JPH07191028A - 免疫測定方法 - Google Patents
免疫測定方法Info
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- JPH07191028A JPH07191028A JP33068293A JP33068293A JPH07191028A JP H07191028 A JPH07191028 A JP H07191028A JP 33068293 A JP33068293 A JP 33068293A JP 33068293 A JP33068293 A JP 33068293A JP H07191028 A JPH07191028 A JP H07191028A
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- JP
- Japan
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- sample
- reagent
- antibody
- specific component
- hydrogen peroxide
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 試薬への試料の添加が簡単に確認できる免疫
測定法を提供する。 【構成】 試料中の特定成分と特定成分に対する抗体ま
たは抗原とを反応させることにより試料中の特定成分を
定量する免疫測定法において、試薬液に予め酸化酵素お
よび過酸化水素検出試薬を添加することを特徴とする方
法。
測定法を提供する。 【構成】 試料中の特定成分と特定成分に対する抗体ま
たは抗原とを反応させることにより試料中の特定成分を
定量する免疫測定法において、試薬液に予め酸化酵素お
よび過酸化水素検出試薬を添加することを特徴とする方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査方法において
多用されている免疫測定法の改良に関する。
多用されている免疫測定法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】試料中の目的成分を免疫測定法を用いて
分析する際には、試料と試薬を混合し反応させる過程が
必要であるが、病院の臨床検査等では多数の試料を同時
に扱うため、しばしば試料と試薬とを混合したか否かが
判別不明になる。
分析する際には、試料と試薬を混合し反応させる過程が
必要であるが、病院の臨床検査等では多数の試料を同時
に扱うため、しばしば試料と試薬とを混合したか否かが
判別不明になる。
【０００３】大量の試料の目的成分を免疫反応等化学反
応を用いて分析する際に、試料と試薬との混合の有無を
確認するために、検体とは異なる色の色素を試薬に添加
する方法が特開平２−１５７６５８号公報に開示され、
色素としてｐＨ指示薬、蛍光性色素、食用色素を用いる
ことが記載されている。また、抗原抗体反応において、
試料の試薬への添加により試料中の染料が色調変化する
ことにより、試料と試薬の混合の有無を確認する方法が
特表平２−５００８６１号公報に開示され、該染料とし
てブロムフェノールブルー等のｐＨ指示薬を用いること
が記載されている。
応を用いて分析する際に、試料と試薬との混合の有無を
確認するために、検体とは異なる色の色素を試薬に添加
する方法が特開平２−１５７６５８号公報に開示され、
色素としてｐＨ指示薬、蛍光性色素、食用色素を用いる
ことが記載されている。また、抗原抗体反応において、
試料の試薬への添加により試料中の染料が色調変化する
ことにより、試料と試薬の混合の有無を確認する方法が
特表平２−５００８６１号公報に開示され、該染料とし
てブロムフェノールブルー等のｐＨ指示薬を用いること
が記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】試薬の混合の有無を確
認するために、蛍光性色素および食用色素等有色物質を
加える方法は、試料に試薬を添加する前添加法に用いる
ことはできるが、自動分析器等で一般に用いられている
試薬に試料を添加する後添加法に用いることができな
い。またｐＨ指示薬を加える方法は、通常中性付近で用
いる試薬や試料の希釈液の液性を、酸性または塩基性に
変更せねばならず、抗原抗体反応の至適ｐＨからはずれ
たり、試薬の安定性に影響したりするので、適用できる
測定法も限られている。
認するために、蛍光性色素および食用色素等有色物質を
加える方法は、試料に試薬を添加する前添加法に用いる
ことはできるが、自動分析器等で一般に用いられている
試薬に試料を添加する後添加法に用いることができな
い。またｐＨ指示薬を加える方法は、通常中性付近で用
いる試薬や試料の希釈液の液性を、酸性または塩基性に
変更せねばならず、抗原抗体反応の至適ｐＨからはずれ
たり、試薬の安定性に影響したりするので、適用できる
測定法も限られている。
【０００５】酸化酵素および過酸化水素検出試薬を、試
料と試薬との混合の有無を確認する物質として用いる本
発明により、尿、血液等の体液由来の試料に適用可能
で、試薬と試料が同一のｐＨ条件下においても、前添加
法および後添加法に使用することができる、試料中の特
定成分の測定方法が提供される。
