JPH0767682A - レトロウイルス様粒子、その製造方法、それから成るワクチン、およびパッケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡ - Google Patents
レトロウイルス様粒子、その製造方法、それから成るワクチン、およびパッケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡInfo
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- JPH0767682A JPH0767682A JP3297746A JP29774691A JPH0767682A JP H0767682 A JPH0767682 A JP H0767682A JP 3297746 A JP3297746 A JP 3297746A JP 29774691 A JP29774691 A JP 29774691A JP H0767682 A JPH0767682 A JP H0767682A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＲＮＡを内包しないレトロウイルス属に属す
るウイルスの開裂型ｇａｇタンパク質から成るレトロウ
イルス様粒子、好ましくは、ＲＮＡを内包せず、ｅｎｖ
タンパク質を含まない開裂型ｇａｇタンパク質から成る
レトロウイルス様粒子、その製造方法、該粒子を有効成
分とする抗レトロウイルス・ワクチン、およびレトロウ
イルス属に属するウイルスのパッケージング能を有する
ＲＮＡのｃＤＮＡを提供する。 【構成】 パッケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡ
を含まず、レトロウイルス由来の少なくともｇａｇ遺伝
子のｃＤＮＡ、およびｐｏｌ遺伝子のｃＤＮＡをウイル
スの増殖に非必須なゲノム領域に組み込んだウイルス・
ベクターを感染させた細胞を培養することにより、開裂
型ｇａｇタンパク質により構成されたＲＮＡを内包しな
いレトロウイルス様粒子を製造する。
るウイルスの開裂型ｇａｇタンパク質から成るレトロウ
イルス様粒子、好ましくは、ＲＮＡを内包せず、ｅｎｖ
タンパク質を含まない開裂型ｇａｇタンパク質から成る
レトロウイルス様粒子、その製造方法、該粒子を有効成
分とする抗レトロウイルス・ワクチン、およびレトロウ
イルス属に属するウイルスのパッケージング能を有する
ＲＮＡのｃＤＮＡを提供する。 【構成】 パッケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡ
を含まず、レトロウイルス由来の少なくともｇａｇ遺伝
子のｃＤＮＡ、およびｐｏｌ遺伝子のｃＤＮＡをウイル
スの増殖に非必須なゲノム領域に組み込んだウイルス・
ベクターを感染させた細胞を培養することにより、開裂
型ｇａｇタンパク質により構成されたＲＮＡを内包しな
いレトロウイルス様粒子を製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＲＮＡを内包しないレト
ロウイルス属に属するウイルスの開裂型ｇａｇタンパク
質から成るレトロウイルス様粒子、好ましくは、ＲＮＡ
を内包せず、ｅｎｖタンパク質を含まない開裂型ｇａｇ
タンパク質から成るレトロウイルス様粒子、その製造方
法、該粒子を有効成分とする抗レトロウイルス・ワクチ
ン、およびレトロウイルス属に属するウイルスのパッケ
ージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡに関する。
ロウイルス属に属するウイルスの開裂型ｇａｇタンパク
質から成るレトロウイルス様粒子、好ましくは、ＲＮＡ
を内包せず、ｅｎｖタンパク質を含まない開裂型ｇａｇ
タンパク質から成るレトロウイルス様粒子、その製造方
法、該粒子を有効成分とする抗レトロウイルス・ワクチ
ン、およびレトロウイルス属に属するウイルスのパッケ
ージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルスはエイズ、成人Ｔ細胞白
血病、癌、リューマチ等の多くの難病の病原ウイルスで
あると確認、または推定されている。とくに、最近、後
天性免疫不全症候群（エイズ）の発症、蔓延が世界的に
憂慮されており、その予防、治療対策が緊急課題となっ
ている。
血病、癌、リューマチ等の多くの難病の病原ウイルスで
あると確認、または推定されている。とくに、最近、後
天性免疫不全症候群（エイズ）の発症、蔓延が世界的に
憂慮されており、その予防、治療対策が緊急課題となっ
ている。
【０００３】レトロウイルス粒子は、多くのタンパク質
で構成されている。例えば、感染に関与する外皮糖タン
パク質（ｅｎｖタンパク質）、レトロウイルスの酵素群
であるｐｏｌタンパク質（逆転写酵素、プロテアーゼ、
エンドヌクレアーゼの存在が知られている）、核タンパ
ク質（ｇａｇタンパク質）などがある。
で構成されている。例えば、感染に関与する外皮糖タン
パク質（ｅｎｖタンパク質）、レトロウイルスの酵素群
であるｐｏｌタンパク質（逆転写酵素、プロテアーゼ、
エンドヌクレアーゼの存在が知られている）、核タンパ
ク質（ｇａｇタンパク質）などがある。
【０００４】効果的なエイズワクチンを得ようとする場
合には、ウイルスを中和し得る抗体を誘導するのに適当
な抗原を含んでいることが必要である。そのような抗原
としてｅｎｖタンパク質、特に感染能力に関係するとさ
れるｅｎｖタンパク質の一種であるｇｐ１２０（セル
（Ｃｅｌｌ）、５３、４８３（１９８８））がその最有
力候補として選ばれ、この抗原タンパク質をコードする
遺伝子を大腸菌に組み換える遺伝子操作技術により産生
する研究（例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２
２８、９３−９６（１９８５））などが既に行われてい
る。
合には、ウイルスを中和し得る抗体を誘導するのに適当
な抗原を含んでいることが必要である。そのような抗原
としてｅｎｖタンパク質、特に感染能力に関係するとさ
れるｅｎｖタンパク質の一種であるｇｐ１２０（セル
（Ｃｅｌｌ）、５３、４８３（１９８８））がその最有
力候補として選ばれ、この抗原タンパク質をコードする
遺伝子を大腸菌に組み換える遺伝子操作技術により産生
する研究（例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２
２８、９３−９６（１９８５））などが既に行われてい
る。
【０００５】しかし、種々の患者や感染者から分離され
たエイズの病原ウイルスとされているＨＩＶ（ｈｕｍａ
ｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）
のゲノム塩基配列の解析結果より、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝
子は極めて変異が激しいことが明らかとなり（サイエン
ティフィック・アメリカン（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍ
ｅｒｉｃａｎ）、２５３、８４−９３（１９８５））、
この部位を利用する手法では全てのＨＩＶに対応できな
い可能性がある。
たエイズの病原ウイルスとされているＨＩＶ（ｈｕｍａ
ｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）
のゲノム塩基配列の解析結果より、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝
子は極めて変異が激しいことが明らかとなり（サイエン
ティフィック・アメリカン（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍ
ｅｒｉｃａｎ）、２５３、８４−９３（１９８５））、
この部位を利用する手法では全てのＨＩＶに対応できな
い可能性がある。
【０００６】これに対し、ウイルス粒子の骨組みとなる
ｇａｇタンパク質をコードする遺伝子や逆転写酵素等を
コードしているｐｏｌ遺伝子は変異の起こる確率が低い
と考えられるため、それらの遺伝子産物を抗原とするワ
クチンは有利であるとして、逆転写酵素を大腸菌に組み
換える遺伝子操作によって産生する研究（例えば、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３６、３０５−３０８
（１９８７））、ｇａｇ−ｐ５５やｐ２４などを組み換
え多核体ウイルスの系で産生する研究（例えば、ヴィロ
ロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１５８、２４８−２５０
（１９８７））、ｐ１７の抗原決定部位に特異的に結合
する抗体と結合するポリペプチドを合成する研究（特開
昭６３−２７４９８号）、ｐ１７の単クローン抗体がエ
イズの中和活性を有するという報告（ジャーナル・オブ
・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、６３、２６７−
２７２（１９８９））なども行われた。
ｇａｇタンパク質をコードする遺伝子や逆転写酵素等を
コードしているｐｏｌ遺伝子は変異の起こる確率が低い
と考えられるため、それらの遺伝子産物を抗原とするワ
クチンは有利であるとして、逆転写酵素を大腸菌に組み
換える遺伝子操作によって産生する研究（例えば、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３６、３０５−３０８
（１９８７））、ｇａｇ−ｐ５５やｐ２４などを組み換
え多核体ウイルスの系で産生する研究（例えば、ヴィロ
ロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１５８、２４８−２５０
（１９８７））、ｐ１７の抗原決定部位に特異的に結合
する抗体と結合するポリペプチドを合成する研究（特開
昭６３−２７４９８号）、ｐ１７の単クローン抗体がエ
イズの中和活性を有するという報告（ジャーナル・オブ
・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、６３、２６７−
２７２（１９８９））なども行われた。
【０００７】また、本発明者らも、ｇａｇ遺伝子、およ
びｐｏｌ遺伝子を組み込んだワクチニアウイルスについ
て研究した結果、ウイルス・ベクターを感染させた細胞
中で、レトロウイルスのｅｎｖタンパク質を発現させず
に、ｇａｇタンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現
させることによって、開裂型のｇａｇタンパク質が発現
し、その開裂型ｇａｇタンパク質により構成されるレト
ロウイルスのコア構造物粒子が得られることを見いだし
た（特開平３−７２８７４号）。
びｐｏｌ遺伝子を組み込んだワクチニアウイルスについ
て研究した結果、ウイルス・ベクターを感染させた細胞
中で、レトロウイルスのｅｎｖタンパク質を発現させず
に、ｇａｇタンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現
させることによって、開裂型のｇａｇタンパク質が発現
し、その開裂型ｇａｇタンパク質により構成されるレト
ロウイルスのコア構造物粒子が得られることを見いだし
た（特開平３−７２８７４号）。
【０００８】このコア構造物粒子はｅｎｖタンパク質が
ないために感染性を有しないが、その後の研究により、
この粒子内にＲＮＡを内包していることが判明した。そ
のため、この粒子をワクチンとしてヒトに接種した場
合、ヒトの体内でレトロウイルスが構築されてしまう危
険性が皆無とはいえず、安全性の点でより改善すること
が望まれていた。
ないために感染性を有しないが、その後の研究により、
この粒子内にＲＮＡを内包していることが判明した。そ
のため、この粒子をワクチンとしてヒトに接種した場
合、ヒトの体内でレトロウイルスが構築されてしまう危
険性が皆無とはいえず、安全性の点でより改善すること
が望まれていた。
【０００９】一方、このようなレトロウイルスには、ウ
イルス内にＲＮＡを内包するかどうかを制御している遺
伝子があることが予想されていた（サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ），２２９，１３８８−１３９０（１９８
５））が、どの様な配列のものが該当する遺伝子である
か確認されておらず、また、粒子内へのＲＮＡのパッケ
ージング機構についても知られていなかった。このた
め、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様粒子を得るこ
とはできなかった。
イルス内にＲＮＡを内包するかどうかを制御している遺
伝子があることが予想されていた（サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ），２２９，１３８８−１３９０（１９８
５））が、どの様な配列のものが該当する遺伝子である
か確認されておらず、また、粒子内へのＲＮＡのパッケ
ージング機構についても知られていなかった。このた
め、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様粒子を得るこ
とはできなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、より安
全なワクチンを供給するべく鋭意研究の結果、ウイルス
・ベクターを感染させた細胞中で、パッケージング能を
有するＲＮＡのｃＤＮＡを含まず、ｇａｇ遺伝子、およ
びｐｏｌ遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだウイルス・ベク
ターを用いることによって、開裂型ｇａｇタンパク質に
より構成される、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様
粒子が得られることを見いだし、本発明を完成するに至
った。
全なワクチンを供給するべく鋭意研究の結果、ウイルス
・ベクターを感染させた細胞中で、パッケージング能を
有するＲＮＡのｃＤＮＡを含まず、ｇａｇ遺伝子、およ
びｐｏｌ遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだウイルス・ベク
ターを用いることによって、開裂型ｇａｇタンパク質に
より構成される、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様
粒子が得られることを見いだし、本発明を完成するに至
った。
【００１１】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、第一の発明として少なくとも開裂型ｇａｇタンパク
質を含み、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様粒子が
提供される。
ば、第一の発明として少なくとも開裂型ｇａｇタンパク
質を含み、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様粒子が
提供される。
【００１２】また、第二の発明としてパッケージング能
を有するＲＮＡのｃＤＮＡを含まず、レトロウイルス由
来の少なくともｇａｇ遺伝子のｃＤＮＡ、およびｐｏｌ
遺伝子のｃＤＮＡをウイルスの増殖に非必須なゲノム領
域に組み込んだウイルス・ベクターを感染させた細胞を
培養し、開裂型ｇａｇタンパク質により構成されたＲＮ
Ａを内包しないレトロウイルス様粒子の製造方法が提供
される。
を有するＲＮＡのｃＤＮＡを含まず、レトロウイルス由
来の少なくともｇａｇ遺伝子のｃＤＮＡ、およびｐｏｌ
遺伝子のｃＤＮＡをウイルスの増殖に非必須なゲノム領
域に組み込んだウイルス・ベクターを感染させた細胞を
培養し、開裂型ｇａｇタンパク質により構成されたＲＮ
Ａを内包しないレトロウイルス様粒子の製造方法が提供
される。
【００１３】さらに、第三の発明として少なくとも開裂
型ｇａｇタンパク質を含み、ＲＮＡを内包しないレトロ
ウイルス様粒子を有効成分とする抗レトロウイルス・ワ
クチンが提供される。
型ｇａｇタンパク質を含み、ＲＮＡを内包しないレトロ
ウイルス様粒子を有効成分とする抗レトロウイルス・ワ
クチンが提供される。
【００１４】そして、第四の発明としてレトロウイルス
に属するウイルスのＲＮＡパッケージング能を有するＲ
ＮＡのｃＤＮＡが提供される。
に属するウイルスのＲＮＡパッケージング能を有するＲ
ＮＡのｃＤＮＡが提供される。
【００１５】本発明のレトロウイルス様粒子は、ＲＮＡ
を内包せず、かつ開裂型ｇａｇタンパク質から成る粒子
である。この粒子は、本発明の粒子は逆転写酵素等のｐ
ｏｌタンパク質を内包していると考えられるが、粒子を
形成する限り、ｐｏｌタンパク質の存在の有無は特に問
題はない。しかし、ｐｏｌタンパク質がある方が高い抗
原性が期待される。
を内包せず、かつ開裂型ｇａｇタンパク質から成る粒子
である。この粒子は、本発明の粒子は逆転写酵素等のｐ
ｏｌタンパク質を内包していると考えられるが、粒子を
形成する限り、ｐｏｌタンパク質の存在の有無は特に問
題はない。しかし、ｐｏｌタンパク質がある方が高い抗
原性が期待される。
【００１６】本発明においてウイルス・ベクターに組み
込まれる遺伝子はレトロウイルス属に属するウイルス由
来のものである。レトロウイルス属に属するウイルスは
特に限定されないが、具体的にはオンコウイルス亜科に
属するウイルス、レンチウイルス亜科に属するウイルス
などが挙げられ、さらに具体的にはオンコウイルス亜科
に属するＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩなど、レンチウ
イルス亜科に属するＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩなどが挙
げられる。
込まれる遺伝子はレトロウイルス属に属するウイルス由
来のものである。レトロウイルス属に属するウイルスは
特に限定されないが、具体的にはオンコウイルス亜科に
属するウイルス、レンチウイルス亜科に属するウイルス
などが挙げられ、さらに具体的にはオンコウイルス亜科
に属するＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩなど、レンチウ
