JPH07209301A - エイズ検査試薬 - Google Patents
エイズ検査試薬Info
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- JPH07209301A JPH07209301A JP238894A JP238894A JPH07209301A JP H07209301 A JPH07209301 A JP H07209301A JP 238894 A JP238894 A JP 238894A JP 238894 A JP238894 A JP 238894A JP H07209301 A JPH07209301 A JP H07209301A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 エイズウイルス感染者の病態検査試薬を提供
する。 【構成】 血清中ＩｇＧを固相化プロテインＡまたプロ
テインＧを用いてトラップする。ＩｇＧ糖鎖のガラクト
−ス含量により反応性の異なるレクチンを用い、ＩｇＧ
を測定する。 【効果】 エイズ病態 stage IIIにおいて、ガラクト−
ス欠損ＩｇＧ量が有意に減少することが確認されたこと
により、検査試薬として期待される。
する。 【構成】 血清中ＩｇＧを固相化プロテインＡまたプロ
テインＧを用いてトラップする。ＩｇＧ糖鎖のガラクト
−ス含量により反応性の異なるレクチンを用い、ＩｇＧ
を測定する。 【効果】 エイズ病態 stage IIIにおいて、ガラクト−
ス欠損ＩｇＧ量が有意に減少することが確認されたこと
により、検査試薬として期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はエイズの病態検査試薬お
よび検査方法に関するものであり、医薬の分野で利用さ
れる。
よび検査方法に関するものであり、医薬の分野で利用さ
れる。
【０００２】
【従来の技術】現代の黒死病ともいえるエイズ（後天性
免疫不全症候群、aquired immunodefficiency syndrom
e、ＡＩＤＳ）は現在世界中で猛威をふるっており、198
1年に米国ではじめて患者が報告されてから1992年12月
末までに世界保健機構（ＷＨＯ）に報告されたエイズの
累積患者数は60万人を超えている。また最近のＷＨＯの
報告によると、エイズウイルスによる感染者は1993年５
月の時点で 1,400万人いると推定されており、日本にお
いても例外ではなく、エイズウイルス感染者が急増して
おり、非常に憂慮される事態になっている。エイズはレ
トロウイルスの一種であるエイズウイルス（ＨＩＶ）が
ＣＤ４分子をもつ細胞に主に感染し、免疫系において中
枢的役割を担っているＤＣ４陽性Ｔ細胞を劇的に減少さ
せて生体の感染防御機構を破壊する致死的なウイルス性
疾患である。
免疫不全症候群、aquired immunodefficiency syndrom
e、ＡＩＤＳ）は現在世界中で猛威をふるっており、198
1年に米国ではじめて患者が報告されてから1992年12月
末までに世界保健機構（ＷＨＯ）に報告されたエイズの
累積患者数は60万人を超えている。また最近のＷＨＯの
報告によると、エイズウイルスによる感染者は1993年５
月の時点で 1,400万人いると推定されており、日本にお
いても例外ではなく、エイズウイルス感染者が急増して
おり、非常に憂慮される事態になっている。エイズはレ
トロウイルスの一種であるエイズウイルス（ＨＩＶ）が
ＣＤ４分子をもつ細胞に主に感染し、免疫系において中
枢的役割を担っているＤＣ４陽性Ｔ細胞を劇的に減少さ
せて生体の感染防御機構を破壊する致死的なウイルス性
疾患である。
【０００３】ＨＩＶ感染症の病期分類の仕方はいくつか
提案されているが、1986年米国防疫センター（ＣＤＣ）
により示された診断基準は我が国でも馴染みが深い。こ
のＣＤＣ分類は全体を４つの群に分けている。第１群は
倦怠、発熱、発疹などの急性感染症状期で２〜３週間続
いた後消失する。第２群は抗ＨＩＶ抗体が陽性となった
時期で、大半の例では感染３〜８週間後であり、無症状
のまま３〜10年以上の長期間経過する、いわゆる無症候
性キャリアの時期である。第３群は体重減少や持続的な
全身性リンパ節腫瘍がみられる時期、第４群は免疫不全
