JPH07163378A - 過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 遺伝子組換え技術を用いることにより、過酸
化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの生産性の向上に利
用できるＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子の提
供。 【構成】 過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼをコ
ードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＮＡＤＨを分子状酸素に
より酸化して過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素
(特願平２−４０７８８９号)をコードするＤＮＡ断片及
び該断片を含むプラスミドを導入した微生物を用いての
該酵素の製造に関するもので、ＮＡＤＨ生成反応を利用
した生体微量物質の検出に有用である。

【０００２】

【従来の技術】ＮＡＤＨオキシダーゼには、分子状酸素
と反応して過酸化水素を生成するものと水を生成するも
のがある。過酸化水素生成型酵素は、ストレプトコッカ
ス・ミュータンスを培養することにより、その生産物中
に見出すことができるが、通常の培養を行ったとき、水
生成型酵素との生産比を常に高く保持する、安定な培養
条件が得難く、また水生成型酵素との分離が必要であ
る。そこで合理的かつ理論的に過酸化水素生成型ＮＡＤ
Ｈオキシダーゼの生産性を高める製造方法、すなわち遺
伝子組換え技術を用いたＮＡＤＨオキシダーゼの製造方
法が望まれている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】過酸化水素生成型ＮＡ
ＤＨオキシダーゼの生産性を高めるためには、ストレプ
トコッカス・ミュータンスを用いた従来の方法では不十
分である。そこで本発明は、遺伝子組換え技術を用いる
ことによりＮＡＤＨオキシダーゼの生産性の向上に利用
できるＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子を提供
することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、過酸化水
素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの有利な製造方法を開発
するために、鋭意研究を進めた結果、ストレプトコッカ
ス・ミュータンス菌体内過酸化水素型ＮＡＤＨオキシダ
ーゼ遺伝子をクローン化し且つそのＤＮＡ塩基配列を決
定するのに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００５】本発明は過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシ
ダーゼをコードするＤＮＡを提供する。また、本発明は
下記のＮＡＤＨ結合部位を含むアミノ酸配列で特定され
る過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする
ＤＮＡを提供する。

【０００６】

【化９】

【０００７】特に本発明は、下記のＮＡＤＨ結合部位を
含む塩基配列で特定される過酸化水素生成型ＮＡＤＨオ
キシダーゼをコードするＤＮＡを提供する。

【０００８】

【化１０】

【０００９】更に本発明は下記のＦＡＤ結合部位を含む
アミノ酸配列で特定される過酸化水素生成型ＮＡＤＨオ
キシダーゼをコードするＤＮＡを提供する。

【００１０】

【化１１】

【００１１】特に、下記のＦＡＤ結合部位を含む塩基配
列で特定される過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ
をコードするＤＮＡを提供する。

【００１２】

【化１２】

【００１３】更にまた、本発明は下記の塩基配列で特定
される過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼをコード
するＤＮＡを提供する。

【００１４】

【化１３】

【００１５】特に、本発明は下記のアミノ酸配列で特定
される過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼをコード
するＤＮＡを提供する。

【００１６】

【化１４】

【００１７】

【化１５】

【００１８】本発明のＤＮＡの上流には、非翻訳領域と
して、以下の塩基配列が存在する。

【００１９】

【化１６】

【００２０】本発明に係わる過酸化水素生成型ＮＡＤＨ
オキシダーゼをコードする遺伝子のクローニングは、常
法に従い、例えば次のようにして行う。先ず、過酸化水
素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ生産能を有する微生物よ
り染色体ＤＮＡを調製し、この染色体ＤＮＡを、適当な
制限酵素で切断して得たＤＮＡ断片と、同様にしてベク
ターを切断して得たベクター断片とを、例えば、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼなどにより結合させ、ＮＡＤＨオキシダー
ゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡを形成する。

【００２１】クローニングによって得られたＮＡＤＨオ
キシダーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを制限酵素で切断
した後、クローニングベクターと結合し、これを宿主微
生物に導入し、目的とする形質転換体をスクリーニング
すること等により、常法にしたがってＮＡＤＨオキシダ
ーゼ遺伝子をクローン化することができる。

