JP2002153275A - スプーマウイルスプラスミドおよびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子を、静止細胞の染色体内にまで導入す
ることができるプラスミドベクターとして使用すること
ができ、しかも安全性の高いウイルスを見出し、これを
利用した遺伝子治療等に利用するベクター系の構築が求
められており、このようなウイルスプラスミドおよびベ
クター系の提供すること。 【解決手段】 次の性質を有するスプーマウイルスプラ
スミドを提供 （１）５'ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）および
３'ＬＴＲの間に、構造遺伝子としてコア蛋白遺伝子
（ｇａｇ）、プロテアーゼインテグレース逆転写酵素遺
伝子（ｐｏｌ）、エンベロープ蛋白遺伝子（ｅｎｖ）、
トランスアクチベーター遺伝子（ｂｅｌＩ）およびｂｅ
ｌＩＩを有し、ｂｅｌＩＩＩを有さない。 （２）５'ＬＴＲは、１,３５５ｂｐ、３'ＬＴＲは１,３
５５ｂｐである。 （３）ｇａｇは、１,５４５ｂｐである。 （４）ｂｅｌＩは、６３０ｂｐ、ｂｅｌＩＩは、９４２
ｂｐである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、スプーマウイルス
プラスミドおよびこれを利用するウイルスベクター系に
関する。

【０００２】

【従来の技術】１９９０年にアメリカで最初の遺伝子治
療がアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症の患者に
行われて以来、数多くの遺伝子治療が行われている。こ
の遺伝子治療は、最初は既存の治療方法では根本的治療
が不可能な癌や重篤な先天性遺伝子疾患を中心に利用が
検討されていたが、最近では、動脈硬化性の血管病変や
慢性リュウマチ等の治療にも適用が検討され始めてい
る。

【０００３】遺伝子治療は、正常な遺伝子を生体に導入
し、疾患を治療する技術であるから、効率の高い遺伝子
導入法が求められる。従来、遺伝子を生体内に導入する
方法としては、進化の過程で効率よく自分自身のゲノム
を宿主細胞に挿入できるようになったウイルスをベクタ
ーとして利用することが多い。そして、このウイルスで
も、主にベクターとして使用されるのは、レトロウイル
スとアデノウイルスである。

【０００４】しかしながら、これらのウイルスも、遺伝
子治療のためのベクターとして使用するには問題点があ
った。すなわち、最もよく使用されているレトロウイル
ス（マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）等）をベクターとして用いた場合、生
体内に導入される遺伝子は染色体中にはいるため治療遺
伝子の効果の発現は長期間に亘るが、感染する細胞は増
殖細胞に限られ、また、本来の遺伝子と同様な発現コン
トロールがかからないという問題があった。また、レト
ロウイルスのウイルスゲノムがＲＮＡであるため、細胞
内において転写エラーが起きる可能性が高く、エラー遺
伝子を染色体内に導入する危険性があった。更には、元
は病原ウイルスであるため、潜在的には発病するリスク
もある上、内在性ウイルスによる自己増殖性ウイルスの
出現もありえた。

【０００５】これに対し、アデノウイルスをベクターと
して使用した場合は、静止細胞にも感染し、また、ウイ
ルスゲノムはＤＮＡであるため導入遺伝子のエラーが起
きにくいという利点もあるが、遺伝子を染色体に導入す
ることができないため、治療効果は一時的であり、数カ
月毎に治療用ウイルスの導入が必要である。しかも、ア
デノウイルス自体呼吸器疾患、角結膜炎、乳幼児下痢症
等の原因ウイルスであるため、安全性にも問題があり、
既にアデノウイルスに罹患している場合、自己増殖性ウ
イルスの出現も考えられる。

