JP2759457B2

JP2759457B2 - 抗腫瘍性蛋白質

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Publication number: JP2759457B2
Application number: JP63117887A
Authority: JP
Inventors: 直義鈴木; 豊吉田; 文雄尾▲崎▼; 深一小島; 義和柳; 和志諏訪
Original assignee: SUMITOMO SEIYAKU KK
Current assignee: SUMITOMO SEIYAKU KK
Priority date: 1988-05-13
Filing date: 1988-05-13
Publication date: 1998-05-28
Anticipated expiration: 2013-05-28
Also published as: KR890017268A; EP0341734A3; AU3468989A; AU628052B2; EP0341734A2; NZ229113A; JPH01287097A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は抗腫瘍作用を有する新規蛋白質に関するもの
である。

〔従来の技術〕

トキソプラズマ原虫由来の生理活性蛋白質としては、
インターフェロン誘導剤（特開昭59−27832号公開公報
参照）と抗腫瘍剤（特開昭62−249927号公開公報参照）
が知られている。

すなわち、トキソプラズマ原虫を物理的に破砕し、1
0,000G以上で遠心分離することによって得られる沈渣、
および上清をゲル濾過法によって分子量分画して得た分
子量が100,000以上の水溶性画分、分子量が20,000〜10
0,000の水溶性画分ならびに分子量が4,000以下の水溶性
画分から選択されるインターフェロン誘導剤が開示され
ている。

そして、抗腫瘍作用を有する蛋白質としては主成分分
子量が15,000〜20,000のものが開示されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者らはトキソプラズマ原虫を物理的に破砕した
水溶性成分中の生理活性物質について鋭意研究を重ねた
結果、主成分分子量が4,000〜15,000の蛋白質にも優れ
た抗腫瘍活性を有することを見い出した。

また、当該蛋白質は逆相液体クロマトグラフィーを用
いることによって、効率よく精製することができること
を見出した。

従って、本発明の第１の目的は抗腫瘍作用を有する新
規蛋白質を提供することである。

本発明の第２の目的は当該新規蛋白質の精製方法を提
供することである。

本発明の第３の目的は新規抗腫瘍剤を提供することで
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸
配列からなる抗腫瘍性蛋白質、就中トキソプラズマ原虫
由来の抗腫瘍性蛋白質である。

また、本発明は逆相液体クロマトグラフィーを用いる
ことによる前記抗腫瘍性蛋白質の精製方法である。

さらに本発明は前記抗腫瘍性蛋白質を有効成分とする
抗腫瘍剤である。

この明細書においては、アミノ酸、保護基、活性基、
溶媒等について、IUPAC−IUBに基づく略号および、当該
分野における慣用略号で表示する場合があり、それらを
例示すると次の通りである。

アミノ酸残基に対する略号は以下の通りである。略号名称 Arg Ｌ−アルギニン Leu Ｌ−ロイシン Val Ｌ−バリン His Ｌ−ヒスチジン Thr Ｌ−スレオニン Ser Ｌ−セリン Glu Ｌ−グルタミン酸 Lys Ｌ−リジン Gln Ｌ−グルタミン Ile Ｌ−イソロイシン Asn Ｌ−アスパラギン Tyr Ｌ−チロシン Asp Ｌ−アスパラギン酸 Gly グリシン Ala Ｌ−アラニン Phe Ｌ−フェニルアラニン Pro Ｌ−プロリン Met Ｌ−メチオニン Asx Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−アスパラギン Glx Ｌ−グルタミン酸またはＬ−グルタミン特に断らない限り、本明細書で接頭辞Ｌ無しで命名さ
れているアミノ酸残基は天然に生ずる絶対立体配置Ｌに
該当する。

他の略号は次の通りである。略号名称 Boc ｔ−ブチルオキシカルボニル Cl−Ｚ 2−クロルベンジルオキシカルボニル Tos ｐ−トルエンスルホニル OcHex シクロヘキシルエステル Bzl ベンジル Clz−Bzl 2,6−ジクロルベンジル TFA トリフルオロ酢酸 DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド DMF ジメチルホルムアミド以下、本発明の抗腫瘍性蛋白質の代表例および該蛋白
質をトキソプラズマ原虫より単離精製する場合に得られ
る蛋白質について詳細に説明する。

