JPH07191029A - 蛍光標識試薬の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】スルホン基とカルボキシル基を併せ持つ水溶性
シアニン色素と、アミノ基を有する高分子化合物とを結
合させて蛍光標識試薬を製造する方法において、Ｎ−ア
ルコキシカルボニル−２−アルコキシ−１，２−ジヒド
ロキノリンを作用させ、カルボキシル基とアミノ基を選
択的に結合させることを特徴とする蛍光標識試薬の製造
方法。 【効果】本発明の製造方法によれば、スルホン基とカル
ボキシル基とを併せ持つシアニン色素を用いて水溶性の
高い蛍光標識試薬を高収率で製造することが可能とな
り、高感度で低価格の免疫測定を容易にすることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛍光免疫測定法に用い
る蛍光標識試薬の製造方法に関する。より詳しくは、ス
ルホン基とカルボキシル基とを併せ持つ水溶性シアニン
色素とアミノ基を有する高分子化合物とをカルボキシル
基を介してアミノ基と選択的に結合させることを特徴と
する蛍光標識試薬の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】従来、抗
原、抗体の濃度の測定方法としてはラジオアイソトープ
や酵素で抗原や抗体を標識する方法が用いられてきた
が、これらの方法は感度、安全性などの面で問題があ
り、これらの方法に代わって蛍光色素で抗原や抗体を標
識し、これを用いて抗原や抗体の濃度を測定する方法が
種々研究されている。

【０００３】例えば、特開昭５９−５０１８７３号（米
国特許番号第４８５２８０９号）などでは、光ファイバ
ーの側面に抗原、抗体を結合させ、蛍光色素で標識した
抗体、抗原をこの光ファイバー表面で免疫反応させると
ともに、この光ファイバーに励起光を導波することによ
り、光ファイバー上の蛍光色素を励起させ、生ずる蛍光
を光ファイバーの出射端面で反射させ、光ファイバーの
入射端面から蛍光と残余の励起光を取り出し、これをビ
ームスプリッターを経由することにより分光させ、蛍光
のみを測定する方法が記載されている。

【０００４】従来よりこのような蛍光免疫測定法におい
ては、標識物としてフルオレセインイソチオシアネー
ト、ローダミンイソチオシアネートなどの蛍光色素で修
飾された蛍光標識抗原や蛍光標識抗体が用いられてき
た。しかしながら、このような蛍光標識抗原や蛍光標識
抗体は、一つの抗原又は抗体に結合する蛍光色素の量が
一つであるため，感度の改善が困難であった。また、ロ
ーダミンやフルオレセイン等の蛍光色素は、励起波長が
４００ｎｍ付近であるため、励起光源が大型で、高価で
あるという欠点を持っていた。そのため、これらの蛍光
色素に代えて、６３０ｎｍ帯で励起するシアニン色素で
修飾されたアビジンを用いてビオチン化抗原やビオチン
化抗体を標識することにより、Ｈｅ−Ｎｅレーザを光源
として使用可能な蛍光標識抗原や蛍光標識抗体が開発さ
れている（ＷＯ９０／１３０２９公報）。