【００２２】クローニング方法としては、具体的には、
ストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＩＢ１１７２３
(Streptococcus mutans ＮＣＩＢ１１７２３)を炭素
源、窒素源、無機塩類、その他の栄養素を程よく含有す
る培地で培養し遠心分離して菌体を集める。培養培地の
好適な例としては、ブレインハートインフュージョン培
地が挙げられる。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは
３０〜３７℃の範囲、培養開始pＨは６〜８、好ましく
は７付近で、対数増殖期中期まで静置培養する。目的と
するＤＮＡは、得られた菌体を溶菌させることによって
調製することができる。

【００２３】溶菌方法は、例えばリゾチームやα−グル
カナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理などが用いら
れる。また、必要により他の酵素剤やラウリル硫酸ナト
リウムなどの界面活性剤が併用される。

【００２４】このようにして得られる溶菌物からＤＮＡ
を分離、精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル抽出、除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレア
ーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜
組み合わせることによって行うことができる。

【００２５】ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音波
処理、制限酵素処理などにより行うことができる。切断
後、必要に応じてホスファターゼやＤＮＡポリメラーゼ
などの修飾酵素で処理してＤＮＡ断片末端の塩基配列を
変えることができる。切断されたＤＮＡから目的たんぱ
くをコードする塩基配列を持つＤＮＡ断片を得るには、
例えば目的のたんぱくのアミノ酸配列を基に合成した合
成プローブを用いて、電気泳動したゲルでサザンハイブ
リダイゼーション(Southern,E.M.,J.Mol.Biol.,９８,５
０３,(１９７５))を用い、反応するＤＮＡ断片を抽出す
ることによって適当な長さの断片のみが得られる。

【００２６】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖できるファージやプラスミド、例えばエッシェリヒ
ア コリ(Escherichia coli)を宿主微生物にする場合
には、λファージやＭ１３ファージ、またｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などが使用できる。Ｄ
ＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知の
ＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えばＤＮ
Ａ断片とベクター断片を生体外で適当なＤＮＡリガーゼ
の作用により組換えＤＮＡを作製する。

【００２７】宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定
かつ自律的増殖が可能で、その形質発現のできるもので
あればどのようなものでもよい。宿主微生物に組換えＤ
ＮＡを導入する方法は、公知の方法、例えば宿主微生物
がエッシェリヒア コリの場合にはカルシウム法(Leder
berg.E.M.,＆ Cohen.S.N.,J.Bacteriol．,１１９,１０
７２,(１９７４))などを採用することができる。

【００２８】λファージであれば、インビトロパッケー
ジング法(Horn,B.,Methods in Enzymol.,６８,２９９,
(１９７９))によりλファージ粒子を形成し、このλフ
ァージ粒子をエッシェリヒア コリの培養懸濁液に添加
して、該ＮＡＤＨオキシダーゼ生産能を保有する形質導
入ファージを得ることができる。

【００２９】組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物
の選択方法は、常法によって行い、例えばコロニーハイ
ブリダイゼーションによりポジティブクローンを得るこ
とができる。得られた形質転換体を３７℃で液体培養
し、公知の方法、例えばアルカリ抽出法(Birnboim,H.C.
＆ Doly,J.,Nucleic Acids Res.,７,１５１３(１９７
９))によってプラスミドを得る。このプラスミドを用
い、ジデオキシ法(Sanger,F.,Nickelen,S., ＆ Colusio
n,A.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.７４,５４９３,(１９７
７))によってシークエンスを決定することができる。ま
た、得られた形質転換体を培養することにより、目的と
する過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを大量に得
ることができる。

【００３０】

【実施例】次に、本発明を実施例により説明する。 実施例１ 過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子のクロー
ン化。 ストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＩＢ１１７２３
（ＮＣＩＭＢ（ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリーン・バクテリア）、イギ
リス、アバディーン、マーシャー・ドライブ、ストリー
ト２３番）をブレインハートインフュジョンの液体培地
にて３７℃６時間静置培養し、遠心分離にて集菌、洗浄
して得られた菌体をリゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダ
ーゼ(２０００Ｕ／ml)処理後、Saito−Miuraの方法(Sai
to,H.＆Miura,K.,Biochem.Biophys.Acta,７２,６１９,
(１９６３))に従って染色体ＤＮＡを分離した。これを
トリス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素Ｓau３
Ａlで部分消化した。分解物を１０〜４０％シュークロ
ース密度勾配遠心法により分画し、９〜２３kbの染色体
ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガー
ゼによりλＥＭＢＬ３（ストラトジーン（Stratagene C
loning Systems）製、アメリカ合衆国、カリフォルニ
ア、ラ・ジョラ、パインズ・ロード、ノース・トリー１
１０９９番）のアームに連結し、これをインビトロパッ
ケージングキット（ストラタジーン（Stratagene Cloni
ng Systems)製）を用いてファージ粒子に組み込み、エ
ッシェリヒア コリＰ２３９２（ストラタジーン（Stra
tagene Cloning Systems)製）に感染させた。