☆TLA−H4: （１）色および性状白色粉末状。

（２）水溶性易溶性。

（３）分子量 TSK−G2000SWを用いる高速ゲル濾過法により、分子
量は約10,500である。

指標蛋白として牛血清アルブミン（分子量67,000）、
卵白アルブミン（分子量43,000）、リボヌクレアーゼＡ
（分子量13,700）およびブタ・インシュリン（分子量5,
800）を用い、溶出緩衝液としてM/15リン酸緩衝液−M/1
0塩化ナトリウム（pH6.7）を用いた。指標蛋白はすべて
Sigma社製を用いた。

非還元下でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法によって測定した分子量は約8,500である。指標蛋
白としてフォスフォリラーゼＢ（分子量94,000）、牛血
清アルブミン（分子量67,000）、卵白アルブミン（分子
量43,000）、カーボニック・アンヒドラーゼ（分子量3
0,000）、大豆トリプシンインヒビター（分子量21,00
0）、リゾチーム（分子量14,400）およびブタインシュ
リン（分子量5,800）を用いた。

ブタインシュリンはSigma社製、それ以外の指標蛋白
はPharmacia社製。

（４）Ｎ末端アミノ酸配列 Met−Gln−Ile−Phe−Val−Lys−Thr−Leu−Thr−Gly
−Lys−Thr−Ile− アミノ酸配列はApplied Biosystems社製470A型プロテ
イン・シーケンサーを用いてエドマン分解し、生成した
PTH（フェニルチオヒダントイン）−アミノ酸誘導体を
島津社製高速液体クロマトグラフィーを用いて同定し
た。

（５）アミノ酸組成： TLA−H4（１μｇ）に0.1％チオグリコール酸含有定沸
点塩酸0.2mlを加え、封管中110℃で24時間加水分解して
アミノ酸組成を調べた結果は第１に示す通りである。

☆TLA−H5A: （１）色および性状白色粉末状。

（２）水溶性易溶性。

指標蛋白はTLA−H4の項で記載した前記のものと同じ
である。

非還元下でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法によって測定した分子量は約8,500である。

（５）アミノ酸組成： TLA−H5A（２μｇ）に0.1％チオグリコール酸含有定
沸点塩酸0.2mlを加え、封管中110℃で24時間加水分解し
てアミノ酸組成を調べた結果は表１に示す通りである。

☆TLA−H5C: （１）色および性状白色粉末状。

（２）水溶性易溶性。

（５）アミノ酸組成： TLA−H5C（２μｇ）に0.1％チオグリコール酸含有定
沸点塩酸0.2mlを加え、封管中110℃で24時間加水分解し
てアミノ酸組成を調べた結果は表１に示す通りである。

☆TLA−H6: （１）色および性状白色粉末状。

（２）水溶性易溶性。

なお、TLA−H6の態様としては、上記配列においてＸ
がAspであるもの、ＸがGluであるもの、およびこれらの
混合物であるものがあげられ、以下の記載においては、
ＸがGluであるものを、特にTLA−H6Eと称し、ＸがAspで
あるものをTLA−H6Dと称する。また、特記しない限り、
TLA−H6はＸがAspであるものとＸがGluであるものとの
混合物を指すものとする。

（５）アミノ酸組成： TLA−H6（２μｇ）に0.1％チオグリコール酸含有定沸
点塩酸0.2mlを加え、封管中110℃で24時間加水分解して
アミノ酸組成を調べた結果は表１に示す通りである。

☆TLA−H8: （１）色および性状白色粉末状。

（２）水溶性易溶性。

（３）分子量非還元下でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法によって測定した分子量は約14,000である。

アミノ酸配列はApplied Biosystems社製470A型プロテ
イン・シーケンサーを用いてエドマン分解し、生成した
PTH（フェニルチオヒダントイン）−アミノ酸誘導体を
アプライド・バイオシステムズ社製120A型PTHアナライ
ザーを用いて同定した。