イルス亜科に属するＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩなどが挙
げられる。
【００１７】本発明において、ウイルス・ベクターに組
み込まれるレトロウイルスのｃＤＮＡは、ウイルス・ベ
クターを感染させる細胞において、少なくともｇａｇタ
ンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現し、かつパッ
ケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡを欠失したもの
であれば、特に限定されない。
み込まれるレトロウイルスのｃＤＮＡは、ウイルス・ベ
クターを感染させる細胞において、少なくともｇａｇタ
ンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現し、かつパッ
ケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡを欠失したもの
であれば、特に限定されない。
【００１８】このようなｃＤＮＡは、例えば、ｐＮＬ４
３（ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．）、５９、２、２８４（１９８６））などのよう
に、エイズ患者の染色体にプロウイルスの形で組み込ま
れたＨＩＶ−Ｉを一旦λファージなどを用いてクローニ
ングし、それを用いてＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むプ
ラスミドを構築するか、あるいは、患者より分離したＨ
ＩＶ−ＩのＲＮＡゲノムを逆転写してｃＤＮＡに変換
し、その後、プラスミドに移してＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮ
Ａを含むプラスミドを構築し、得られたプラスミドを適
当な制限酵素で切断することによって得ることができ
る。
３（ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．）、５９、２、２８４（１９８６））などのよう
に、エイズ患者の染色体にプロウイルスの形で組み込ま
れたＨＩＶ−Ｉを一旦λファージなどを用いてクローニ
ングし、それを用いてＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むプ
ラスミドを構築するか、あるいは、患者より分離したＨ
ＩＶ−ＩのＲＮＡゲノムを逆転写してｃＤＮＡに変換
し、その後、プラスミドに移してＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮ
Ａを含むプラスミドを構築し、得られたプラスミドを適
当な制限酵素で切断することによって得ることができ
る。
【００１９】ここで、パッケージング能とは、レトロウ
イルス様粒子内にＲＮＡを内包する機能をいい、このパ
ッケージング能を有するＲＮＡ配列をパッケージングシ
グナルという。
イルス様粒子内にＲＮＡを内包する機能をいい、このパ
ッケージング能を有するＲＮＡ配列をパッケージングシ
グナルという。
【００２０】パッケージングシグナルのＲＮＡ配列は、
本発明者によってはじめて見いだされたものであり、そ
のｃＤＮＡの具体例は、配列番号１に示すものである。
このｃＤＮＡは、前述のプラスミドｐＮＬ４３に組み込
まれているＨＩＶ由来の遺伝子のｃＤＮＡのｇａｇの開
始コドンの上流３９ｂｐとｇａｇの開始コドンを含む７
ｂｐの計４６ｂｐに相当する。
本発明者によってはじめて見いだされたものであり、そ
のｃＤＮＡの具体例は、配列番号１に示すものである。
このｃＤＮＡは、前述のプラスミドｐＮＬ４３に組み込
まれているＨＩＶ由来の遺伝子のｃＤＮＡのｇａｇの開
始コドンの上流３９ｂｐとｇａｇの開始コドンを含む７
ｂｐの計４６ｂｐに相当する。
【００２１】パッケージング能を有するＲＮＡは、いわ
ゆるシュテム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造とい
う二次構造を形成することにより機能すると考えられ
る。そのような二次構造の具体例としては、配列番号１
のｃＤＮＡに対応するＲＮＡ配列によって形成される図
１に示すものがある。ＲＮＡがシュテム−ループ（ｓｔ
ｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成しない場合、パッケージン
グ能を持たないことがある。
ゆるシュテム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造とい
う二次構造を形成することにより機能すると考えられ
る。そのような二次構造の具体例としては、配列番号１
のｃＤＮＡに対応するＲＮＡ配列によって形成される図
１に示すものがある。ＲＮＡがシュテム−ループ（ｓｔ
ｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成しない場合、パッケージン
グ能を持たないことがある。
【００２２】パッケージングシグナルの二次構造がシュ
テム−ループ構造をとり得るかどうかは、Ｚｕｃｋｅ
ｒ’ Ｆｏｌｄプログラムを用いたコンピューターによ
る構造解析（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓａｒ
ｃｈ、９、１３３−１４８（１９８１））などからわか
る。
テム−ループ構造をとり得るかどうかは、Ｚｕｃｋｅ
ｒ’ Ｆｏｌｄプログラムを用いたコンピューターによ
る構造解析（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓａｒ
ｃｈ、９、１３３−１４８（１９８１））などからわか
る。
【００２３】パッケージングシグナルの一部が欠損した
り、修飾されたりすることで、パッケージング能を失っ
たＲＮＡのｃＤＮＡは本願のパッケージングシグナルの
ｃＤＮＡ（以下、シグナルｃＤＮＡという）ではなく、
このようなｃＤＮＡを含んでいても本発明の粒子を製造
するに当たり、問題はない。ただし、欠損したり、修飾
されたりした部分がパッケージングシグナルのうちｇａ
ｇ遺伝子をコードする部分である場合、ｇａｇタンパク
質を発現しない可能性も考えられる。
り、修飾されたりすることで、パッケージング能を失っ
たＲＮＡのｃＤＮＡは本願のパッケージングシグナルの
ｃＤＮＡ（以下、シグナルｃＤＮＡという）ではなく、
このようなｃＤＮＡを含んでいても本発明の粒子を製造
するに当たり、問題はない。ただし、欠損したり、修飾
されたりした部分がパッケージングシグナルのうちｇａ
ｇ遺伝子をコードする部分である場合、ｇａｇタンパク
質を発現しない可能性も考えられる。
【００２４】しかし、改変によりパッケージング能を失
ったシグナルｃＤＮＡであっても、変異などによりパッ
ケージング能を回復する可能性があることから、シグナ
ルｃＤＮＡの塩基配列を改変したものは含んでいないこ
とが好ましい。
ったシグナルｃＤＮＡであっても、変異などによりパッ
ケージング能を回復する可能性があることから、シグナ
ルｃＤＮＡの塩基配列を改変したものは含んでいないこ
とが好ましい。
【００２５】本発明に用いるウイルス・ベクターも動物
細胞に感染し、ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子を発
現できるものであれば、特に限定されない。例えば、ワ
クチニアウイルス、アビポックスウイルス、バキュロウ
イルスなどが挙げられる。
細胞に感染し、ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子を発
現できるものであれば、特に限定されない。例えば、ワ
クチニアウイルス、アビポックスウイルス、バキュロウ
イルスなどが挙げられる。
【００２６】本発明に用いるウイルス・ベクターの構築
方法も、特に限定されない。例えば、ウイルス・ベクタ
ーとしてワクチニアウイルスを用いる場合には、組み込
む遺伝子をかえること以外、特開平１−７４９８２号に
記載された方法に準じて構築することができる。
方法も、特に限定されない。例えば、ウイルス・ベクタ
ーとしてワクチニアウイルスを用いる場合には、組み込
む遺伝子をかえること以外、特開平１−７４９８２号に
記載された方法に準じて構築することができる。
【００２７】また、ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子
のｃＤＮＡを一緒にウイルス・ベクターに組み込む代わ
りに、別のウイルス・ベクターに組み込むこともでき
る。もちろん、その場合にもシグナルｃＤＮＡを欠損し
たものが用いられる。本発明では、そのようなウイルス
・ベクターを、動物培養細胞に感染させ、その培養上清
中にｇａｇタンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現
させる。
のｃＤＮＡを一緒にウイルス・ベクターに組み込む代わ
りに、別のウイルス・ベクターに組み込むこともでき
る。もちろん、その場合にもシグナルｃＤＮＡを欠損し
たものが用いられる。本発明では、そのようなウイルス
・ベクターを、動物培養細胞に感染させ、その培養上清
中にｇａｇタンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現
させる。
【００２８】双方を一緒に組み込んだものであれば同時
に双方を発現するが、片方ずつを組み込んだものを用い
るときは、二つのベクターを同時に感染させる。二つの
タンパク質が発現することによりｇａｇタンパク質は開
裂型となる。
に双方を発現するが、片方ずつを組み込んだものを用い
るときは、二つのベクターを同時に感染させる。二つの
タンパク質が発現することによりｇａｇタンパク質は開
裂型となる。
【００２９】ここで発現されるｇａｇタンパク質の開裂
はプロテアーゼ活性を有するｐｏｌタンパク質によるも
のと考えられる。
はプロテアーゼ活性を有するｐｏｌタンパク質によるも
のと考えられる。
【００３０】本発明で用いる動物培養細胞はウイルス・
ベクターが増殖可能なものであればよく、その具体例と
して、ウイルス・ベクターがワクチニアウイルスである
場合は、例えばＴＫ-１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＦＬ
（ヒト羊膜由来）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚部癌由来）、
ＫＢ（ヒト鼻咽喉癌由来）、ＲＫ１３（ウサギ腎由
来）、ＣＶ−１（サル腎由来）、ＢＳＣ−１（サル腎由
来）、Ｌ９２９（マウス結合組織由来）、ＣＥ（ニワト
リ胚）細胞、ＣＥＦ（ニワトリ胎児繊維芽細胞）、ＳＷ
４８０（ヒト結腸ガン由来）などが例示される。
ベクターが増殖可能なものであればよく、その具体例と
して、ウイルス・ベクターがワクチニアウイルスである
場合は、例えばＴＫ-１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＦＬ
（ヒト羊膜由来）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚部癌由来）、
ＫＢ（ヒト鼻咽喉癌由来）、ＲＫ１３（ウサギ腎由
来）、ＣＶ−１（サル腎由来）、ＢＳＣ−１（サル腎由
来）、Ｌ９２９（マウス結合組織由来）、ＣＥ（ニワト
リ胚）細胞、ＣＥＦ（ニワトリ胎児繊維芽細胞）、ＳＷ
４８０（ヒト結腸ガン由来）などが例示される。
【００３１】ウイルス・ベクターがアビポックスウイル
スである場合は、本発明で用いる動物培養細胞としては
鶏胚用繊維芽細胞などの鶏由来細胞などが例示される
が、発育鶏卵漿尿膜なども含む。ウイルス・ベクターが
バキュロウイルスの場合は、例えばスポドプテラ・フル
ギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｒｕｇｉｐｅｒ
ｄａ）由来のＳｆ９株などが例示される。
スである場合は、本発明で用いる動物培養細胞としては
鶏胚用繊維芽細胞などの鶏由来細胞などが例示される
が、発育鶏卵漿尿膜なども含む。ウイルス・ベクターが
バキュロウイルスの場合は、例えばスポドプテラ・フル
ギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｒｕｇｉｐｅｒ
ｄａ）由来のＳｆ９株などが例示される。
【００３２】しかし、一般的な培養条件においては、用
いる細胞によっては開裂型ｇａｇタンパク質の発現量が
低く、例えばＣＶ−１にＨＩＶ−Ｉの遺伝子を組み込ん
だワクチニアウイルスを感染させた場合には、開裂型ｇ
ａｇタンパク質はほどんど発現が認められない。開裂型
ｇａｇタンパク質の発現量が多いウイルス・ベクターと
動物培養細胞の組み合せが好ましく、そのような例とし
てはＨＩＶ−Ｉの遺伝子を組み込んだワクチニアウイル
スをＳＷ４８０に感染させる場合がある。
いる細胞によっては開裂型ｇａｇタンパク質の発現量が
低く、例えばＣＶ−１にＨＩＶ−Ｉの遺伝子を組み込ん
だワクチニアウイルスを感染させた場合には、開裂型ｇ
ａｇタンパク質はほどんど発現が認められない。開裂型
ｇａｇタンパク質の発現量が多いウイルス・ベクターと
動物培養細胞の組み合せが好ましく、そのような例とし
てはＨＩＶ−Ｉの遺伝子を組み込んだワクチニアウイル
スをＳＷ４８０に感染させる場合がある。
【００３３】培養上清からの粒子の精製は特に限定され
ない。例えば、常法（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２２４、４９７−５００（１９８４））に従って、上清
をショ糖、あるいは酒石酸カリウム密度勾配遠心を行
い、さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心を行うち、
これらのタンパク質がレトロウイルス様粒子を形成し
て、回収される。
ない。例えば、常法（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２２４、４９７−５００（１９８４））に従って、上清
をショ糖、あるいは酒石酸カリウム密度勾配遠心を行
い、さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心を行うち、
これらのタンパク質がレトロウイルス様粒子を形成し
て、回収される。
【００３４】開裂型ｇａｇタンパク質により構成される
レトロウイルス様粒子は、例えば、レトロウイルスがＨ
ＩＶ−Ｉで、比重により分画した場合、比重がＨＩＶ−
Ｉ粒子と同じ約１．１５のフラクションに認められる。
レトロウイルス様粒子は、例えば、レトロウイルスがＨ
ＩＶ−Ｉで、比重により分画した場合、比重がＨＩＶ−
Ｉ粒子と同じ約１．１５のフラクションに認められる。
【００３５】精製の各段階においてどのフラクション中
にレトロウイルス様粒子が存在するかの確認の方法は特
に限定されない。例えば、ｇａｇタンパク質に対する抗
体を使う方法や逆転写酵素活性を測定する方法がある。
にレトロウイルス様粒子が存在するかの確認の方法は特
に限定されない。例えば、ｇａｇタンパク質に対する抗
体を使う方法や逆転写酵素活性を測定する方法がある。
【００３６】本発明の開裂型ｇａｇタンパク質により構
成される粒子は逆転写酵素を内包していても内包してい
なくてもかまわないが、通常、少なくとも一部は逆転写
酵素を内包する。従って、逆転写酵素活性を測定すれ
ば、本発明の粒子を含むフラクションは判別できる。
成される粒子は逆転写酵素を内包していても内包してい
なくてもかまわないが、通常、少なくとも一部は逆転写
酵素を内包する。従って、逆転写酵素活性を測定すれ
ば、本発明の粒子を含むフラクションは判別できる。
【００３７】逆転写酵素活性の測定は常法に従えばよ
い。例えば、微生物学実習提要（東京大学医科学研究所
学友会編、丸善より発行、１９８８年）の記述に準じて
組み換えウイルス感染細胞上清をｐｏｌｙ−Ａを鋳型、
ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーとして、32Ｐ−ｄＴＴＰ
の酸不溶性画分への取り込みを測定すればよい。
い。例えば、微生物学実習提要（東京大学医科学研究所
学友会編、丸善より発行、１９８８年）の記述に準じて
組み換えウイルス感染細胞上清をｐｏｌｙ−Ａを鋳型、
ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーとして、32Ｐ−ｄＴＴＰ
の酸不溶性画分への取り込みを測定すればよい。
【００３８】本発明の粒子はウイルス遺伝子を含まない
ために増殖性がなく、病原性を示さない。一方、この粒
子は、少なくとも開裂型ｇａｇタンパク質によりその構
造が形成されているために抗原性を有する。
ために増殖性がなく、病原性を示さない。一方、この粒
子は、少なくとも開裂型ｇａｇタンパク質によりその構
造が形成されているために抗原性を有する。
【００３９】また、ｇａｇタンパク質やｐｏｌタンパク
質はｅｎｖタンパク質に比べて変異が少ないと考えられ
る。したがって、少なくともｇａｇタンパク質が存在す
るために、本発明の粒子の抗原性は安定している。
質はｅｎｖタンパク質に比べて変異が少ないと考えられ
る。したがって、少なくともｇａｇタンパク質が存在す
るために、本発明の粒子の抗原性は安定している。
【００４０】さらに、本発明のレトロウイルス様粒子
は、自然界のレトロウイルス粒子、またはその一部であ
るレトロウイルス・コア構造粒子と同一または類似の構
造を有していることから、レトロウイルス様粒子を形成
していないｅｎｖタンパク質、ｇａｇタンパク質、ｐｏ
ｌタンパク質、あるいはその単なる混合物以上の抗原性
も期待できる。
は、自然界のレトロウイルス粒子、またはその一部であ
るレトロウイルス・コア構造粒子と同一または類似の構
造を有していることから、レトロウイルス様粒子を形成
していないｅｎｖタンパク質、ｇａｇタンパク質、ｐｏ
ｌタンパク質、あるいはその単なる混合物以上の抗原性
も期待できる。
【００４１】しかし、ｅｎｖタンパク質であるｇｐ１２
０は感染の際にウイルス粒子を細胞膜に固定化する機能
を有し、ｇｐ４１はウイルス遺伝子を細胞内へ侵入させ
る機能を有するため、より安全なワクチンを得るために
