WO2007136001A1

WO2007136001A1 - 炎症性腸疾患の鑑別判断方法

Info

Publication number: WO2007136001A1
Application number: PCT/JP2007/060257
Authority: WO
Inventors: Eiji Miyoshi; Hideki Iijima; Shinichiro Shinzaki; Masahiko Tsujii; Norio Hayashi; Takatoshi Nakagawa; Akihiro Kondo; Naoyuki Taniguchi
Original assignee: Osaka University
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-18
Publication date: 2007-11-29
Also published as: EP2034305A4; EP2034305A1; US20090186371A1; ES2430995T3; JPWO2007136001A1; EP2034305B1; US8043832B2; JP4973885B2

Description

明細書

炎症性腸疾患の鑑別判断方法

技術分野

[0001] 本発明は炎症性腸疾患の鑑別判断方法に関する。詳細には、本発明は炎症性腸疾患患者が潰瘍性大腸炎である力、クローン病であるかを鑑別判断する方法に関する背景技術

[0002] 潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患（IBD)は、現在全国で約 12万人の患者が存在する難治性疾患として知られている。現在、 IBD患者が潰瘍性大腸炎であるかクローン病であるかの鑑別診断は、主に特徴的な注腸造影の所見、内視鏡の所見、類上皮細胞肉芽腫の有無を観察する病理学的所見、血便の有無、肛門病変の合併などを観察する臨床症状の相違に基づき行われてレ、る。かかる鑑別診断のためには、内視鏡による検査が必須となり、患者への負担が大きい。非侵襲的で客観的判断の可能な鑑別診断法が求められている。

[0003] 免疫グロブリン G (以下「IgG」とする）は正常ヒト血清中の生体内に存在する免疫グロブリンの約 75— 85%を占める糖タンパク質である。 IgGは図 1に示すように同一の 2本の H鎖と同一の 2本の L鎖から構成されている対称形の構造の分子である。

[0004] IgGの Fc領域には糖鎖が存在しており、 IgG全体の立体構造を保つ上で重要な働きを有し、また Fc o/レセプターや補体などのエフェクター分子との相互作用に大きな影響を与えることが知られている。このような糖鎖として図 2に示す 16種類が存在することが知られている。

[0005] 健常人においては IgGの 16種類の糖鎖の相対比率はほぼ一定である力骨髄腫患者やリューマチ患者の糖鎖は特異的な相対比率を示すことが知られている。例えば慢性関節リウマチ患者にぉレ、ては、ガラクトースを有してレ、なレ、ァガラクト糖鎖が多数存在することが報告されている。係る知見に基づき、慢性関節リウマチの診断を行う方法 (特許文献 1)が提案され、また糖鎖の相対比率を得る手段 (非特許文献 1)やガラクトース欠損糖鎖を有するァガラタト IgGに対する血中抗体 (CARF)を測定する手段（非特許文献 2)等が開発されている。しかし、この CARFはリウマチの活動性にはよく相関するものの、必ずしも血中ァガラクト IgGの量を反映するものではないことが確認されている。

[0006] また、 IgG糖鎖の変化に基 Vヽてエイズの病態を診断するエイズ検査試薬 (特許文献

2)、肝疾患、悪性高血圧疾患、免疫グロブリン A腎症、小児疾患等の診断方法 (特許文献 3)が提案されている。特に炎症性疾患全般において、ァガラタト IgGが増えることは古くから報告されている (非特許文献 3)。炎症性疾患のなかでも特に自己免疫疾患にぉレ、てァガラタト IgG量が上昇することが報告されてレ、る。このような疾患でァガラタト IgGが上昇する機序としては、 TNFや IL6など急性期のサイト力インの関与が示唆されているものの、詳細は明ら力ではない。炎症性腸疾患においても、クローン病や潰瘍性大腸炎でァガラクト IgGが健常人と比べて上昇することが報告されており、しかもその値が C反応性蛋白（CRP)や臨床症状と相関すると言われている (非特許文献 4および 5)。しかしながら、これらの報告は、 IgG糖鎖の全分画におけるァガラクト IgGの比率を指標として検討されたものであり、特定の糖鎖間の比率に基づいて炎症性腸疾患を鑑別診断する方法にっレ、て言及した従来技術はなヽ。

[0007] 特許文献 1 :特開平 8 - 220099号公報

特許文献 2 :特開平 7— 209301号公報

特許文献 3：特開平 8— 82623号公報

非特許文献 1 : TAKARA BIO ONLINE CATALOGUE「PALSTATION (登録商標）を用レヽたヒト IgGの糖鎖分析」 http：〃 bio.takara.co. jp/catalog/catalog_d.asp?CJD=C07 30 (平成 18年 3月 15日ダウンロード）

非特許文献 2：血清中抗ガラ外ース欠損 IgG抗体測定用医薬品ピコルミ (登録商標） CA'RF添付書類

非特午文献 3： Thomas W. Rademacher et al., Springer Semin Immunopathol, Vol. 10 , 231-249 (1998)