の進行にともない、全身症状、二次感染症、二次悪性腫
瘍などの発症群でいわゆる臨床的エイズとなり、ＨＩＶ
感染症のスペクトルの中で終末像というべき状態であ
る。
提案されているが、1986年米国防疫センター（ＣＤＣ）
により示された診断基準は我が国でも馴染みが深い。こ
のＣＤＣ分類は全体を４つの群に分けている。第１群は
倦怠、発熱、発疹などの急性感染症状期で２〜３週間続
いた後消失する。第２群は抗ＨＩＶ抗体が陽性となった
時期で、大半の例では感染３〜８週間後であり、無症状
のまま３〜10年以上の長期間経過する、いわゆる無症候
性キャリアの時期である。第３群は体重減少や持続的な
全身性リンパ節腫瘍がみられる時期、第４群は免疫不全
の進行にともない、全身症状、二次感染症、二次悪性腫
瘍などの発症群でいわゆる臨床的エイズとなり、ＨＩＶ
感染症のスペクトルの中で終末像というべき状態であ
る。
【０００４】エイズの治療薬としては、アジドチミジン
を始めとする抗エイズ薬が臨床的に使用され、また現在
ＨＩＶの増殖過程をもとに、それぞれをＨＩＶ増殖阻害
のターゲットポイントとして抗エイズ薬の開発研究が進
められており、今後各種の新薬が開発利用されるものと
予想される。
を始めとする抗エイズ薬が臨床的に使用され、また現在
ＨＩＶの増殖過程をもとに、それぞれをＨＩＶ増殖阻害
のターゲットポイントとして抗エイズ薬の開発研究が進
められており、今後各種の新薬が開発利用されるものと
予想される。
【０００５】ここ数年の間、エイズに対する基礎的、臨
床的研究が進められ、それに伴い、エイズに対する検査
法にも改良が加えられ実用化されている。血液学的検査
項目として、末梢リンパ球、Ｔ４リンパ球、ＩｇＧ量、
リンパ球機能の測定（吉田、エイズウイルス、臨床検査
ＭＯＯＫ，No.28, 163-169, 1988）、血清学的検査とし
て、抗ＨＩＶ抗体およびＨＩＶ抗原の測定、ＰＣＲを用
いた遺伝子検査法などがあり、ＤＮＡレベルで判定でき
るようになり、ＨＩＶ感染の診断が確実なものになって
きている。
床的研究が進められ、それに伴い、エイズに対する検査
法にも改良が加えられ実用化されている。血液学的検査
項目として、末梢リンパ球、Ｔ４リンパ球、ＩｇＧ量、
リンパ球機能の測定（吉田、エイズウイルス、臨床検査
ＭＯＯＫ，No.28, 163-169, 1988）、血清学的検査とし
て、抗ＨＩＶ抗体およびＨＩＶ抗原の測定、ＰＣＲを用
いた遺伝子検査法などがあり、ＤＮＡレベルで判定でき
るようになり、ＨＩＶ感染の診断が確実なものになって
きている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これまで臨床
検査項目として多くの因子が発表されているものの、Ｈ
ＩＶの病態を正確に反映する検査方法は充分とは言え
ず、現在使用されている治療薬をはじめ今後開発される
であろう抗ＨＩＶ薬の適切な投薬、治療の指針を与える
新しい適切な病態検査法の確立が望まれている。従っ
て、本発明の目的はエイズ患者の病態を判断する検査試
薬及び検査方法を提供することにある。
検査項目として多くの因子が発表されているものの、Ｈ
ＩＶの病態を正確に反映する検査方法は充分とは言え
ず、現在使用されている治療薬をはじめ今後開発される
であろう抗ＨＩＶ薬の適切な投薬、治療の指針を与える
新しい適切な病態検査法の確立が望まれている。従っ
て、本発明の目的はエイズ患者の病態を判断する検査試
薬及び検査方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者はこれまで疾患
とＩｇＧ糖鎖の関係について鋭意研究を行って来たが、
これまでの研究から患者血清中のＩｇＧの糖鎖パターン
の変化が患者における特定のＢ細胞の増大などによって
引き起こされることが示唆された。エイズは免疫機構の
中枢ともいうべきＣＤ４陽性Ｔ細胞が減少して感染防御
機構が破壊され日和見感染症を発症するようになるにも
かかわらず、血液中の免疫グロブリン量はエイズウイル
ス感染後はむしろ増大する。このように、様々な免疫系
の異常を示すエイズウイルス感染者でも、特定のＢ細胞
クローンあるいはＢ細胞群の増大があればＩｇＧの糖鎖
パターンに変化が生じるのではないかと考えた。
とＩｇＧ糖鎖の関係について鋭意研究を行って来たが、