は、粒子にｅｎｖタンパク質が含まれていないことが好
ましい。
０は感染の際にウイルス粒子を細胞膜に固定化する機能
を有し、ｇｐ４１はウイルス遺伝子を細胞内へ侵入させ
る機能を有するため、より安全なワクチンを得るために
は、粒子にｅｎｖタンパク質が含まれていないことが好
ましい。
【００４２】本発明でいうｅｎｖタンパク質とは、レト
ロウイルスの感染、病原性を司るｅｎｖタンパク質、お
よびその変異物や改変物をいい、感染への影響力、病原
性を失ったｅｎｖタンパク質の改変物等を意味しない。
ロウイルスの感染、病原性を司るｅｎｖタンパク質、お
よびその変異物や改変物をいい、感染への影響力、病原
性を失ったｅｎｖタンパク質の改変物等を意味しない。
【００４３】本発明の粒子のうち、ｅｎｖタンパク質を
含まない粒子は、ｅｎｖ遺伝子を含まないウイルス・ベ
クターを用いることによって得ることができる。また、
ｅｎｖタンパク質をコードしている遺伝子のすぐ上流に
終止コドンを組み込ませる等の処理によりｅｎｖタンパ
ク質が発現できないようにしたウイルス・ベクターを用
いることによって得ることができる。
含まない粒子は、ｅｎｖ遺伝子を含まないウイルス・ベ
クターを用いることによって得ることができる。また、
ｅｎｖタンパク質をコードしている遺伝子のすぐ上流に
終止コドンを組み込ませる等の処理によりｅｎｖタンパ
ク質が発現できないようにしたウイルス・ベクターを用
いることによって得ることができる。
【００４４】本発明でいうｅｎｖ遺伝子を含まないと
は、ｅｎｖタンパク質をコードしている遺伝子を発現し
得る形で含まないことを意味し、レトロウイルスの感
染、病原性に関係のないｅｎｖ遺伝子由来の遺伝子（ｅ
ｎｖ遺伝子の一部やｅｎｖ遺伝子の改変物等）を含んで
いても構わない。
は、ｅｎｖタンパク質をコードしている遺伝子を発現し
得る形で含まないことを意味し、レトロウイルスの感
染、病原性に関係のないｅｎｖ遺伝子由来の遺伝子（ｅ
ｎｖ遺伝子の一部やｅｎｖ遺伝子の改変物等）を含んで
いても構わない。
【００４５】
【発明の効果】本発明のレトロウイルス様粒子は、レト
ロウイルス粒子、またはその一部であるレトロウイルス
・コア構造物粒子の構造と同一または類似の構造を持つ
が、レトロウイルスの遺伝子を含まないために増殖性を
持たないことから、これを有効成分とすることにより、
安全生の高い、有効な抗レトロウイルス・ワクチンが期
待できる。また、本発明のレトロウイルス様粒子の製造
方法によれば、効率よく本発明のレトロウイルス様粒子
を得ることができる。
ロウイルス粒子、またはその一部であるレトロウイルス
・コア構造物粒子の構造と同一または類似の構造を持つ
が、レトロウイルスの遺伝子を含まないために増殖性を
持たないことから、これを有効成分とすることにより、
安全生の高い、有効な抗レトロウイルス・ワクチンが期
待できる。また、本発明のレトロウイルス様粒子の製造
方法によれば、効率よく本発明のレトロウイルス様粒子
を得ることができる。
【００４６】さらに、本発明のパッケージングシグナル
はパッケージング能を支配することから、この部分のｃ
ＤＮＡから組み込む遺伝子を除去することにより、ＲＮ
Ａを含まないタンパク質の産生を可能にする一方、パッ
ケージングシグナルを意図的に組み込むことによって、
粒子内に所望のＲＮＡを内包させることができ（後述の
実施例３参照）、例えば、生体に感染したＲＮＡウイル
スのアンチセンスＲＮＡを内包した粒子を製造すれば、
ウイルスＲＮＡと二重鎖を形成し、ウイルスＲＮＡの発
現が抑制される。
はパッケージング能を支配することから、この部分のｃ
ＤＮＡから組み込む遺伝子を除去することにより、ＲＮ
Ａを含まないタンパク質の産生を可能にする一方、パッ
ケージングシグナルを意図的に組み込むことによって、
粒子内に所望のＲＮＡを内包させることができ（後述の
実施例３参照）、例えば、生体に感染したＲＮＡウイル
スのアンチセンスＲＮＡを内包した粒子を製造すれば、
ウイルスＲＮＡと二重鎖を形成し、ウイルスＲＮＡの発
現が抑制される。
【００４７】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。なお、実施例、比較例、および参考例中の
部、および％はとくに断りのないかぎり重量基準であ
る。
に説明する。なお、実施例、比較例、および参考例中の
部、および％はとくに断りのないかぎり重量基準であ
る。
【００４８】実施例１ （１）組み換えベクターｐＵＨＫの作製（図２参照） ｐＵＣ９（ファルマシア社製）をＥｃｏＲＩ、およびＰ
ｓｔＩで消化後、ポリメラーゼで処理し、切断端を平滑
末端とした後、両端を連結し、ＥｃｏＲＩ部位が欠損し
たｐＵＣ９’を作製した。このｐＵＣ９’をＨｉｎｄＩ
ＩＩ で切断後、ワクチニアウイルスＴＫ遺伝子を含む
ワクチニアウイルスＷＲ株のＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片を
連結し、得られた約７．７ｋｂｐの組み換えベクターｐ
ＵＨＫをと命名した。
ｓｔＩで消化後、ポリメラーゼで処理し、切断端を平滑
末端とした後、両端を連結し、ＥｃｏＲＩ部位が欠損し
たｐＵＣ９’を作製した。このｐＵＣ９’をＨｉｎｄＩ
ＩＩ で切断後、ワクチニアウイルスＴＫ遺伝子を含む
ワクチニアウイルスＷＲ株のＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片を
連結し、得られた約７．７ｋｂｐの組み換えベクターｐ
ＵＨＫをと命名した。
【００４９】（２）組み換えベクターｐＮＺ６８Ｋ２の
作製（図３参照） ワクチニアウイルスＷＲ株の７．５Ｋプロモーター（モ
スら（Ｍｏｓｓ ｅｔ．ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）、１
２５、８０５−８１３（１９８１））をｐＵＣ１９（フ
ァルマシア社製）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した後、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで順次切断して、７．５Ｋプ
ロモーターの前後にポリリンカー部位を有する約３５０
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
作製（図３参照） ワクチニアウイルスＷＲ株の７．５Ｋプロモーター（モ
スら（Ｍｏｓｓ ｅｔ．ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）、１
２５、８０５−８１３（１９８１））をｐＵＣ１９（フ
ァルマシア社製）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した後、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで順次切断して、７．５Ｋプ
ロモーターの前後にポリリンカー部位を有する約３５０
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００５０】このＤＮＡ断片のＳ１ヌクレアーゼ処理し
たものと、（１）で得たプラスミドｐＵＨＫのＥｃｏＲ
Ｉ消化物をポリメラーゼ処理したものとを連結し、得ら
れた約８ｋｂｐの組み換えプラスミドをｐＮＺ６８Ｋ２
と命名した。
たものと、（１）で得たプラスミドｐＵＨＫのＥｃｏＲ
Ｉ消化物をポリメラーゼ処理したものとを連結し、得ら
れた約８ｋｂｐの組み換えプラスミドをｐＮＺ６８Ｋ２
と命名した。
【００５１】（３）組み換えプラスミドｐＮＺ−ｇａｇ
／ｐｏｌ−ｄＰの作製（図４参照） ＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むｐＮＬ４３をＢｇｌＩＩ
とＥｃｏＲＩで消化後、低融点アガロース電気泳動で約
５．１ｋｂｐの断片を分離し、フェノール抽出によりそ
の断片を回収した。
／ｐｏｌ−ｄＰの作製（図４参照） ＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むｐＮＬ４３をＢｇｌＩＩ
とＥｃｏＲＩで消化後、低融点アガロース電気泳動で約
５．１ｋｂｐの断片を分離し、フェノール抽出によりそ
の断片を回収した。
【００５２】この断片をさらにＭｎｌＩで消化後、低融
点アガロース電気泳動で約５ｋｂｐの断片を分離し、フ
ェノール抽出によりその断片を回収した。
点アガロース電気泳動で約５ｋｂｐの断片を分離し、フ
ェノール抽出によりその断片を回収した。
【００５３】この断片中には図４に示すように、ｇａｇ
遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子領域が含まれているが、
（ｇａｇ遺伝子の開始コドン上流の）スプライシングド
ナー部位、およびシグナルｃＤＮＡと思われる部分を含
む８４ｂｐを除去した断片である。
遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子領域が含まれているが、
（ｇａｇ遺伝子の開始コドン上流の）スプライシングド
ナー部位、およびシグナルｃＤＮＡと思われる部分を含
む８４ｂｐを除去した断片である。
【００５４】実施例１（２）で得たｐＮＺ６８Ｋ２をＳ
ｍａＩとＥｃｏＲＩで消化した後、先に得た約５ｋｂｐ
のＤＮＡ断片と連結して約１３ｋｂｐの組み換えプラス
ミドｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを得た。
ｍａＩとＥｃｏＲＩで消化した後、先に得た約５ｋｂｐ
のＤＮＡ断片と連結して約１３ｋｂｐの組み換えプラス
ミドｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを得た。
【００５５】（４）組み換えワクチニアウイルスの作出 ２５ｃｍ2 のカルチャーボトルでＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥ
Ｍを培地として培養されたＣＶ−１細胞に、ワクチニア
ウイルスＷＲ株を０．１ｐ．ｆ．ｕ．／細胞接種し、４
５分ｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを２．２ｍｌの滅菌
水で溶かし、樋高ら（蛋白質・核酸・酵素、２７、３４
０（１９８５））の方法によって、ＤＮＡ−リン酸カル
シウム共沈物をつくり、その０．５ｍｌを感染ＣＶ−１
細胞上に滴下した。３０分間、３７℃、５％ ＣＯ2 イ
ンキュベーターに静置し、５％牛胎児血清を含むＥａｇ
ｌｅ ＭＥＭ培地４．５ｍｌを加えた。その３時間後培
養液を交換し、４８時間後、培養細胞ごと３度凍結融解
し、３０秒間超音波処理した。
Ｍを培地として培養されたＣＶ−１細胞に、ワクチニア
ウイルスＷＲ株を０．１ｐ．ｆ．ｕ．／細胞接種し、４
５分ｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを２．２ｍｌの滅菌
水で溶かし、樋高ら（蛋白質・核酸・酵素、２７、３４
０（１９８５））の方法によって、ＤＮＡ−リン酸カル
シウム共沈物をつくり、その０．５ｍｌを感染ＣＶ−１
細胞上に滴下した。３０分間、３７℃、５％ ＣＯ2 イ
ンキュベーターに静置し、５％牛胎児血清を含むＥａｇ
ｌｅ ＭＥＭ培地４．５ｍｌを加えた。その３時間後培
養液を交換し、４８時間後、培養細胞ごと３度凍結融解
し、３０秒間超音波処理した。
【００５６】組み換え体のｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ
遺伝子の挿入を確認するため、６ｃｍのペトリ皿に培養
されたＴＫ陰性細胞（ＴＫ-１４３）に上記超音波処理
物を接種し、４５分後、１％寒天・１２％牛胎児血清・
２５μｇ／ｍｌＢＵｄＲ（５−ブロモ−２’−デオキシ
ウリジン）加Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭを積層し、３日間
培養後、感染細胞を０．０１％ニュートラル・レッドで
染色した。形成されたプラークをパスツールピペットで
単離し、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ中に希釈する。単離し
たプラークにつき、再度同様の操作を繰り返し、プラー
クを純化した。
遺伝子の挿入を確認するため、６ｃｍのペトリ皿に培養
されたＴＫ陰性細胞（ＴＫ-１４３）に上記超音波処理
物を接種し、４５分後、１％寒天・１２％牛胎児血清・
２５μｇ／ｍｌＢＵｄＲ（５−ブロモ−２’−デオキシ
ウリジン）加Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭを積層し、３日間
培養後、感染細胞を０．０１％ニュートラル・レッドで
染色した。形成されたプラークをパスツールピペットで
単離し、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ中に希釈する。単離し
たプラークにつき、再度同様の操作を繰り返し、プラー
クを純化した。
【００５７】この純化したプラークより得られたウイル
スを増殖させ、増殖ウイルスよりＤＮＡを調製し、ｇａ
ｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子をコードするｃＤＮＡを
プローブとするドットブロットハイブリダイゼーション
により得られた組み換えワクチニアウイルスが目的とす
るＤＮＡをゲノム内に持つ組み換えウイルスであること
を確認し、Ｖ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰと命名した。
スを増殖させ、増殖ウイルスよりＤＮＡを調製し、ｇａ
ｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子をコードするｃＤＮＡを
プローブとするドットブロットハイブリダイゼーション
により得られた組み換えワクチニアウイルスが目的とす
るＤＮＡをゲノム内に持つ組み換えウイルスであること
を確認し、Ｖ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰと命名した。
【００５８】（５）組み換え体の細胞上清での発現 組織培養用９ｃｍディッシュにダルベッコ改変Ｅａｇｌ
ｅ’ｓ ＭＥＭを培地として培養したＳＷ４８０細胞に
ｍ．ｏ．ｉ．１０〜２０のＶ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを
接種し、３７℃、１時間感染後、ウイルス液を抜取り、
細胞をＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭで洗浄し、５％牛胎児血
清加Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭを加えた。１６時間後、細
胞上清を回収し、１０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７．４）
−０．１Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で作製し
た２０〜６０％の酒石酸カリウムの密度勾配上に重層
し、ローターＳＷ４７（ベックマン製）で３５，０００
ｒｐｍ、１６時間遠心した。遠心後、各フラクションに
分けた。
ｅ’ｓ ＭＥＭを培地として培養したＳＷ４８０細胞に
ｍ．ｏ．ｉ．１０〜２０のＶ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを
接種し、３７℃、１時間感染後、ウイルス液を抜取り、
細胞をＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭで洗浄し、５％牛胎児血
清加Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭを加えた。１６時間後、細
胞上清を回収し、１０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７．４）
−０．１Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で作製し
た２０〜６０％の酒石酸カリウムの密度勾配上に重層
し、ローターＳＷ４７（ベックマン製）で３５，０００
ｒｐｍ、１６時間遠心した。遠心後、各フラクションに
分けた。
【００５９】５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭジチオスレイトール、７５ｍＭ ＫＣ
ｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ−
Ａ、５μｇ／ｍｌ ｏｌｉｇｏ−ｄＴ、０．０５％ＮＰ
４０を含む反応液５ｍｌに［α−32Ｐ］−ｄＴＴＰ（４
００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）を５〜１０μ
ｌ加えた。
０）、１０ｍＭジチオスレイトール、７５ｍＭ ＫＣ
ｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ−
Ａ、５μｇ／ｍｌ ｏｌｉｇｏ−ｄＴ、０．０５％ＮＰ
４０を含む反応液５ｍｌに［α−32Ｐ］−ｄＴＴＰ（４
００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）を５〜１０μ
ｌ加えた。
【００６０】この反応液を、９６穴Ｕ字型プレートにフ
ラクションと対照の数だけ分注しておき、そこへ各フラ
クションあるいは対照用１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）−０．１Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ溶液１０ｍｌ加え、３７℃で１時間反応させた。反応
中に、ニトロセルロースフィルターに鉛筆で２ｃｍ間隔
の碁盤の目を書いておき、反応終了後、各フラクショ
ン、および対照の反応液１０μｌをニトロセルロースフ
ィルター上の各区画にスポットした。
ラクションと対照の数だけ分注しておき、そこへ各フラ