【０００６】このように、現在開発されている遺伝子治
療用のウイルスベクターは、実用化のためにはなお改善
すべき点があり、新たなウイルスプラスミドベクターの
提供が求められている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、遺伝子を、静
止細胞の染色体内にまで導入することができるプラスミ
ドベクターとして使用することができ、しかも安全性の
高いウイルスを見出し、これを利用した遺伝子治療等に
利用するベクター系の構築が求められており、このよう
なウイルスプラスミドおよびベクター系の提供が本発明
の課題である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々のウ
イルスについてその性質を検索していたところ、レトロ
ウイルス科スプーマウイルス（Supuma virinae）亜科に
属する、ネコ由来のウイルスは遺伝子治療用のベクター
として優れた性質を有するものであること、更にそのｅ
ｎｖ遺伝子をヒトｅｎｖ遺伝子に置き換えることにより
更にその性質が向上することを見出し、本発明を完成し
た。

【０００９】すなわち本発明の第一の目的は、次の性質
を有するスプーマウイルスプラスミドを提供することで
ある。 （１）５'ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）および
３'ＬＴＲの間に、構造遺伝子としてコア蛋白遺伝子
（ｇａｇ）、プロテアーゼ／インテグレース／逆転写酵
素遺伝子（ｐｏｌ）、エンベロープ蛋白遺伝子（ｅｎ
ｖ）、トランスアクチベーター遺伝子（ｂｅｌＩ）およ
びｂｅｌＩＩを有し、ｂｅｌＩＩＩを有さない。 （２）５'ＬＴＲは、１,３５５ｂｐ、３'ＬＴＲは１,３
５５ｂｐである。 （３）ｇａｇは、１,５４５ｂｐである。 （４）ｂｅｌＩは、６３０ｂｐ、ｂｅｌＩＩは、９４２
ｂｐである。

【００１０】また、本発明の第二の目的は、上記スプー
マウイルスプラスミドを利用するウイルスベクター系を
提供することである。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のスプーマウイルスプラス
ミドの調製は、例えば次のごとくすればよい。すなわ
ち、ネコスプーマウイルス株に感染したネコ細胞を培養
した後、細胞を回収し、更にこの細胞からＤＮＡを回収
する。

【００１２】次いで、このＤＮＡを鋳型として、二組の
ネコスプーマウイルス特異的なプライマーペアを用い、
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）を行なった後、ゲル電気泳動により、遺伝子
断片を分離回収する。

【００１３】回収した遺伝子から、例えば、プラスミド
ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたクローニ
ングにより、図１に示すｐＳＫＹ１.０とｐＳＫＹ２.０
を構築する。さらにｐＳＫＹ２.０をＳａｌＩ制限酵素
で処理し、ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子断片をゲル電
気泳動により分離回収する。同様に、ｐＳＫＹ１.０も
ＳａｌＩ酵素で処理し、ｅｎｖ−ｂｅｌＩ−ｂｅｌＩＩ
−ＬＴＲ遺伝子断片をゲル電気泳動により分離回収す
る。

【００１４】最後に両断片をライゲーションすることに
より、ネコスプーマウイルス（以下、「ＦｅＦＶ」とい
う）全長をコードするプラスミド（ｐＳＫＹ３.０（Ｃ
ｏｌｅｍａｎ）、ｐＳＫＹ５.０（Ｓ７８０１）／図１
参照）を得る。

【００１５】このようにして得られたウイルスベクター
は、上記したような性質を有するものであり、図２の１
番目に示すような構造を有するものであった。この構造
を他のウイルスと比較すると、ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ−１；図２の３番目）やマウス白血病ウイルス
（ＭＬＶ；図２の４番目）とは明らかに相違し、ヒトス
プーマウイルス（ＨＦＶ；図２の２番目）とは類似する
が、ｂｅｌIIIの存在および両端のＬＴＲの長さの点に
おいて相違するものであった。