これまでの研究から患者血清中のＩｇＧの糖鎖パターン
の変化が患者における特定のＢ細胞の増大などによって
引き起こされることが示唆された。エイズは免疫機構の
中枢ともいうべきＣＤ４陽性Ｔ細胞が減少して感染防御
機構が破壊され日和見感染症を発症するようになるにも
かかわらず、血液中の免疫グロブリン量はエイズウイル
ス感染後はむしろ増大する。このように、様々な免疫系
の異常を示すエイズウイルス感染者でも、特定のＢ細胞
クローンあるいはＢ細胞群の増大があればＩｇＧの糖鎖
パターンに変化が生じるのではないかと考えた。
【０００８】そこで様々な病態期にあるエイズウイルス
感染者の血中ＩｇＧを精製し、その糖鎖構造を解析した
結果、どのエイズウイルス感染者血清中ＩｇＧも図１に
示す一連の糖鎖を持っていることが確認されたが、意外
にも病態によってガラクトース含量が変化していること
が判明し、本発明を完成するに至った。ＩｇＧの糖鎖中
には２分子のガラクトースが含まれるが、ガラクトース
を保有する糖鎖と保有しない糖鎖の比をみると、病態 s
tage IIIの患者において有意に上昇し、病態 stage IV
の患者において、顕著に減少していることを初めて見い
出したものである。
感染者の血中ＩｇＧを精製し、その糖鎖構造を解析した
結果、どのエイズウイルス感染者血清中ＩｇＧも図１に
示す一連の糖鎖を持っていることが確認されたが、意外
にも病態によってガラクトース含量が変化していること
が判明し、本発明を完成するに至った。ＩｇＧの糖鎖中
には２分子のガラクトースが含まれるが、ガラクトース
を保有する糖鎖と保有しない糖鎖の比をみると、病態 s
tage IIIの患者において有意に上昇し、病態 stage IV
の患者において、顕著に減少していることを初めて見い
出したものである。
【０００９】すなわち本発明は、標識レクチンを必須の
構成要素とするエイズ検査試薬、また、固相化プロテイ
ンＡ、固相化プロテインＧまたは固相化抗ＩｇＧ抗体、
および標識レクチンを必須の構成要素とするエイズ検査
試薬及びそれを用いた検査方法であって、ウイルス感染
者の血清を含む生体試料中のＩｇＧ糖鎖のガラクト−ス
欠損の度合いを解析することにより、エイズ病態期を診
断するための検査方法および検査試薬に関するものであ
り、エイズウイルス感染者の治療に際して、正確な病態
把握を可能にしたものである。
構成要素とするエイズ検査試薬、また、固相化プロテイ
ンＡ、固相化プロテインＧまたは固相化抗ＩｇＧ抗体、
および標識レクチンを必須の構成要素とするエイズ検査
試薬及びそれを用いた検査方法であって、ウイルス感染
者の血清を含む生体試料中のＩｇＧ糖鎖のガラクト−ス
欠損の度合いを解析することにより、エイズ病態期を診
断するための検査方法および検査試薬に関するものであ
り、エイズウイルス感染者の治療に際して、正確な病態
把握を可能にしたものである。
【００１０】具体的な手法としては、個々の患者の血清
ＩｇＧを精製し公知の方法により糖鎖を解析することも
可能であるが簡便性の観点から、例えばＩｇＧ糖鎖のガ
ラクトース含有量により反応性の異なるレクチンを使用
する方法、ガラクトースの有無を認識する抗体を用いる
方法などが挙げられる。好ましくはレクチンを使用する
方法である。また検体試料は血清に限られず、唾液、骨
髄液など生体試料すべてに適用できることはいうまでも
ない。以下にレクチンを用いる手法を一例として本発明
を説明する。
ＩｇＧを精製し公知の方法により糖鎖を解析することも
可能であるが簡便性の観点から、例えばＩｇＧ糖鎖のガ
ラクトース含有量により反応性の異なるレクチンを使用
する方法、ガラクトースの有無を認識する抗体を用いる
方法などが挙げられる。好ましくはレクチンを使用する
方法である。また検体試料は血清に限られず、唾液、骨
髄液など生体試料すべてに適用できることはいうまでも
ない。以下にレクチンを用いる手法を一例として本発明
を説明する。
【００１１】生体試料中のＩｇＧをトラップする方法と
しては、レクチンとの反応性を考慮すれば公知の方法を
用いればよく、例えばプロテインＡ、プロテインＧまた
は抗ＩｇＧ抗体などを用い、これに生体試料を反応させ
ＩｇＧを結合（トラップ）させる。洗浄後、結合したＩ
ｇＧに適切な標識レクチンを反応させ、洗浄後、結合し
た標識レクチン量を測定し、レクチン結合量からＩｇＧ
