜遺伝
子の断片（１２８７塩基長、４２９アミノ酸残基）を増
幅した。これをＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）で切断し、
図３に示すＢｇl II（ＡＧＡＴＣＴ、ＢａｍＨＩ部位に
結合できる）で切断した多角体病ウイルスの発現ベクタ
ーｐＢＭ０５０にＴ４ＤＮＡライゲースで結合させ、カ
ルシウムで処理した大腸菌ＪＭ１０５株に加えてクロー
ニングを行った。
【００５０】外被膜遺伝子断片を含むクローンＤＮＡ３
μｇとカイコ多角体病ウイルスのゲノムＤＮＡ１５μｇ
（モル比５０：１）とを混合して、リポフェクチンを２
０μｇ／ｍｌに加えて、シャーレで培養したカイコの卵
巣由来の細胞Ｂｍ−Ｎ４に共感染させて２７℃で培養し
てプラックを形成させた。
μｇとカイコ多角体病ウイルスのゲノムＤＮＡ１５μｇ
（モル比５０：１）とを混合して、リポフェクチンを２
０μｇ／ｍｌに加えて、シャーレで培養したカイコの卵
巣由来の細胞Ｂｍ−Ｎ４に共感染させて２７℃で培養し
てプラックを形成させた。
【００５１】プラックを実体顕微鏡で観察すると、野生
型ウイルスのプラックでは感染細胞の核内に多角体が観
察されるのに対して、外被膜遺伝子を含むウイルスによ
り形成されたプラックでは核内から多角体が消失するの
で組み換え体ウイルスは容易に区別される。この組み換
え体ウイルスを鈍化してＢｍ−Ｎ４細胞に感染させ外被
膜蛋白質を得た。このものを用いて実施例１（３）記載
の方法に従いコンポーネントワクチンを作製した。
型ウイルスのプラックでは感染細胞の核内に多角体が観
察されるのに対して、外被膜遺伝子を含むウイルスによ
り形成されたプラックでは核内から多角体が消失するの
で組み換え体ウイルスは容易に区別される。この組み換
え体ウイルスを鈍化してＢｍ−Ｎ４細胞に感染させ外被
膜蛋白質を得た。このものを用いて実施例１（３）記載
の方法に従いコンポーネントワクチンを作製した。
【００５２】試験例 ペタルマ株及びペタルマ株と外被膜蛋白質のアミノ酸配
列が２０％異なる静岡株の試作ワクチンを実施例１
（３）に記載した通りに作製した。これらのワクチンを
ネコに夫々３回接種することにより免疫しておき、攻撃
ウイルスとして夫々にペタルマ株及び静岡株ウイルスを
接種して防御効果を調べた。
列が２０％異なる静岡株の試作ワクチンを実施例１
（３）に記載した通りに作製した。これらのワクチンを
ネコに夫々３回接種することにより免疫しておき、攻撃
ウイルスとして夫々にペタルマ株及び静岡株ウイルスを
接種して防御効果を調べた。
【００５３】また、対照としてはＰＢＳを投与した。表
２にそれらの結果を示した。これによりペタルマ株ワク
チンで免疫されたネコはＹａｍａｍｏｔｏらの報告通り
同じペタルマウイルスの感染を防御することはできた
が、静岡株の感染は防御できなかった。これに対して、
静岡株で作製したワクチンを接種されたネコは両株のネ
コ免疫ウイルス感染を防御することができた。
２にそれらの結果を示した。これによりペタルマ株ワク
チンで免疫されたネコはＹａｍａｍｏｔｏらの報告通り
同じペタルマウイルスの感染を防御することはできた
が、静岡株の感染は防御できなかった。これに対して、
静岡株で作製したワクチンを接種されたネコは両株のネ
コ免疫ウイルス感染を防御することができた。
【００５４】
【表２】
【００５５】
【発明の効果】以上に詳述したように、本発明によりネ
コ免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子ＲＮＡに対応
する新規ＤＮＡ塩基配列が決定された。更に、同ＤＮＡ
を組み込んだベクターを用いて外被膜ペプチドを生産さ
せ、これを用いてワクチンを製造することが可能となっ
た。また、新規ネコ免疫不全ウイルス静岡株を培養によ
り増殖させ、同株に対するワクチンが作製された。更に
ネコ免疫不全ウイルスＴＭ株、ペタルマ株のワクチンも
作製され、これら３種のワクチンを混合することにより
多価ワクチンが製造される。
コ免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子ＲＮＡに対応
する新規ＤＮＡ塩基配列が決定された。更に、同ＤＮＡ
を組み込んだベクターを用いて外被膜ペプチドを生産さ
せ、これを用いてワクチンを製造することが可能となっ
た。また、新規ネコ免疫不全ウイルス静岡株を培養によ
り増殖させ、同株に対するワクチンが作製された。更に
ネコ免疫不全ウイルスＴＭ株、ペタルマ株のワクチンも
作製され、これら３種のワクチンを混合することにより
多価ワクチンが製造される。
【配列表】
【００５６】配列の長さ：２５７１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：センスＤＮＡ 起源 生物名：ネコ免疫不全ウイルス 株名：静岡株 配列
【００５７】
【化７】
【００５８】
【化８】
【図１】ネコ免疫不全ウイルスの外被膜蛋白質遺伝子Ｒ
ＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列（１〜１５００）およ
びその配列から推定される外被膜蛋白質のアミノ酸配列
を示すものである。
ＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列（１〜１５００）およ
びその配列から推定される外被膜蛋白質のアミノ酸配列
を示すものである。
【図２】ネコ免疫不全ウイルスの外被膜蛋白質遺伝子Ｒ
ＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列（１５０１〜２５７
１）およびその配列から推定される外被膜蛋白質のアミ
ノ酸配列を示すものである。
ＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列（１５０１〜２５７
１）およびその配列から推定される外被膜蛋白質のアミ
ノ酸配列を示すものである。
【図３】多角体病ウイルスの発現ベクターを示す地図で
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/155 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:92）
Claims (10)
- 【請求項１】 ネコ免疫不全ウイルス外被膜遺伝子ＲＮ