クションあるいは対照用１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）−０．１Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ溶液１０ｍｌ加え、３７℃で１時間反応させた。反応
中に、ニトロセルロースフィルターに鉛筆で２ｃｍ間隔
の碁盤の目を書いておき、反応終了後、各フラクショ
ン、および対照の反応液１０μｌをニトロセルロースフ
ィルター上の各区画にスポットした。
【００６１】このフィルターを風乾により完全に乾燥さ
せた後、５％トリクロロ酢酸−５％ピロリン酸ナトリウ
ム液中で１５分間振盪しながら洗浄し、未反応の放射性
前駆体を除去した。
せた後、５％トリクロロ酢酸−５％ピロリン酸ナトリウ
ム液中で１５分間振盪しながら洗浄し、未反応の放射性
前駆体を除去した。
【００６２】続いて５％トリクロロ酢酸中で５分、そし
て５０％エタノール中で５分洗浄した。乾燥後、碁盤の
目にそって各区間を切り放し、シンチレーションバイア
ルに入れて、トルエンシンチレータ中で液体シンチレー
ションカウンターにより取り込みを測定した。対照の３
倍以上の取り込みを陽性とし、逆転写酵素活性があると
判断した。
て５０％エタノール中で５分洗浄した。乾燥後、碁盤の
目にそって各区間を切り放し、シンチレーションバイア
ルに入れて、トルエンシンチレータ中で液体シンチレー
ションカウンターにより取り込みを測定した。対照の３
倍以上の取り込みを陽性とし、逆転写酵素活性があると
判断した。
【００６３】次いで、逆転写酵素活性が認められたフラ
クションをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分画し、ニトロセルロースフィルターにブロッティング
する（アナリティカル・バイオケミストリィ（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１２、１９５−２０３（１
９８１））。検出法として 125ＩラベルプロテインＡ、
抗ｐ２４モノクロナール抗体（ジャパニーズ・ジャーナ
ル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊａｐａｎｅｓｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃ
ｈ）、７８、２３５−２４１（１９８７））を利用する
いわゆるウェスタンブロッティング法によって、開裂型
ｇａｇタンパク質の発現が確認され、Ｖ−ｇａｇ／ｐｏ
ｌ−ｄＰ感染ＳＷ４８０細胞はその上清に分子量２４，
０００ダルトンの開裂型ｇａｇタンパク質ｐ２４を産生
していることが判明した。
クションをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分画し、ニトロセルロースフィルターにブロッティング
する（アナリティカル・バイオケミストリィ（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１２、１９５−２０３（１
９８１））。検出法として 125ＩラベルプロテインＡ、
抗ｐ２４モノクロナール抗体（ジャパニーズ・ジャーナ
ル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊａｐａｎｅｓｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃ
ｈ）、７８、２３５−２４１（１９８７））を利用する
いわゆるウェスタンブロッティング法によって、開裂型
ｇａｇタンパク質の発現が確認され、Ｖ−ｇａｇ／ｐｏ
ｌ−ｄＰ感染ＳＷ４８０細胞はその上清に分子量２４，
０００ダルトンの開裂型ｇａｇタンパク質ｐ２４を産生
していることが判明した。
【００６４】ｇａｇ−ｐ５５の構造から考えて、ｇａｇ
−ｐ５５の中央部分のアミノ酸配列に相当するｐ２４が
産生されていることから、ｇａｇ−ｐ５５の両端のアミ
ノ酸配列に相当するｐ１７、ｐ１５も産生されていると
考えられる。
−ｐ５５の中央部分のアミノ酸配列に相当するｐ２４が
産生されていることから、ｇａｇ−ｐ５５の両端のアミ
ノ酸配列に相当するｐ１７、ｐ１５も産生されていると
考えられる。
【００６５】逆転写酵素活性の検出される比重約１．１
５の分画を、さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心に
より精製し、逆転写酵素活性の検出される比重約１．１
５の分画にｐ２４が確認された。
５の分画を、さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心に
より精製し、逆転写酵素活性の検出される比重約１．１
５の分画にｐ２４が確認された。
【００６６】いわゆるネガティブ染色法により、上記の
ｐ２４が確認された分画を電子顕微鏡により観察すると
ワクチニアウイルスとは異なる直径約１１０〜１５０ｎ
ｍの球形の粒子が認められた。
ｐ２４が確認された分画を電子顕微鏡により観察すると
ワクチニアウイルスとは異なる直径約１１０〜１５０ｎ
ｍの球形の粒子が認められた。
【００６７】比較例１ （１）組み換えプラスミドＷ−ｇａｇの作製 ＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むｐＮＬ４３（ジャーナル
・オブ・ビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、５９、２、２
８４（１９８６））をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化
後、低融点アガロース電気泳動で約５．１ｋｂｐの断片
を分離し、フェノール抽出によりその断片を回収した。
・オブ・ビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、５９、２、２
８４（１９８６））をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化
後、低融点アガロース電気泳動で約５．１ｋｂｐの断片
を分離し、フェノール抽出によりその断片を回収した。
【００６８】次に、実施例１（２）で得たｐＮＺ６８Ｋ
２をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、先に得た約５．
１ｋｂｐのＤＮＡ断片とライゲーションして、得られた
約１３ｋｂｐの組み換えをプラスミドＷ−ｇａｇと命名
した。
２をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、先に得た約５．
１ｋｂｐのＤＮＡ断片とライゲーションして、得られた
約１３ｋｂｐの組み換えをプラスミドＷ−ｇａｇと命名
した。
【００６９】（２）組み換えワクチニアウイルスの作出 プラスミドとしてＷ−ｇａｇを用いるほかは、実施例１
（４）と同様の方法で組み換えワクチニアウイルスを作
製した。得られた組み換えワクチニアウイルスをＶ−２
０−１−８と命名した。
（４）と同様の方法で組み換えワクチニアウイルスを作
製した。得られた組み換えワクチニアウイルスをＶ−２
０−１−８と命名した。
【００７０】（３）組み換え体の細胞上清での発現 組み換えワクチニアウイルスとしてＶ−２０−１−８を
用いた以外は、実施例１（５）と同様の方法でレトロウ
イルス様粒子を発現させ、実施例１（５）で得られた粒
子と同様の粒子が発現していることを確認した。
用いた以外は、実施例１（５）と同様の方法でレトロウ
イルス様粒子を発現させ、実施例１（５）で得られた粒
子と同様の粒子が発現していることを確認した。
【００７１】実施例２ （１）レトロウイルス様粒子内のＨＩＶ−Ｉ由来ＲＮＡ
の確認 実施例１（５）で得た粒子、および比較例１（３）で得
た粒子からＲＮＡを抽出すべく、フェノール／クロロホ
ルム（１：１）で処理した後、エタノール沈澱により混
在するタンパク質除去した。
の確認 実施例１（５）で得た粒子、および比較例１（３）で得
た粒子からＲＮＡを抽出すべく、フェノール／クロロホ
ルム（１：１）で処理した後、エタノール沈澱により混
在するタンパク質除去した。
【００７２】各粒子抽出物を１６％ホルムアデヒドを含
んだ１％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロー
スＨＡＷＰフィルター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、５２０１−５２０５（１９
８０））に移した後、32ＰでラベルしたＨＩＶ−ＩのＤ
ＮＡをプローブとしてハイブリダイズした。
んだ１％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロー
スＨＡＷＰフィルター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、５２０１−５２０５（１９
８０））に移した後、32ＰでラベルしたＨＩＶ−ＩのＤ
ＮＡをプローブとしてハイブリダイズした。
【００７３】その結果、実施例１（５）で得た粒子の抽
出物からは、ＲＮＡが検出されなかったが、比較例１
（３）で得た粒子の抽出物からは、ＲＮＡが検出され
た。従って、実施例１（５）で得た粒子はＲＮＡを内包
せず、比較例１（３）で得た粒子はＲＮＡを内包してい
ることがわかった。
出物からは、ＲＮＡが検出されなかったが、比較例１
（３）で得た粒子の抽出物からは、ＲＮＡが検出され
た。従って、実施例１（５）で得た粒子はＲＮＡを内包
せず、比較例１（３）で得た粒子はＲＮＡを内包してい
ることがわかった。
【００７４】（２）感染細胞中のＨＩＶ−Ｉ由来ＲＮＡ
の確認 実施例１（５）、および比較例１（３）の感染細胞を、
それぞれ４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ａｒ
ａ−Ｃ）を添加したダルベッコ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍ
ＥＭで、３７℃、４８時間培養した。その後、それぞれ
細胞を回収し、細胞を１％ＳＤＳ／１２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶かし（グアニジウムチオ
シアネート法）、ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅを得た。
の確認 実施例１（５）、および比較例１（３）の感染細胞を、
それぞれ４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ａｒ
ａ−Ｃ）を添加したダルベッコ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍ
ＥＭで、３７℃、４８時間培養した。その後、それぞれ
細胞を回収し、細胞を１％ＳＤＳ／１２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶かし（グアニジウムチオ
シアネート法）、ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅを得た。
【００７５】各ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅを１６％ホルム
アデヒドを含んだ１％アガロースゲルで電気泳動し、ニ
トロセルロースＨＡＷＰフィルター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、５２０１−５２
０５（１９８０））に移した後、32ＰでラベルしたＨＩ
Ｖ−ＩのＤＮＡをプローブとしてハイブリダイズした。
その結果、各ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅからは、ＨＩＶ−
Ｉ由来のＲＮＡが検出された。
アデヒドを含んだ１％アガロースゲルで電気泳動し、ニ
トロセルロースＨＡＷＰフィルター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、５２０１−５２
０５（１９８０））に移した後、32ＰでラベルしたＨＩ
Ｖ−ＩのＤＮＡをプローブとしてハイブリダイズした。
その結果、各ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅからは、ＨＩＶ−
Ｉ由来のＲＮＡが検出された。
【００７６】（１）の結果と（２）の結果から、実施例
１（４）で得られた組み換えワクチニアウイルスには、
ＲＮＡのパッケージング能がないことがわかる。
１（４）で得られた組み換えワクチニアウイルスには、
ＲＮＡのパッケージング能がないことがわかる。
【００７７】実施例３ （１）組み換えプラスミドｐＮＺ−ＨＮＰの作製 実施例１（２）で得たｐＮＺ６８Ｋ２をＢａｍＨＩで消
化し、センダイウイルス（ＨＶＪ）のＮＰ遺伝子領域を
含む約２ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓａｒｃｈ、１１、７３１７−７３３０（１９
８３））とライゲーションして、得られた組み換えプラ
スミドをｐＮＺ−ＨＮＰ（約１０ｋｂｐ）と命名した。
化し、センダイウイルス（ＨＶＪ）のＮＰ遺伝子領域を
含む約２ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓａｒｃｈ、１１、７３１７−７３３０（１９
８３））とライゲーションして、得られた組み換えプラ
スミドをｐＮＺ−ＨＮＰ（約１０ｋｂｐ）と命名した。
【００７８】（２）組み換えプラスミドｐＮＺ−ＰＳ−
ＮＰｂの作製 （１）で得たｐＮＺ−ＨＮＰをＢａｍＨＩおよびＮａｅ
Ｉで消化し、このＮＰ遺伝子の上流に配列番号１に示す
４６ｂｐのＤＮＡの両端に合成リンカーを結合させた合
成ＤＮＡを挿入した。得られた組み換えプラスミドをｐ
ＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂと命名した。配列番号１記載の４６
ｂｐのＤＮＡは、ｐＮＬ４３に含まれているＨＩＶ−Ｉ
ゲノムの第７５１番目から第７９６番目の領域に相当す
る。
ＮＰｂの作製 （１）で得たｐＮＺ−ＨＮＰをＢａｍＨＩおよびＮａｅ
Ｉで消化し、このＮＰ遺伝子の上流に配列番号１に示す
４６ｂｐのＤＮＡの両端に合成リンカーを結合させた合
成ＤＮＡを挿入した。得られた組み換えプラスミドをｐ
ＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂと命名した。配列番号１記載の４６
ｂｐのＤＮＡは、ｐＮＬ４３に含まれているＨＩＶ−Ｉ
ゲノムの第７５１番目から第７９６番目の領域に相当す
る。
【００７９】なお、このｐＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂに組み込
まれた４６ｂｐのＤＮＡはＺｕｃｋｅｒ’ Ｆｏｌｄプ
ログラムを用いたコンピューターによる構造解析から、
図１に示すような二次構造（シュテム−ループ（ｓｔｅ
ｍ−ｌｏｏｐ）構造）をとることが明らかになった。
まれた４６ｂｐのＤＮＡはＺｕｃｋｅｒ’ Ｆｏｌｄプ
ログラムを用いたコンピューターによる構造解析から、
図１に示すような二次構造（シュテム−ループ（ｓｔｅ
ｍ−ｌｏｏｐ）構造）をとることが明らかになった。
【００８０】（３）ｐＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂ移入Ｖ−ｇａ
ｇ／ｐｏｌ−ｄＰ感染細胞上清でのレトロウイルス様粒
子の発現 実施例１（５）のＶ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰ感染細胞
に、ｐＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂをリン酸カルシウム沈降法に
より移入し、実施例２（２）と同様の条件下で細胞を培
養し、レトロウイルス様粒子を発現させた。その結果、
実施例１（５）で得られた粒子と同様の粒子が発現して
いることを確認した。
ｇ／ｐｏｌ−ｄＰ感染細胞上清でのレトロウイルス様粒
子の発現 実施例１（５）のＶ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰ感染細胞
に、ｐＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂをリン酸カルシウム沈降法に
より移入し、実施例２（２）と同様の条件下で細胞を培
養し、レトロウイルス様粒子を発現させた。その結果、
実施例１（５）で得られた粒子と同様の粒子が発現して
いることを確認した。
【００８１】（４）レトロウイルス様粒子内のＲＮＡの
確認 プローブとして32ＰでラベルしたＨＶＪのＮＰ遺伝子を
用いるほかは、実施例２の（１）と同様の方法のより、
ＮＰ遺伝子の存在を確認した。このように、粒子内にＮ
Ｐ遺伝子が内包されていることから、上記配列番号１に
示すＤＮＡ断片がパッケージング能を有するＲＮＡのｃ
ＤＮＡであることが確認された。
確認 プローブとして32ＰでラベルしたＨＶＪのＮＰ遺伝子を
用いるほかは、実施例２の（１）と同様の方法のより、
ＮＰ遺伝子の存在を確認した。このように、粒子内にＮ
Ｐ遺伝子が内包されていることから、上記配列番号１に
示すＤＮＡ断片がパッケージング能を有するＲＮＡのｃ
ＤＮＡであることが確認された。
【００８２】
【図１】ＲＮＡパッケージング能を有するＲＮＡのシュ
テム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を示した説明
図である。
テム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を示した説明
図である。
【図２】組み換えプラスミドｐＵＨＫの作製手順を示し
た説明図である。
た説明図である。
【図３】組み換えプラスミドｐＮＺ６８Ｋ２の作製手順
を示した説明図である。
を示した説明図である。
【図４】組み換えプラスミドｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−
ｄｐの作製手順を示した説明図である。
ｄｐの作製手順を示した説明図である。
【００８３】
配列番号：1 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA AGGAGAGAGA TGGGTG 46