糖鎖中のガラクトース含量の変化を計算すればよい。用
いられるプロテインＡとは Staphylococcus aureus（ス
タフィロコッカス・アウレウス）の細胞膜より単離され
たタンパク質であり、内部構造の相似したいくつかの部
分からなる分子量42,000のシングルポリペプチドから構
成されるものである。プロテインＡはＩｇＧのＦｃ部位
と結合する性質があり、この結合性によりＩｇＧの精製
に使用することができ、このこと自体は公知である。ま
た本発明に用いられるプロテインＧはプロテインＡ同
様、Staphylococcus aureus 由来のタンパク質であり、
プロテインＧもＩｇＧのＦｃ部位と結合する性質があ
り、この結合性によりＩｇＧの精製に使用することがで
き、このこと自体は公知である。抗ＩｇＧ抗体はＩｇＧ
のフラグメントに対する抗体、例えば抗Ｈ鎖抗体なども
使用できる。
しては、レクチンとの反応性を考慮すれば公知の方法を
用いればよく、例えばプロテインＡ、プロテインＧまた
は抗ＩｇＧ抗体などを用い、これに生体試料を反応させ
ＩｇＧを結合（トラップ）させる。洗浄後、結合したＩ
ｇＧに適切な標識レクチンを反応させ、洗浄後、結合し
た標識レクチン量を測定し、レクチン結合量からＩｇＧ
糖鎖中のガラクトース含量の変化を計算すればよい。用
いられるプロテインＡとは Staphylococcus aureus（ス
タフィロコッカス・アウレウス）の細胞膜より単離され
たタンパク質であり、内部構造の相似したいくつかの部
分からなる分子量42,000のシングルポリペプチドから構
成されるものである。プロテインＡはＩｇＧのＦｃ部位
と結合する性質があり、この結合性によりＩｇＧの精製
に使用することができ、このこと自体は公知である。ま
た本発明に用いられるプロテインＧはプロテインＡ同
様、Staphylococcus aureus 由来のタンパク質であり、
プロテインＧもＩｇＧのＦｃ部位と結合する性質があ
り、この結合性によりＩｇＧの精製に使用することがで
き、このこと自体は公知である。抗ＩｇＧ抗体はＩｇＧ
のフラグメントに対する抗体、例えば抗Ｈ鎖抗体なども
使用できる。
【００１２】本発明に用いられるレクチンとは糖鎖結合
性蛋白質の総称であり、当初はヒマの種子より入手され
たが、植物ばかりでなく、細菌をはじめ動物にも広く分
布しており、現在は起源の異なる各種のレクチンを入手
することができる。起源の異なるいずれのレクチンも構
造の異なる複数の種類の糖鎖と結合してこれを認識する
ことができる。従って本発明においてはレクチンは起源
によって特に限定されないが、ＩｇＧ糖鎖のガラクトー
ス含量により反応性の異なるレクチンであればいずれも
使用することができる。ガラクトース欠損ＩｇＧとレク
チンとの反応性に関しては、本出願人の出願に係わる特
開平３−７３８５７（特願平２−１２３７６６）号公報
に開示されており、コンカナバリンＡ、レンズカリナリ
スアグルチニンおよびＲＣＡ１２０は、本発明で使用さ
れるレクチンとして好ましい例である。
性蛋白質の総称であり、当初はヒマの種子より入手され
たが、植物ばかりでなく、細菌をはじめ動物にも広く分
布しており、現在は起源の異なる各種のレクチンを入手
することができる。起源の異なるいずれのレクチンも構
造の異なる複数の種類の糖鎖と結合してこれを認識する
ことができる。従って本発明においてはレクチンは起源
によって特に限定されないが、ＩｇＧ糖鎖のガラクトー
ス含量により反応性の異なるレクチンであればいずれも
使用することができる。ガラクトース欠損ＩｇＧとレク
チンとの反応性に関しては、本出願人の出願に係わる特
開平３−７３８５７（特願平２−１２３７６６）号公報
に開示されており、コンカナバリンＡ、レンズカリナリ
スアグルチニンおよびＲＣＡ１２０は、本発明で使用さ
れるレクチンとして好ましい例である。
【００１３】レクチンの標識は標識方法として通常に行
われる方法を使用して行えばよい。従って、例えば酵素
標識、放射標識、蛍光標識、電気化学発光標識等を適宜
に選択してこれを行えばよく、これらの標識方法によっ
て本発明は限定されない。酵素標識にあたっては、酵素
をレクチンに直接に結合してもよいし、また適当な架橋
剤、例えばビオチンとアビジンを介して結合してもよ
い。