【０００５】しかし、従来の蛍光色素は、水溶媒系で溶
けにくく、また溶解しても加水分解を生じるなど大変不
安定であるため、反応試薬の作成が困難であった。そこ
で、この問題を解決するため、スルホン基とカルボキシ
ル基とを併せ持つ水溶性のシアニン色素が開発され、こ
れとアビジン等のアミノ基を持つ化合物との結合には、
カルボジイミド類が縮合剤として使用されてきた（Ｊ．
Ｃ．Ｓｅｅｈａｎ，Ｇ．Ｐ．Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．，７７，１０６７（１９５５））。とこ
ろで、縮合剤としてカルボジイミド類を用いると、スル
ホン基とカルボキシル基とを併せ持つ水溶性のシアニン
色素の場合は、解離度の高いスルホン基の方がやや反応
選択性が高いため、スルホン基が選択的に活性化されて
アミノ基と結合し、その結果遊離のカルボキシル基を有
する水溶性の低い結合体が優先的に生じ、水溶性の高い
遊離のスルホン基を有する結合体の収率が低下するとい
う問題がある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、前
記の課題を解決するために鋭意検討した。その結果、縮
合剤として、ペプチド合成の分野でカップリング試薬と
して知られているＮ−エトキシカルボニル−２−エトキ
シ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（Ｄ．Ｂｅ
ｌｌｅａｕ，Ｇ．Ｍａｌｅｋ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．，９０，１６５１（１９６８））を用いた場合、
スルホン基とカルボキシル基とを併せ持つ水溶性のシア
ニン色素であっても、カルボキシル基とアミノ基が結合
した水溶性の高い結合体が高収率で得られることを見い
出し、さらに研究を進めて本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、（１）スルホン基
とカルボキシル基を併せ持つ水溶性シアニン色素と、ア
ミノ基を有する高分子化合物とを結合させて蛍光標識試
薬を製造する方法において、Ｎ−アルコキシカルボニル
−２−アルコキシ−１，２−ジヒドロキノリンを作用さ
せ、カルボキシル基とアミノ基を選択的に結合させるこ
とを特徴とする蛍光標識試薬の製造方法、（２）スルホ
ン基とカルボキシル基を併せ持つ水溶性シアニン色素が
一般式（Ｉ）、（II）又は（III)により表されるシアニ
ン色素であることを特徴とする上記（１）記載の製造方
法、並びに

【０００８】

【化４】

【０００９】（式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌ
ｉ⁺ 、Ｎ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、またはピリジ
ニウムイオンを表す。）

【００１０】

【化５】

【００１１】（式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌ
ｉ⁺ 、Ｎ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、またはピリジ
ニウムイオンを表す。）

【００１２】

【化６】

【００１３】（式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌ
ｉ⁺ 、Ｎ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、またはピリジ
ニウムイオンを表す。） （３）アミノ基を有する高分子化合物がキトサン、スル
ホン化キトサン、ポリガラクトサミン、ポリノイラミン
酸、抗体、アビジン、およびプロテインＡからなる群よ
り選ばれるものである上記（１）または（２）記載の製
造方法に関する。

【００１４】本発明の方法に用いられる蛍光標識試薬
は、分子中にカルボキシル基とスルホン基とを併せ持つ
シアニン色素であれば特に制限されるものではなく、具
体的には、一般式（Ｉ）に示される構造式を有する色素
ＮＫ３６８２（日本感光色素研究所製）およびその塩、
一般式（II）に示される構造式を有する色素ＮＫ３７５
９（日本感光色素研究所製）およびその塩、一般式（II
I)に示される構造式を有する色素ＮＫ３９４２（日本感
光色素研究所製）およびその塩等が挙げられる。本発明
で用いるこれらのシアニン色素は、赤外域を吸収する蛍
光色素であるため、小型で高出力かつ低価格な半導体レ
ーザを光源として使用することができる。従って、優れ
た蛍光免疫測定法の実現を可能とする。

【００１５】本発明の方法におけるシアニン色素とアミ
ノ基を有する高分子化合物との反応は、Ｎ−アルコキシ
カルボニル−２−アルコキシ−１，２−ジヒドロキノリ
ン（ＡＡＤＱ）により、シアニン色素中のスルホン基と
カルボキシル基のうち、非プロトン性溶媒中でカルボキ
シル基のみを活性化し、アミノ基と反応させることによ
り行われる。ＡＡＤＱ（IV) は、下記反応式に示すよう
に、一般に酸成分であるＲＣＯＯＨと反応して中間体
（Ｖ）を生じ、この中間体は、徐徐に混合酸無水物（V
I）とキノリン（VII)とに分解する。この混合酸無水物
は、アミノ基を有する高分子化合物との反応で直ちにア
ミノ基と反応して酸アミド結合を形成する。従って、酸
成分として前記のようなカルボキシル基とスルホン基と
を併せもつシアニン色素を用いた場合、シアニン色素中
のカルボキシル基が反応し解離しているスルホン基は反
応に関与しないため、高い収率でカルボキシル基とアミ
ノ基との反応結合物を得ることが可能となる。ＡＡＤＱ
としては、前記のＥＥＤＱの他に、一般式（IV) におけ
るＲ’，Ｒ”を種々組合せたものが挙げられる。