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年７月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＲＮＡを内包しないレト
ロウイルス属に属するウイルスの開裂型ｇａｇタンパク
質から成るレトロウイルス様粒子、好ましくは、ＲＮＡ
を内包せず、ｅｎｖタンパク質を含まない開裂型ｇａｇ
タンパク質から成るレトロウイルス様粒子、その製造方
法、該粒子を有効成分とする抗レトロウイルス・ワクチ
ン、およびレトロウイルス属に属するウイルスのパッケ
ージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡに関する。
ロウイルス属に属するウイルスの開裂型ｇａｇタンパク
質から成るレトロウイルス様粒子、好ましくは、ＲＮＡ
を内包せず、ｅｎｖタンパク質を含まない開裂型ｇａｇ
タンパク質から成るレトロウイルス様粒子、その製造方
法、該粒子を有効成分とする抗レトロウイルス・ワクチ
ン、およびレトロウイルス属に属するウイルスのパッケ
ージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルスはエイズ、成人Ｔ細胞白
血病、癌、リューマチ等の多くの難病の病原ウイルスで
あると確認、または推定されている。とくに、最近、後
天性免疫不全症候群（エイズ）の発症、蔓延が世界的に
憂慮されており、その予防、治療対策が緊急課題となっ
ている。
血病、癌、リューマチ等の多くの難病の病原ウイルスで
あると確認、または推定されている。とくに、最近、後
天性免疫不全症候群（エイズ）の発症、蔓延が世界的に
憂慮されており、その予防、治療対策が緊急課題となっ
ている。
【０００３】レトロウイルス粒子は、多くのタンパク質
で構成されている。例えば、感染に関与する外皮糖タン
パク質（ｅｎｖタンパク質）、レトロウイルスの酵素群
であるｐｏｌタンパク質（逆転写酵素、プロテアーゼ、
エンドヌクレアーゼの存在が知られている）、核タンパ
ク質（ｇａｇタンパク質）などがある。
で構成されている。例えば、感染に関与する外皮糖タン
パク質（ｅｎｖタンパク質）、レトロウイルスの酵素群
であるｐｏｌタンパク質（逆転写酵素、プロテアーゼ、
エンドヌクレアーゼの存在が知られている）、核タンパ
ク質（ｇａｇタンパク質）などがある。
【０００４】効果的なエイズワクチンを得ようとする場
合には、ウイルスを中和し得る抗体を誘導するのに適当
な抗原を含んでいることが必要である。そのような抗原
としてｅｎｖタンパク質、特に感染能力に関係するとさ
れるｅｎｖタンパク質の一種であるｇｐ１２０（セル
（Ｃｅｌｌ）、５３、４８３（１９８８））がその最有
力候補として選ばれ、この抗原タンパク質をコードする
遺伝子を大腸菌に組み換える遺伝子操作技術により産生
する研究（例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２
２８、９３−９６（１９８５））などが既に行われてい
る。
合には、ウイルスを中和し得る抗体を誘導するのに適当
な抗原を含んでいることが必要である。そのような抗原
としてｅｎｖタンパク質、特に感染能力に関係するとさ
れるｅｎｖタンパク質の一種であるｇｐ１２０（セル
（Ｃｅｌｌ）、５３、４８３（１９８８））がその最有
力候補として選ばれ、この抗原タンパク質をコードする
遺伝子を大腸菌に組み換える遺伝子操作技術により産生
する研究（例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２
２８、９３−９６（１９８５））などが既に行われてい
る。
【０００５】しかし、種々の患者や感染者から分離され
たエイズの病原ウイルスとされているＨＩＶ（ｈｕｍａ
ｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）
のゲノム塩基配列の解析結果より、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝
子は極めて変異が激しいことが明らかとなり（サイエン
ティフィック・アメリカン（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍ
ｅｒｉｃａｎ）、２５３、８４−９３（１９８５））、
この部位を利用する手法では全てのＨＩＶに対応できな
い可能性がある。
たエイズの病原ウイルスとされているＨＩＶ（ｈｕｍａ
ｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）
のゲノム塩基配列の解析結果より、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝
子は極めて変異が激しいことが明らかとなり（サイエン
ティフィック・アメリカン（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍ
ｅｒｉｃａｎ）、２５３、８４−９３（１９８５））、
この部位を利用する手法では全てのＨＩＶに対応できな
い可能性がある。
【０００６】これに対し、ウイルス粒子の骨組みとなる
ｇａｇタンパク質をコードする遺伝子や逆転写酵素等を
コードしているｐｏｌ遺伝子は変異の起こる確率が低い
と考えられるため、それらの遺伝子産物を抗原とするワ
クチンは有利であるとして、逆転写酵素を大腸菌に組み
換える遺伝子操作によって産生する研究（例えば、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３６、３０５−３０８
（１９８７））、ｇａｇ−ｐ５５やｐ２４などを組み換
え多核体ウイルスの系で産生する研究（例えば、ヴィロ
ロジー（ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１５８、２４８−２５０
（１９８７））、ｐ１７の抗原決定部位に特異的に結合
する抗体と結合するポリペプチドを合成する研究（特開
昭６３−２７４９８号）、ｐ１７の単クローン抗体がエ
イズの中和活性を有するという報告（ジャーナル・オブ
・ヴィロロジー（Ｊ．ｖｉｒｏｌ．）、６３、２６７−
２７２（１９８９））なども行われた。
ｇａｇタンパク質をコードする遺伝子や逆転写酵素等を
コードしているｐｏｌ遺伝子は変異の起こる確率が低い
と考えられるため、それらの遺伝子産物を抗原とするワ
クチンは有利であるとして、逆転写酵素を大腸菌に組み
換える遺伝子操作によって産生する研究（例えば、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３６、３０５−３０８
（１９８７））、ｇａｇ−ｐ５５やｐ２４などを組み換
え多核体ウイルスの系で産生する研究（例えば、ヴィロ
ロジー（ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１５８、２４８−２５０
（１９８７））、ｐ１７の抗原決定部位に特異的に結合
する抗体と結合するポリペプチドを合成する研究（特開
昭６３−２７４９８号）、ｐ１７の単クローン抗体がエ
イズの中和活性を有するという報告（ジャーナル・オブ
・ヴィロロジー（Ｊ．ｖｉｒｏｌ．）、６３、２６７−
２７２（１９８９））なども行われた。
【０００７】また、本発明者らも、ｇａｇ遺伝子、およ
びｐｏｌ遺伝子を組み込んだワクチニアウイルスについ
て研究した結果、ウイルス・ベクターを感染させた細胞
中で、レトロウイルスのｅｎｖタンパク質を発現させず
に、ｇａｇタンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現
させることによって、開裂型のｇａｇタンパク質が発現
し、その開裂型ｇａｇタンパク質により構成されるレト
ロウイルスのコア構造物粒子が得られることを見いだし
た（特開平３−７２８７４号）。
びｐｏｌ遺伝子を組み込んだワクチニアウイルスについ
て研究した結果、ウイルス・ベクターを感染させた細胞
中で、レトロウイルスのｅｎｖタンパク質を発現させず
に、ｇａｇタンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現
させることによって、開裂型のｇａｇタンパク質が発現
し、その開裂型ｇａｇタンパク質により構成されるレト
ロウイルスのコア構造物粒子が得られることを見いだし
た（特開平３−７２８７４号）。
【０００８】このコア構造物粒子はｅｎｖタンパク質が
ないために感染性を有しないが、その後の研究により、
この粒子内にＲＮＡを内包していることが判明した。そ
のため、この粒子をワクチンとしてヒトに接種した場
合、ヒトの体内でレトロウイルスが構築されてしまう危
険性が皆無とはいえず、安全性の点でより改善すること
が望まれていた。
ないために感染性を有しないが、その後の研究により、
この粒子内にＲＮＡを内包していることが判明した。そ
のため、この粒子をワクチンとしてヒトに接種した場
合、ヒトの体内でレトロウイルスが構築されてしまう危
険性が皆無とはいえず、安全性の点でより改善すること
が望まれていた。
【０００９】一方、このようなレトロウイルスには、ウ
イルス内にＲＮＡを内包するかどうかを制御している遺
伝子があることが予想されていた（サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ），２２９，１３８８−１３９０（１９８
５））が、どの様な配列のものが該当する遺伝子である
か確認されておらず、また、粒子内へのＲＮＡのパッケ
ージング機構についても知られていなかった。このた
め、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様粒子を得るこ
とはできなかった。
イルス内にＲＮＡを内包するかどうかを制御している遺
伝子があることが予想されていた（サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ），２２９，１３８８−１３９０（１９８
５））が、どの様な配列のものが該当する遺伝子である
か確認されておらず、また、粒子内へのＲＮＡのパッケ
ージング機構についても知られていなかった。このた
め、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様粒子を得るこ
とはできなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、より安
全なワクチンを供給するべく鋭意研究の結果、ウイルス
・ベクターを感染させた細胞中で、パッケージング能を
有するＲＮＡのｃＤＮＡを含まず、ｇａｇ遺伝子、およ
びｐｏｌ遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだウイルス・ベク
ターを用いることによって、開裂型ｇａｇタンパク質に
より構成される、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様
粒子が得られることを見いだし、本発明を完成するに至
った。
全なワクチンを供給するべく鋭意研究の結果、ウイルス
・ベクターを感染させた細胞中で、パッケージング能を
有するＲＮＡのｃＤＮＡを含まず、ｇａｇ遺伝子、およ
びｐｏｌ遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだウイルス・ベク
ターを用いることによって、開裂型ｇａｇタンパク質に
より構成される、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様
粒子が得られることを見いだし、本発明を完成するに至
った。
【００１１】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、第一の発明として少なくとも開裂型ｇａｇタンパク
質を含み、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様粒子が
提供される。
ば、第一の発明として少なくとも開裂型ｇａｇタンパク
質を含み、ＲＮＡを内包しないレトロウイルス様粒子が
提供される。
【００１２】また、第二の発明としてパッケージング能
を有するＲＮＡのｃＤＮＡを含まず、レトロウイルス由
来の少なくともｇａｇ遺伝子のｃＤＮＡ、およびｐｏｌ
遺伝子のｃＤＮＡをウイルスの増殖に非必須なゲノム領
域に組み込んだウイルス・ベクターを感染させた細胞を
培養し、開裂型ｇａｇタンパク質により構成されたＲＮ
Ａを内包しないレトロウイルス様粒子の製造方法が提供
される。
を有するＲＮＡのｃＤＮＡを含まず、レトロウイルス由
来の少なくともｇａｇ遺伝子のｃＤＮＡ、およびｐｏｌ
遺伝子のｃＤＮＡをウイルスの増殖に非必須なゲノム領
域に組み込んだウイルス・ベクターを感染させた細胞を
培養し、開裂型ｇａｇタンパク質により構成されたＲＮ
Ａを内包しないレトロウイルス様粒子の製造方法が提供
される。
【００１３】さらに、第三の発明として少なくとも開裂
型ｇａｇタンパク質を含み、ＲＮＡを内包しないレトロ
ウイルス様粒子を有効成分とする抗レトロウイルス・ワ
クチンが提供される。
型ｇａｇタンパク質を含み、ＲＮＡを内包しないレトロ
ウイルス様粒子を有効成分とする抗レトロウイルス・ワ
クチンが提供される。
【００１４】そして、第四の発明としてレトロウイルス
に属するウイルスのＲＮＡパッケージング能を有するＲ
ＮＡのｃＤＮＡが提供される。
に属するウイルスのＲＮＡパッケージング能を有するＲ
ＮＡのｃＤＮＡが提供される。
【００１５】本発明のレトロウイルス様粒子は、ＲＮＡ
を内包せず、かつ開裂型ｇａｇタンパク質から成る粒子
である。この粒子は、本発明の粒子は逆転写酵素等のｐ
ｏｌタンパク質を内包していると考えられるが、粒子を
形成する限り、ｐｏｌタンパク質の存在の有無は特に問
題はない。しかし、ｐｏｌタンパク質がある方が高い抗
原性が期待される。
を内包せず、かつ開裂型ｇａｇタンパク質から成る粒子
である。この粒子は、本発明の粒子は逆転写酵素等のｐ
ｏｌタンパク質を内包していると考えられるが、粒子を
形成する限り、ｐｏｌタンパク質の存在の有無は特に問
題はない。しかし、ｐｏｌタンパク質がある方が高い抗
原性が期待される。
【００１６】本発明においてウイルス・ベクターに組み
込まれる遺伝子はレトロウイルス属に属するウイルス由
来のものである。レトロウイルス属に属するウイルスは
特に限定されないが、具体的にはオンコウイルス亜科に
属するウイルス、レンチウイルス亜科に属するウイルス
などが挙げられ、さらに具体的にはオンコウイルス亜科
に属するＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩなど、レンチウ
イルス亜科に属するＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩなどが挙
げられる。
込まれる遺伝子はレトロウイルス属に属するウイルス由
来のものである。レトロウイルス属に属するウイルスは
特に限定されないが、具体的にはオンコウイルス亜科に
属するウイルス、レンチウイルス亜科に属するウイルス
などが挙げられ、さらに具体的にはオンコウイルス亜科
に属するＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩなど、レンチウ
イルス亜科に属するＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩなどが挙
げられる。
【００１７】本発明において、ウイルス・ベクターに組
み込まれるレトロウイルスのｃＤＮＡは、ウイルス・ベ
クターを感染させる細胞において、少なくともｇａｇタ
ンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現し、かつパッ
ケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡを欠失したもの
であれば、特に限定されない。
み込まれるレトロウイルスのｃＤＮＡは、ウイルス・ベ
クターを感染させる細胞において、少なくともｇａｇタ
ンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現し、かつパッ
ケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡを欠失したもの
であれば、特に限定されない。
【００１８】このようなｃＤＮＡは、例えば、ｐＮＬ４
３（ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．）、５９、２、２８４（１９８６））などのよう
に、エイズ患者の染色体にプロウイルスの形で組み込ま
れたＨＩＶ−Ｉを一旦λファージなどを用いてクローニ
ングし、それを用いてＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むプ
ラスミドを構築するか、あるいは、患者より分離したＨ
ＩＶ−ＩのＲＮＡゲノムを逆転写してｃＤＮＡに変換
し、その後、プラスミドに移してＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮ
Ａを含むプラスミドを構築し、得られたプラスミドを適
当な制限酵素で切断することによって得ることができ
る。
３（ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．）、５９、２、２８４（１９８６））などのよう
に、エイズ患者の染色体にプロウイルスの形で組み込ま
れたＨＩＶ−Ｉを一旦λファージなどを用いてクローニ
ングし、それを用いてＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むプ
ラスミドを構築するか、あるいは、患者より分離したＨ
ＩＶ−ＩのＲＮＡゲノムを逆転写してｃＤＮＡに変換
し、その後、プラスミドに移してＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮ
Ａを含むプラスミドを構築し、得られたプラスミドを適
当な制限酵素で切断することによって得ることができ
る。
【００１９】ここで、パッケージング能とは、レトロウ
イルス様粒子内にＲＮＡを内包する機能をいい、このパ
ッケージング能を有するＲＮＡ配列をパッケージングシ
グナルという。