（５）アミノ酸組成 TLA−H8（0.5μｇ）に0.1％チオグリコール酸含有定
沸点塩酸0.2mlを加え、封管中110℃で24時間加水分解し
てアミノ酸組成を調べた結果は表１に示す通りである。

☆TLA−H: （１）色および性状白色粉末状。

（２）水溶性易溶性。

（３）分子量セファデックスＧ−75を用いるゲル濾過法により、
分子量4,000〜15,000である。

指標蛋白として牛血清アルブミン（分子量67,000）、
蛋白アルブミン（分子量43,000）、キモトリプシノーゲ
ン（分子量25,000）およびリボヌクレアーゼＡ（分子量
13,700）を用い、溶出緩衝液として0.1M酢酸アンモニウ
ム（pH4.8）を用いた。指標蛋白はすべてSigma社製を用
いた。

TSK−G2000SWを用いる高速ゲル濾過法により、分子
量4,000〜15,000である（第１図参照）。

（４）呈色反応クーマシー・ブリリアント・ブルーＧ−250に対する
反応性は陽性であり、蛋白質であることが確認された。

本発明の抗腫瘍性蛋白質は、生物学的に許容される酸
付加塩、たとえば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、
コハク酸塩、フマール酸塩などの有機酸塩、塩酸塩、臭
化水素酸塩、硫酸塩などの無機酸塩などの態様であって
もよい。

かかる塩は自体既知の手段によって容易に製造するこ
とができる。例えば、酢酸塩の場合は、当該抗腫瘍性蛋
白質を水に溶かし、必要量の酢酸を加えることによって
製造される。

〔製造方法〕

本発明の抗腫瘍性蛋白質の製造方法としては、たとえ
ば次のような方法が例示される。

（ｉ）トキソプラズマ株から抽出・精製し単離する方
法：トキソプラズマ株から抽出・精製し単離する方法で
は、製造原料としては、いずれのトキソプラズマ（以
下、Tpと略す）株をも使用することができるが、その代
表例としてトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gon
dii）RH株タヒゾイトが挙げられる。Tpは、通常入手さ
れるものをそのまま用いてもよく、またこれを常法に従
い、動物体内でまたは組織培養細胞で増殖させた後単離
して用いることもできる。

Tpの物理的破砕は特開昭59−27832号公報に記載され
ているように常法に従い超音波破砕法および凍結融解法
を単独あるいは組み合せて行うことができる。

すなわち、超音波破砕法による場合には、Tpを、例え
ば蒸溜水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（PBS）、塩
平衡ハンクス液等の適当な緩衝液、好ましくは蒸溜水を
用いて通常の100mg/ml（２×10⁹個Tp/ml）前後の溶液な
いし希釈液とし、これを４〜15℃の温度で１〜５分間程
度超音波処理を複数回行う。また、凍結融解法による場
合には、上記と同様にして調整したTp含有液を、予め−
20℃〜−80℃で凍結し、次いで凍結物を約20〜37℃で融
解する操作を数回（通常５回程度）繰り返すことにより
所望の破砕物を収得することができる。

次いで、Tp破砕物中の不溶物を所望により遠心（例え
ば、16,000G、４℃、60分）等により除去し、変性防止
のために塩化ナトリウム溶液等を加え等張とした後、10
0,000G以上の超高速遠心（例えば、４℃、120分）を行
うことによって上清を採集する。

この上清を無菌濾過した後、凍結乾燥し粉末状の蛋白
質（トキソプラズマ溶解抗原、以下、TLAと略す）を得
る。

上記粉末状の蛋白質TLAは公知の精製法、例えばゲル
濾過クロマトグラフィー、限外濾過、透析、塩析などを
単独あるいは組み合せて精製することができる。

好ましくは、TLAを水あるいは生理食塩水に溶解し、
適当なゲル濾過用充填剤、例えばセファデックスＧ−5
0、セファデックスＧ−100、セファクリルＳ−200、バ
イオゲルＰ−30あるいはバイオゲルＰ−60、好ましくは
セファデックスＧ−75を用いるゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより分子量分画し、分子量4,000〜15,000の画分
を分取し、凍結乾燥し白色粉末状の蛋白物質（トキソプ
ラズマ溶解抗原−Ｈ、すなわちTLA−Ｈ）を得る。