非特許文献 4 : R Dube et al" Gut, Vol. 31, 431 - 434 (1990)

非特許文献 5 : Mae F. Go et al., J. Clin. Gastroenterol. Vol 18， 86-87 (1994) 発明の開示

|J正された，紙 (規則 9 . 発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、炎症性腸疾患を鑑別判断するための、客観的かつ非侵襲的方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明は、炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性の高い患者より採取された血清中の免疫グロブリン G糖鎖分画において、式 (I)

[化 1]

GN M ^F'

M—— GN GN ）

GN M"

で示される GO糖鎖量と、式 (II)

[化 2]

で示される G2糖鎖量

(上記式中、 Gはガラクトース、 Mはマンノース、 GNは N—ァセチルダルコサミン、 F はフコースを示す）

の相対比を測定し、得られた相対比に基づき患者の鑑別判断を行う、炎症性腸疾患の判定方法を提供する。

[0010] 本発明の方法において、式 (I)で示される GO糖鎖量の式 (II)で示される G2糖鎖量に対する相対比（G0/G2)を測定する。該比が一定の値より高い場合にクローン病であると判定される。一方、該比が一定の値より低い場合には、潰瘍性大腸炎と判定される。

発明の効果

[0011] 本発明により、炎症性腸疾患を発症している、あるいはその疑いの高い患者において、潰瘍性大腸炎とクローン病の鑑別診断を行うことができる。本発明の方法は患者より採取された末梢血を用レ、るものであり内視鏡による診断を必須とする従来の方法と比して患者への負担は格段に低レ、。

更に具体的に述べれば、本発明は、炎症性腸疾患患者から採取した末梢血を用いて、該腸疾患が潰瘍性大腸炎に由来するものか或いはクローン病に由来するもの力、を鑑別判断し得る方法に関するものである。本発明の方法により、従来は特徴的な注腸造影の所見、内視鏡の所見、類上皮細胞肉芽腫の有無を観察する病理学的所見、血便の有無、肛門病変の合併などを観察して総合的に判断する必要のあったこれらの鑑別を、例えば血便の有無、肛門病変の合併等の非侵襲的所見から炎症性腸疾患と判断される患者の末梢血を用いて、当該炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎に由来するものかあるいはクローン病に由来するもの力、を鑑別判定し得るので、患者の肉体的、精神的負担を大いに軽減できるという効果を奏する。また、本発明の方法に用いられる G0ZG2比は炎症性腸疾患の予後予測マーカーとしても有用である。図面の簡単な説明

[図 l]IgG抗体の模式図を示す。

[図 2]IgG抗体の糖鎖全 16種類を示す。

[図 3]HPLCの各ピークと図 2に示す各糖鎖構造との対応関係を示す。

[図 4]HPLCパターンと G0/G2測定方法を示す

[図 5]健常人由来の IgGの糖鎖の HPLCパターンの一例を示す。

[図 6]クローン病患者由来の IgGの糖鎖の HPLCパターンの一例を示す。

[図 7]潰瘍性大腸炎患者由来の IgGの糖鎖の HPLCパターンの一例を示す。

[図 8]クローン病患者 (CD)、潰瘍性大腸炎患者 (UC)および健常人 (HC)の GO/

G2比の分布を示す。

[図 9]クローン病患者 (CD)、潰瘍性大腸炎患者 (UC)および健常人 (HC)の GO/ G2比の分布を示す。

[図 10]クローン病患者 (CD)および潰瘍性大腸炎患者 (UC)の疾患活動性および罹病範囲と G0/G2比の関係を示す。

[図 11A]クローン病患者 (CD)、潰瘍性大腸炎患者 (UC)および健常人 (HC)のガラクトース欠損（aGAL)陽性/陰性率を示す。 [図 11B]クローン病患者と健常人の鑑別判断のための G0/G2比および ASCAレべルについての ROC曲線を示す。

[図 11C]クローン病患者と潰瘍性大腸炎患者の鑑別判断のための G0/G2比および ASCAレベルについての ROC曲線を示す。

[図 11D]クローン病患者（CD)における G0ZG2比と ASCAレベルの関係を示す。

[図 11E]潰瘍性大腸炎患者 (UC)における G0ZG2比と ASCAレベルの関係を示す

[図 12]慢性関節リウマチと潰瘍性大腸炎を併発している患者の糖鎖の HPLCパターンを示す。

[図 13A]クローン病患者 (CD)、潰瘍性大腸炎患者 (UC)および健常人 (HC)の形質細胞における j3 _ 1， 4 _ガラクトシルトランスフェラーゼ（ /3 4GalT) 1の相対的 mRN A発現を示す。