【００１６】より具体的なＦｅＦＶとＨＦＶとの相違
は、以下の点が挙げられる。 （ 遺伝子の長さ ） ・ＨＦＶの５'−ＬＴＲおよび３'−ＬＴＲは、その長さ
が１,７６９ｂｐであり、ＦｅＦＶより長い。 ・ＦｅＦＶのｅｎｖ長は、２,９４３ｂｐであるのに対
し、ＨＦＶは２,９６７ｂｐである。 ・ＨＦＶのｇａｇ長は、１,９４７ｂｐでありＦｅＦＶ
より長い。 ・ＦｅＦＶのｐｏｌ長は ３,４７１ｂｐであるのに対
し、ＨＦＶは、３,４３２ｂｐである。 ・ＨＦＶのｂｅｌＩ長は、９０３ｂｐ、ｂｅｌＩＩ長は
１,０７１ｂｐであり共にＦｅＦＶより長い。 ・ＦｅＦＶの全長は、１１,６９３ｂｐであるのに対
し、ＨＦＶは１３,２４２ｂｐである。

【００１７】（ 遺伝子の相同性 ）ＦｅＦＶの構造遺伝
子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの塩基配列は、ＨＦＶ
中のそれらと、４９.９％、６４.６％および５６.８％
が一致する。また、ＦｅＦＶ調節遺伝子、ｂｅｌＩおよ
びｂｅｌＩＩの塩基配列は、ＨＦＶ中のそれらと、４
４.７％および４６.６％が一致する。

【００１８】また、ＦｅＦＶとＨＦＶとのキメラスプー
マウイルスプラスミドを調製するには、例えば、次の如
くすればよい。すなわち、ＦｅＦＶプラスミドのｅｎｖ
部位を含む断片を適当な制限酵素により切断し、クレノ
ウポリメラーゼで断端を平滑末端にしたのち、ゲル電気
泳動にてＤＮＡを分離回収する。一方、ヒトスプーマウ
イルスのｅｎｖ部位を含む遺伝子断片をＰＣＲにより増
幅した後、ゲル電気泳動により断片を回収し、上記と同
じ制限酵素で切断してＤＮＡ断片を得る。最後に、両Ｄ
ＮＡ断片をライゲーションして、ネコ−ヒトキメラスプ
ーマウイルスプラスミドを構築する。

【００１９】以上のようにして得られたスプーマウイル
スプラスミドは、治療や診断等の用途に使用することが
できる。例えば、本発明のスプーマウイルスプラスミド
からｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ｔａｓ遺伝子を除いた
後、これに代えてマルチクローニングサイト、内部プロ
モーター遺伝子およびレポーターないし薬剤耐性遺伝子
を導入する。更に、マルチクローニングサイトに目的遺
伝子断片を導入して、５'ＬＴＲ−ψ−目的遺伝子−内
部プロモーター遺伝子−プロモーター−レポーターない
し薬剤耐性遺伝子−３'ＬＴＲの順で結合されたベクタ
ーを得る。このベクターを、クローニングした後、パッ
ケージング細胞に導入し、目的遺伝子を発現するウイル
スベクターを得ることができる。

【００２０】上記ウイルスベクターにおいて、内部プロ
モーター遺伝子としては、ヒトサイトメガロウイルスプ
ロモーター遺伝子等が、レポーターないし薬剤耐性遺伝
子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、グリーンフ
ルオレセントプロテイン遺伝子等やネオマイシン耐性遺
伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が利用できる。ま
た、パッケージング細胞としては、ψ２、ＰＡ３１７等
が利用でき、パッケージング細胞への導入に当たって
は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等の手法
を利用することができる。

【００２１】

【作用】本発明のスプーマウイルスプラスミドは、遺伝
子治療等において、目的遺伝子を細胞内に導入するため
に優れた性質を有するものであるが、これは、スプーマ
ウイルス、特にネコ由来のスプーマウイルスを使用する
ためである。