【００１６】

【化７】

【００１７】（式中、Ｒ’、Ｒ''はメチル、エチル、プ
ロピル、ブチル、イソブチルおよびペンチルの中から選
ばれるものである。） こうして得られるシアニン色素とアミノ基を有する高分
子化合物との結合物、すなわちシアニン色素標識高分子
化合物は、遊離のスルホン基を有するため水溶性に優れ
ている。

【００１８】ＡＡＤＱによるシアニン色素とアミノ基を
有する高分子化合物との反応は、公知の方法によって行
うことができる。例えば、まず、シアニン色素をジメチ
ルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の有機溶媒に
溶解して氷冷した後、１〜２倍等量のＡＡＤＱを添加
し、０〜４℃に０．５〜４時間静置する。この間に混合
酸無水物が形成される。一方、アミノ基を有する高分子
化合物を水に溶解して、氷冷する。これにシアニン色素
を含むジメチルホルムアミド等の溶液を添加し、０〜４
℃にて２〜１８時間静置して反応させる。反応終了後、
未反応のシアニン色素およびＡＡＤＱ等は除去すること
が好ましく、例えば透析法、遠心分離法、ゲル濾過法又
は限外濾過法などとアルコール、水等による洗浄との併
用によって除くことができる。

【００１９】本発明に用いられるアミノ基を有する高分
子化合物としては、まず、キトサン、スルホン化キトサ
ン、ポリガラクトサミン、ポリノイラミン酸等のアミノ
グリカンおよびそれらの誘導体が挙げられる。これらの
アミノグリカン例えばキトサンの分子量は、通常１０⁴
〜１０⁵ 程度であるが、反応活性基の数を増加させるた
め１０⁵ 〜１０⁶ 程度のものを使用するのが好ましい。
また、キトサンの水溶性を高めるため、スルホン化キト
サンを有利に用いることができる。また、アミノグリカ
ンの他に抗体、アビジン、プロテインＡ、ポリリジン等
のポリペプチド類も本発明に用いられるアミノ基を有す
る高分子化合物として有利に用いることができる。

【００２０】なお、本発明の方法により製造される蛍光
標識試薬は、以下に記載される工程により、蛍光免疫測
定に使用される。説明の便宜上、本発明の方法により製
造されるシアニン色素修飾アビジンを使用する場合を例
にとる。

【００２１】工程Ａ：まず、測定対象物質（例えば、抗
原）に対する抗体を光ファイバーのコア表面に固定す
る。次いで、該抗体の結合した光ファイバーと測定対象
物質（抗原）を特異的に反応させて、光ファイバーのコ
ア表面上に抗体と測定対象物質（抗原）の結合した免疫
複合体（光ファイバーのコア表面−抗体−測定対象物
質）を形成する。

【００２２】工程Ｂ：前記の測定対象物質（抗原）に対
して特異的な結合能を有する抗体の結合したビオチン化
アミノグリカン（抗体−アミノグリカン−ビオチン）と
本発明のシアニン色素修飾アビジン（アビジン−シアニ
ン色素）を反応させて、ビオチン−アビジンの結合を介
したシアニン色素標識抗体を調製する（抗体−アミノグ
リカン−ビオチン−アビジン−シアニン色素）。

【００２３】工程Ｃ：工程Ａで調製した免疫複合体の末
端抗原と工程Ｂで調製したシアニン色素標識抗体を反応
させて、光ファイバーのコア表面−抗体−測定対象物質
−抗体−アミノグリカン−ビオチン−アビジン−シアニ
ン色素の複合体を形成させ、７５０〜８５０ｎｍの半導
体レーザを励起光源とする蛍光測定装置を用いて光ファ
イバーのコア表面に固定されたシアニン色素の蛍光を測
定する。