料と試薬との混合の有無を確認する物質として用いる本
発明により、尿、血液等の体液由来の試料に適用可能
で、試薬と試料が同一のｐＨ条件下においても、前添加
法および後添加法に使用することができる、試料中の特
定成分の測定方法が提供される。
【０００６】
【０００７】本発明は、試料に例えば体液を用いた場
合、試料中には通常グルコース、コレステロール、乳酸
等の酸化酵素により過酸化水素を発生する物質が含まれ
ているので、酸化酵素および過酸化水素検出試薬を試薬
液に含有させておけば、試薬液と試料の混合により過酸
化水素が発生し、過酸化水素検出試薬の色調が変化し、
試料と試薬との混合の有無が確認できるとの知見によ
る。
合、試料中には通常グルコース、コレステロール、乳酸
等の酸化酵素により過酸化水素を発生する物質が含まれ
ているので、酸化酵素および過酸化水素検出試薬を試薬
液に含有させておけば、試薬液と試料の混合により過酸
化水素が発生し、過酸化水素検出試薬の色調が変化し、
試料と試薬との混合の有無が確認できるとの知見によ
る。
【０００８】本発明は、試料中の特定成分と特定成分に
対する抗体または抗原とを反応させることにより試料中
の特定成分を定量する免疫測定法において、試薬液に予
め酸化酵素および過酸化水素検出試薬を添加することを
特徴とする方法に関する。
対する抗体または抗原とを反応させることにより試料中
の特定成分を定量する免疫測定法において、試薬液に予
め酸化酵素および過酸化水素検出試薬を添加することを
特徴とする方法に関する。
【０００９】本発明において、試料とは酸化酵素により
過酸化水素を発生する物質を含む液体であればどのよう
なものでもよいが、血液、唾液、尿等の体液を用いるこ
とが好ましい。
過酸化水素を発生する物質を含む液体であればどのよう
なものでもよいが、血液、唾液、尿等の体液を用いるこ
とが好ましい。
【００１０】試料中の特定成分としては、がん胎児性抗
原（ＣＥＡ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、補体 （Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ
１ｑ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、α1 −アンチトリプ
シン、α1 −マイクログロブリン、β2 −マイクログロ
ブリン、ハプトグロブリン、トランスフェリン、セルロ
プラスミン、フェリチン、アルブミン、ヘモグロビンＡ
1 、ヘモグロビンＡ1C、ミオグロビン、ミオシン、デュ
パン−２、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、組織ポリ
ペプチド抗原（ＴＰＡ）、アポリポ蛋白Ａ1 、アポリポ
蛋白Ｅ、リウマチ因子、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳ
Ｏ）、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、フィブリン分解
産物Ｄ分画（ＦＤＰ−Ｄ）、フィブリン分解産物Ｄ−Ｄ
分画（ＦＤＰ−Ｄ Ｄｉｍｅｒ）、フィブリン分解産物
Ｅ分画（ＦＤＰ−Ｅ）、アンチトロンビン−III （ＡＴ
−III)等の蛋白質、アミラーゼ、前立腺由来酸性ホスフ
ァターゼ（ＰＡＰ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、
フィブリノーゲン、エラスターゼ、プラスミノーゲン、
クレアチンキナーゼ心筋型（ＣＫ−ＭＢ）等の酵素、イ
ンシュリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、3,5,3 ´
−トリヨードサイロニン（Ｔ3 ）、サイロキシン（Ｔ
4 ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、生長ホルモ
ン（ＧＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）等のホルモン、Ｂ
型肝炎ウイルス関連抗体、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原、
Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ＨＴＬＶ−Ｉ（成人Ｔ細胞白血
病ウイルス）抗体、ＨＩＶ（エイズウイルス）抗体、ク
ラミジア抗体、梅毒の抗体、トキソプラズマ抗体等各種
感染症の原因ウイルスに対する抗体等があげられる。
原（ＣＥＡ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、補体 （Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ
１ｑ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、α1 −アンチトリプ
シン、α1 −マイクログロブリン、β2 −マイクログロ
ブリン、ハプトグロブリン、トランスフェリン、セルロ
プラスミン、フェリチン、アルブミン、ヘモグロビンＡ
1 、ヘモグロビンＡ1C、ミオグロビン、ミオシン、デュ