【００２２】すなわち、レトロウイルスとアデノウイル
スについての遺伝子治療用ベクターとしての得失は前に
記載したとおりであるが、スプーマウイルスはレトロウ
イルスに属しながら、宿主の細胞内に入る際のウイルス
ゲノムは、ＤＮＡであるという特質を有する。従って、
染色体の中に入るという点では、他のレトロウイルスと
同様であるが、静止細胞にも感染したり、逆転写がなく
エラーがないという点ではアデノウイルスと同様な性質
を有するため、レトロウイルスとアデノウイルスの優れ
た点を併せ持つものといえる。しかも、スプーマウイル
ス自体は、ヒトについての感染者での何らかの障害が報
告されておらず、安全なウイルスとされているものであ
る。

【００２３】なお、ヒト由来のスプーマウイルスについ
ては既に知られているが（特開平６−３４３４７７
号）、本発明のネコ由来のスプーマウイルスは、１種類
しかないヒト由来のスプーマウイルスと異なり、数多く
の野生株が存在するため、これを基礎に構築される本発
明のスプーマウイルスプラスミドは、同一患者に繰り返
し投与することも可能であり、更に、知らないうちにヒ
トスプーマウイルスに感染している患者に対しても投与
可能であるという遺伝子治療上の大きな利点がある。

【００２４】更に、ネコ由来のスプーマウイルスは、ヒ
トスプーマウイルスと比べ、ゲノムが短かく、しかもウ
イルス転写にネガティブな影響を与えるとされるｂｅｌ
IIIがないため、より長い目的遺伝子を導入することが
できると同時にウイルス合成にとっても有利であるとい
うメリットも有するものである。

【００２５】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれら実施例等により何ら制約される
ものではない。

【００２６】実 施 例 １ ネコスプーマウイルスのクローニング：ネコスプーマウ
イルス株、コールマン株（Ｃｏｌｅｍａｎ）およびＳ７
８０１株持続感染ネコ細胞（ＣＲＦＫ）（Ｍｉｙａｚａ
ｗａ，Ｔ.Ｊ.Ｖｅｔ., "Ｍｅｄ. Ｓｃｉ"，１９９５，
５７，６５−６９）を１０％牛胎児血清添加ダルベッコ
改変イーグル培地で５％ＣＯ₂ 存在下で培養した。培養
細胞をトリコスタチンＡ、３μＭ添加培養３日後、細胞
を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で遠心洗浄後、
細胞をＨｉｒｔ法（Ｈｉｒｔ，Ｂ., "Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉ
ｏｌ"，１９６７，２６，３６５−３６９）に従い処理
し、ＤＮＡを回収した。

【００２７】ＤＮＡを鋳型として、二組のプライマー、
オリゴヌクレオチドｆ１（５'−ｃｔａｇｇｇａｃｃｔ
ｔａｃｃｔｔａｃｔｇａｇｇａａｇｇａｔ−３'）とオ
リゴヌクレオチドｒ１（５'−ｇｇａａｔｇｇａａｔｇ
ｃｔｃａｃａａａｃａａｃｔａｃａｇａ−３'）、そし
てオリゴヌクレオチドｆ２（５'−ａｇｃｔｇａｔｇａ
ｔｃｃａａｇｔｇａｔｇｔｔｇｃｔｔｃｃｃ−３'）と
オリゴヌクレオチドｒ２（５'−ｃｇａｃｔｃａｔｃｏ
ｔｇａｇｔｔｇｃａｔｇｔｔｇａｃａｔａ−３'）を用
いて、ＴａｑポリメラーゼでＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を常法に従って行
い、１.０％アガロースゲル電気泳動により、遺伝子断
片を分離回収した。

【００２８】回収した遺伝子から、プラスミドｐＣＲＩ
Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたクローニングによ
り、ｐＳＫＹ１.０とｐＳＫＹ２.０（図参照）を構築し
た。さらにＳａｌＩ制限酵素でｐＳＫＹ２.０を処理し
た後、ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子断片を１.０％ア
ガロースゲル電気泳動により分離回収した。ｐＳＫＹ
１.０をＳａｌＩ酵素で処理し、同様に１.０％アガロー
スゲル電気泳動により分離回収し、ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐ
ｏｌ遺伝子断片をＴ４リガーゼによりライゲーション
し、ＦｅＦＶ全長をコードするプラスミドｐＳＫＹ３.
０（Ｃｏｌｅｍａｎ）、ｐＳＫＹ５.０（Ｓ７８０１）
を構築した（図１参照）。なお、これらのプラスミドの
ｅｎｖの塩基配列を次に示す。