われる方法を使用して行えばよい。従って、例えば酵素
標識、放射標識、蛍光標識、電気化学発光標識等を適宜
に選択してこれを行えばよく、これらの標識方法によっ
て本発明は限定されない。酵素標識にあたっては、酵素
をレクチンに直接に結合してもよいし、また適当な架橋
剤、例えばビオチンとアビジンを介して結合してもよ
い。
【００１４】本発明の検査試薬を使用してエイズの病態
検査を行う方法は、例えば基本的には以下のように行え
ばよい。まず、ニトロセルロース膜にプロテインＡを固
定し、ここに試料血清を加えて反応させ、次にビオチン
−コンカナバリンＡを加えて反応させ、更に次にアビジ
ン−パーオキシダーゼを加えて反応し、洗浄後、パーオ
キシダーゼの基質液を加えて発色させ、測定する。この
測定方法において本発明検査試薬はプロテインＡ及びビ
オチン−コンカナバリンＡ（標識レクチン）を必須の要
素として提供しており、測定操作の過程で使用されるそ
の他の成分、例えば燐酸緩衝液、ブロッキング液、ニト
ロセルロース膜、アビジン−パーオキシダーゼ、トリス
緩衝液、基質溶液、反応停止液等は測定者の便益のため
に検査試薬のセットの中に適宜に加えればよく、これら
の添加によって本発明は限定されない。
検査を行う方法は、例えば基本的には以下のように行え
ばよい。まず、ニトロセルロース膜にプロテインＡを固
定し、ここに試料血清を加えて反応させ、次にビオチン
−コンカナバリンＡを加えて反応させ、更に次にアビジ
ン−パーオキシダーゼを加えて反応し、洗浄後、パーオ
キシダーゼの基質液を加えて発色させ、測定する。この
測定方法において本発明検査試薬はプロテインＡ及びビ
オチン−コンカナバリンＡ（標識レクチン）を必須の要
素として提供しており、測定操作の過程で使用されるそ
の他の成分、例えば燐酸緩衝液、ブロッキング液、ニト
ロセルロース膜、アビジン−パーオキシダーゼ、トリス
緩衝液、基質溶液、反応停止液等は測定者の便益のため
に検査試薬のセットの中に適宜に加えればよく、これら
の添加によって本発明は限定されない。
【００１５】プロテインＡまたはプロテインＧによって
ＩｇＧを精製すること及びレクチンによって糖鎖を認識
することはいずれも従来公知であるが、これらを一体に
してエイズ検査試薬としての利用は新規であり、病態の
判定に有用である。
ＩｇＧを精製すること及びレクチンによって糖鎖を認識
することはいずれも従来公知であるが、これらを一体に
してエイズ検査試薬としての利用は新規であり、病態の
判定に有用である。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
【００１７】実施例１ 患者血清ＩｇＧ糖鎖の構造解析 健常者及び患者血清ＩｇＧの精製は硫酸アンモニウム分
画後、ＤＥ−５２陰イオン交換体カラムクロマトグラフ
ィーを行い、常法により精製した。精製したヒトＩｇＧ
を、無水ヒドラジンを加え、ふたをし、 100℃で９時間
加熱した。反応後、ふたを外し、硫酸の入ったデシケー
ターに試料を入れ減圧下でヒドラジンを蒸発除去した。
次いで飽和ＮａＨＣＯ3 水溶液を加え溶かし、これに無
水酢酸を攪拌しながら加えた。室温で30分間放置後、Ｄ
ｏｗｅｘ５０のカラムで脱塩した。素通り分画と洗液を
合わせ微量のオクタノールを加え減圧濃縮乾燥した。
画後、ＤＥ−５２陰イオン交換体カラムクロマトグラフ
ィーを行い、常法により精製した。精製したヒトＩｇＧ
を、無水ヒドラジンを加え、ふたをし、 100℃で９時間
加熱した。反応後、ふたを外し、硫酸の入ったデシケー
ターに試料を入れ減圧下でヒドラジンを蒸発除去した。
次いで飽和ＮａＨＣＯ3 水溶液を加え溶かし、これに無
水酢酸を攪拌しながら加えた。室温で30分間放置後、Ｄ
ｏｗｅｘ５０のカラムで脱塩した。素通り分画と洗液を
合わせ微量のオクタノールを加え減圧濃縮乾燥した。
【００１８】Ｎ−アセチル化された糖鎖を精製するため
に、サンプルに少量の水を入れて溶かし、濾紙にスポッ
トし、１−ブタノール−エタノール−水（４：１：１、
v／v ）を溶媒とし、室温で２日間下降法で展開した。
展開後、移動距離’０−５cmの部分を切り出し、糖鎖を
水で抽出した。抽出液を濃縮乾固し、 100μl の0.05Ｍ
ＮａＯＨ水溶液を加えた後、１０倍当量のＮａＢ3 Ｈ4
液を加え、30℃、４時間還元した。１Ｎ酢酸を加え反応