パン−２、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、組織ポリ
ペプチド抗原（ＴＰＡ）、アポリポ蛋白Ａ1 、アポリポ
蛋白Ｅ、リウマチ因子、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳ
Ｏ）、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、フィブリン分解
産物Ｄ分画（ＦＤＰ−Ｄ）、フィブリン分解産物Ｄ−Ｄ
分画（ＦＤＰ−Ｄ Ｄｉｍｅｒ）、フィブリン分解産物
Ｅ分画（ＦＤＰ−Ｅ）、アンチトロンビン−III （ＡＴ
−III)等の蛋白質、アミラーゼ、前立腺由来酸性ホスフ
ァターゼ（ＰＡＰ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、
フィブリノーゲン、エラスターゼ、プラスミノーゲン、
クレアチンキナーゼ心筋型（ＣＫ−ＭＢ）等の酵素、イ
ンシュリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、3,5,3 ´
−トリヨードサイロニン（Ｔ3 ）、サイロキシン（Ｔ
4 ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、生長ホルモ
ン（ＧＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）等のホルモン、Ｂ
型肝炎ウイルス関連抗体、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原、
Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ＨＴＬＶ−Ｉ（成人Ｔ細胞白血
病ウイルス）抗体、ＨＩＶ（エイズウイルス）抗体、ク
ラミジア抗体、梅毒の抗体、トキソプラズマ抗体等各種
感染症の原因ウイルスに対する抗体等があげられる。
【００１１】特定成分に対する抗体または抗原とは、特
定成分がタンパク質、酵素、ホルモンの場合は、これら
に対する抗体を表し、特定成分が抗体の場合は抗原を表
す。特定成分に対する抗体または抗原は天然のものを用
いてもよいし、特定成分から公知方法により得られるも
のを用いてもよい〔「単クローン抗体実験マニュア
ル」，富山朔二ら編、講談社サイエンティフィック刊，
１９８７年：新生化学実験講座，第１２巻，「分子免疫
学 III 抗原、抗体、補体」，日本生化学会編，東京化
学同人社刊，１９９２年〕。該抗原または抗体は複数の
抗体または抗原からなるものでもよく、抗体または抗原
を限定分解したものあるいは蛋白修飾したものでもよ
い。
定成分がタンパク質、酵素、ホルモンの場合は、これら
に対する抗体を表し、特定成分が抗体の場合は抗原を表
す。特定成分に対する抗体または抗原は天然のものを用
いてもよいし、特定成分から公知方法により得られるも
のを用いてもよい〔「単クローン抗体実験マニュア
ル」，富山朔二ら編、講談社サイエンティフィック刊，
１９８７年：新生化学実験講座，第１２巻，「分子免疫
学 III 抗原、抗体、補体」，日本生化学会編，東京化
学同人社刊，１９９２年〕。該抗原または抗体は複数の
抗体または抗原からなるものでもよく、抗体または抗原
を限定分解したものあるいは蛋白修飾したものでもよ
い。
【００１２】免疫測定法とは公知の酵素免疫測定法、放
射化免疫測定法、化学発光免疫測定法等を表す。
射化免疫測定法、化学発光免疫測定法等を表す。
【００１３】試薬液とは、試料中の特定成分を酵素免疫
測定法、放射化免疫測定法、化学発光免疫測定法等の免
疫測定法等で分析する際に通常用いられる測定用の試薬
液で、酵素免疫測定法または化学発光免疫測定法におい
て試料中の特定成分に対する抗体または抗原がプレート
等の固体と結合している場合（固定化抗体型）は、該プ
レートへ添加する水性媒体を表す。また、放射化免疫測
定法等非固定化抗体型免疫測定法の場合は、水性媒体中
特定成分に対する抗体または抗原を主要成分として含有
するものであればよい。
測定法、放射化免疫測定法、化学発光免疫測定法等の免
疫測定法等で分析する際に通常用いられる測定用の試薬
液で、酵素免疫測定法または化学発光免疫測定法におい
て試料中の特定成分に対する抗体または抗原がプレート
等の固体と結合している場合（固定化抗体型）は、該プ
レートへ添加する水性媒体を表す。また、放射化免疫測
定法等非固定化抗体型免疫測定法の場合は、水性媒体中
特定成分に対する抗体または抗原を主要成分として含有
するものであればよい。
【００１４】水性媒体とは、蒸留水、イオン交換水、生
理食塩水または濃度範囲が0.1 〜200 ｍＭ、好ましくは
0.1 〜100 ｍＭの緩衝液があげられる。緩衝液としては
リン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ト
リス−塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢
酸緩衝液、グッドの緩衝液等があげられる。なお、水ま
たは緩衝液は必要により、塩化ナトリウム等の塩、牛血
清アルブミン等の安定化剤、アジ化ナトリウム等の防腐
剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔ
ｗｅｅｎ２０）等の界面活性剤、スキムミルク等を含有
していてもよい。
理食塩水または濃度範囲が0.1 〜200 ｍＭ、好ましくは
0.1 〜100 ｍＭの緩衝液があげられる。緩衝液としては
リン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ト
リス−塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢
酸緩衝液、グッドの緩衝液等があげられる。なお、水ま
たは緩衝液は必要により、塩化ナトリウム等の塩、牛血
清アルブミン等の安定化剤、アジ化ナトリウム等の防腐
剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔ
ｗｅｅｎ２０）等の界面活性剤、スキムミルク等を含有
していてもよい。
【００１５】酸化酵素としては、体液中の成分であるグ
ルコース、コレステロール、乳酸等に作用して過酸化水
素を生成する反応を触媒する酸化酵素が用いられ、具体
的にはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）[E.C.1.1.3.
4.]、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）[E.C.1.
1.3.6.]、乳酸オキシダーゼ（ＬＯＤ）等があげられ
る。これらの酵素は、動物、植物もしくは微生物由来の
天然の酵素、遺伝子操作等により製造した酵素またはこ
れらを遺伝子工学等により改変したものが含まれる。本
発明においては該酸化酵素の一種類以上を試料に添加す
る。
ルコース、コレステロール、乳酸等に作用して過酸化水
素を生成する反応を触媒する酸化酵素が用いられ、具体
的にはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）[E.C.1.1.3.
4.]、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）[E.C.1.
1.3.6.]、乳酸オキシダーゼ（ＬＯＤ）等があげられ
る。これらの酵素は、動物、植物もしくは微生物由来の
天然の酵素、遺伝子操作等により製造した酵素またはこ
れらを遺伝子工学等により改変したものが含まれる。本
発明においては該酸化酵素の一種類以上を試料に添加す
る。
【００１６】過酸化水素検出試薬は、過酸化水素を検出
することができる試薬系であればいずれも用いることが
できるが、例えば４−アミノアンチピリンと発色試薬か
らなる試薬が好ましい。該発色試薬としては、４−アミ
ノアンチピリンおよび過酸化水素の存在下発色する試薬
が用いられ、具体的には、フェノール等のフェノール
類、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ' −
アセチルエチレンジアミン〔ＥＭＡＥ〕、Ｎ−エチル−
Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ' −サクシニルエチレ
ンジアミン〔ＥＭＳＥ〕等のアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−3,5 −ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ-(2-ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル)-アニシジン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−スルホプロピル)-アニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル)-3,5-ジメトキシアニリン、Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−
スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−スルホプロピル)-3,5-ジメチ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル)-ｍ−トルイジン、Ｎ−スルホプロピルアニ
リン等のトリンダー試薬類等があげられる。
することができる試薬系であればいずれも用いることが
できるが、例えば４−アミノアンチピリンと発色試薬か
らなる試薬が好ましい。該発色試薬としては、４−アミ
ノアンチピリンおよび過酸化水素の存在下発色する試薬
が用いられ、具体的には、フェノール等のフェノール
類、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ' −
アセチルエチレンジアミン〔ＥＭＡＥ〕、Ｎ−エチル−
Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ' −サクシニルエチレ