【００２９】ｐＳＫＹ３.０：

【化４】

【００３０】ｐＳＫＹ５.０：

【化５】

【００３１】実 施 例 ２ キメラスプーマウイルスの作製：実施例１で得たｐＳＫ
Ｙ３.０をＳａｌＩとＭｒｏＩ制限酵素で処理し、クレ
ノウポリメラーゼで断端を平滑末端にしたのち、１.０
％アガロースゲル電気泳動にて分離回収した。ｐＨＦＶ
−Ｎプラスミド（Ａｄａｃｈｉ，Ａ.ＶｉｒｕｓＧｅｎ
ｅｓ １９９５，１１，１５−２０）を鋳型にして、ヒ
トスプーマウイルスｅｎｖ部位を含む遺伝子断片を一組
のプライマー、オリゴヌクレオチドｅｎｖｆ１（５'−
ａａａｔｇａａｔａａａｇｃｇｃｔｇａｇｇ−３'）と
オリゴヌクレオチドｅｎｖｒ１（５'−ｔａａａａｃａ
ｇｔｃａｇｇｇｔｃａｇｔａｔｃ−３'）を用い、ＰＣ
Ｒ後、１.０％アガロースゲル電気泳動により断片を回
収した。ヒトスプーマウイルスｅｎｖ ＤＮＡ断片をＳ
ａｌＩ−ＭｒｏＩ処理ｐＳＫＹ３.０にライゲーション
し、キメラクローンｐＳＫＹ４.０を構築した（ｐＳＫ
４.０／図１、ＨＦＶｅｎｖ遺伝子が挿入されてい
る）。なお、このプラスミドのｅｎｖの塩基配列を次に
示す。

【００３２】ｐＳＫＹ４.０：

【化６】

【００３３】実 施 例 ３ シークエンスと感染性ウイルス粒子の確認：ＦＶの全塩
基配列は、ＤＮＡシークエンサーＤＳＱ−２０００Ｌ
（Ｓｈｉｍａｚｕ）を用いて決定した。ｐＳＫＹ３.０
の全塩基配列を図８〜図１１に、ｐＳＫＹ４.０を図３
〜図７に、ｐＳＫＹ５.０を図１２〜図１５にそれぞれ
示した。

【００３４】ＣＲＦＫ細胞へのプラスミドの導入には、
リポフェクションを用いて、１０μｇＤＮＡをＣＲＦＫ
細胞と伴に３７℃で３０時間培養した。得られた感染性
ウイルス粒子の確認は、ＣＰＥ（細胞障害効果）アッセ
イと電子顕微鏡解析によって行なった。ＳＫＹ３.０は
ＣＲＦＫ細胞に感染後１０⁶ ＴＣＩＤ₅₀の（５０％ｏｆ
ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｌｅｔｈａｌ ｄｏ
ｓｅ）ウイルス粒子を培養７日目に産生した。

【００３５】実 施 例 ４ ＦＦＶ−ＩＦＮ−τ合成ウイルスの作製：ｐＳＫＹ３.
０のｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ｔａｓ遺伝子を除き、
５'ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＭＣＳ（ｍｕｌｔｉ−ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ｓｉｔｅｓ）−ＣＭＶプロモーターネオマイシン
抵抗遺伝子−３'ＬＴＲプラスミド、ｐＦＦＶｎｅｏを
作成する。ｐＦＦＶｎｅｏのＭＣＳ部位に、ｐｋａｚ−
６よりインターフェロンτ遺伝子断片（９１８ｂｐ）
（Ｉｍａｋａｗａ，Ｋ. Ｎａｔｕｒｅ １９８７，３
３０，３７７−３７９）を分離回収し、ライゲーション
する。クローン化したｐＦＦＶｎｅｏ−ＩＦＮ−τを構
築する。また、ｐｓｉを欠損したｐＳＫＹ４.０Δｐｓ
ｉを組み込んだパッケージング細胞にｐＦＦＶｎｅｏ−
ＩＦＮ−τをリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）を用い導入
し、ＦＦＶ−ＩＦＮ−τ合成ウイルスを得る。