【００２４】前記の説明においては、アミノ基を有する
高分子化合物としてアビジンを例にしたが、本発明の方
法に用いられるアミノ基を有する高分子化合物として
は、前記のようにアビジン以外にも抗体、プロテイン
Ａ、キトサン、スルホン化キトサン、ポリガラクトサミ
ン、ポリノイラミン酸等のアミノグリカンが用いられ
る。光ファイバーのコア表面にシアニン色素を固定する
ために介在する化合物として、アビジンの場合にはビオ
チンが使用されるように、使用するアミノ基を有する高
分子化合物と特異的に結合する化合物が選択される。具
体的には、アビジンとビオチン、プロテインＡと抗体な
どが好ましく、特にアビジンとビオチンの組み合わせが
最適である。キトサン、ポリガラクトサミン、ポリノイ
ラミン酸等のアミノグリカンの場合は、これらの抗体を
用いることができるが、キトサン等にビオチンを結合さ
せて、ビオチン化キトサン等とアビジンとを組み合わせ
て用いるのが便利である。

【００２５】

【実施例】以下、実施例および比較例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。 実施例１ （１）キトサン２．５ｇを５％ＬｉＣｌ含有ジメチルア
セトアミド（ＤＭＡ）５００ｍｌに懸濁し、ここへピリ
ジン−三酸化硫黄錯体１８ｇを溶解し、６０℃で２４時
間反応させた。 （２）反応後、冷却しながら氷水を加え、さらにｐＨ１
０に調整しながら最終的に約１リットルとした。 （３）遠心分離により沈澱を除去した後、上清をエバポ
レーションによって約５００ｍｌに濃縮し、さらにこれ
を蒸留水に対して透析し、ＤＭＡ、ピリジンおよび生成
したＮａ₂ ＳＯ₄ を除去した。 （４）前記（３）の溶液に濃ＨＣｌを加え、溶液の最終
濃度が０．０８Ｎとなるように調製した。この溶液を１
００℃で２．５時間、加熱処理した。 （５）加熱後、氷浴中で冷却し、さらに６％ＮａＯＨ水
溶液でｐＨ１０に調整し、生じた沈澱を遠心分離により
除去し、上清を得た。 （６）前記（５）の上清を蒸留水に対して一晩透析した
のち、これをエバポレーターにて濃縮乾固し、スルホン
化キトサン（Ｓ−Ｃ）標品を得た。

【００２６】（７）ＮＫ３６８２の２７．６ｍｇを０．
５ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、Ｎ
Ｋ３６８２が溶解した後、この液を氷浴中で冷却した。 （８）前記（７）の氷冷したＮＫ３６８２溶液にＥＥＤ
Ｑ（和光純薬工業社製）１０．４ｍｇを加え、溶解した
後、４℃に２時間静置した。 （９）前記（６）で得られたＳ−Ｃ２ｍｇを０．５ｍｌ
の水に溶解し、氷冷した後、前記（８）のＥＥＤＱによ
り活性化したＮＫ３６８２の溶液０．５ｍｌを加え、４
℃にて１２時間反応させた。 （１０）前記（９）の反応液にメタノールを約９ｍｌ加
え、限外濾過にて未反応のＮＫ３６８２およびＥＥＤＱ
等を除去した。 （１１）さらに２〜３回メタノールで洗浄したのち、メ
タノールを除去し、ここへ水３ｍｌを加えて、ＮＫ３６
８２の結合したＳ−Ｃ（Ｆ−Ｓ−Ｃ）の水溶液を得た。

【００２７】（１２）前記（１１）で得られたＦ−Ｓ−
Ｃ水溶液に３ｍｇのヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体を溶解し、
さらにここへ５ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）を加
え、４℃で一晩反応させた。 （１３）ゲル濾過によって、未反応の抗体、Ｆ−Ｓ−
Ｃ、およびＷＳＣ等を除去し、ヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体
の結合したＦ−Ｓ−Ｃ（Ｆ−Ｓ−Ｃ−Ａｂ）を得た。Ｆ
−Ｓ−Ｃ−Ａｂとして回収できた抗体量は２．８ｍｇ
（９３．３％）であった。