かくして得られたTLA−Ｈは、本発明に含まれる抗腫
瘍性蛋白質の混合物の態様であり、本発明はかかる混合
物態様の抗腫瘍性蛋白質をも包含するものである。

上記混合物からの任意の各蛋白質の単離は公知の精製
法、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーあるいは適当な抗体などを用いるアフ
ィニティークロマトグラフィーを単独あるいは組み合せ
て行なうことができる。

好ましくは、TLA−Ｈを水あるいは0.1％トリフルオロ
酢酸に溶解し、適当な逆相系充填剤、例えば炭素数１か
ら18のアルキル基あるいはフェニル基の結合したシリカ
ゲル担体を用いる逆相型液体クロマトグラフィーにより
単離する。溶出溶媒としてはトリフルオロ酢酸、酢酸、
ギ酸あるいはリン酸を含むアセトニトリル、プロパノー
ル、イソプロパノールなどを使用することができる。

例えば、バイオラッド社製RP−304カラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーにより分画し（第２図参
照）、アセトニトリル濃度30〜35％で溶出される画分を
分取し、凍結乾燥し、白色粉末状の蛋白物質（たとえ
ば、トキソプラズマ溶解抗原−H4、−H5A、−H5C、−H6
および−H8、すなわちそれぞれTLA−H4、TLA−H5A、TLA
−H5C、TLA−H6およびTLA−H8）を得る。これは通常、
冷暗所に保存される。

（ii）化学合成による方法：化学合成による方法では、通常のペプチド化学におい
て用いられる方法に準じて合成することができる。すな
わち、液相法、固相法いずれによっても得ることができ
る。

より詳細には、例えば固相合成法を採用する場合、Ｃ
末端アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボ
キシル基によって、まず不溶性担体に結合させる。次い
で、アミノ保護基を除去した後、目的ペプチドのアミノ
酸配列に従い、順次アミノ基保護アミノ酸をその反応性
アミノ基および反応性カルボキシル基との縮合反応によ
り結合させ、一段階ずつ合成し、全配列を合成した後、
ペプチドを不溶性担体からはずすとともに保護基を除去
することにより、目的のペプチドを得ることができる。

上記各種方法において、反応性の官能基は保護してお
くことが好ましい。

アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシ
カルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｐ−メトキ
シベンジルオキシカルボニル、２−クロルベンジルオキ
シカルボニル、ｐ−トルエンスルホニル、トリフルオロ
アセチル、フタリル、ホルミル、ｏ−ニトロフェニルス
ルフェニル、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル、
ジフェニルホスフィノチオイル基などがあげられる。カ
ルボキシル基の保護基としては、例えばアルキルエステ
ル（メチル、エチル、ｔ−ブチルなどのC_1-4アルキルエ
ステル）、ベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエス
テル、ｐ−メチルベンジルエステル、シクロヘキシルエ
ステル、シクロペンチルエステルなどがあげられる。Ar
gのグアニド基の保護基としては、例えばｐ−トルエン
スルホニル、メシチレン−２−スルホニル、ニトロ、ベ
ンジルオキシカルボニル基などがあげられる。Ser、Th
r、Tyrの水酸基は、必ずしも保護する必要はないが、必
要であれば、例えば、ベンジル、2,6−ジクロルベンジ
ル、ｔ−ブチル、ベンジルオキシカルボニル、アセチル
基などで保護することができる。Metは必要であればス
ルホキシドとして保護することも可能である。

上記各種方法において、ペプチド結合形成方法として
は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ドなどのカルボジイミド型縮合剤を用いる方法、対称型
酸無水物法、混合酸無水物法、アジド法、活性エステル
法、酸化還元法、ジフェニルホスホリルアジド法、カル
ボジイミド型縮合剤＋添加物（１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドなど）法な
ど既知の手段があげられる。