【００３６】ＦＦＶ−ＩＦＮ−τ合成ウイルスをヒトＭ
ｏｌｔ−４Ｔ細胞またはマクロファージ、末梢血Ｔ細胞
またはマクロファージに公知の方法で感染させた後、さ
らにＨＩＶ−１感染・増殖に対する抑制作用を検討す
る。τの発現は、抗τウサギ抗体（Ｉｍａｇａｗａ，
Ｋ.Ｎａｔｕｒｅ １９８７，３３０，３７７−３７
９）を用いウエスタンブロット法により検討する。

【００３７】

【発明の効果】本発明のスプーマウイルスプラスミド
は、遺伝子を、静止細胞の染色体内にまで導入すること
ができ、しかも安全性の高いものである。

【００３８】従って、このプラスミドは遺伝子治療等に
利用するベクターとして広く利用することが期待できる
ものである。すなわち、本発明のスプーマウイルスプラ
スミドのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを組み込んだパッ
ケージング細胞と、５'−ＬＴＲの下流に、疾病患者の
治療に必要な遺伝子、内部プロモーター遺伝子、レポー
ターないし薬剤耐性遺伝子および３'ＬＴＲをこの順序
で結合したスプーマウイルスプラスミドベクターをトラ
ンスフェクションさせ、得られた組換えウイルスを適当
な手段で疾病患部に感染させることにより、当該疾病を
治療することが期待できる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KATAKURA Industries CO.,LTD <120> Feline spuma retrovirus <130> pSKY4.0 <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 11757 <212> DNA <213> Spuma retrovirus <400> 1 tatcatgggc caaagagaat tctcacagag gagaatactc tctgctgcca tctagtgacg 60 atgaggacga agaaatgtca gaaagagagg aattattgtg ccatataaat caatgtcaac 120 aaaagctctt ttatcccgga gggacgactg atgtccttgg aatggaaagc aatgtttggc 180 tcactaaatt tgttaatatt aaatttccta aaggaacaaa agtgatactt cctgatggaa 240 gaaaattcat agcctgtgat cctgagctaa aaccattatt gcaggaattg aaattcttgg 300 atagggcaac atctgagtca tctgactctg aatagaaagc ctgaatttac ctggattatg 360 caactttgtc cgaggtggca gagtggttat gtatctgtca tactcgggga aagttttgtc 420 tttacatgtt caagacatat aaagggtaga aaaatatatt cctgactaaa cttcctgggg 480 actagaggtg tggaaacttt gctgcctctg cttcacggga agtttttggt tcgaatcctt 540 ttttaggtac ttagttaaga taagtagtaa ataagttact ctcgttcatg tattcatatc 600 gaaaccatgt atcctttgaa accatgtatt ctttagtcat ttagatactt agagtatgag 660 aaaagaaact gcaataataa 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ccccactttg 7380 tcctccaaag gacaaaagct cctcttcaga gatttggttc catatgatag ttgcaacata 7440 cctaaggcag tacttctctt aaacagaact tattggccat tttccttgtg ggaaggcgat 7500 tgtgggatat ttcaaacaaa tatcacagaa catgctagct gtaagaaatt caatcgaact 7560 cagacttcgc atccttatgc ttgcactttt tggagacaat atttagggaa tgcctcaata 7620 aaatgcgtgg atgactcagc acaatgttat tatagtcctg cttacactgg agttgaaaat 7680 agggaagatt ttggatggca agcatataat gacaattttc ccccacctat atgtattaaa 7740 gagataccaa ttattaaaaa gaattacaaa gtatcctctg tcctagctga atgcataaat 7800 aaggcaaaac aatatggaat cgaagaagtg atagataaat tggaaaactt gttccttacc 7860 aggcatgtgt tgcctgaaga tacttttaaa ccttataata actttacgtg gcctaaatat 7920 gaaaaacaaa ataaacaaca aaaaacctct tgtgaaggaa gaaaaaacag aagacaaaga 7980 aggtccgtaa gtacagaaaa cctaagaaga atgcaagagg