[図 13B]クローン病患者（CD)、潰瘍性大腸炎患者 (UC)および健常人 (HC)の B細胞における β 4GalTlの相対的 mRNA発現を示す。

[図 13C]クローン病患者 (CD)、潰瘍性大腸炎患者 (UC)および健常人 (HC)の形質細胞における β 4GalTの酵素活性を示す。

[図 14]クローン病患者（CD)および潰瘍性大腸炎患者 (UC)の血清中の抗ァガラクト IgG抗体量を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0013] 本発明の方法は、患者より採取された末梢血より得られた血清を用いる。本明細書および請求の範囲において「炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性の高い患者」は、従来から知られた炎症性腸疾患と関連づけられる臨床所見により炎症性腸疾患の罹患が確認された患者、および臨床所見より炎症性腸疾患に罹患している疑いが高いと考えられる患者である。

[0014] 本発明の方法においては、患者の末梢血より得られた血清中の IgGの糖鎖構造を調べる。患者の末梢血より血清を得る方法は、現在臨床検査で採用されているいずれの方法を用いても良い。

[0015] 得られた血清より IgGを得、その糖鎖パターンを解析する。前述の非特許文献 1、非特許文献 3等に記載されているように、血清中の IgG糖鎖パターンを調べる方法はレ、くつか報告されている。本発明においては、血清中の IgGの糖鎖中の式 (I)で示される GO糖鎖と式 (II)で示される G2糖鎖の相対比を調べることができる方法であれば、いずれの方法を採用してもよい。例えば糖鎖を単離し、蛍光標識し、これを HPLC で展開して GO糖鎖と G2糖鎖の相対比を調べる方法が例示される。

[0016] 一の態様において本発明は、 1)炎症性腸疾患患者の血清中の免疫グロブリン Gを単離する工程、

2)免疫グロブリン Gより糖鎖を切り出す工程、

3) G2糖鎖量と GO糖鎖量の相対比を測定する工程、および

4)得られた相対比によって、炎症性腸疾患を鑑別する工程

を含む。

[0017] 各工程は、いずれも公知の方法を採用して行えばよぐ特に限定されるものではなレ、。例えば血清からプロテイン Aを用いて IgGを単離し、次いで N—ダリカナーゼにて糖鎖を遊離させ、遊離された糖鎖を蛍光標識したものを HPLCで展開することによつて、患者の IgG糖鎖のパターンを測定することができる (例えば非特許文献 1等)。

[0018] 具体的に説明する。プロテイン Aは IgGと特異的に結合する。このプロテイン Aを担体に結合させたカラムが市販されている。力かるカラムに血清を作用させることにより、 IgGを単離することができる。

[0019] 得られた IgGより糖鎖を切り出す。糖鎖の切り出しは、ヒドラジン分解、 Nァセチルイ匕処理等を用いる化学的方法、 N—ダリカナーゼ等の酵素を作用させる方法が知られており、いずれを用いてもよい。 IgGより切り出された糖鎖を、ピリジルァミノ（PA)ィ匕する。得られた PAィ匕糖鎖を次いで、市販の糖鎖分析用カラムを用いて、カラム記載のプロトコルに従い HPLC分析する。

[0020] 図 3に、糖鎖分析 HPLCパターンを示す。図 2に示す各 IgG糖鎖に対応するピークを各アルファベットで示した。図 4に G0/G2測定の概念図を示す。本態様においては GO糖鎖量と G2糖鎖量の相対比として、 GO糖鎖のピークおよび G2糖鎖のピークの高さの比を用いる。

[0021] 本発明の判定方法においては、抗 IgG (GO糖鎖）抗体および抗 IgG (G2糖鎖）抗体をそれぞれ作成し、これらを用いて ELISA法等の常套の方法にて患者の血清中の IgG糖鎖パターンを調べてもよい。抗体は、 IgG (G0糖鎖）と IgG (G2糖鎖）を特異的に区別し、その相対的な量比を測定することが可能なものであれば、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよレ、。抗体の調製、 ELISA法を利用した定量法はよく知られており、公知のいずれの方法によって行ってもよい。

[0022] 本発明においては、上記のようにして得られる血清中の IgG糖鎖における G2糖鎖と GO糖鎖の相対比に基づき、炎症性腸疾患の患者の鑑別判定を行う。 G2糖鎖に対する GO糖鎖の相対比（G0/G2)が予め設定された値より高い場合に、炎症性腸疾患はクローン病である、あるいはクローン病である可能性が高いと判定される。炎症性腸疾患患者にぉレ、て該相対比が予め設定された値より低レ、場合には、潰瘍性大腸炎である、あるいは潰瘍性大腸炎である可能性が高いと判定される。

[0023] さらに、患者の炎症性腸疾患は、 G0ZG2比がより高いほど重症であると判定、あるいは将来重症になると予測される。

[0024] ここで「予め設定された値」は、 IgG糖鎖パターンの測定プロトコルを決定した後、該プロトコルにて、従来からの判定基準によりクローン病であるカ潰瘍性大腸炎であるかの診断がされている患者の血清、および健常人の血清についてのデータを元に設定される値である。

