JPH07121198B2 - 魚類の成長ホルモン - Google Patents

魚類の成長ホルモン

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JPH07121198B2
JPH07121198B2 JP61281147A JP28114786A JPH07121198B2 JP H07121198 B2 JPH07121198 B2 JP H07121198B2 JP 61281147 A JP61281147 A JP 61281147A JP 28114786 A JP28114786 A JP 28114786A JP H07121198 B2 JPH07121198 B2 JP H07121198B2
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growth hormone
thr
leu
fish
basic
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豊 苅谷
信光 宮崎
省二 木村
道夫 野中
浩司 川内
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マルハ株式会社
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、スズキ類の魚類の成長ホルモン及びそれを用
いる魚類の成長促進方法に関する。
〔従来の技術及びその問題点〕
成長ホルモンは、脳下垂体ホルモンの一種であるが、主
として哺乳類の成長ホルモンにつき、その活性及び構造
が研究されて来た。例えば、ヒト成長ホルモンについて
は、U.J.LewisらによってJ.Am.Chem.Soc.,80 4429(198
5)に、ウシ成長ホルモンについては、C.H.Liによって
J.Biol.Chem.,211 555(1954)に、ヒツジ成長ホルモン
については、H.PapkoffらによってBiochim.Biophys.,Ac
ta29 145(1958)に報告されている。一方、魚類の成長
ホルモンについては、A.F.Cookらによるコイよりの単離
例がGen.Comp.Endocrin.,50 335(1983)に、H.Kawauch
iらによるサケよりの単離例がArch.Biochim.Biophys.,2
44 542(1986)に報告されており、信頼性のある知見が
蓄積されつつあるものの、哺乳類の場合に比べて今後の
研究対象とすべき魚種は多い。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らは、このように背景のもと、マグロ脳下垂体
から成長ホルモンを抽出し、それがポリペプタイドであ
ることを同定すると共に、分子量、C末端からのアミノ
酸配列等の理化学的性質を分析した。次いで、以下に記
載の応用目標に基づき、該成長ホルモンの成長促進効果
を検討した。
硬骨魚類真骨類(Teleoste)は、ニシン類、中生類及び
スズキ類の三類に分類することができ、スズキ類が最も
進化した一群、ニシン類が最も原始的な一群、中生類が
ニシン類とスズギ類の中間的形質を帯びた一群とされて
いる。このうち、海産魚類の大部分が属しているのはス
ズキ類(Perichthyes)である。このスズキ類の養殖を
目標とするにあたり、該魚類に成長ホルモンを投与して
成長を促進せしめる方法をとるならば、スズキ類の魚類
の脳下垂体から抽出した成長ホルモンを用いるのが最適
である。実際に本発明者らの抽出したマグロ成長ホルモ
ンを、マグロ近縁魚種以外のスズキ類の魚種に投与した
ところ、優れた成長促進効果が得られることを確認し
た。また、スズキ類よりも進化の程度の低いニシン類
(Clupeichthyes)の魚種に対しても同様の効果を示す
ことを明らかにした。
本発明は、上記の知見に基づき完成されたもので、以下
に本発明を更に詳細に説明する。
本発明に関する魚類の成長ホルモンを構成する成長ホル
モンは、スズキ類サバ目サバ科のキワダマグロ(Thunnu
s albacares)の脳下垂体から塩基性水溶液によって抽
出したポリペプタイドであり、その理化学的性質は以下
の通りである。