【００２８】（１４）ポリメタクリル酸メチルからなる
樹脂製光ファイバー（三菱レイヨン（株）製）を３ｃｍ
に切り、両端面をエタノールを潤滑剤としてポリシング
フィルムで研磨した。 （１５）０．５ｍｌの水に１０ｍｇの硫酸ニッケルを溶
かし、次いで２．５ｍｌのエタノールを加えた。この際
に生じる沈澱を遠心分離にて除去し、採取した上澄みを
ニッケル−エタノール溶液とした。次にエタノール溶媒
の２０ｍＭ水酸化カリウム溶液０．４ｍｌにニッケル−
エタノール溶液０．１ｍｌと５０％グルタルアルデヒド
５０μｌを添加し混合して、処理溶液とした。 （１６）前記（１４）の光ファイバーの片面を前記（１
５）の処理溶液中に、５０℃で１０分間浸漬した後、２
０ｍＭ塩酸、次にＰＢＳで洗浄した。次にこの光ファイ
バーを２ｍｇ／ｍｌのヒト膵アミラーゼ溶液に浸漬し、
４℃に一晩静置した。 （１７）光ファイバーを溶液から取り出し、１％水素化
ホウ素ナトリウム水溶液に１５分間浸漬した後、ＰＢＳ
で洗浄して、ヒト膵アミラーゼ固定化センサーとし、こ
れを検出部とした。

【００２９】（１８）濃度既知のヒト膵アミラーゼ抗体
溶液の中に、前記（１７）の検出部を２０分間浸漬し、
前記（１３）で調製したＦ−Ｓ−Ｃ−Ａｂの溶液中に２
０分間浸漬した。次いで、０．０５％トゥイーン２０含
有ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ）で洗浄後、１個のレー
ザを使用する蛍光測定系である図１に示す装置を用い
て、７８０ｎｍ半導体レーザ系で測定したところ、０．
３ｎｇ／ｍｌまで測定できた。

【００３０】比較例１ （１）実施例１の（１）〜（６）と同様の方法でＳ−Ｃ
標品を得た。 （２）前記（１）のＳ−Ｃ２ｍｇを０．５ｍｌの水に溶
解し、２７．６ｍｇのＮＫ３６８２をＤＭＦに溶解し
て、両液を混合し、ここへ水溶性カルボジイミド（ＷＳ
Ｃ）を１０ｍｇ加え、４℃にて１２時間反応させた。 （３）実施例１の（１０）〜（１３）と同様の方法でＦ
−Ｓ−Ｃ−Ａｂを得た。このとき、Ｆ−Ｓ−Ｃ−Ａｂと
して回収できた抗体量は約０．４ｍｇで、用いた抗体の
１３．３％に過ぎなかったのに対し、実施例１で回収で
きた抗体量は前記のように９０％以上の回収率であっ
た。この相違は、ＥＥＤＱにより活性化されたＮＫ３６
８２を用いた場合とＷＳＣにより活性化されたＮＫ３６
８２を用いた場合におけるＦ−Ｓ−Ｃの収率の相違およ
び得られたＦ−Ｓ−Ｃの水溶性の相違によるものと考え
られる。

【００３１】実施例２ （１）５ｍｇのＮＫ３９４２を１００μｌのＤＭＦに冷
却しながら溶解し、ここへ４ｍｇのＥＥＤＱを加えて溶
解し、４℃にて２時間静置した。 （２）（株）日本バイオテスト研究所製のヤギ由来抗ヒ
トＣＲＰ抗体溶液１ｍｌ（１３ｍｇ／ｍｌ）を５ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７）にて４℃で４時間透析し、透析後
に前記（１）のＮＫ３９４２溶液と混合し、４℃に１６
時間静置した。 （３）５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したセフ
ァデックスＧ５０カラムにてゲル濾過を行い、ＮＫ３９
４２の結合した抗ヒトＣＲＰ抗体（Ｆ−Ａｂ）を得た。
このときＦ−Ａｂとして回収できた抗体量は１２．３ｍ
ｇ（９４．６％）であった。 （４）ヒト膵アミラーゼの代わりに、抗ヒトＣＲＰ抗体
を用いた以外は実施例１の（１４）〜（１７）と同様の
方法で抗ヒトＣＲＰ抗体固定化センサーを作成し、これ
を検出部とした。 （５）濃度既知のＣＲＰ溶液中に前記（４）の検出部を
２０分間浸漬し、次に、前記（３）で調製したＦ−Ａｂ
溶液に２０分間浸漬した。０．０１％トゥイーン２０含
有５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄した後、図１に
示す装置を用いて７８０ｎｍ半導体レーザ系で測定した
ところ、２ｎｇ／ｍｌまで測定できた。