[0025] 例えば、本願明細書に記載の実施例において用いた方法である、 G2糖鎖と GO糖鎖の量の相対比として、 IgGから糖鎖を単離し、 GO糖鎖と G2糖鎖の量の相対比（G 0/G2)を、それぞれの糖鎖の HPLCピークの高さの比として求めた場合、 G0/G2 が 1. 5以上、好ましくは 2. 0以上、より好ましくは 2. 1以上である場合に患者はクローン病である、あるいはクローン病である可能性が高いと判定される。一方、炎症性腸疾患患者において G0/G2が 2. 1未満である場合、好ましくは 2. 0未満である場合、さらに好ましくは 1. 5未満である場合に患者は潰瘍性大腸炎である、あるいは潰瘍性大腸炎である可能性が高いと判定される。なお、この値は限定的ではなぐ当業者は当該プロトコルにて症例数を増やして検討し、さらに信頼性の高い値を得ることができる。

[0026] なお、慢性関節リウマチ患者においてァガラタト IgG含量が高いことが知られており、その他の炎症性疾患においても IgGの糖鎖パターンに変化が見られることが知られている。本発明による炎症性腸疾患の判定に際しては患者が併発する疾患について考慮する必要がある。

[0027] 本発明の別の態様において、前記 G0ZG2が予め設定された値より低い場合に該患者の予後が良好であると判定される。本態様における「予め設定された値」は健常人の G0ZG2比に基づき設定され、例えば健常人の G0/G2比の平均 + 2SDであり、その値として 1. 4が例示される。この値が限定的でないことは前記と同様である。

[0028] 本発明のキットは、本発明の判定方法を実施するため、 GO糖鎖量および G2糖鎖量を検出するための試薬を含む。前述のように患者の血清中の GO糖鎖量および G2 糖鎖量は、 HPLCによって、あるいは抗 IgG (GO糖鎖）抗体および抗 IgG (G2糖鎖）抗体を用いる ELISA法等によっても調べることができる。よって、 GO糖鎖量および G 2糖鎖量を検出するための試薬には、これら方法に使用されるあらゆる試薬が包含される。

[0029] キットの一例は、（1)血清中の IgGを単離するための試薬、；および（2) IgGより糖鎖を切り出すための試薬、を含むキットである。「血清中の IgGを単離するための試薬」には、当該目的に使用可能なあらゆる手段が包含され、例えばプロテイン Aまたは G を有するカラムが挙げられる。本キットはさらに、切り出した糖鎖を修飾するための試薬、例えば 2—アミノビリジン、および/または糖鎖分析用 HPLCカラムを含んでもよレ、。

[0030] キットの別の例は、例えば ELISA法に有用なキットであり、（1)抗 IgG (GO糖鎖）抗体；（2)抗 IgG (G2糖鎖)抗体；（3) IgG (GO糖鎖）および IgG (G2糖鎖）を固定化するための固相支持体、例えばマイクロプレート、プラスチックチューブまたはビーズ；および (4)検出用酵素、例えば西洋ヮサビペルォキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、およびその基質、を含む。本キットはさらに適当な希釈液、洗浄液、標準物質を含んでもよい。

[0031] この度、潰瘍性大腸炎患者においてクローン病患者および健常人と比較して糖転移酵素である _ 1， 4 _ガラクトシルトランスフェラーゼ（ /3 4GalT) 1の mRNAの発現が上昇しており、より高い 4GalT活性が観察されることが明らかとなった（実施例 6)。よって本願は、炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性の高い患者において i3 1, 4 ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を測定すること、およびその測定結果に基づき患者の鑑別判断を行うことを含む、炎症性腸疾患の判定方法を包含する。

実施例

[0032] 実施例 1

表 1に記載のクローン病患者（CD) 27例、潰瘍性大腸炎患者 (UC) 27例および健常人 (HC) 10例の末梢血より常法により血清を得た。なお、患者には関節炎リウマチに罹患してレ、る者はレ、なかった。

[0033] [表 1]

CD UC HC

人数（男 Z女） 27 (22/5) 27 (1 6/1 1 ) 1 0 (6/4) 年齢 39 ± 16 40 ± 1 6 37 ± 12

CRP 2. 1 ±4 1. 7±4

[0034] 血清からの IgGの精製はタカラバイオ（株）の ImmunoPure IgG Purification Kitを用レ、、キットに添付されたプロトコルに従って IgGを含む画分を集めた。

得られた IgG画分の約 2nmol相当をマイクロ遠心チューブに投入して凍結乾燥し、 lOOmM NH HCO (pH8. 6) 40 μ 1と水 20 μ 1をカロ免て溶角早した。ここへグリぺ

4 3

プチダーゼ F (タカラバイオ（株））を 20 μ l(lOmU)加え、 37°Cでー晚インキュベーシヨンした。反応後、 lOOmM酢酸アンモニゥム緩衝液（ρΗ4· 0)50μ1を添カロし、 37°C にて 1時間インキュベーションし、グリコシルァミンからアンモニアを遊離させて、糖鎖を単離した。