イルス様粒子内にＲＮＡを内包する機能をいい、このパ
ッケージング能を有するＲＮＡ配列をパッケージングシ
グナルという。
【００２０】パッケージングシグナルのＲＮＡ配列は、
本発明者によってはじめて見いだされたものであり、そ
のｃＤＮＡの具体例は、配列番号１に示すものである。
このｃＤＮＡは、前述のプラスミドｐＮＬ４３に組み込
まれているＨＩＶ由来の遺伝子のｃＤＮＡのｇａｇの開
始コドンの上流３９ｂｐとｇａｇの開始コドンを含む７
ｂｐの計４６ｂｐに相当する。
本発明者によってはじめて見いだされたものであり、そ
のｃＤＮＡの具体例は、配列番号１に示すものである。
このｃＤＮＡは、前述のプラスミドｐＮＬ４３に組み込
まれているＨＩＶ由来の遺伝子のｃＤＮＡのｇａｇの開
始コドンの上流３９ｂｐとｇａｇの開始コドンを含む７
ｂｐの計４６ｂｐに相当する。
【００２１】パッケージング能を有するＲＮＡは、いわ
ゆるシュテム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造とい
う二次構造を形成することにより機能すると考えられ
る。そのような二次構造の具体例としては、配列番号１
のｃＤＮＡに対応するＲＮＡ配列によって形成される図
１に示すものがある。ＲＮＡがシュテム−ループ（ｓｔ
ｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成しない場合、パッケージン
グ能を持たないことがある。
ゆるシュテム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造とい
う二次構造を形成することにより機能すると考えられ
る。そのような二次構造の具体例としては、配列番号１
のｃＤＮＡに対応するＲＮＡ配列によって形成される図
１に示すものがある。ＲＮＡがシュテム−ループ（ｓｔ
ｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成しない場合、パッケージン
グ能を持たないことがある。
【００２２】パッケージングシグナルの二次構造がシュ
テム−ループ構造をとり得るかどうかは、Ｚｕｃｋｅ
ｒ’ Ｆｏｌｄプログラムを用いたコンピューターによ
る構造解析（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓａｒ
ｃｈ、９、１３３−１４８（１９８１））などからわか
る。
テム−ループ構造をとり得るかどうかは、Ｚｕｃｋｅ
ｒ’ Ｆｏｌｄプログラムを用いたコンピューターによ
る構造解析（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓａｒ
ｃｈ、９、１３３−１４８（１９８１））などからわか
る。
【００２３】パッケージングシグナルの一部が欠損した
り、修飾されたりすることで、パッケージング能を失っ
たＲＮＡのｃＤＮＡは本願のパッケージングシグナルの
ｃＤＮＡ（以下、シグナルｃＤＮＡという）ではなく、
このようなｃＤＮＡを含んでいても本発明の粒子を製造
するに当たり、問題はない。ただし、欠損したり、修飾
されたりした部分がパッケージングシグナルのうちｇａ
ｇ遺伝子をコードする部分である場合、ｇａｇタンパク
質を発現しない可能性も考えられる。
り、修飾されたりすることで、パッケージング能を失っ
たＲＮＡのｃＤＮＡは本願のパッケージングシグナルの
ｃＤＮＡ（以下、シグナルｃＤＮＡという）ではなく、
このようなｃＤＮＡを含んでいても本発明の粒子を製造
するに当たり、問題はない。ただし、欠損したり、修飾
されたりした部分がパッケージングシグナルのうちｇａ
ｇ遺伝子をコードする部分である場合、ｇａｇタンパク
質を発現しない可能性も考えられる。
【００２４】しかし、改変によりパッケージング能を失
ったシグナルｃＤＮＡであっても、変異などによりパッ
ケージング能を回復する可能性があることから、シグナ
ルｃＤＮＡの塩基配列を改変したものは含んでいないこ
とが好ましい。
ったシグナルｃＤＮＡであっても、変異などによりパッ
ケージング能を回復する可能性があることから、シグナ
ルｃＤＮＡの塩基配列を改変したものは含んでいないこ
とが好ましい。
【００２５】本発明に用いるウイルス・ベクターも動物
細胞に感染し、ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子を発
現できるものであれば、特に限定されない。例えば、ワ
クチニアウイルス、アビポックスウイルス、バキュロウ
イルスなどが挙げられる。
細胞に感染し、ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子を発
現できるものであれば、特に限定されない。例えば、ワ
クチニアウイルス、アビポックスウイルス、バキュロウ
イルスなどが挙げられる。
【００２６】本発明に用いるウイルス・ベクターの構築
方法も、特に限定されない。例えば、ウイルス・ベクタ
ーとしてワクチニアウイルスを用いる場合には、組み込
む遺伝子をかえること以外、特開平１−７４９８２号に
記載された方法に準じて構築することができる。
方法も、特に限定されない。例えば、ウイルス・ベクタ
ーとしてワクチニアウイルスを用いる場合には、組み込
む遺伝子をかえること以外、特開平１−７４９８２号に
記載された方法に準じて構築することができる。
【００２７】また、ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子
のｃＤＮＡを一緒にウイルス・ベクターに組み込む代わ
りに、別のウイルス・ベクターに組み込むこともでき
る。もちろん、その場合にもシグナルｃＤＮＡを欠損し
たものが用いられる。本発明では、そのようなウイルス
・ベクターを、動物培養細胞に感染させ、その培養上清
中にｇａｇタンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現
させる。
のｃＤＮＡを一緒にウイルス・ベクターに組み込む代わ
りに、別のウイルス・ベクターに組み込むこともでき
る。もちろん、その場合にもシグナルｃＤＮＡを欠損し
たものが用いられる。本発明では、そのようなウイルス
・ベクターを、動物培養細胞に感染させ、その培養上清
中にｇａｇタンパク質、およびｐｏｌタンパク質を発現
させる。
【００２８】双方を一緒に組み込んだものであれば同時
に双方を発現するが、片方ずつを組み込んだものを用い
るときは、二つのベクターを同時に感染させる。二つの
タンパク質が発現することによりｇａｇタンパク質は開
裂型となる。
に双方を発現するが、片方ずつを組み込んだものを用い
るときは、二つのベクターを同時に感染させる。二つの
タンパク質が発現することによりｇａｇタンパク質は開
裂型となる。
【００２９】ここで発現されるｇａｇタンパク質の開裂
はプロテアーゼ活性を有するｐｏｌタンパク質によるも
のと考えられる。
はプロテアーゼ活性を有するｐｏｌタンパク質によるも
のと考えられる。
【００３０】本発明で用いる動物培養細胞はウイルス・
ベクターが増殖可能なものであればよく、その具体例と
して、ウイルス・ベクターがワクチニアウイルスである
場合は、例えばＴＫ−１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＦＬ
（ヒト羊膜由来）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚部癌由来）、
ＫＢ（ヒト鼻咽喉癌由来）、ＲＫ１３（ウサギ腎由
来）、ＣＶ−１（サル腎由来）、ＢＳＣ−１（サル腎由
来）、Ｌ９２９（マウス結合組織由来）、ＣＥ（ニワト
リ胚）細胞、ＣＥＦ（ニワトリ胎児繊維芽細胞）、ＳＷ
４８０（ヒト結腸ガン由来）などが例示される。
ベクターが増殖可能なものであればよく、その具体例と
して、ウイルス・ベクターがワクチニアウイルスである
場合は、例えばＴＫ−１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＦＬ
（ヒト羊膜由来）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚部癌由来）、
ＫＢ（ヒト鼻咽喉癌由来）、ＲＫ１３（ウサギ腎由
来）、ＣＶ−１（サル腎由来）、ＢＳＣ−１（サル腎由
来）、Ｌ９２９（マウス結合組織由来）、ＣＥ（ニワト
リ胚）細胞、ＣＥＦ（ニワトリ胎児繊維芽細胞）、ＳＷ
４８０（ヒト結腸ガン由来）などが例示される。
【００３１】ウイルス・ベクターがアビポックスウイル
スである場合は、本発明で用いる動物培養細胞としては
鶏胚用繊維芽細胞などの鶏由来細胞などが例示される
が、発育鶏卵漿尿膜なども含む。ウイルス・ベクターが
バキュロウイルスの場合は、例えばスポドプテラ・フル
ギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｒｕｇｉｐｅｒ
ｄａ）由来のＳｆ９株などが例示される。
スである場合は、本発明で用いる動物培養細胞としては
鶏胚用繊維芽細胞などの鶏由来細胞などが例示される
が、発育鶏卵漿尿膜なども含む。ウイルス・ベクターが
バキュロウイルスの場合は、例えばスポドプテラ・フル
ギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｒｕｇｉｐｅｒ
ｄａ）由来のＳｆ９株などが例示される。
【００３２】しかし、一般的な培養条件においては、用
いる細胞によっては開裂型ｇａｇタンパク質の発現量が
低く、例えばＣＶ−１にＨＩＶ−Ｉの遺伝子を組み込ん
だワクチニアウイルスを感染させた場合には、開裂型ｇ
ａｇタンパク質はほどんど発現が認められない。開裂型
ｇａｇタンパク質の発現量が多いウイルス・ベクターと
動物培養細胞の組み合せが好ましく、そのような例とし
てはＨＩＶ−Ｉの遺伝子を組み込んだワクチニアウイル
スをＳＷ４８０に感染させる場合がある。
いる細胞によっては開裂型ｇａｇタンパク質の発現量が
低く、例えばＣＶ−１にＨＩＶ−Ｉの遺伝子を組み込ん
だワクチニアウイルスを感染させた場合には、開裂型ｇ
ａｇタンパク質はほどんど発現が認められない。開裂型
ｇａｇタンパク質の発現量が多いウイルス・ベクターと
動物培養細胞の組み合せが好ましく、そのような例とし
てはＨＩＶ−Ｉの遺伝子を組み込んだワクチニアウイル
スをＳＷ４８０に感染させる場合がある。
【００３３】培養上清からの粒子の精製は特に限定され
ない。例えば、常法（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２２４、４９７−５００（１９８４））に従って、上清
をショ糖、あるいは酒石酸カリウム密度勾配遠心を行
い、さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心を行うち、
これらのタンパク質がレトロウイルス様粒子を形成し
て、回収される。
ない。例えば、常法（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２２４、４９７−５００（１９８４））に従って、上清
をショ糖、あるいは酒石酸カリウム密度勾配遠心を行
い、さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心を行うち、
これらのタンパク質がレトロウイルス様粒子を形成し
て、回収される。
【００３４】開裂型ｇａｇタンパク質により構成される
レトロウイルス様粒子は、例えば、レトロウイルスがＨ
ＩＶ−Ｉで、比重により分画した場合、比重がＨＩＶ−
Ｉ粒子と同じ約１．１５のフラクションに認められる。
レトロウイルス様粒子は、例えば、レトロウイルスがＨ
ＩＶ−Ｉで、比重により分画した場合、比重がＨＩＶ−
Ｉ粒子と同じ約１．１５のフラクションに認められる。
【００３５】精製の各段階においてどのフラクション中
にレトロウイルス様粒子が存在するかの確認の方法は特
に限定されない。例えば、ｇａｇタンパク質に対する抗
体を使う方法や逆転写酵素活性を測定する方法がある。
にレトロウイルス様粒子が存在するかの確認の方法は特
に限定されない。例えば、ｇａｇタンパク質に対する抗
体を使う方法や逆転写酵素活性を測定する方法がある。
【００３６】本発明の開裂型ｇａｇタンパク質により構
成される粒子は逆転写酵素を内包していても内包してい
なくてもかまわないが、通常、少なくとも一部は逆転写
酵素を内包する。従って、逆転写酵素活性を測定すれ
ば、本発明の粒子を含むフラクションは判別できる。
成される粒子は逆転写酵素を内包していても内包してい
なくてもかまわないが、通常、少なくとも一部は逆転写
酵素を内包する。従って、逆転写酵素活性を測定すれ
ば、本発明の粒子を含むフラクションは判別できる。
【００３７】逆転写酵素活性の測定は常法に従えばよ
い。例えば、微生物学実習提要（東京大学医科学研究所
学友会編、丸善より発行、１９８８年）の記述に準じて
組み換えウイルス感染細胞上清をｐｏｌｙ−Ａを鋳型、
ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーとして、３２Ｐ−ｄＴＴ
Ｐの酸不溶性画分への取り込みを測定すればよい。
い。例えば、微生物学実習提要（東京大学医科学研究所
学友会編、丸善より発行、１９８８年）の記述に準じて
組み換えウイルス感染細胞上清をｐｏｌｙ−Ａを鋳型、
ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーとして、３２Ｐ−ｄＴＴ
Ｐの酸不溶性画分への取り込みを測定すればよい。
【００３８】本発明の粒子はウイルス遺伝子を含まない
ために増殖性がなく、病原性を示さない。一方、この粒
子は、少なくとも開裂型ｇａｇタンパク質によりその構
造が形成されているために抗原性を有する。
ために増殖性がなく、病原性を示さない。一方、この粒
子は、少なくとも開裂型ｇａｇタンパク質によりその構
造が形成されているために抗原性を有する。
【００３９】また、ｇａｇタンパク質やｐｏｌタンパク
質はｅｎｖタンパク質に比べて変異が少ないと考えられ
る。したがって、少なくともｇａｇタンパク質が存在す
るために、本発明の粒子の抗原性は安定している。
質はｅｎｖタンパク質に比べて変異が少ないと考えられ
る。したがって、少なくともｇａｇタンパク質が存在す
るために、本発明の粒子の抗原性は安定している。
【００４０】さらに、本発明のレトロウイルス様粒子
は、自然界のレトロウイルス粒子、またはその一部であ
るレトロウイルス・コア構造粒子と同一または類似の構
造を有していることから、レトロウイルス様粒子を形成
していないｅｎｖタンパク質、ｇａｇタンパク質、ｐｏ
ｌタンパク質、あるいはその単なる混合物以上の抗原性
も期待できる。
は、自然界のレトロウイルス粒子、またはその一部であ
るレトロウイルス・コア構造粒子と同一または類似の構
造を有していることから、レトロウイルス様粒子を形成
していないｅｎｖタンパク質、ｇａｇタンパク質、ｐｏ
ｌタンパク質、あるいはその単なる混合物以上の抗原性
も期待できる。
【００４１】しかし、ｅｎｖタンパク質であるｇｐ１２
０は感染の際にウイルス粒子を細胞膜に固定化する機能
を有し、ｇｐ４１はウイルス遺伝子を細胞内へ侵入させ
る機能を有するため、より安全なワクチンを得るために
は、粒子にｅｎｖタンパク質が含まれていないことが好
ましい。
０は感染の際にウイルス粒子を細胞膜に固定化する機能
を有し、ｇｐ４１はウイルス遺伝子を細胞内へ侵入させ
る機能を有するため、より安全なワクチンを得るために
は、粒子にｅｎｖタンパク質が含まれていないことが好
ましい。
【００４２】本発明でいうｅｎｖタンパク質とは、レト
ロウイルスの感染、病原性を司るｅｎｖタンパク質、お
よびその変異物や改変物をいい、感染への影響力、病原
性を失ったｅｎｖタンパク質の改変物等を意味しない。
ロウイルスの感染、病原性を司るｅｎｖタンパク質、お
よびその変異物や改変物をいい、感染への影響力、病原
性を失ったｅｎｖタンパク質の改変物等を意味しない。
【００４３】本発明の粒子のうち、ｅｎｖタンパク質を
含まない粒子は、ｅｎｖ遺伝子を含まないウイルス・ベ
クターを用いることによって得ることができる。また、
ｅｎｖタンパク質をコードしている遺伝子のすぐ上流に
終止コドンを組み込ませる等の処理によりｅｎｖタンパ
ク質が発現できないようにしたウイルス・ベクターを用
いることによって得ることができる。
含まない粒子は、ｅｎｖ遺伝子を含まないウイルス・ベ
クターを用いることによって得ることができる。また、
ｅｎｖタンパク質をコードしている遺伝子のすぐ上流に
終止コドンを組み込ませる等の処理によりｅｎｖタンパ
ク質が発現できないようにしたウイルス・ベクターを用
いることによって得ることができる。
【００４４】本発明でいうｅｎｖ遺伝子を含まないと
は、ｅｎｖタンパク質をコードしている遺伝子を発現し
得る形で含まないことを意味し、レトロウイルスの感
染、病原性に関係のないｅｎｖ遺伝子由来の遺伝子（ｅ
ｎｖ遺伝子の一部やｅｎｖ遺伝子の改変物等）を含んで
いても構わない。
は、ｅｎｖタンパク質をコードしている遺伝子を発現し
得る形で含まないことを意味し、レトロウイルスの感
染、病原性に関係のないｅｎｖ遺伝子由来の遺伝子（ｅ
ｎｖ遺伝子の一部やｅｎｖ遺伝子の改変物等）を含んで
いても構わない。
【００４５】
【発明の効果】本発明のレトロウイルス様粒子は、レト
ロウイルス粒子、またはその一部であるレトロウイルス
・コア構造物粒子の構造と同一または類似の構造を持つ
が、レトロウイルスの遺伝子を含まないために増殖性を
持たないことから、これを有効成分とすることにより、
安全生の高い、有効な抗レトロウイルス・ワクチンが期
待できる。また、本発明のレトロウイルス様粒子の製造
方法によれば、効率よく本発明のレトロウイルス様粒子
を得ることができる。
ロウイルス粒子、またはその一部であるレトロウイルス
・コア構造物粒子の構造と同一または類似の構造を持つ
が、レトロウイルスの遺伝子を含まないために増殖性を
持たないことから、これを有効成分とすることにより、
安全生の高い、有効な抗レトロウイルス・ワクチンが期
待できる。また、本発明のレトロウイルス様粒子の製造
方法によれば、効率よく本発明のレトロウイルス様粒子
を得ることができる。
【００４６】さらに、本発明のパッケージングシグナル
はパッケージング能を支配することから、この部分のｃ
ＤＮＡから組み込む遺伝子を除去することにより、ＲＮ
Ａを含まないタンパク質の産生を可能にする一方、パッ