を停止させ、ついでＤｏｗｅｘ５０カラムを通して糖鎖
分画を集め、減圧乾固した後、メタノールを加えて硼酸
を減圧除去し、下降法の濾紙クロマトグラフィーによ
り、トリチウム標識糖鎖を精製した。
に、サンプルに少量の水を入れて溶かし、濾紙にスポッ
トし、１−ブタノール−エタノール−水（４：１：１、
v／v ）を溶媒とし、室温で２日間下降法で展開した。
展開後、移動距離’０−５cmの部分を切り出し、糖鎖を
水で抽出した。抽出液を濃縮乾固し、 100μl の0.05Ｍ
ＮａＯＨ水溶液を加えた後、１０倍当量のＮａＢ3 Ｈ4
液を加え、30℃、４時間還元した。１Ｎ酢酸を加え反応
を停止させ、ついでＤｏｗｅｘ５０カラムを通して糖鎖
分画を集め、減圧乾固した後、メタノールを加えて硼酸
を減圧除去し、下降法の濾紙クロマトグラフィーによ
り、トリチウム標識糖鎖を精製した。
【００１９】得られた標識糖鎖をシアリダーゼ処理した
後、高圧濾紙電気泳動にかけ、中性糖画分を集め、脱塩
後、RCA120-HPLC を行うとともに、エキソグリコシダー
ゼによる逐次分解にかけ、酵素処理後の各段階で反応液
をＢｉｏ−ｇｅｌ Ｐ−４（-400mesh）を用いたカラム
クロマトグラフィーで分析し、（Ｇ1 ＋Ｇ2 ）／Ｇ0比
を計算した。Ｇ0 とはガラクトースを含まない糖鎖、Ｇ
1 およびＧ2 はガラクトースを、それぞれ１分子及び２
分子含有する糖鎖を意味する。その結果は図２に示す。
表１のｔ検定に示されるごとく、stage III において有
意に（Ｇ1 ＋Ｇ2 ）／Ｇ0 値の増加、stage IVにおいて
顕著な減少が認められ、エイズ病態を明確に判定しうる
ことを確認した。
後、高圧濾紙電気泳動にかけ、中性糖画分を集め、脱塩
後、RCA120-HPLC を行うとともに、エキソグリコシダー
ゼによる逐次分解にかけ、酵素処理後の各段階で反応液
をＢｉｏ−ｇｅｌ Ｐ−４（-400mesh）を用いたカラム
クロマトグラフィーで分析し、（Ｇ1 ＋Ｇ2 ）／Ｇ0比
を計算した。Ｇ0 とはガラクトースを含まない糖鎖、Ｇ
1 およびＧ2 はガラクトースを、それぞれ１分子及び２
分子含有する糖鎖を意味する。その結果は図２に示す。
表１のｔ検定に示されるごとく、stage III において有
意に（Ｇ1 ＋Ｇ2 ）／Ｇ0 値の増加、stage IVにおいて
顕著な減少が認められ、エイズ病態を明確に判定しうる
ことを確認した。
【００２０】
【表１】
【００２１】実施例２ 市販されているプロテインＡ（例えばシグマ、ファルマ
シアなど）あるいはプロテインＧ（例えばシグマ、ファ
ルマシアなど）と標識レクチン（例えばペルオキシダー
ゼ標識、ビオチン標識など）（市販品としては例えばシ
グマ、生化学工業など）とを組み合わせて本発明のエイ
ズ検査試薬とした。
シアなど）あるいはプロテインＧ（例えばシグマ、ファ
ルマシアなど）と標識レクチン（例えばペルオキシダー
ゼ標識、ビオチン標識など）（市販品としては例えばシ
グマ、生化学工業など）とを組み合わせて本発明のエイ
ズ検査試薬とした。
【００２２】実施例３ 実施例２に示した構成要素以外にプロテインＡなどを固
定（結合）させる固相体（例えばニトロセルロースメン
ブレン、カップ）、ブロッキングバッファー（例えばＢ
ＳＡやゼラチンを含むリン酸バッファーやトリスバッフ
ァー）、標識酵素（例えばストレプトアビジン−ペルオ
キシダーゼなど）、酵素基質（過酸化水素水）や発色剤
（例えば４−クロロナフトール）を構成要素とし、本発
明のエイズ検査試薬とした。
定（結合）させる固相体（例えばニトロセルロースメン
ブレン、カップ）、ブロッキングバッファー（例えばＢ
ＳＡやゼラチンを含むリン酸バッファーやトリスバッフ
ァー）、標識酵素（例えばストレプトアビジン−ペルオ
キシダーゼなど）、酵素基質（過酸化水素水）や発色剤
（例えば４−クロロナフトール）を構成要素とし、本発
明のエイズ検査試薬とした。
【００２３】実施例４ 固相面に結合・固定させたプロテインＡ、プロテインＧ
あるいは抗ＩｇＧ抗体とヒト血漿、あるいは血清を反応
させ、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に選択する。
結合したＩｇＧに存在する糖鎖構造を標識レクチン（例
えばペルオキシダーゼ−レクチン）で標識し、レクチン