(i)アミノ酸組成:下記第1表の通り。
(ii)C末端より下記22個のアミノ酸配列を有する。
His−Lys−Val−Glu−Thr−Tyr−Leu−Thr−Val−Ala−
Lys−Cys−Arg−Leu−Ser−Pro−Glu−Ala−Asn−Cys−
Thr−Leu−COOH (iii)分子量:23,000前後。
(iv)溶解性:塩基性水溶液に可溶。中性及び酸性水溶
液に難溶又は不溶。
(V)塩基性酸性の区別:塩基性ポリペプタイド (VI)物質の色、形状:白色粉末。
(VII)ポリアクリルアミド電気泳動:単一バンド 本発明の成長ホルモンの純度は、SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(9.9%ポリアクリルアミド/0.1%SD
S)を用いて検定できる。
アミノ酸組成は、本物質を20%定沸点塩酸中で、110℃
にて24時間加水分解し、フェニルイソチオシアネート
(PITC)を付加後、日本分光工業製高速液体クロマトグ
ラフで分析することができる。
また、斯る成長ホルモンのC末端のアミノ酸配列の分析
は、還元カルボキシメチル化、ブロムシアン分解によっ
て得られるフラグメントにつき、Applied Biosystems社
製470A型シーケンサー及びSpectra Physics社製高速液
体クロマトグラフの組合せによって実施できる。
本発明の成長ホルモンは、3〜4年齢の雌のキワダマグ
ロ(Thunnus albacares)の脳下垂体から、塩基性水溶
液による抽出方法によって製造することができる。
具体的には、脳下垂体に、氷冷アセトンを加え、ホモゲ
ナイザーを用いて500〜1000rpm、1〜2分間摩砕した
後、冷凍遠心処理(15,000rpm、−10℃、30分間、以下
同じ)を施す。上清液を除き、残渣に氷冷した1.5mMフ
ェニルメチルスルフォルニルフルオライド(PSF)及び5
mM EDTAよりなる溶液を加え、ホモゲナイザーを用い
て、500rpm、15秒×数回摩砕する。NaOH水溶液でpH9と
し、氷冷下撹拌抽出を1時間行った後、冷凍遠心処理を
行う。上清を水に対して透析後、凍結乾燥し、粉末を得
る。この粉末を、0.05M NH4HCO3緩衝液(pH9)に溶か
し、セファデックスカラムクロマトグラフィーにかけ
る。平衡化、溶出には、同じNH4HCO3緩衝液を用いる。
活性画分を集めて凍結乾燥を行うことにより得られる粉
末を、更に、0.05MAcONH4緩衝液(pH9)に溶かし、DEセ
ルロース・カラムクロマトグラフィーにかける。平衡化
には同じAcONH4緩衝液を用い、溶出は0.05〜025M同緩衝
液の直線的濃度向勾配による。活性画分を集めて凍結乾
燥を行うことにより得られる粉末を、0.1%トリフルオ
ル酢酸(TFA)(pH2)に溶かし、逆相系高速液体クロマ
トグラフィーにかける。平衡化には、0.1%TFAを含む40
%アセトニトリルを用い、溶出は、40〜100%アセトニ
トリルの直線的濃度勾配による。活性画分を集めて凍結
乾燥を行い、本発明の成長ホルモンを白色粉末として得
る。
成長ホルモン活性は、マダイ及びニジマス用い、実施例
に示した方法で測定する。本発明の成長ホルモンは、硬
骨魚類真骨類(Teleostei)に属するスズキ類(Percich
thyes)及びニシン類(Clupeichthyes)の成長を促進す
ることができる。
〔実施例〕
実施例1(キワダマグロ成長ホルモンの抽出と精製) 3〜4年齢の雌のキワダマグロ(Thunnus albacares)
の脳下垂体20gに冷アセトン500mlを加え、ホモゲナイザ
ーを用いて、500rpmにて2分間摩砕した後、冷凍遠心
(15,000rpm、−10℃、30分間)した。上清液を除いた
後、残渣に氷冷した1.5mM PMSF及び5mM EDTAよりなる
溶液500mlを加え、ホモゲナイザーを用いて、500rpmに
て15秒間×4回摩砕した。NaOH水溶液でpH9に調製し、
氷冷下1時間撹拌抽出を行った後、再び上記と同様に冷
凍遠心を行い、上清を分離した。この上清を水に対して
透析後、凍結乾燥を行って約1570mgの粉末を得た。この
粉末を1/2量を、20mlの0.05M NH4HCO3緩衝液(pH9)に
溶かし、0.05M NH4HCO3緩衝液(pH9)で平衡化したセ