caggcttagg cctggccaat 8040 gcaattacca ctgtggccaa gatttctgac ctgaatgatc agaaattagc caagggagta 8100 catttgctta gagatcatgt tgtcactcta atggaagcca atttggatga tattgtgtcc 8160 ttaggagagg gaatacagat agaacatata cacaatcact taacctcttt aaaattgctt 8220 actttggaaa aaagaattga ctggaggttt ataaatgatt catggattca ggaagaatta 8280 agtgtttcag acaatataat gaaagtaata agaaaaactg caagatgtat tccttacaat 8340 gtcaaacaaa ccaggaattt aaacacttcc actgcatggg aaatatattt atattatgag 8400 atcatcattc caactactat atatacacag aattggaata taaagaatct aggtcacctt 8460 gtaaggaatg caggatattt atctaaggtg tggattcaac aaccatttga agtactaaac 8520 caggaatgtg gaacaaatat atatttacat atggaagaat gtgttgacca agactatata 8580 atatgtgaaa aagtaataga acttcctccc tgtggaaatg gaactggttc agactgccca 8640 gtgctaacta aaccgcttac agatgaatac ttggaaattg aacccctgaa gaatgggagc 8700 tatttggttt tatcaagtac tacagactgc ggcataccag cttacgtgcc tgtggttata 8760 acagtgaatg acacaatcag ctgttttgat aaagagttta aaaggccact taaacaggaa 8820 ctgagagtaa caaaatatgc accatctgtt cctcaattgg aactaagagt tcctcggtta 8880 acaagcttaa ttgcaaaaat aaaaggaatt caaatagaaa tcaccagcag ctgggaaact 8940 ataaaagagc aagtcgcaag agccaaggca gagcttctac gcttggacct ccacgaagga 9000 gactatccag agtggctgca actccttgga gaagcaacta aagacgtttg 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atactcgggg aaagttttgt 10740 ctttacatgt tcaagacata taaaaggtag aaaaatatat tcctgactaa acttcctggg 10800 gactagaggt gtggaaactt tgctgcctct gcttcacggg aagtttttgg ttcaaatcct 10860 tttttaggta cttagttaag aaaagtaatg aataagttac tctcgttcat acattcatat 10920 cgaaaccatg tattctttag tcatttagat acttagagta taagaaaaga aactgcaatt 10980 gtaactatca atattagtaa acaaagtaca gctcattgtt atctgatgat gtcacgagaa 11040 gaagacctag aagagaagaa caattttcgg catgcagtag agcgggaact tggtgtagga 11100 gctaagtcac cgtcttacat ctagagccca ctcttcttga actgttcgaa tcctattttt 11160 ggagctctta catcaccttt aagagactga aaaacgtgac ttgtacacag gaagctcctt 11220 tagggtagag gaaatgttct aatctcctat cttaaagggt tgcttcattt aaggttcgaa 11280 actgtgtact ggaagtagat tttgcataac tttaaacttt tagttgcatg tttctgatat 11340 tagaagcata taaaagggtt atggtagatt gtacgggagc tcttctcaca gacttggctg 11400 cgtccagggt gagattgaga ctctccagct tgggtaagat tttgatatgt attttgcttg 11460 aatacttttg ccttgctcaa agattaataa attgattttt ctttcactca attgaagctt 11520 catataatta tattattgtc tgaagccaga actcacatga gtggtgtttc tctattcctg 11580 gggaaaagtg ttcttctatt tgaaagtgtt agagctacta agtgaaggac taacctatcc 11640 caggtatagg ccgcgacagt 11660