Ａに対応するＤＮＡ塩基配列が、 【化１】 【化２】 に示される特徴を持つネコ免疫不全ウイルス株。 - 【請求項２】 請求項１記載のネコ不全ウイルス株を持
続的に生産可能とせしめることを特徴とするネコＴ細胞
系株化細胞。 - 【請求項３】 ネコ免疫不全ウイルスの外被膜遺伝子Ｒ
ＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、 【化３】 【化４】 に示される全長またはその一部の長さを持つことを特徴
とするＤＮＡ。 - 【請求項４】 ネコ免疫不全ウイルス外被膜蛋白質であ
り、そのアミノ酸配列が、 【化５】 【化６】 で示される蛋白質の全長またはその一部の長さを持つ蛋
白質、さらにはそれらに糖鎖が付加されたことを特徴と
する蛋白質。 - 【請求項５】 前記請求項１記載のウイルス株を不活化
処理加工あるいは弱毒化処理加工により作製したことを
特徴とする後天性ネコ免疫不全症候群に対するワクチ
ン。 - 【請求項６】 前記請求項１記載のネコ免疫不全ウイル
ス株と他の１株またはそれ以上のネコ免疫不全ウイルス
を混合し、不活化処理加工あるいは弱毒化処理加工によ
り作製したことを特徴とする後天性ネコ免疫不全症候群
に対する多価ワクチン。 - 【請求項７】 他の１株またはそれ以上の株のネコ免疫
不全ウイルスが、ネコ免疫不全ウイルスペタルマ株、ネ
コ免疫不全ウイルスデイクソン株、ネコ免疫不全ウイル
スＴＭ２株からなる群より選ばれた１株ないしそれ以上
の株のウイルス株であることを特徴とする請求項６記載
の多価ワクチン。 - 【請求項８】 ネコ免疫不全ウイルスの外被膜遺伝子を
含むＤＮＡであり、請求項４に記載された蛋白質の全部
またはその一部を発現し得るように構築されたことを特
徴とする発現用プラスミド、ファージあるいはウイルス
のベクターＤＮＡ構造物。 - 【請求項９】 ネコ免疫不全ウイルス外被膜蛋白質の全
部またはその一部であり、請求項８の発現用ベクターＤ
ＮＡを含む菌あるいは動物の細胞の培養によって生産さ
れたことを特徴とする蛋白質。 - 【請求項１０】 生産された蛋白質が前記請求項４記載
の蛋白質であることを特徴とする請求項９記載の蛋白
質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03019394A JP3531880B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-02-28 | 新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ並びにネコ免疫不全ウイルスワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03019394A JP3531880B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-02-28 | 新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ並びにネコ免疫不全ウイルスワクチン |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004017184A Division JP3656073B2 (ja) | 2004-01-26 | 2004-01-26 | 新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ並びにネコ免疫不全ウイルスワクチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07236476A true JPH07236476A (ja) | 1995-09-12 |
| JP3531880B2 JP3531880B2 (ja) | 2004-05-31 |
Family
ID=12296923
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03019394A Expired - Lifetime JP3531880B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-02-28 | 新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ並びにネコ免疫不全ウイルスワクチン |
Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JP3531880B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1493028A2 (en) * | 2001-07-06 | 2005-01-05 | Genentech, Inc. | Phage displayed pdz domain ligands |
| US8685893B2 (en) | 1998-07-27 | 2014-04-01 | Genentech, Inc. | Phage display |
-
1994
- 1994-02-28 JP JP03019394A patent/JP3531880B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8685893B2 (en) | 1998-07-27 | 2014-04-01 | Genentech, Inc. | Phage display |
| EP1493028A2 (en) * | 2001-07-06 | 2005-01-05 | Genentech, Inc. | Phage displayed pdz domain ligands |
| EP1493028A4 (en) * | 2001-07-06 | 2006-06-14 | Genentech Inc | PHAGEN DISPLAY PRESENTED LIGANDS OF THE PDZ DOMAIN |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3531880B2 (ja) | 2004-05-31 |
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