ンジアミン〔ＥＭＳＥ〕等のアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−3,5 −ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ-(2-ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル)-アニシジン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−スルホプロピル)-アニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル)-3,5-ジメトキシアニリン、Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−
スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−スルホプロピル)-3,5-ジメチ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ-(2-ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル)-ｍ−トルイジン、Ｎ−スルホプロピルアニ
リン等のトリンダー試薬類等があげられる。
【００１７】試薬液中の酸化酵素の濃度は0.1 〜1000Ｕ
／ｍｌ、好ましくは0.1 〜100 Ｕ／ｍｌであり、過酸化
水素検出試薬の濃度は0.1 〜100 ｍＭ、好ましくは0.1
〜10ｍＭである。また、試薬液のｐＨは４〜８である
が、ＧＯＤを使用する場合は４〜７、ＬＯＤを使用する
場合は５〜８、ＣＨＯＤを使用する場合は５〜８であ
る。
／ｍｌ、好ましくは0.1 〜100 Ｕ／ｍｌであり、過酸化
水素検出試薬の濃度は0.1 〜100 ｍＭ、好ましくは0.1
〜10ｍＭである。また、試薬液のｐＨは４〜８である
が、ＧＯＤを使用する場合は４〜７、ＬＯＤを使用する
場合は５〜８、ＣＨＯＤを使用する場合は５〜８であ
る。
【００１８】本発明においては、酸化酵素および過酸化
水素検出試薬からなる確認用試薬液を以下のように免疫
測定法に用いる。免疫測定法が、酵素免疫測定法、化学
発光免疫測定法等固定化抗体型の場合は、固定化抗体に
該確認用試薬液を添加した後、試料を加え反応させ、さ
らに標識化抗体を加えて反応させた後、常法により標識
化抗体量を測定する〔石川栄治、”酵素免疫測定法第二
版”、石川栄治、河合忠、宮井潔編：82、医学書院、東
京(1982)〕。免疫測定法が、放射化免疫測定法等固定化
抗体を用いない場合は、前添加法または後添加法により
試料と確認用試薬液を混合し反応させた後、常法により
定量することができる（実験生物学講座１４，「免疫生
物学」，村松繁ら編，１９８５年、丸善刊）。
水素検出試薬からなる確認用試薬液を以下のように免疫
測定法に用いる。免疫測定法が、酵素免疫測定法、化学
発光免疫測定法等固定化抗体型の場合は、固定化抗体に
該確認用試薬液を添加した後、試料を加え反応させ、さ
らに標識化抗体を加えて反応させた後、常法により標識
化抗体量を測定する〔石川栄治、”酵素免疫測定法第二
版”、石川栄治、河合忠、宮井潔編：82、医学書院、東
京(1982)〕。免疫測定法が、放射化免疫測定法等固定化
抗体を用いない場合は、前添加法または後添加法により
試料と確認用試薬液を混合し反応させた後、常法により
定量することができる（実験生物学講座１４，「免疫生
物学」，村松繁ら編，１９８５年、丸善刊）。
【００１９】標識体は、抗ヒトイムノグロブリンを結合
した標識物質または特定物質に対する抗体または抗原を
結合した標識物質を意味し、標識物質としては、西洋ワ
サビのペルオキシダ−ゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスフ
ァターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＬＤ）
等の酵素およびアクリジウム−Ｉ等の発光物質等があげ
られる。
した標識物質または特定物質に対する抗体または抗原を
結合した標識物質を意味し、標識物質としては、西洋ワ
サビのペルオキシダ−ゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスフ
ァターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＬＤ）
等の酵素およびアクリジウム−Ｉ等の発光物質等があげ
られる。
【００２０】標識体量の測定法としては、標識物質が酵
素の場合は基質を用いた該酵素活性の測定法、発光物質
の場合は発光光度計を用いた発光光度測定法等があげら
れる。酵素活性測定法のうちＰＯＤ活性の測定には基質
としてｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシフェニルプ
ロピオン酸等が、ＡＬＰ活性の測定には基質として3-
（２' −スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−
（３''−ホスフォピロキシ）フェニル−１，２−ジオキ
セタン〔ＡＭＰＰＤ〕、ｐ−ニトロフェニルフォスフェ
ートが、ＧＬＤ活性の測定には基質としてｐ−ニトロフ
ェニル−β−ガラクトシド、４−メチルウムベリフェリ
ル−β−ガラクトシド等が用いられ、通常分光光度法等
を用いて測定する。
素の場合は基質を用いた該酵素活性の測定法、発光物質
の場合は発光光度計を用いた発光光度測定法等があげら