[0035] 得られた液を PALSTATION (登録商標）（タカラバイオ (株））により、添付のプロトコルに従いピリジルアミノィ匕（PA化）した。

[0036] PAィ匕糖鎖の約 1Z10量 (約 200pmol相当）を溶離液 B20。/o、溶離液 A80%を含む液で平衡化した糖鎖分析用 ODS シリカカラム PALPAK Type R (登録商標タカラバイオ株式会社)へ注入し、溶離液 Bの割合を 60分かけて 50%まで直線的に上昇させて、糖鎖を溶出した。糖鎖の検出は、蛍光検出器 (Ex320nm Em400nm )により行った。

[0037] カラム： PALPAK Type R (4.6 ππηΦ X 250 mm)タカラバイオ（株）

溶離液 A: 10 mM酢酸一トリメチルァミン (pH3.8)

溶離液 B： 0.5% 1-ブタノール含有溶離液 A

流速： 1.0 ml/min

カラム温度： 40°C

蛍光検出： Ex320nm Em400nm

[0038] 図 5〜7に健常人、クローン病患者、潰瘍性大腸炎患者の代表的な HPLCパターンを示す。 G0/G2は、上記式 (I) (図 2の E)で示される糖鎖（GO糖鎖）およびで式（

II) (図 2の H)で示される糖鎖（G2糖鎖）のピーク高さの比である。患者の背景は下記のとおりである。

[0039] 図 5 :

健常人 58歳男性 G0/G2 = 0. 57

図 6 :

クローン病患者 17歳男性大腸型: G0/G2 = 7. 93

図 7 :

潰瘍性大腸炎患者 17歳男性全大腸炎型: G0/G2 = l . 21

[0040] また、全症例の G0/G2の値の分布を図 8に示した。 HPLCのパターンは、クローン病群と、潰瘍性大腸炎および健常人群に分類された。クローン病患者全症例において、 GO糖鎖は G2糖鎖より高いピークを呈した。 G0/G2の比が 2. 1以上を陽性とすると、健常人は全例陰性であつたが、クローン病患者の 81 %、潰瘍性大腸炎患者では 11%が陽性であった。一方、 1. 5以上を陽性とすると、クローン病で全例が陽性であり、潰瘍性大腸炎の 37%、健常人の 20%が陽性であった。カットオフ値を 1. 5、 2. 0、 2. 1とした場合の、各群に含まれる人数を表 2に示す。

[0041] [表 2] G 0 / G 2のカットオフ値と陽性率

力ットオフ値 CD UC HC

≥ 2. 1 22/27 3/27 0/ 10

(8 1%) (1 1%) (0%)

≥ 2. 0 23/27 4/27 1/10

(85%) (1 5%) (10%)

≥ 1. 5 27/27 1 0/27 2/10

(100%) (37%) (20%) 実施例 2

クローン病患者 (CD) 45例、潰瘍性大腸炎患者 (UC) 42例、および健常人 (HC) 25例の血清を用いて、実施例 1と同様の実験を行った。詳細な患者特性は表 3に示す。

[表 3]

患者特性

CO UC HC

n= 45 n= 42 25 男性/女性 35 /10 26 /16 15 /1Q 年齡（年），平均（SD) 38.8 (15.4) 40.0 (15.4) 37.6 (11.7) 喫 ¾者， n (%) 15 (33) 1 (17) 6 (?_4) 診断時の平均年齡（年），平均（SD) 28.9 (13.7) 35.0 (15.2)

騰外科手銜（盲縢炎手術を含む) (50 1 (5)

職外徴候， η ί%) 4 (9) 2 (5)

処置：

サラゾスルファピリジン / メサラジン， η (%) 38 (84) 35 {83)

ステロイド, η (%) 4 (S) 19 (45)*

6- Ρ/ΑΖΑ, π (%) 4 (9) f (2)

インフリキシマブ. η (¾) 4 (9) 0 «)

抗生物貧. (¾) 5 (11) 2 (5)

完全静脈栄養/栄養療法， η (%) 29 (64)* 4 (10)

簇勉置， η (%} 1 (2) 2 C5)

疾患置 , π

小縢 / 結觴 / 两方 9/8/28

全大腸/左側大腸 / 直腸および S字結腸 24/10/3

瘐患學動 , n

炎症 / 狭窄 / m 13/20/12

GRP. mg/dS , (SD) 1.6 (3.3) 1.7 (3.5)

CDAI . 平均 (SO) 197 (102}

CAI , 平均（SD) 5.7 (5.7)