の糖鎖構造の特異的認識作用により、ＩｇＧ上の糖鎖構
造の変化を検出する。検出法としては、ＩｇＧ糖鎖への
レクチン結合量を発色などのシグナルにより定量する。
レクチンとしてＲＣＡ１２０を用いる。プロテインＡ
（250 μg ／ml）をリン酸バッファー（50mMリン酸塩、
0.15M NaCl, pH7.4 ）に溶解し、その10μl をニトロセ
ルロース膜に結合させる（ドット・プロッティング）。
その後、膜を乾燥後、ブロッキングバッファー（50mMTr
is-HCl, 0.15M NaCl, 0.05 ％NP-40, 2.5％ゼラチン（W
/V), pH7.4 ）でブロッキングを行う。この膜 (IgG-tra
pping membrane)（以下、ＩＧＧＴＭと略記）をエイズ
患者及び健常人血清中ＩｇＧ糖鎖の検討に使用した。
あるいは抗ＩｇＧ抗体とヒト血漿、あるいは血清を反応
させ、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に選択する。
結合したＩｇＧに存在する糖鎖構造を標識レクチン（例
えばペルオキシダーゼ−レクチン）で標識し、レクチン
の糖鎖構造の特異的認識作用により、ＩｇＧ上の糖鎖構
造の変化を検出する。検出法としては、ＩｇＧ糖鎖への
レクチン結合量を発色などのシグナルにより定量する。
レクチンとしてＲＣＡ１２０を用いる。プロテインＡ
（250 μg ／ml）をリン酸バッファー（50mMリン酸塩、
0.15M NaCl, pH7.4 ）に溶解し、その10μl をニトロセ
ルロース膜に結合させる（ドット・プロッティング）。
その後、膜を乾燥後、ブロッキングバッファー（50mMTr
is-HCl, 0.15M NaCl, 0.05 ％NP-40, 2.5％ゼラチン（W
/V), pH7.4 ）でブロッキングを行う。この膜 (IgG-tra
pping membrane)（以下、ＩＧＧＴＭと略記）をエイズ
患者及び健常人血清中ＩｇＧ糖鎖の検討に使用した。
【００２４】エイズ患者及び健常人血清をブロッキング
バッファーで希釈後、ＩＧＧＴＭに加え膜上にＩｇＧを
結合させる（60分間、室温）。反応後、これらのＩＧＧ
ＴＭを軽くリンスし、５分間の洗浄後、ビオチン−ＲＣ
Ａ１２０（20μg ／ml）を 500μl 加え、反応させる
（60分間、室温）。反応後、ＩＧＧＴＭを軽くリンス、
５分間の洗浄を２回繰り返し、次にストレプトアビジン
−ペルオキシダーゼを 500μl を加え、反応させる。反
応後、軽くリンス後、５分間の洗浄を２回繰り返す。洗
浄後、ＴＢＳ(20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH7.4) で軽
くリンス後、ペルオキシダーゼの基質溶液（500 μg ／
ml）を加え、発色反応を開始する（５〜10分間）。反応
終了後、蒸留水でＩＧＧＴＭをよく洗浄した後、乾燥
し、ＩＧＧＴＭ上の発色シグナルを定量化する。定量化
には、Dual-wavelength Flying-spotscanner CS 9000
（島津）（λ＝540nm ）を使用した。
バッファーで希釈後、ＩＧＧＴＭに加え膜上にＩｇＧを
結合させる（60分間、室温）。反応後、これらのＩＧＧ
ＴＭを軽くリンスし、５分間の洗浄後、ビオチン−ＲＣ
Ａ１２０（20μg ／ml）を 500μl 加え、反応させる
（60分間、室温）。反応後、ＩＧＧＴＭを軽くリンス、
５分間の洗浄を２回繰り返し、次にストレプトアビジン
−ペルオキシダーゼを 500μl を加え、反応させる。反
応後、軽くリンス後、５分間の洗浄を２回繰り返す。洗
浄後、ＴＢＳ(20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH7.4) で軽
くリンス後、ペルオキシダーゼの基質溶液（500 μg ／
ml）を加え、発色反応を開始する（５〜10分間）。反応
終了後、蒸留水でＩＧＧＴＭをよく洗浄した後、乾燥
し、ＩＧＧＴＭ上の発色シグナルを定量化する。定量化
には、Dual-wavelength Flying-spotscanner CS 9000
（島津）（λ＝540nm ）を使用した。
【図１】 ＩｇＧの糖鎖構造を示す図である。
【図２】 健常者およびエイズウイルス感染者ＣＤＣ分