ケージングシグナルを意図的に組み込むことによって、
粒子内に所望のＲＮＡを内包させることができ（後述の
実施例３参照）、例えば、生体に感染したＲＮＡウイル
スのアンチセンスＲＮＡを内包した粒子を製造すれば、
ウイルスＲＮＡと二重鎖を形成し、ウイルスＲＮＡの発
現が抑制される。
はパッケージング能を支配することから、この部分のｃ
ＤＮＡから組み込む遺伝子を除去することにより、ＲＮ
Ａを含まないタンパク質の産生を可能にする一方、パッ
ケージングシグナルを意図的に組み込むことによって、
粒子内に所望のＲＮＡを内包させることができ（後述の
実施例３参照）、例えば、生体に感染したＲＮＡウイル
スのアンチセンスＲＮＡを内包した粒子を製造すれば、
ウイルスＲＮＡと二重鎖を形成し、ウイルスＲＮＡの発
現が抑制される。
【００４７】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。なお、実施例、比較例、および参考例中の
部、および％はとくに断りのないかぎり重量基準であ
る。
に説明する。なお、実施例、比較例、および参考例中の
部、および％はとくに断りのないかぎり重量基準であ
る。
【００４８】実施例１ （１）組み換えベクターｐＵＨＫの作製（図２参照） ｐＵＣ９（ファルマシア社製）をＥｃｏＲＩ、およびＰ
ｓｔＩで消化後、ポリメラーゼで処理し、切断端を平滑
末端とした後、両端を連結し、ＥｃｏＲＩ部位が欠損し
たｐＵＣ９’を作製した。このｐＵＣ９’をＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断後、ワクチニアウイルスＴＫ遺伝子を含むワ
クチニアウイルスＷＲ株のＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片を連
結し、得られた約７．７ｋｂｐの組み換えベクターｐＵ
ＨＫをと命名した。
ｓｔＩで消化後、ポリメラーゼで処理し、切断端を平滑
末端とした後、両端を連結し、ＥｃｏＲＩ部位が欠損し
たｐＵＣ９’を作製した。このｐＵＣ９’をＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断後、ワクチニアウイルスＴＫ遺伝子を含むワ
クチニアウイルスＷＲ株のＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片を連
結し、得られた約７．７ｋｂｐの組み換えベクターｐＵ
ＨＫをと命名した。
【００４９】（２）組み換えベクターｐＮＺ６８Ｋ２の
作製（図３参照） ワクチニアウイルスＷＲ株の７．５Ｋプロモーター（モ
スら（Ｍｏｓｓ ｅｔ．ａｌ）、セル（ｃｅｌｌ）、１
２５、８０５−８１３（１９８１））をｐＵＣ１９（フ
ァルマシア社製）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した後、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで順次切断して、７．５Ｋプ
ロモーターの前後にポリリンカー部位を有する約３５０
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
作製（図３参照） ワクチニアウイルスＷＲ株の７．５Ｋプロモーター（モ
スら（Ｍｏｓｓ ｅｔ．ａｌ）、セル（ｃｅｌｌ）、１
２５、８０５−８１３（１９８１））をｐＵＣ１９（フ
ァルマシア社製）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した後、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで順次切断して、７．５Ｋプ
ロモーターの前後にポリリンカー部位を有する約３５０
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００５０】このＤＮＡ断片のＳ１ヌクレアーゼ処理し
たものと、（１）で得たプラスミドｐＵＨＫのＥｃｏＲ
Ｉ消化物をポリメラーゼ処理したものとを連結し、得ら
れた約８ｋｂｐの組み換えプラスミドをｐＮＺ６８Ｋ２
と命名した。
たものと、（１）で得たプラスミドｐＵＨＫのＥｃｏＲ
Ｉ消化物をポリメラーゼ処理したものとを連結し、得ら
れた約８ｋｂｐの組み換えプラスミドをｐＮＺ６８Ｋ２
と命名した。
【００５１】（３）組み換えプラスミドｐＮＺ−ｇａｇ
／ｐｏｌ−ｄＰの作製（図４参照） ＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むｐＮＬ４３をＢｇｌＩＩ
とＥｃｏＲＩで消化後、低融点アガロース電気泳動で約
５．１ｋｂｐの断片を分離し、フェノール抽出によりそ
の断片を回収した。
／ｐｏｌ−ｄＰの作製（図４参照） ＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むｐＮＬ４３をＢｇｌＩＩ
とＥｃｏＲＩで消化後、低融点アガロース電気泳動で約
５．１ｋｂｐの断片を分離し、フェノール抽出によりそ
の断片を回収した。
【００５２】この断片をさらにＭｎｌＩで消化後、低融
点アガロース電気泳動で約５ｋｂｐの断片を分離し、フ
ェノール抽出によりその断片を回収した。
点アガロース電気泳動で約５ｋｂｐの断片を分離し、フ
ェノール抽出によりその断片を回収した。
【００５３】この断片中には図４に示すように、ｇａｇ
遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子領域が含まれているが、
（ｇａｇ遺伝子の開始コドン上流の）スプライシングド
ナー部位、およびシグナルｃＤＮＡと思われる部分を含
む８４ｂｐを除去した断片である。
遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子領域が含まれているが、
（ｇａｇ遺伝子の開始コドン上流の）スプライシングド
ナー部位、およびシグナルｃＤＮＡと思われる部分を含
む８４ｂｐを除去した断片である。
【００５４】実施例１（２）で得たｐＮＺ６８Ｋ２をＳ
ｍａＩとＥｃｏＲＩで消化した後、先に得た約５ｋｂｐ
のＤＮＡ断片と連結して約１３ｋｂｐの組み換えプラス
ミドｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを得た。
ｍａＩとＥｃｏＲＩで消化した後、先に得た約５ｋｂｐ
のＤＮＡ断片と連結して約１３ｋｂｐの組み換えプラス
ミドｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを得た。
【００５５】（４）組み換えワクチニアウイルスの作出 ２５ｃｍ２のカルチャーボトルでＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥ
Ｍを培地として培養されたＣＶ−１細胞に、ワクチニア
ウイルスＷＲ株を０．１ｐ．ｆ．ｕ．／細胞接種し、４
５分ｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを２．２ｍｌの滅菌
水で溶かし、樋高ら（蛋白質・核酸・酵素、２７、３４
０（１９８５））の方法によって、ＤＮＡ−リン酸カル
シウム共沈物をつくり、その０．５ｍｌを感染ＣＶ−１
細胞上に滴下した。３０分間、３７℃、５％ ＣＯ２イ
ンキュベーターに静置し、５％牛胎児血清を含むＥａｇ
ｌｅ ＭＥＭ培地４．５ｍｌを加えた。その３時間後培
養液を交換し、４８時間後、培養細胞ごと３度凍結融解
し、３０秒間超音波処理した。
Ｍを培地として培養されたＣＶ−１細胞に、ワクチニア
ウイルスＷＲ株を０．１ｐ．ｆ．ｕ．／細胞接種し、４
５分ｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを２．２ｍｌの滅菌
水で溶かし、樋高ら（蛋白質・核酸・酵素、２７、３４
０（１９８５））の方法によって、ＤＮＡ−リン酸カル
シウム共沈物をつくり、その０．５ｍｌを感染ＣＶ−１
細胞上に滴下した。３０分間、３７℃、５％ ＣＯ２イ
ンキュベーターに静置し、５％牛胎児血清を含むＥａｇ
ｌｅ ＭＥＭ培地４．５ｍｌを加えた。その３時間後培
養液を交換し、４８時間後、培養細胞ごと３度凍結融解
し、３０秒間超音波処理した。
【００５６】組み換え体のｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ
遺伝子の挿入を確認するため、６ｃｍのペトリ皿に培養
されたＴＫ陰性細胞（ＴＫ−１４３）に上記超音波処理
物を接種し、４５分後、１％寒天・１２％牛胎児血清・
２５μｇ／ｍｌＢＵｄＲ（５−ブロモ−２’−デオキシ
ウリジン）加Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭを積層し、３日間
培養後、感染細胞を０．０１％ニュートラル・レッドで
染色した。形成されたプラークをパスツールピペットで
単離し、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ中に希釈する。単離し
たプラークにつき、再度同様の操作を繰り返し、プラー
クを純化した。
遺伝子の挿入を確認するため、６ｃｍのペトリ皿に培養
されたＴＫ陰性細胞（ＴＫ−１４３）に上記超音波処理
物を接種し、４５分後、１％寒天・１２％牛胎児血清・
２５μｇ／ｍｌＢＵｄＲ（５−ブロモ−２’−デオキシ
ウリジン）加Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭを積層し、３日間
培養後、感染細胞を０．０１％ニュートラル・レッドで
染色した。形成されたプラークをパスツールピペットで
単離し、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ中に希釈する。単離し
たプラークにつき、再度同様の操作を繰り返し、プラー
クを純化した。
【００５７】この純化したプラークより得られたウイル
スを増殖させ、増殖ウイルスよりＤＮＡを調製し、ｇａ
ｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子をコードするｃＤＮＡを
プローブとするドットブロットハイブリダイゼーション
により得られた組み換えワクチニアウイルスが目的とす
るＤＮＡをゲノム内に持つ組み換えウイルスであること
を確認し、Ｖ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰと命名した。
スを増殖させ、増殖ウイルスよりＤＮＡを調製し、ｇａ
ｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子をコードするｃＤＮＡを
プローブとするドットブロットハイブリダイゼーション
により得られた組み換えワクチニアウイルスが目的とす
るＤＮＡをゲノム内に持つ組み換えウイルスであること
を確認し、Ｖ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰと命名した。
【００５８】（５）組み換え体の細胞上清での発現 組織培養用９ｃｍディッシュにダルベッコ改変Ｅａｇｌ
ｅ’ｓ ＭＥＭを培地として培養したＳＷ４８０細胞に
ｍ．ｏ．ｉ．１０〜２０のｖ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを
接種し、３７℃、１時間感染後、ウイルス液を抜取り、
細胞をＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭで洗浄し、５％牛胎児血
清加Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭを加えた。１６時間後、細
胞上清を回収し、１０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７．４）
−０．１Ｍ Ｎａｃｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で作製し
た２０〜６０％の酒石酸カリウムの密度勾配上に重層
し、ローターＳＷ４７（ベックマン製）で３５，０００
ｒｐｍ、１６時間遠心した。遠心後、各フラクションに
分けた。
ｅ’ｓ ＭＥＭを培地として培養したＳＷ４８０細胞に
ｍ．ｏ．ｉ．１０〜２０のｖ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰを
接種し、３７℃、１時間感染後、ウイルス液を抜取り、
細胞をＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭで洗浄し、５％牛胎児血
清加Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭを加えた。１６時間後、細
胞上清を回収し、１０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７．４）
−０．１Ｍ Ｎａｃｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で作製し
た２０〜６０％の酒石酸カリウムの密度勾配上に重層
し、ローターＳＷ４７（ベックマン製）で３５，０００
ｒｐｍ、１６時間遠心した。遠心後、各フラクションに
分けた。
【００５９】５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭジチオスレイトール、７５ｍＭ ＫＣ
ｌ、５ｍＭ Ｍｇｃｌ２、１０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ−
Ａ、５μｇ／ｍｌ ｏｌｉｇｏ−ｄＴ、０．０５％ＮＰ
４０を含む反応液５ｍｌに［α−３２Ｐ］−ｄＴＴＰ
（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）を５〜１
０μｌ加えた。
０）、１０ｍＭジチオスレイトール、７５ｍＭ ＫＣ
ｌ、５ｍＭ Ｍｇｃｌ２、１０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ−
Ａ、５μｇ／ｍｌ ｏｌｉｇｏ−ｄＴ、０．０５％ＮＰ
４０を含む反応液５ｍｌに［α−３２Ｐ］−ｄＴＴＰ
（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）を５〜１
０μｌ加えた。
【００６０】この反応液を、９６穴Ｕ字型プレートにフ
ラクションと対照の数だけ分注しておき、そこへ各フラ
クションあるいは対照用１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）−０．１Ｍ Ｎａｃｌ−１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ溶液１０ｍｌ加え、３７℃で１時間反応させた。反応
中に、ニトロセルロースフィルターに鉛筆で２ｃｍ間隔
の碁盤の目を書いておき、反応終了後、各フラクショ
ン、および対照の反応液１０μｌをニトロセルロースフ
ィルター上の各区画にスポットした。
ラクションと対照の数だけ分注しておき、そこへ各フラ
クションあるいは対照用１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）−０．１Ｍ Ｎａｃｌ−１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ溶液１０ｍｌ加え、３７℃で１時間反応させた。反応
中に、ニトロセルロースフィルターに鉛筆で２ｃｍ間隔
の碁盤の目を書いておき、反応終了後、各フラクショ
ン、および対照の反応液１０μｌをニトロセルロースフ
ィルター上の各区画にスポットした。
【００６１】このフィルターを風乾により完全に乾燥さ
せた後、５％トリクロロ酢酸−５％ピロリン酸ナトリウ
ム液中で１５分間振盪しながら洗浄し、未反応の放射性
前駆体を除去した。
せた後、５％トリクロロ酢酸−５％ピロリン酸ナトリウ
ム液中で１５分間振盪しながら洗浄し、未反応の放射性
前駆体を除去した。
【００６２】続いて５％トリクロロ酢酸中で５分、そし
て５０％エタノール中で５分洗浄した。乾燥後、碁盤の
目にそって各区間を切り放し、シンチレーションバイア
ルに入れて、トルエンシンチレータ中で液体シンチレー
ションカウンターにより取り込みを測定した。対照の３
倍以上の取り込みを陽性とし、逆転写酵素活性があると
判断した。
て５０％エタノール中で５分洗浄した。乾燥後、碁盤の
目にそって各区間を切り放し、シンチレーションバイア
ルに入れて、トルエンシンチレータ中で液体シンチレー
ションカウンターにより取り込みを測定した。対照の３
倍以上の取り込みを陽性とし、逆転写酵素活性があると
判断した。
【００６３】次いで、逆転写酵素活性が認められたフラ
クションをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分画し、ニトロセルロースフィルターにブロッティング
する（アナリティカル・バイオケミストリィ（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１２、１９５−２０３（１
９８１））。検出法として１２５Ｉラベルプロテイン
Ａ、抗ｐ２４モノクロナール抗体（ジャパニーズ・ジャ
ーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊａｐａｎｅｓ
ｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒ
ｃｈ）、７８、２３５−２４１（１９８７））を利用す
るいわゆるウェスタンブロッティング法によって、開裂
型ｇａｇタンパク質の発現が確認され、ｖ−ｇａｇ／ｐ
ｏｌ−ｄＰ感染ＳＷ４８０細胞はその上清に分子量２
４，０００ダルトンの開裂型ｇａｇタンパク質ｐ２４を
産生していることが判明した。
クションをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分画し、ニトロセルロースフィルターにブロッティング
する（アナリティカル・バイオケミストリィ（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１２、１９５−２０３（１
９８１））。検出法として１２５Ｉラベルプロテイン
Ａ、抗ｐ２４モノクロナール抗体（ジャパニーズ・ジャ
ーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊａｐａｎｅｓ
ｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒ
ｃｈ）、７８、２３５−２４１（１９８７））を利用す
るいわゆるウェスタンブロッティング法によって、開裂
型ｇａｇタンパク質の発現が確認され、ｖ−ｇａｇ／ｐ
ｏｌ−ｄＰ感染ＳＷ４８０細胞はその上清に分子量２
４，０００ダルトンの開裂型ｇａｇタンパク質ｐ２４を
産生していることが判明した。
【００６４】ｇａｇ−ｐ５５の構造から考えて、ｇａｇ
−ｐ５５の中央部分のアミノ酸配列に相当するｐ２４が
産生されていることから、ｇａｇ−ｐ５５の両端のアミ
ノ酸配列に相当するｐ１７、ｐ１５も産生されていると
考えられる。
−ｐ５５の中央部分のアミノ酸配列に相当するｐ２４が
産生されていることから、ｇａｇ−ｐ５５の両端のアミ
ノ酸配列に相当するｐ１７、ｐ１５も産生されていると
考えられる。
【００６５】逆転写酵素活性の検出される比重約１．１
５の分画を、さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心に
より精製し、逆転写酵素活性の検出される比重約１．１
５の分画にｐ２４が確認された。
５の分画を、さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心に
より精製し、逆転写酵素活性の検出される比重約１．１
５の分画にｐ２４が確認された。
【００６６】いわゆるネガティブ染色法により、上記の
ｐ２４が確認された分画を電子顕微鏡により観察すると
ワクチニアウイルスとは異なる直径約１１０〜１５０ｎ
ｍの球形の粒子が認められた。
ｐ２４が確認された分画を電子顕微鏡により観察すると
ワクチニアウイルスとは異なる直径約１１０〜１５０ｎ
ｍの球形の粒子が認められた。
【００６７】比較例１ （１）組み換えプラスミドＷ−ｇａｇの作製 ＨＩＶ−Ｉの全ｃＤＮＡを含むｐＮＬ４３（ジャーナル
・オブ・ビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、５９、２、２
８４（１９８６））をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化
後、低融点アガロース電気泳動で約５．１ｋｂｐの断片
を分離し、フェノール抽出によりその断片を回収した。
・オブ・ビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、５９、２、２
８４（１９８６））をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化
後、低融点アガロース電気泳動で約５．１ｋｂｐの断片
を分離し、フェノール抽出によりその断片を回収した。
【００６８】次に、実施例１（２）で得たｐＮＺ６８Ｋ
２をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、先に得た約５．
１ｋｂｐのＤＮＡ断片とライゲーションして、得られた
約１３ｋｂｐの組み換えをプラスミドＷ−ｇａｇと命名
した。
２をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、先に得た約５．
１ｋｂｐのＤＮＡ断片とライゲーションして、得られた
約１３ｋｂｐの組み換えをプラスミドＷ−ｇａｇと命名
した。
【００６９】（２）組み換えワクチニアウイルスの作出 プラスミドとしてＷ−ｇａｇを用いるほかは、実施例１
（４）と同様の方法で組み換えワクチニアウイルスを作
製した。得られた組み換えワクチニアウイルスをＶ−２
０−１−８と命名した。
（４）と同様の方法で組み換えワクチニアウイルスを作
製した。得られた組み換えワクチニアウイルスをＶ−２
０−１−８と命名した。
【００７０】（３）組み換え体の細胞上清での発現 組み換えワクチニアウイルスとしてＶ−２０−１−８を
用いた以外は、実施例１（５）と同様の方法でレトロウ
イルス様粒子を発現させ、実施例１（５）で得られた粒
子と同様の粒子が発現していることを確認した。
用いた以外は、実施例１（５）と同様の方法でレトロウ
イルス様粒子を発現させ、実施例１（５）で得られた粒
子と同様の粒子が発現していることを確認した。
【００７１】実施例２ （１）レトロウイルス様粒子内のＨＩＶ−Ｉ由来ＲＮＡ
の確認 実施例１（５）で得た粒子、および比較例１（３）で得
た粒子からＲＮＡを抽出すベく、フェノール／クロロホ
ルム（１：１）で処理した後、エタノール沈澱により混
在するタンパク質除去した。
の確認 実施例１（５）で得た粒子、および比較例１（３）で得
た粒子からＲＮＡを抽出すベく、フェノール／クロロホ
ルム（１：１）で処理した後、エタノール沈澱により混
在するタンパク質除去した。
【００７２】各粒子抽出物を１６％ホルムアデヒドを含
んだ１％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロー
スＨＡＷＰフィルター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ・ＵＳＡ、７７、５２０１−５２０５（１９
８０））に移した後、３２ＰでラベルしたＨＩＶ−Ｉの
ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイズした。
んだ１％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロー
スＨＡＷＰフィルター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ・ＵＳＡ、７７、５２０１−５２０５（１９
８０））に移した後、３２ＰでラベルしたＨＩＶ−Ｉの
ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイズした。
【００７３】その結果、実施例１（５）で得た粒子の抽
出物からは、ＲＮＡが検出されなかったが、比較例１
（３）で得た粒子の抽出物からは、ＲＮＡが検出され
た。従って、実施例１（５）で得た粒子はＲＮＡを内包
せず、比較例１（３）で得た粒子はＲＮＡを内包してい
ることがわかった。
出物からは、ＲＮＡが検出されなかったが、比較例１
（３）で得た粒子の抽出物からは、ＲＮＡが検出され
た。従って、実施例１（５）で得た粒子はＲＮＡを内包
せず、比較例１（３）で得た粒子はＲＮＡを内包してい
ることがわかった。
【００７４】（２）感染細胞中のＨＩＶ−Ｉ由来ＲＮＡ
の確認 実施例１（５）、および比較例１（３）の感染細胞を、
それぞれ４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ａｒ
ａ−Ｃ）を添加したダルベッコ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍ
ＥＭで、３７℃、４８時間培養した。その後、それぞれ
細胞を回収し、細胞を１％ＳＤＳ／１２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶かし（グアニジウムチオ
シアネート法）、ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅを得た。
の確認 実施例１（５）、および比較例１（３）の感染細胞を、
それぞれ４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ａｒ
ａ−Ｃ）を添加したダルベッコ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍ
ＥＭで、３７℃、４８時間培養した。その後、それぞれ
細胞を回収し、細胞を１％ＳＤＳ／１２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶かし（グアニジウムチオ
シアネート法）、ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅを得た。
【００７５】各ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅを１６％ホルム
アデヒドを含んだ１％アガロースゲルで電気泳動し、ニ
トロセルロースＨＡＷＰフィルター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、５２０１−５２
０５（１９８０））に移した後、３２ＰでラベルしたＨ
ＩＶ−ＩのＤＮＡをプローブとしてハイブリダイズし
た。その結果、各ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅからは、ＨＩ
Ｖ−Ｉ由来のＲＮＡが検出された。
アデヒドを含んだ１％アガロースゲルで電気泳動し、ニ
トロセルロースＨＡＷＰフィルター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、５２０１−５２
０５（１９８０））に移した後、３２ＰでラベルしたＨ
ＩＶ−ＩのＤＮＡをプローブとしてハイブリダイズし
た。その結果、各ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅからは、ＨＩ
Ｖ−Ｉ由来のＲＮＡが検出された。
【００７６】（１）の結果と（２）の結果から、実施例
１（４）で得られた組み換えワクチニアウイルスには、
ＲＮＡのパッケージング能がないことがわかる。
１（４）で得られた組み換えワクチニアウイルスには、
ＲＮＡのパッケージング能がないことがわかる。
【００７７】実施例３ （１）組み換えプラスミドｐＮＺ−ＨＮＰの作製 実施例１（２）で得たｐＮＺ６８Ｋ２をＢａｍＨＩで消
化し、センダイウイルス（ＨｖＪ）のＮＰ遺伝子領域を
含む約２ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓａｒｃｈ、１１、７３１７−７３３０（１９
８３））とライゲーションして、得られた組み換えプラ
スミドをｐＮＺ−ＨＮＰ（約１０ｋｂｐ）と命名した。
化し、センダイウイルス（ＨｖＪ）のＮＰ遺伝子領域を
含む約２ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓａｒｃｈ、１１、７３１７−７３３０（１９
８３））とライゲーションして、得られた組み換えプラ
スミドをｐＮＺ−ＨＮＰ（約１０ｋｂｐ）と命名した。
【００７８】（２）組み換えプラスミドｐＮＺ−ＰＳ−
ＮＰｂの作製 （１）で得たｐＮＺ−ＨＮＰをＢａｍＨＩおよびＮａｅ
Ｉで消化し、このＮＰ遺伝子の上流に配列番号１に示す
４６ｂｐのＤＮＡの両端に合成リンカーを結合させた合
成ＤＮＡを挿入した。得られた組み換えプラスミドをｐ
ＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂと命名した。配列番号１記載の４６
ｂｐのＤＮＡは、ｐＮＬ４３に含まれているＨＩＶ−Ｉ
ゲノムの第７５１番目から第７９６番目の領域に相当す
る。
ＮＰｂの作製 （１）で得たｐＮＺ−ＨＮＰをＢａｍＨＩおよびＮａｅ
Ｉで消化し、このＮＰ遺伝子の上流に配列番号１に示す
４６ｂｐのＤＮＡの両端に合成リンカーを結合させた合
成ＤＮＡを挿入した。得られた組み換えプラスミドをｐ
ＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂと命名した。配列番号１記載の４６
ｂｐのＤＮＡは、ｐＮＬ４３に含まれているＨＩＶ−Ｉ
ゲノムの第７５１番目から第７９６番目の領域に相当す
る。
【００７９】なお、このｐＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂに組み込
まれた４６ｂｐのＤＮＡはＺｕｃｋｅｒ’ Ｆｏｌｄプ
ログラムを用いたコンピューターによる構造解析から、
図１に示すような二次構造（シュテム−ループ（ｓｔｅ
ｍ−ｌｏｏｐ）構造）をとることが明らかになった。
まれた４６ｂｐのＤＮＡはＺｕｃｋｅｒ’ Ｆｏｌｄプ
ログラムを用いたコンピューターによる構造解析から、
図１に示すような二次構造（シュテム−ループ（ｓｔｅ
ｍ−ｌｏｏｐ）構造）をとることが明らかになった。
【００８０】（３）ｐＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂ移入Ｖ−ｇａ
ｇ／ｐｏｌ−ｄＰ感染細胞上清でのレトロウイルス様粒
子の発現 実施例１（５）のＶ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰ感染細胞
に、ｐＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂをリン酸カルシウム沈降法に
より移入し、実施例２（２）と同様の条件下で細胞を培
養し、レトロウイルス様粒子を発現させた。その結果、
実施例１（５）で得られた粒子と同様の粒子が発現して
いることを確認した。
ｇ／ｐｏｌ−ｄＰ感染細胞上清でのレトロウイルス様粒
子の発現 実施例１（５）のＶ−ｇａｇ／ｐｏｌ−ｄＰ感染細胞
に、ｐＮＺ−ＰＳ−ＮＰｂをリン酸カルシウム沈降法に
より移入し、実施例２（２）と同様の条件下で細胞を培
養し、レトロウイルス様粒子を発現させた。その結果、
実施例１（５）で得られた粒子と同様の粒子が発現して
いることを確認した。
【００８１】（４）レトロウイルス様粒子内のＲＮＡの
確認 プローブとして３３２ＰでラベルしたＨＶＪのＮＰ遺伝
子を用いるほかは、実施例２の（１）と同様の方法のよ
り、ＮＰ遺伝子の存在を確認した。このように、粒子内
にＮＰ遺伝子が内包されていることから、上記配列番号
１に示すＤＮＡ断片がパッケージング能を有するＲＮＡ
のｃＤＮＡであることが確認された。
確認 プローブとして３３２ＰでラベルしたＨＶＪのＮＰ遺伝
子を用いるほかは、実施例２の（１）と同様の方法のよ
り、ＮＰ遺伝子の存在を確認した。このように、粒子内
にＮＰ遺伝子が内包されていることから、上記配列番号
１に示すＤＮＡ断片がパッケージング能を有するＲＮＡ
のｃＤＮＡであることが確認された。
【００８２】
【配列表】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＮＡパッケージング能を有するＲＮＡのシュ
テム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を示した説明
図である。
テム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を示した説明
図である。
【図２】組み換えプラスミドｐＵＨＫの作製手順を示し
た説明図である。
た説明図である。
【図３】組み換えプラスミドｐＮＺ６８Ｋ２の作製手順
を示した説明図である。
を示した説明図である。
【図４】組み換えプラスミドｐＮＺ−ｇａｇ／ｐｏｌ−
ｄｐの作製手順を示した説明図である。
ｄｐの作製手順を示した説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/10
Claims (5)
- 【請求項１】 少なくともｇａｇタンパク質を有し、Ｒ
ＮＡを内包しないレトロウイルス様粒子。 - 【請求項２】 ｅｎｖタンパク質を含まない請求項１記
載のレトロウイルス様粒子。 - 【請求項３】 パッケージング能を有するＲＮＡのｃＤ
ＮＡを含まず、レトロウイルス属に属するウイルスのｇ
ａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子のｃＤＮＡを組み込ん
だウイルス・ベクターを細胞に感染させ、感染させた細
胞を培養することを特徴とする請求項１記載のレトロウ
イルス様粒子の製造方法。 - 【請求項４】 請求項１または２記載のレトロウイルス
様粒子を有効成分とするとする抗レトロウイルス・ワク
チン。 - 【請求項５】 レトロウイルス属に属するウイルスのパ
ッケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3297746A JPH0767682A (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | レトロウイルス様粒子、その製造方法、それから成るワクチン、およびパッケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3297746A JPH0767682A (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | レトロウイルス様粒子、その製造方法、それから成るワクチン、およびパッケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767682A true JPH0767682A (ja) | 1995-03-14 |
Family
ID=17850643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3297746A Pending JPH0767682A (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | レトロウイルス様粒子、その製造方法、それから成るワクチン、およびパッケージング能を有するＲＮＡのｃＤＮＡ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767682A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0998722A (ja) * | 1995-10-04 | 1997-04-15 | Fugetsudo Honten:Kk | 絹入りアイスクリーム |
-
1991
- 1991-10-18 JP JP3297746A patent/JPH0767682A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0998722A (ja) * | 1995-10-04 | 1997-04-15 | Fugetsudo Honten:Kk | 絹入りアイスクリーム |
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