【図面の簡単な説明】

【図１】 スプーマウイルス等のゲノム構造を示す図面
である。

【図２】 種々のレトロウイルスについての構造を示す
図面である。

【図３】 キメラスプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ
４.０の全塩基配列を示す図面。

【図４】 キメラスプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ
４.０の全塩基配列を示す図面。

【図５】 キメラスプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ
４.０の全塩基配列を示す図面。

【図６】 キメラスプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ
４.０の全塩基配列を示す図面。

【図７】 キメラスプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ
４.０の全塩基配列を示す図面。

【図８】 スプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ３.０
の全塩基配列を示す図面。

【図９】 スプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ３.０
の全塩基配列を示す図面。

【図１０】 スプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ３.
０の全塩基配列を示す図面。

【図１１】 スプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ３.
０の全塩基配列を示す図面。

【図１２】 スプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ５.
０の全塩基配列を示す図面。

【図１３】 スプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ５.
０の全塩基配列を示す図面。

【図１４】 スプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ５.
０の全塩基配列を示す図面。

【図１５】 スプーマウイルスプラスミドｐＳＫＹ５.
０の全塩基配列を示す図面。 以 上

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の性質を有するスプーマウイルスプラ
   スミド。 （１）５'ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）および
   ３'ＬＴＲの間に、構造遺伝子としてコア蛋白遺伝子
   （ｇａｇ）、プロテアーゼ／インテグレース／逆転写酵
   素遺伝子（ｐｏｌ）、エンベロープ蛋白遺伝子（ｅｎ
   ｖ）、トランスアクチベーター遺伝子（ｂｅｌＩ）およ
   びｂｅｌＩＩを有し、ｂｅｌＩＩＩを有さない。 （２）５'ＬＴＲは、１３５５ｂｐ、３'ＬＴＲは１３５
   ５ｂｐである。 （３）ｇａｇは、１,５４５ｂｐである。 （４）ｂｅｌＩは、６３０ｂｐ、ｂｅｌＩＩは、９４２
   ｂｐである。
2. 【請求項２】 ネコ由来のものである請求項第１項記載
   のスプーマウイルスプラスミド。
3. 【請求項３】 ｅｎｖが次の塩基配列で表されるもので
   ある請求項第１項または第２項記載のスプーマウイルス
   プラスミド。 【化１】
4. 【請求項４】 ｅｎｖが次の塩基配列で表されるもので
   ある請求項第１項または第２項記載のスプーマウイルス
   プラスミド。 【化２】
5. 【請求項５】 ５'−ＬＴＲ、３'−ＬＴＲ、ｇａｇ、ｐ
   ｏｌ、ｂｅｌＩおよびｂｅｌＩＩはネコ由来の遺伝子で
   あり、ｅｎｖはヒト由来の遺伝子である請求項第１項記
   載のスプーマウイルス。
6. 【請求項６】 ｅｎｖが次の塩基配列で表されるもので
   ある請求項第１項または第５項記載のスプーマウイルス
   プラスミド。 【化３】
7. 【請求項７】 請求項第１項ないし第６項の何れかの項
   記載のスプーマウイルスプラスミドを利用するウイルス
   ベクター系。
8. 【請求項８】 コア蛋白遺伝子（ｇａｇ）、プロテアー
   ゼ／インテグレース／逆転写酵素遺伝子（ｐｏｌ）、エ
   ンベロープ蛋白遺伝子（ｅｎｖ）を組み込んだパッケー
   ジング細胞と、５'ロングターミナルリピート（ＬＴ
   Ｒ）の下流に、目的遺伝子、内部プロモーター遺伝子お
   よびレポーターないし薬剤耐性遺伝子および３'ＬＴＲ
   をこの順序で結合したスプーマウイルスプラスミドベク
   ターを含む請求項第７項記載のウイルスベクター系。