ファデックスG−100カラム(5.5φ×70cm)に通塔し
た。上記と同じNH4HCO3緩衝液で溶出させ、10mlずつの
分画を得た。第1図に示すB及びC分画を集め、凍結乾
燥して、約260mgの粉末を得た。この粉末を40mlの0.05M
AcONH4緩衝液(pH9)に溶かし、0.05M AcONH4緩衝液
(pH9)で平衡化したDE52カラム(1.2φ×20cm)に通塔
した。上記と同じAcONH4緩衝液で非吸着分画を完全に溶
出せしめた後、0.05〜0.25M AcONH4緩衝液(pH9)の直
線的濃度勾配により吸着分画の溶出を行い、5mlずつの
分画を得た。第2図に示すA分画を集め、凍結乾燥し
て、約80mgの粉末を得た。この粉末1mgに4M尿素及び0.1
%TFAよりなる水溶液(pH2)を100μ加え室温放置し
て溶解させた後、0.1%TFAを含む40%アセトニトリルで
平衡化したTSK−gel ODS120Tカラム(0.4φ×25cm)を
装着した日本分光工業製高速液体クロマトグラフィーに
付した。溶出は0.1%TFAを含む40%アセトニトリル5
分、0.1%TFAを含む40〜100%アセトニトリルの直線的
濃度勾配20分間(流速1ml/分)で行い、第3図に示すC
分画を集め凍結乾燥した。この高速液体クロマトグラフ
ィーによる精製を20回繰り返し、10mgの白色粉末、即ち
キワダマグロ成長ホルモンを得た。
実施例2(分子量の測定) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(9.9%ポリアク
リルアミド/0.1%SDS)で上記成長ホルモンを展開し
た。標準蛋白質としてBOH Chemicalsの標準蛋白質マー
カー(分子量1.43万、2.86万、4.29万)を使用して得ら
える検量線によると、分子量は約23,000と算出された
(第4図)。また同時に該成長ホルモンは単一バンドを
与えた。
実施例3(C末端フラグメントのアミノ酸配列の分析) キワダマグロより得られた上記成長ホルモン1mgをジチ
オスレイトールにより還元、モノヨード酢酸によりカル
ボキシメチル化した後、1mlの70%蟻酸に溶解し、適量
のブロムシアンを加えて遮光条件下24時間放置した。凍
結乾燥して得られる、MetのC側で開裂して生じたフラ
グメントを含む粉末を50μの20%蟻酸に溶解し、0.1
%TFAを含む20%イソプロパノールで平衡化したTSK−ge
l ODS120Tカラムを装着した日本分光工業製高速液体ク
ロマトグラフィーに付した。溶出は0.1%TFAを含む20〜
70%イソプロパノールの直線的濃度勾配90分間(流速0.
5ml/分)で行い、C末端フラグメントを含む分画を遠心
減圧乾燥して粉末を得た。この粉末を60μの40%アセ
トニトリルに溶かし、このうち30μを470A型シークエ
ンサー(Applied Biosystems社)とSP8100型高速液体ク
ロマトグラフ(Spectra Physics社)に付し、構成アミ
ノ酸を分析したところ、下記の通りC末端まで22個のア
ミノ酸残基が決定された。
His−Lys−Val−Glu−Thr−Tyr−Leu−Thr−Val−Ala−
Lys−Cys−Arg−Leu−Ser−Pro−Glu−Ala−Asn−Cys−
Thr−Leu−COOH 実施例4(スズキ類に対するマグロ成長ホルモン活性の
測定) 孵化後90日のマダイ(13〜17g)の稚魚(1群10尾)に
固体識別し、それぞれの腹腔内に、キワダマグロより実
施例1と同様にして単離された成長ホルモンを、15μg
(0.1ml)/尾、1.5μg(0.1ml)/尾、対照区として
0.9%食塩水を0.1ml/尾ずつ、それぞれ5日おきに4回
投与した。
飼育は、水温22.0〜26.5℃の条件下で行い、朝夕2回食
糧を投餌した。
第1回目の投与から30日後の体重増加を第2表に示す。
第2表の結果から、本発明の成長ホルモンがスズキ類の
一種であるマダイの成長を促進することが明らかに示さ
れた。
実施例5(ニシン類に対するマグロ成長ホルモン活性の
測定) 孵化後4〜7ヶ月齢(6〜8g)のニジマス(1群10匹)
を固体識別し、それぞれの腹腔内に、キワダマグロより
実施例1の如く単離された成長ホルモンを、10μg(0.