【００３１】この感染したエッシェリヒア コリのプラ
ークを、過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼのＮ−
末端アミノ酸配列を基に合成したプローブとプラークハ
イブリダイゼーションを行った。これにより合成したプ
ローブとハイブリダイズする陽性クローンを得た。

【００３２】実施例２ 過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子の形質転
換体の作製 実施例１で得られた合成ＤＮＡプローブとハイブリダイ
ズした陽性プラークは過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシ
ダーゼの抗体とも反応した。この陽性プラークからクロ
ーンＤＮＡ抽出し、制限酵素ＢamＨ１にて分解し、４kb
p ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＢamＨ１で消
化したプラスミドpＭＷ(アンピシリン耐性でかつＢamＨ
１で１ケ所切断可能なプラスミドＤＮＡ；ニッポンジー
ン製)と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加して連結処
理した。この処理液を用い、エッシェリヒア コリＪＭ
１０９（宝酒造製）を宿主として、当該プラスミドを導
入した。得られた形質転換体から前記の抗体と反応する
クローンを得た。当該形質転換体を培養し、集菌洗浄
後、アルカリ法でプラスミドを抽出し、ここで得られた
新規プラスミドをpＨＳ１９と命名した。

【００３３】実施例３ 過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片の塩基配列決定 実施例２で得られたプラスミドpＨＳ１９を制限酵素Ｅc
oＲ１にて分解し、１kbpと３kbpのＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片とプラスミドpＵＣ１１８（宝酒造製）
またはpＵＣ１１９（宝酒造製)を用いて当該酵素遺伝子
の再クローニングを行い、１kbpＤＮＡ断片を組み込ん
だ形質転換体と３kbpＤＮＡを組み込んだ形質転換体を
得た。両形質転換体よりプラスミドを抽出し、キロシー
クエンス用デリーションキット(宝酒造製)を用い、塩基
配列決定に必要な各種サイズＤＮＡを有するデリーショ
ン変異体を作製した。ＤＮＡ塩基配列の解析は、デオキ
シヌクレオチド鎖終結法(Messing,J. ＆ Vieira,J.,Gen
e,１９,２６９,(１９８２))によって行った。

【００３４】得られた塩基配列を配列表の配列番号：１
に示した。また当該配列の上流部分（１〜２７８塩基
対）を除く構造遺伝子を翻訳したアミノ酸配列を、配列
表の配列番号：２に示した。得られたアミノ酸配列はAm
phibacillus xylanusのＮＡＤＨオキシダーゼ構造遺伝
子の配列（GENETYX:Amino Acid Homology Data）と５
４.６％のホモロジーを有していた。

【００３５】実施例４ ＮＡＤＨ結合部位およびＦＡＤ結合部位の解析 ＮＡＤＨオキシダーゼの基質であるＮＡＤＨの結合部
位、およびフラビン補酵素（ＦＡＤ）の結合部位は、２
個のグリシン残基の間にいずれのアミノ酸でもよい４個
のアミノ酸残基を挟むアミノ酸配列、すなわち−ＧＸＸ
ＸＸＧ−（１文字表記、Ｘはいずれのアミノ酸でもよ
い）を共通に有することが予測される（Ho-Jin PARK, e
t. al, Eur. J. Biochem, 205, 875〜879(1992))。これ
より、実施例３で得られた配列番号：２に示した全アミ
ノ酸配列中、−ＧＸＸＸＸＧ−に相当する配列を検索し
たところ、２カ所のみが当該配列と合致した。よって、
このうちのいずれかがＮＡＤＨ結合部位であり、他方が
ＦＡＤ結合部位であると考えられる。