保護基の除去法としては、例えば、トリフルオロ酢酸
法、メタンスルホン酸法、トリフルオロメタンスルホン
酸法、フッ化水素法、液体アンモニウムナトリウム法な
ど既知の手段があげられる。

本発明によって製造されるペプチド類の精製は、例え
ばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロ
マトグラフィー、逆相型液体クロマトグラフィーなどの
ペプチド化学の分野で通常用いられる方法を単独にまた
は組み合わせて用いることによって行うことができる。

（iii）酵素的切断による方法：前記の方法で得られた抗腫瘍性蛋白質または構造の類
似するユビキチンを適当な酵素、たとえばカルボキシペ
プチターゼ、トリプシン、V8プロテアーゼ、リジルエン
ドペプチダーゼ、サーモライシン、ペプシン、プロナー
ゼなど、好ましくはカルボキシペプチターゼ、リジルエ
ンドペプチダーゼで消化することによって、Ｃ末端側の
アミノ酸を、任意の個数削除することによって製造する
ことができる。

〔抗腫瘍作用〕

本発明の抗腫瘍性蛋白質は、下記のマウスに対する試
験によって、顕著な抗腫瘍作用を有することが判明し
た。

試験例１ BALB/cマウス（雄性、５週齢）１群５〜12匹の腹側部
皮下に、それぞれsarcoma180（Ｓ−180）細胞３×10⁶個
を移植した。

Ｓ−180移植後約１週間で、腫瘍が一定の大きさに達
した後、このＳ−180担癌マウスを５〜12匹ずつの２群
に分け、第１群（12匹）を対照とし、第２群（５匹）に
対して１週間ごとに、後記の実施例で製造した本発明の
抗腫瘍性蛋白物質TLA−H0.4μｇを３回筋肉投与した。

これら２群のマウスの腫瘍容積〔（長軸）×（短軸）
^２×1/2〕mm³を経時的に測定したところ、表２に示すよ
うに、対照群に比較して、TLA−Ｈは著しい腫瘍増殖抑
制効果を示した。薬剤の抗腫瘍効果は測定時点の薬剤投
与群の腫瘍増殖率（Ｔ）群の腫瘍増殖率（Ｃ）に対する
割合〔T/C（％）〕で示した。

試験例２試験例１におけるTLA−H0.4μｇの代わりに、後記の
実施例で製造した本発明の蛋白質であるTLA−H6ならび
にTLA−H4、TLA−H8をそれぞれ0.18μｇ使用する以外は
試験例１と同様にして試験を行った。その結果は表３に
示す通りである。

対照群に比較して、TLA−H4、TLA−H6およびTLA−H8
は著しい腫瘍増殖抑制効果を示した。

試験例３後記の実施例で製造した抗腫瘍性蛋白質の一次構造と
極めて類似の既知物質としてユビキチンが存在する（Go
ldstein,G.,Scheid,M.,Hammerling,U.,Boyse,E.A.,Schl
esinger,D.A.,＆Niall,H.D.（1975）Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.72,11−15およびHarris Busch（1984）,Method
s in Enzymol.,106,238−262.）。

そこで、ユビキチンと本発明における蛋白質との抗腫
瘍活性比較を行った。

試験例１における抗腫瘍性蛋白質TLA−H0.4μｇの代
わりに、それぞれ後記の実施例で製造した本発明の抗腫
瘍性蛋白質、即ちTLA−H5A、TLA−H6およびTLA−H6Eを
それぞれ0.83μｇ、0.17μｇ、0.34μｇまた、ユビキチ
ン（Sigma社製）を0.17μｇ、５μｇ使用する以外は試
験例１と同様にして試験を行った。その結果は表４に示
す通りである。