れる。酵素活性測定法のうちＰＯＤ活性の測定には基質
としてｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシフェニルプ
ロピオン酸等が、ＡＬＰ活性の測定には基質として3-
（２' −スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−
（３''−ホスフォピロキシ）フェニル−１，２−ジオキ
セタン〔ＡＭＰＰＤ〕、ｐ−ニトロフェニルフォスフェ
ートが、ＧＬＤ活性の測定には基質としてｐ−ニトロフ
ェニル−β−ガラクトシド、４−メチルウムベリフェリ
ル−β−ガラクトシド等が用いられ、通常分光光度法等
を用いて測定する。
【００２１】
【実施例】次に実施例を用いて本発明を説明する。 実施例１ ９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに１０
μｇ／ｍｌの抗ヒトＡＦＰ−ウサギＩｇＧ（ダコ社）／
0.1 Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ9.5 ）溶液５０μｌを分注、一
夜放置後、ＰＢＳで各ウエルを３回洗浄し、さらに１％
のＢＳＡを含むＰＢＳを２５０μｌ／ウェル分注し、１
時間静置後、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄して反応用プ
レートを作製した。一方、抗ヒトＡＦＰ抗体（ダコ社）
と仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ、ベー
リンガーマンハイム社）を石川の方法〔石川栄治、”酵
素免疫測定法第二版”、石川栄治、河合忠、宮井潔編：
117 、医学書院、東京(1982)〕に従い結合させ、ＡＬＰ
標識抗ヒトＡＦＰウサギＩｇＧを作製した。
μｇ／ｍｌの抗ヒトＡＦＰ−ウサギＩｇＧ（ダコ社）／
0.1 Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ9.5 ）溶液５０μｌを分注、一
夜放置後、ＰＢＳで各ウエルを３回洗浄し、さらに１％
のＢＳＡを含むＰＢＳを２５０μｌ／ウェル分注し、１
時間静置後、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄して反応用プ
レートを作製した。一方、抗ヒトＡＦＰ抗体（ダコ社）
と仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ、ベー
リンガーマンハイム社）を石川の方法〔石川栄治、”酵
素免疫測定法第二版”、石川栄治、河合忠、宮井潔編：
117 、医学書院、東京(1982)〕に従い結合させ、ＡＬＰ
標識抗ヒトＡＦＰウサギＩｇＧを作製した。
【００２２】反応用プレートの各ウェルに第１表に示す
組成の第一検体希釈液を５０μｌ分注し、ついで第１表
に示す組成の第二検体希釈５０μｌを分注撹拌混合し
た。検体希釈液を分注したプレートの各ウェルに２０μ
ｌの第１表に組成を示す標準液またはヒト血清を添加撹
拌し、２５℃で２時間静置反応させた。反応終了後、プ
レートを0.05％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗
浄した後、１００μｌのＰＯＤ標識抗ヒトＡＦＰウサギ
ＩｇＧを分注し、室温で１時間静置反応させた。反応終
了後、プレートを0.05％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
溶液で５回洗浄し、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルフォ
スフェート、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭのＺｎＣ
ｌ2 を含む１００ｍＭグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
１０．３）５０μｌを加えて３０分間室温で静置反応さ
せた後、５０μｌの１Ｎ ＮａＯＨ溶液を加えて反応を
停止させ、４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測
定した。測定血清検体中のＡＦＰ濃度を、標準液のＡＦ
Ｐ濃度と吸光度から作製した検量線より読みとり算出し
た。本発明方法が定量性を阻害していないことを確認す
るため、本発明方法によるＡＦＰの測定値と、第１表の
第一検体希釈液からＥＭＡＥ、ＰＯＤ、ＧＯＤを除き、
第二検体希釈液から４−アミノアンチピリンを除く以外
は同様な方法で測定した比較例におけるＡＦＰの定量値
と比較した。結果を第２表に示した。
組成の第一検体希釈液を５０μｌ分注し、ついで第１表
に示す組成の第二検体希釈５０μｌを分注撹拌混合し
た。検体希釈液を分注したプレートの各ウェルに２０μ
ｌの第１表に組成を示す標準液またはヒト血清を添加撹
拌し、２５℃で２時間静置反応させた。反応終了後、プ
レートを0.05％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗
浄した後、１００μｌのＰＯＤ標識抗ヒトＡＦＰウサギ
ＩｇＧを分注し、室温で１時間静置反応させた。反応終