類 stage II 〜IV患者血清中ＩｇＧ糖鎖の（Ｇ1 ＋Ｇ
2 ）／Ｇ0 を示す図である。
類 stage II 〜IV患者血清中ＩｇＧ糖鎖の（Ｇ1 ＋Ｇ
2 ）／Ｇ0 を示す図である。
Claims (7)
- 【請求項１】 エイズ検査試薬において、標識レクチン
を必須の構成要素とするエイズ検査試薬。 - 【請求項２】 エイズ検査試薬において、固相化プロテ
インＡ、固相化プロテインＧまたは固相化抗ＩｇＧ抗
体、及び標識レクチンを必須の構成要素とする請求項１
記載のエイズ検査試薬。 - 【請求項３】標識レクチンが標識ガラクトース欠損糖鎖
認識レクチンである請求項１または２項記載のエイズ検
査試薬。 - 【請求項４】標識ガラクトース欠損糖鎖認識レクチンが
コンカナバリンＡまたはＲＣＡ１２０である請求項３項
記載のエイズ検査試薬。 - 【請求項５】エイズの病態を検査する方法であって、 ａ）固相化プロテインＡ、固相化プロテインＧまたは固
相化抗ＩｇＧ抗体に生体試料を反応させ、ＩｇＧを結合
させる工程、 ｂ）洗浄後、標識レクチンを反応させる工程、及び ｃ）洗浄後、結合した標識レクチン量を測定する工程か
らなるエイズの検査方法。 - 【請求項６】標識レクチンが標識ガラクトース欠損糖鎖
認識レクチンである請求項５項記載のエイズの検査方
法。 - 【請求項７】標識ガラクトース欠損糖鎖認識レクチンが
コンカナバリンＡまたはＲＣＡ１２０である請求項６項
記載のエイズの検査方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP238894A JPH07209301A (ja) | 1994-01-14 | 1994-01-14 | エイズ検査試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP238894A JPH07209301A (ja) | 1994-01-14 | 1994-01-14 | エイズ検査試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07209301A true JPH07209301A (ja) | 1995-08-11 |
Family
ID=11527854
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP238894A Pending JPH07209301A (ja) | 1994-01-14 | 1994-01-14 | エイズ検査試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07209301A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007136001A1 (ja) | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Osaka University | 炎症性腸疾患の鑑別判断方法 |
| JP2011247665A (ja) * | 2010-05-25 | 2011-12-08 | Gp Biosciences Ltd | 炎症性腸疾患等慢性炎症の鑑別方法 |
-
1994
- 1994-01-14 JP JP238894A patent/JPH07209301A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007136001A1 (ja) | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Osaka University | 炎症性腸疾患の鑑別判断方法 |
| US8043832B2 (en) | 2006-05-19 | 2011-10-25 | Osaka University | Method for determination of inflammatory bowel disease |
| JP2011247665A (ja) * | 2010-05-25 | 2011-12-08 | Gp Biosciences Ltd | 炎症性腸疾患等慢性炎症の鑑別方法 |
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