P<0,001 血清 IgGはプロテイン Gカラム（Amersham Biotech. Bucks, UK)を用いて精製した。詳細には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)で半分に希釈した血清をプロテイン Gカラムにロードした。次いでカラムを最低 10カラム量の PBSで洗浄し、その後同量の 10 mM重炭酸アンモニゥムで洗浄した。カラムに結合した IgGを 0. 1Mトリフルォロ酢酸 (pH2. 2)で溶出した。 IgGの濃度は、 Nanodrop ND-1000 spectroscopy (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE)により 280nmにて測定した。

[0044] 精製した 0 (10_ 2(¾11101)のサンプルを3 66(1 & ンステム(1^1^0^0 Corp., K ansas City, MO)により乾燥した後、 20 μ 1の lOOmM重炭酸アンモニゥムに溶解した。 0. 5mUグリコぺプチダーゼ F (タカラバイオ（株））とー晚 37。Cでインキュベーションし、 IgGから N結合糖鎖を遊離させた。この糖鎖をさらに 50mM酢酸アンモニゥム（p H4. 0)と 30分間インキュベーションし、凍結乾燥した。

[0045] GlycoTag (タカラバイオ (株））を製造元のプロトコルにしたがい使用し、遊離させた糖鎖を 2 -アミノビリジンで標識した。過剰な 2 _アミノピリジンを Cellulose Cartridge Glycan preparation kit (タカラバイオ（株））により除去し、次いでその糖鎖を 2M酢酸と 80°Cで 2時間インキュベーションしてシアル酸を除去した。

[0046] PA化糖鎖を逆相 HPLCシステム（Waters Corp., Milford, MA)により分析した。

カラム： PALPAK Type R-MB (2 ππηΦ X 150 mm、タカラバイオ（株））

溶離液 A: 10mMリン酸ナトリウム緩衝液 (ρΗ4· 4)

溶離液 Β : 0. 5% 1ーブタノール含有リン酸ナトリウム緩衝液

流速： 0· 5mレ min

カラム温度： 40°C

溶離液 B (0— 50%勾配） 30分および溶離液 B (50%) 10分にて糖鎖を溶出した。糖鎖の検出は、蛍光検出器（Waters 2475) (Ex320nm、 Em400nm)にて行った。

[0047] クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者の G0ZG2比は健常人の G0ZG2比よりも有意に高かった (クローン病患者（平均土 SD = 2. 33 ± 1. 58) ;潰瘍性大腸炎患者（1. 24± 0. 78) ;健常人 (0. 69 ± 0. 34)、クローン病患者 vs.健常人、潰瘍性大腸炎患者 vs.健常人のいずれも P< 0. 01、図 9)。さらに、クローン病患者の G0/ G2比は潰瘍性大腸炎患者の G0/G2比よりも有意に高かった (P< 0. 01、図 9)。

[0048] 実施例 3

G0/G2比が臨床パラメーターと相関するかついて検討した。疾患活動性は、クローン病患者についてはクローン病活動指数（CDAI)、潰瘍性大腸炎患者については潰瘍性大腸炎活動指数 (CAI)により決定した。疾患活動期のクローン病患者 (C DAI > = 150)の G0/G2比は、緩解期の患者（CDAI< 150)よりも有意に高かつた（pく 0. 05、図 10A)。また、炎症が回腸に限定されない罹病範囲の広いクローン病患者（ウィーン分類のカテゴリー L2および L3)の G0ZG2比は、回腸末端のみに炎症が見られる患者 (カテゴリー L1)よりも有意に高かった (pく 0. 01、図 10B)。同様に、疾患活動期の潰瘍性大腸炎患者 (CAI > = 6)の G0ZG2比は、緩解期の患者（CAIく 6)よりも有意に高かった（p< 0. 01、図 10C)。さらに、罹病範囲の広い（大腸全体)潰瘍性大腸炎患者の G0ZG2比は、左側の結腸のみが罹患している患者よりも有意に高力た（図 10D)。なお、 G0/G2比と CRP値、発症年齢または罹病期間との間に相関は見られな力、つた (データ非提示)。

[0049] 実施例 4

炎症性腸疾患の血清マーカーとしてのガラクトース欠損 IgGの有効性について検討した。 G0/G2比のカットオフ値を 1. 4 (健常人の G0/G2比の平均 + 2SD)として、 IgGのガラ外ース欠損の陽性/陰性 (aGAL ( + ) / (—））を判断した。その結果、クローン病患者の 73%、潰瘍性大腸炎患者の 33%、および健常人の 0%が陽性であった。各群間の差は有意であった（pく 0. 01、図 11A)。