了後、プレートを0.05％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
溶液で５回洗浄し、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルフォ
スフェート、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭのＺｎＣ
ｌ2 を含む１００ｍＭグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
１０．３）５０μｌを加えて３０分間室温で静置反応さ
せた後、５０μｌの１Ｎ ＮａＯＨ溶液を加えて反応を
停止させ、４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測
定した。測定血清検体中のＡＦＰ濃度を、標準液のＡＦ
Ｐ濃度と吸光度から作製した検量線より読みとり算出し
た。本発明方法が定量性を阻害していないことを確認す
るため、本発明方法によるＡＦＰの測定値と、第１表の
第一検体希釈液からＥＭＡＥ、ＰＯＤ、ＧＯＤを除き、
第二検体希釈液から４−アミノアンチピリンを除く以外
は同様な方法で測定した比較例におけるＡＦＰの定量値
と比較した。結果を第２表に示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】実施例、比較例共に反応プレートに添加し
た検体希釈液は無色透明であるが、実施例のプレートに
血清検体を添加すると、無色透明であったウェル内容は
赤色に変化し、容易に検体添加ウェルと無添加ウェルと
を識別できた。一方比較例では激しい溶血で極端に赤色
をした検体や高濃度のビリルビンを含み濃黄色に着色し
た検体を除き、血清検体２０μｌを添加しても、色調の
変化を観察することは出来ず、また検体添加による量的
変化もわずかなため、検体を添加したウェルと添加して
いないウェルとの差を目視にて判別することは困難であ
った。測定結果においては実施例、比較例で有意な差は
生じず、本発明は目的とする特定成分の測定には影響が
無いことが示された。
た検体希釈液は無色透明であるが、実施例のプレートに
血清検体を添加すると、無色透明であったウェル内容は
赤色に変化し、容易に検体添加ウェルと無添加ウェルと
を識別できた。一方比較例では激しい溶血で極端に赤色
をした検体や高濃度のビリルビンを含み濃黄色に着色し
た検体を除き、血清検体２０μｌを添加しても、色調の
変化を観察することは出来ず、また検体添加による量的
変化もわずかなため、検体を添加したウェルと添加して
いないウェルとの差を目視にて判別することは困難であ
った。測定結果においては実施例、比較例で有意な差は
生じず、本発明は目的とする特定成分の測定には影響が
無いことが示された。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、試薬への試料の添加が簡
単に確認できる免疫測定法が提供される。
単に確認できる免疫測定法が提供される。
Claims (1)
- 【請求項１】 試料中の特定成分と特定成分に対する抗
体または抗原とを反応させることにより試料中の特定成
分を定量する免疫測定法において、試薬液に予め酸化酵
素および過酸化水素検出試薬を添加することを特徴とす
る方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33068293A JPH07191028A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33068293A JPH07191028A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 免疫測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07191028A true JPH07191028A (ja) | 1995-07-28 |
Family
ID=18235405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33068293A Withdrawn JPH07191028A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07191028A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008014752A (ja) * | 2006-07-05 | 2008-01-24 | Denka Seiken Co Ltd | 簡易イムノアッセイ用検体浮遊液およびアッセイ方法 |
-
1993
- 1993-12-27 JP JP33068293A patent/JPH07191028A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008014752A (ja) * | 2006-07-05 | 2008-01-24 | Denka Seiken Co Ltd | 簡易イムノアッセイ用検体浮遊液およびアッセイ方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20010306 |