【００３２】比較例２ （１）実施例２の（１）および（２）において、ＥＥＤ
Ｑによって活性化されたＮＫ３９４２の代わりに、５ｍ
ｇのＮＫ３９４２をそのまま透析後の抗体溶液に溶か
し、さらに４ｍｇのＷＳＣを加えた以外は実施例２の
（２）および（３）と同様の方法でＦ−Ａｂを得た。こ
のとき、Ｆ−Ａｂとして回収できた抗体量は０．１１ｍ
ｇ（回収率８．５％）であった。 （２）実施例２の（４）および（５）と同様の方法で測
定したところ、得られたＦ−Ａｂが少なすぎたため、６
００ｎｇ／ｍｌまでしか検出できなかった。実施例２と
比較例２とを比べると、ＮＫ３９４２と抗ヒトＣＲＰ抗
体との結合には、ＷＳＣよりもＥＥＤＱが遙かに優れて
いることが明らかであり、本発明の蛍光標識試薬の製造
方法においては、ＥＥＤＱが極めて適しているといえ
る。

【００３３】実施例３ 実施例２において、ＮＫ３９４２の代わりにＮＫ３７５
９を用いた以外は全く同様の方法で抗ヒトＣＲＰ抗体固
定化センサーを作成し、濃度既知のＣＲＰ溶液中のＣＲ
Ｐを測定したところ、２ｎｇ／ｍｌまで検出することが
できた。

【００３４】実施例４ 実施例１において、ＥＥＤＱの代わりにＮ−メトキシカ
ルボニル−２−プロポキシ−１，２−ジヒドロキノリン
（ＭＰＤＱ）を用いた以外は全く同様の方法で実施した
ところ、抗体は９０％以上回収でき、かつ、ヒト膵臓ア
ミラーゼを０．３ｎｇ／ｍｌまで測定することができ
た。

【００３５】実施例５ 実施例２において、ＥＥＤＱの代わりにＮ−ブトキシカ
ルボニル−２−ブトキシ−１，２−ジヒドロキノリン
（ＢＢＤＱ）を用いた以外は全く同様の方法で実施した
ところ、抗体は９２％以上回収でき、かつ、ＣＲＰを２
ｎｇ／ｍｌまで測定することができた。

【００３６】

【発明の効果】本発明の製造方法によれば、スルホン基
とカルボキシル基とを併せ持つシアニン色素を用いて水
溶性の高い蛍光標識試薬を高収率で製造することが可能
となり、高感度で低価格の免疫測定を容易にすることが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は１個のレーザを使用する蛍光測定系の概
略図である。

【符号の説明】

１ 光ファイバー ２ レーザ ３ 光軸合わせのためのガイドレール ４ 検出部 ５ フィルター ６ 蛍光検出器 ７ ハーフミラー

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 スルホン基とカルボキシル基を併せ持つ
   水溶性シアニン色素と、アミノ基を有する高分子化合物
   とを結合させて蛍光標識試薬を製造する方法において、
   Ｎ−アルコキシカルボニル−２−アルコキシ−１，２−
   ジヒドロキノリンを作用させ、カルボキシル基とアミノ
   基を選択的に結合させることを特徴とする蛍光標識試薬
   の製造方法。
2. 【請求項２】 スルホン基とカルボキシル基を併せ持つ
   水溶性シアニン色素が一般式（Ｉ）、（II）または（II
   I)により表されるシアニン色素であることを特徴とする
   請求項１記載の製造方法。 【化１】 （式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺ 、Ｎ⁺ Ｈ（Ｃ
   ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、またはピリジニウムイオンを表
   す。） 【化２】 （式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺ 、Ｎ⁺ Ｈ（Ｃ
   ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、またはピリジニウムイオンを表
   す。） 【化３】 （式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺ 、Ｎ⁺ Ｈ（Ｃ
   ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、またはピリジニウムイオンを表
   す。）
3. 【請求項３】 アミノ基を有する高分子化合物がキトサ
   ン、スルホン化キトサン、ポリガラクトサミン、ポリノ
   イラミン酸、抗体、アビジン、およびプロテインＡから
   なる群より選ばれるものである請求項１または請求項２
   記載の製造方法。