[0050] 最も一般的なクローン病患者のマーカーである抗サッカロマイセス'セレヴイシェ抗体 (ASCA)のレベルを測定し、 G0/G2比と比較した。血清中の ASCAの濃度は、 ASCA IgG ELISA kit (Genesis Diagnostics, Cambridge shire, UK)により製造元の説明にしたがい測定し、 10U/ml以上を陽性とした。 ROC (Receiver operated charact eristic)曲線および ROC曲線下面積 (AUC)により、 G0ZG2比の感度および特異性は、クローン病患者と健常人との相違に関して ASCAよりも高いことがわかった (G 0/G2比の AUCvs. ASCAの AUC = 0. 926 (95%CI、 0. 872— 0. 980) vs. 0. 815 (95%CI、 0. 732-0. 897)；図 11B)。さらに、クローン病患者と清瘍十生大月昜炎患者との相違に関しても、 G0/G2比の感度および特異性は ASCAよりも高いことがわかった（G0/G2比の AUCvs. ASCAの AUC = 0. 849 (95%CI、 0. 780— 0 . 918)vs. 0. 792 (95%CI, 0. 714— 0. 869)；図 11C)。なお、クローン病唐、者および潰瘍性大腸炎患者の G0/G2比および ASCAレベルの分布図において、 GO /G2比と ASCAレベルの間に相関は見られなかった（図 11D、 E)。

実施例 5

ガラクトース欠損 IgG (G0/G2比に基づく）と炎症性腸疾患の予後との関係について調べた。患者がサラゾスルファピリジン（SASP)または 5—ァミノサリチル酸（5_ A SA)のいずれかの投与（コルチコステロイド、抗 TNFひ抗体、および免疫調節薬なし )により 1年以上緩解状態を維持してレ、る場合を「臨床的無再発」と定義した。ガラ外ース欠損の陽性 Z陰性 (aGAL ( + ) / (-) )は、実施例 4と同様に判断した。ガラ外ース欠損陽性の潰瘍性大腸炎患者の臨床的無再発率（11 %)は、陰性患者 (77%) よりも有意に低かった (Pく 0. 001 ;表 4)。また、ガラクトース欠損陽性のクローン病患者の臨床的無再発率は陰性患者と比較して低かった (表 4)。さらに、 CRP値が陰性 « 0. 3mg/dl)の場合も、ガラ外ース欠損陽性の潰瘍性大腸炎患者の臨床的無再発率（0% (0/5) )は陰性患者（90% (19/21) )より有意に低かった (pく 0· 001 )。これらの結果は、 G0/G2比が炎症性腸疾患の予後予測マーカーとなることを示唆する。

[表 4] クロ一ン病（CD)および溴瘍性大腸炎（UC)患者における

臨床的無再発率およびガラクト一ス欠損 (aGAL)

[0052] 参考例 1

潰瘍性大腸炎とリウマチを合併した患者力も採取された血清中の、 IgG糖鎖パターンを実施例 1と同様の方法にて調べた。

潰瘍性大腸炎患者 69歳女性、 CRP5. 43、左側大腸炎型、リウマチを合併。

HPLCパターンを図 12に示す。クローン病患者と同様の糖鎖パターンを示し、 GO /G2 = 2. 70であった。

[0053] 実施例 6 炎症性腸疾患患者の血清中のガラクトシダーゼ (糖鎖末端のガラクトースを遊離させる酵素）の活性を調べた。クローン病患者および健常人の血清を、外腕ガラクトースを有する PAィ匕ニ分岐糖鎖（PA-Sugar chain 001、タカラバイオ (株)）と 3日間 3 7°Cでインキュベートし、この糖鎖を HPLCにより分析した。その結果、クローン病患者および健常人のいずれの血清によっても末端ガラクトースの欠失が観察された（データ非提示）。これは、クローン病患者と健常人の間で /3 _ガラクトシダーゼ活性には差がないことを示唆する。

[0054] 次に、糖転移酵素である β—ガラタトシルトランスフェラーゼの酵素活性を炎症性腸疾患患者において調べた。 IgGは Β細胞および形質細胞により産生されることから、これら細胞における /3—1 , 4_ガラクトシルトランスフェラーゼ（j3 4GalT) lの mR NAの発現をリアルタイム PCRにより調べた。また、形質細胞における /3 4GalTの酵素活性を調べた。

[0055] 末梢血単核細胞（PBMC)を炎症性腸疾患患者および健常人の静脈血から Ficol卜 Hypaque密度勾配遠心により単離した。この PBMCから、 B cell isolation kit IIおよび Plasma cell isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) ίこより添付の説明書にしたがい B細胞および形質細胞を単離した。

[0056] 全 RNAを Isogen- LS (Wako Chemicals, Osaka, Japan)により単離し、 Superscript III first strand system (Invitrogen, Carlsbad, CA)を添付の説明書にしたがい使用して相補的 DNAを合成した。ヒト β 4GalTl (Assay ID: Hs00155245_ml)および内部標準 βァクチン用の設計および標識済みの TaqMan PCRプライマーとプローブのセット（ TaqMan ene Expression Assays, Applied Biosystems, roster City, し A)および ABI PRISM 7900HT Sequence Detection Systemの装置およびソフトウェア（A卯 lied Bio systems)を用いてリアルタイム PCRを行った。