【００３６】一方、Amphibacillus xylanusのＦＡＤ結
合部位およびＮＡＤＨ結合部位は、ＮＡＤＨ結合部位に
相当するアミノ酸配列が−ＧＧＧＰＡＧ−（Gly Gly Gl
y Pro Ala Gly)を含み、ＦＡＤ結合部位に相当するアミ
ノ酸配列が−ＧＧＧＮＳＧ−（Gly Gly Gly Asn Gly)を
含むものであると同定されている(ニムラら、日本農芸
化学会口演(1992年度))。上記２カ所の配列をAmphibaci
llus xylanusのＮＡＤＨ結合部位およびＦＡＤ結合部位
と比較すると、一方、すなわち配列番号：２のアミノ酸
配列中、２１５〜２２０の配列がＮＡＤＨ結合部位と、
他方の３５４〜３５９の配列がＦＡＤ結合部位と同一の
配列であり、当該配列はそれぞれＮＡＤＨ結合部位およ
びＦＡＤ結合部位を示すものと推定される。また、上記
各アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列、すなわ
ち配列番号：１の配列中９２１〜９３８の配列はＮＡＤ
Ｈ結合部位、１３３８〜１３５５の配列はＦＡＤ結合部
位をコードするものと推定される。

【００３７】

【配列表】

【００３８】配列番号：１ 配列の長さ：１８０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 株名：ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptcocc
us mutans)ＮＣＩＢ１１７２３ 配列 GGATCCCTTC TCATGTTCTC TCACAAGGAT TTGAGGTTTT AGGTGAAGAT GGTTTAGCAC 60 AACGTGGAAC CTTTATTGTA GATCCGGATG GTATCATTCA AATGATGGAA GTCAATGCAG 120 ATGGTATTGG TCGTGATGCT AGTACCTTGA TTGATAAAGT TCGTGCAGCT CAATCTATTC 180 GCCAACATCC AGGAGAAGTT TGCCCTGCCA AATGGAAAGA GGGAGCTGAA ACTTTAAAAC 240 CAAGTTTGGT ACTTGTCGGT AAAATTTAAG GAGAAACTAT GGCATTAGAC GCAGAAATCA 300 AAGAGCAGTT AGGACAGTAT CTTCAATTAC TTGAGTGTGA GATTGTTTTA CAAGCTCAAT 360 TAAAAGACGA TGCTAATTCT CAAAAAGTTA AGGAATTTCT CCAAGAAATC GTTGCAATGT 420 CTCCTATGAT TTCTTTAGAC GAAAAGGAAC TTCCGCGAAC ACCTAGTTTT CGCATAGCTA 480 AAAAGGGGCA AGAATCTGGT GTTGAATTTG CTGGCTTACC CCTTGGTCAC GAATTTTACT 540 TCGTTTATCT TGGCTCTGTT ACAGGTTTCA GGGCGTCCGC TAAGGTAGAG ACTGATATTG 600 TCAAACGCAT TCAAGCTGTT GATGAACCTA TGCATTTTGA AACCTATGTT AGTTTGACTT 660 GTCATAATTG TCCAGATGTT GTTCAGGCTT TCAATATCAT GTCAGTTGTT AATCCCAACA 720 TTTCACATAC AATGGTGGAA GGTGGCATGT TTAAAGATGA AATTGAAGCT AAGGGAATTA 780 TGTCTGTGCC AACTGTCTAT AAAGATGGAA CAGAATTTAC CTCAGGGCGT GCTAGCATAG 840 AGCAATTACT AGACTTGATA GCAGGTCCTC TTAAAGAAGA TGCTTTTGAT GATAAAGGTG 900 TTTTTGATGT CCTTGTTATT GGTGGGGGTC CTGCTGGTAA TAGCGCGGCT ATCTATGCTG 960 CAAGAAAGGG AGTTAAAACA GGACTTTTAG CTGAAACCAT GGGTGGTCAA GTTATGGAAA 1020 CCGTGGGTAT TGAAAATATG ATCGGTACCC CATATGTTGA AGGACCCCAA TTAATGGCTC 1080 AGGTGGAAGA GCATACCAAG TCTTATTCTG TTGACATCAT GAAGGCACCG CGTGCTAAGT 1140 CTATTCAAAA GACAGACTTG GTTGAAGTTG AACTTGATAA TGGAGCTCAT TTGAAAGCAA 1200 AGACAGCTGT TTTGGCCTTA GGTGCCAAGT GGCGTAAAAT CAATGTACCA GGAGAAAAAG 1260 AATTCTTTAA TAAAGGTGTT ACTTACTGTC CGCACTGTGA TGGTCCTCTT TTCACAGACA 1320 AAAAAGTCGC TGTCATTGGC GGTGGAAACT CAGGTTTAGA AGCAGCTATT GATTTGGCTG 1380 GGTTAGCTAG CCATGTCTAT ATTTTAGAAT TTTTACCTGA GTTAAAAGCT GATAAGATCT 1440 TACAAGATCG TGCGGAAGCT CTTGATAATA TTACCATTCT AACTAATGTT GCGACTAAAG 1500 AAATTATTGG CAATGACCAC GTAGAAGGTC TTCGTTACAG TGATCGTACG ACCAATGAAG 1560 AGTACTTGCT TGATTTAGAA GGTGTTTTTG TTCAAATTGG ATTGGTACCT AGTACTGACT 1620 GGTTAAAGGA TAGTGGACTA GCACTCAATG AAAAAGGTGA AATCATTGTT GCTAAAGATG 1680 GCGCAACTAA TATTCCTGCT ATTTTTGCAG CTGGTGATTG CACAGATAGT GCCTACAAAC 1740 AAATTATCAT TTCCATGGGT TCTGGAGCTA CTGCGGCTTT AGGTGCCTTT GATTATTTGA 1800 TTAGAAATT// 1809