1ml)及び1μg(0.1ml)、対照区として0.9%食塩水
を0.1ml/尾ずつ、それぞれ6日おきに6回投与した。水
温13〜18℃の条件下に、朝夕2回飽食の投餌を行い飼育
した。
第1回目の投与から42日後の体重増加を第3表に示す。
第3表の結果から、本発明の成長ホルモンがニシン類の
一種であるニジマスの成長を促進することが判明した。
第5図及び第6図には更に、各回の成長ホルモン投与時
の、投与開始日における体長及び体重に対する増加割合
(%)をグラフ化して示す。
〔発明の効果〕 本発明によれば、スズキ類のホルモンを硬骨魚類に投与
することによりその成長を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
第1図はキワダマグロ脳下垂体の塩基性水溶液による抽
出物のセファデックスG−100カラムクロマトグラフィ
ーでの溶出パターンを示す図、第2図はゲル過分画B
及びCのDE52カラムクロマトグラフィーでの溶出パター
ンを示す図、第3図はイオン交換分画Aの高速液体クロ
マトグラフィーでの溶出パターンを示す図、第4図はSD
S−ポリアクリルアミド電気泳動で、泳動距離からキワ
ダマグロの成長ホルモンの分子量を算出した図、第5図
及び第6図はキワダマグロ成長ホルモンのニジマス稚魚
に対する成長促進効果を示す図で、それぞれ体長及び体
重の増加割合(%)を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 野中 道夫 東京都中央区月島3丁目2番9号 大洋漁 業株式会社大洋研究所内 (72)発明者 川内 浩司 岩手県気仙郡三陸町越喜来字杉下124番地 (56)参考文献 特開 昭61−225135(JP,A) 特開 昭61−210041(JP,A) 特開 昭60−214798(JP,A) 特公 平6−72159(JP,B2)

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】スズキ類サバ目サバ科のマグロの脳下垂体
    から抽出して得られる下記の理化学的性質を有するポリ
    ペプタイドである魚類の成長ホルモン。 (i)アミノ酸組成:第1表の通り。 (ii)C末端より下記22個のアミノ酸配列を有する。 His−Lys−Val−Glu−Thr−Tyr−Leu−Thr−Val−Ala−
    Lys−Cys−Arg−Leu−Ser−Pro−Glu−Ala−Asn−Cys−
    Thr−Leu−COOH (iii)分子量:23,000前後。 (iv)等電点:7.5前後。 (v)溶解性:塩基性水溶液に可溶。中性及び酸性水溶
    液に難溶又は不溶。 (vi)塩基性酸性の区別:塩基性ポリペプタイド
  2. 【請求項2】スズキ類サバ目サバ科のマグロの脳下垂体
    から抽出して得られる下記の理化学的性質を有するポリ
    ペプタイドである魚類の成長ホルモンを硬骨魚類に投与
    して、成長を促進する方法。 (i)アミノ酸組成:第1表の通り。 (ii)C末端より下記22個のアミノ酸配列を有する。 His−Lys−Val−Glu−Thr−Tyr−Leu−Thr−Val−Ala−
    Lys−Cys−Arg−Leu−Ser−Pro−Glu−Ala−Asn−Cys−
    Thr−Leu−COOH (iii)分子量:23,000前後。 (iv)等電点:7.5前後。 (v)溶解性:塩基性水溶液に可溶。中性及び酸性水溶
    液に難溶又は不溶。 (vi)塩基性酸性の区別:塩基性ポリペプタイド
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPS60214798A (ja) * 1984-04-06 1985-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 魚類の成長ホルモン
JPS61210041A (ja) * 1985-03-13 1986-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 魚類の成長ホルモン
JPH0672159B2 (ja) * 1985-03-28 1994-09-14 協和醗酵工業株式会社 魚類の成長ホルモン

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