[0057] また、単離した形質細胞を ΙΟΟ μ Ιの TNEバッファー（25mM Tris、 1 % NP _4 0、 ImM EDTA)に溶解し、超音波分解し、 12, OOOgで 10分間 4°Cで遠心し、上清を回収した。 7. 5 μ ΐの細胞サンプルを、 6. 25 μ 1の 80mM UDP ガラクトース（ Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、 5 μ 1(7)0. 77 mM ピリジルァミノ化ァガラタト N結合オリゴ糖（ァクセプター分子として使用）とインキュベートし、 HEPESバッファーで 2 5 / 1に調節した (反応混合物中のァクセプター分子の最終濃度は 77 / Mである）。この混合物を 37°Cで 24時間インキュベートし、反応を 1分間の煮沸により終了させた。次いでサンプルを 12, OOOgで 10分間遠心し、 25 /i lの上清のうち 5 μ ΐを前述のように HPLCで分析した。 j3 4GalT活性は、反応中に上昇したガラクトシノレ化ダリカンのピークの曲線下面積を測定し、その濃度を標準的ガラクトシルイ匕二分岐 PA糖を用レ、て決定することで計算した。 4GalT活性は、ガラクトシルイ匕ダリカンの濃度をインキュベーシヨン時間で割り、 nmol/時間で示した。

[0058] 形質細胞における潰瘍性大腸炎患者の 13 4GalTlの mRNAの発現は、クローン病患者（Pく 0. 05)および健常人（Pく 0. 01)よりも有意に高力、つた（図 13A)。また、潰瘍性大腸炎患者の B細胞では、クローン病患者または健常人と比較して 4Gal T1の mRNAの発現が有意に増加していた（図 13B)。さらに、潰瘍性大腸炎患者の形質細胞では、クローン病患者または健常人と比較して /3 4GalTの活性が大幅に上昇していた（図 13C)。

[0059] 参考例 2

リウマチの診断マーカーである抗ァガラクト IgG抗体のレベルをクローン病患者および潰瘍性大腸炎患者において調べた。抗ァガラクト IgG抗体が陽性であつたのは、 4 1例のクローン病患者のうち 1例（2%)および 38例の潰瘍性大腸炎患者のうち 2例（5 %)のみであった（図 14)。これら 3例の抗ァガラクト IgG抗体陽性のクローン病患者および潰瘍性大腸炎患者では、陰性患者と比較して疾患特性や腸管外合併症の相違は観察されなかった。

以上の結果から、抗ァガラクト IgGの抗体レベルでは炎症性腸疾患の鑑別診断、より具体的にはクローン病と潰瘍性大腸炎の鑑別判断は難しいことが判る。

Claims

請求の範囲 [1] 炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性の高い患者より採取された血清中の免疫グロブリン G糖鎖分画において、式 (I)

[化 1]

GN M ^F

M—— GN GN ）

GN M— で示される GO糖鎖量と、式 (II)

[化 2]

G GN M I

\ Μ—— GN G IN , 、

(_τI_τI)

G GN M / で示される G2糖鎖量

の相対比を測定し、得られた相対比に基づき患者の鑑別判断を行う、炎症性腸疾患の判定方法。

[2] GO糖鎖量の G2糖鎖量に対する相対比 G0ZG2が予め設定された値より高い場合に、炎症性腸疾患患者がクローン病であると判定する、請求項 1記載の方法。

[3] GO糖鎖量の G2糖鎖量に対する相対比 G0ZG2が予め設定された値より低い場合に、炎症性腸疾患患者が潰瘍性大腸炎であると判定する、請求項 1記載の方法。

[4] GO糖鎖量の G2糖鎖量に対する相対比 G0ZG2が高いほど該患者の炎症性腸疾患が重症であると判定する、請求項 1〜3いずれかに記載の方法。

[5] GO糖鎖量の G2糖鎖量に対する相対比 G0ZG2が予め設定された値より低い場合に、該患者の予後が良好であると判定する、請求項 1記載の方法。

[6] 1)血清中の免疫グロブリン Gを単離する工程、

2)免疫グロブリン Gより糖鎖を切り出す工程、 3)該糖鎖における G2糖鎖量と GO糖鎖量の相対比を測定する工程、および

4)得られた相対比によって、炎症性腸疾患を判定する工程

を含む、請求項:!〜 3いずれかに記載の方法。

[7] GO糖鎖量および G2糖鎖量を検出するための試薬を含む、請求項 1〜6いずれかに記載の方法を実施するためのキット。

[8] 以下を含む、請求項 7記載のキット：

1)血清中の免疫グロブリン Gを単離するための試薬；および

2)免疫グロブリン Gより糖鎖を切り出すための試薬。

[9] 以下を含む、請求項 7記載のキット：

1 )抗免疫グロプリン G (GO糖鎖)抗体；

2)抗免疫グロブリン G (G2糖鎖)抗体；

3)免疫グロブリン G (GO糖鎖）および免疫グロブリン G (G2糖鎖）を固定化するための固相支持体；および

4)検出用酵素およびその基質。