【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：５１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Leu Asp Ala Glu Ile Lys Glu Gln Leu Gly Gln Tyr Leu 1 ５ １０
１５ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ ２０
２５ ３０ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ ３５
４０ ４５ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ ５０
５５ ６０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ ６５
７０ ７５ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｙｒ ８０
８５ ９０ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ９５
１００ １０５ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｐｈｅ １１０
１１５ １２０ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｈｉｓ
Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ １２５
１３０ １３５ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｈｉｓ １４０
１４５ １５０ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
ＡＳｐ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ １５５
１６０ １６５ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ
Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ １７０
１７５ １８０ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ １８５
１９０ １９５ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｓｐ ２００
２０５ ２１０ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ ２１５
２２０ ２２５ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ２３０
２３５ ２４０ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｉｌｅ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ ２６０
２６５ ２７０ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ ２７５
２８０ ２８５ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ ２９０
２９５ ３００ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｕｅ Ａｌａ Ｌｕｅ Ｇｌｙ ３０５
３１０ ３１５ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ ３２０
３２５ ３３０ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｈｉｓ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ３３５
３４０ ３４５ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ ３５０
３５５ ３６０ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｉｌｅ ３６５
３７０ ３７５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ ３８０
３８５ ３９０ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｕｅ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｌａ ３９５
４００ ４０５ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ ４１０
４１５ ４２０ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ ４２５
４３０ ４３５ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ４４０
４４５ ４５０ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｌａ ４５５
４６０ ４６５ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ ４７０
４７５ ４８０ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ４８５
４９０ ４９５ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｓｎ ５００
５０５ ５１０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 神尾 好是 宮城県仙台市泉区住吉台東２丁目１−１ (72)発明者 伊▲崎▼ 和夫 宮城県黒川郡富谷町東向陽台２丁目15−14

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ
   をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 下記のＮＡＤＨ結合部位を含むアミノ酸
   配列で特定される請求項１記載のＤＮＡ。 【化１】
3. 【請求項３】 下記のＮＡＤＨ結合部位を含む塩基配列
   で特定される請求項１記載のＤＮＡ。 【化２】
4. 【請求項４】 下記のＦＡＤ結合部位を含むアミノ酸配
   列で特定される請求項１記載のＤＮＡ。 【化３】
5. 【請求項５】 下記のＦＡＤ結合部位を含む塩基配列で
   特定される請求項１記載のＤＮＡ。 【化４】
6. 【請求項６】 下記の塩基配列で特定される請求項１記
   載のＤＮＡ。 【化５】
7. 【請求項７】 下記のアミノ酸配列で特定される請求項
   １記載のＤＮＡ。 【化６】 【化７】
8. 【請求項８】 請求項１または５のＤＮＡの上流に、過
   酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子の転写およ
   び翻訳に関する５'末端の非翻訳領域を有する請求項１
   記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 非翻訳領域が下記の塩基配列で特定され
   る請求項８記載のＤＮＡ。 【化８】
10. 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれかに記載の過酸
    化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡ
    を含有するプラスミド。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載のプラスミドＤＮＡを
    導入した微生物。