対照群に比較して、ユビキチンは抗腫瘍活性を実質的
に示さなかったのに対し、TLA−H5A、TLA−H6およびTLA
−H6Eは著しい腫瘍増殖抑制効果を示した。

〔抗腫瘍剤への適用〕本発明の抗腫瘍性蛋白質は、哺乳動物に対して抗腫瘍
活性を有し、抗腫瘍剤として有用である。

すなわち、本発明の抗腫瘍性蛋白質は、例えばマウス
実験腫瘍（例えばSarcoma180細胞移植マウス、Meth Aな
ど）やラット実験腫瘍（メチルコラントレン誘発癌）に
対して優れた抗腫瘍活性を示すものである。

本発明でいう抗腫瘍活性とは、実質的に抗腫瘍剤とし
て使用しうる程度の活性を有するものをいい、例えば、
マウス実験腫瘍Sarcoma180で対照群に対して統計的に有
為な（ｐ＜0.05,t−検定）抗腫瘍活性を有するものをい
う。

本発明の抗腫瘍性蛋白質は、通常単独で水溶液あるい
は生理食塩水溶液として腫瘍細胞の増殖阻止、転移抑制
の目的に使用することができる。

また、必要に応じて一般的に用いられているアジュバ
ントや各種の添加剤、例えば溶解補助剤、軽質鉱物油等
の乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を添
加した配合剤として使用することもできる。

本発明の抗腫瘍性蛋白質を投与される動物は特に制限
されず、ヒトのみならず、例えばマウス、ラット、イ
ヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ等の各種
哺乳動物が対象となる。

これらの動物およびヒトへの投与は通常の投与経路、
例えば筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、静脈内投与により
行うことができる。

抗腫瘍性蛋白質の投与量および投与回数は動物種、投
与経路、投与目的（治療目的）等に応じて各回約1ng/kg
〜5mg/kgの範囲となるように適宜選択されて、１日１〜
数回投与される。

〔実施例〕

実施例１ TLA−H4、TLA−H5A、TLA−H6およびTLA−H8の単離：（１） TpRH株感染２日目のマウス腹腔内をハンクス緩
衝液で洗浄し、その中に含まれるTpを750G、４℃で10分
間遠心分離した。沈渣には腹腔細胞などの夾雑物が含ま
れているので、ナイロンメッシュカラムを用いて濾過
し、可及的に除去した。得られたTp虫体懸濁液をHBSS液
で３回遠心洗浄（750G、４℃で10分間）した。沈渣のTp
虫体を1ml当たり２×10⁹個程度になるように滅菌蒸留水
を混和し、撹拌後、−70℃の冷凍機を用いて凍結融解を
３回繰り返した。ついて、和研薬社製Ｗ−220F型細胞破
壊装置を用いて40Wで１分間の超音波処理を５回行い、
虫体を破砕した。この抽出溶解抗原を16,000G、４℃で6
0分間遠心し、不溶物を除去し、得られた上清に等量の
1.7％塩化ナトリウム溶液を加え等張とした。このよう
に調整された等張液を144,000G、４℃で120分間超高速
遠心して上清を採集し、濾過滅菌を行った後、真空乾燥
して蛋白物質TLA−144を得、これを冷暗所に保存した。

（２） TLA−144（45mg）を2.3mlの水に溶解し、予め
0.1M酢酸アンモニウム緩衝液（pH4.8）で平衡化させた
ファルマシア社製ゲル濾過用充填剤セファデックスＧ−
75を充填したカラム（1.6φ×96cm）に注入し、同上の
緩衝液を用い、流速7ml/時間で溶出した。溶出液をA280
nmでモニターしながら30分毎に3.5mlずつ分画した。分
子量の4,000〜15,000の画分を分取し、凍結乾燥し、白
色粉末状の抗腫瘍性蛋白TLA−Ｈ約0.2mgを得た。

（３）このTLA−Ｈ約0.2mgを予め0.1％トリフルオロ
酢酸で平衡化させたバイオ・ラッド社製逆相系充填剤RP
−304カラム（4.6φ×250mm）に注入し、カラムを0.1％
トリフルオロ酢酸で洗浄後、アセトニトリル濃度を57％
まで増加させ、流速1.0ml/分で溶出した。溶出液をA220
nmでモニターした。アセトニトリル濃度32.0％、32.5
％、34.0％および38.0％で溶出される画分を集め、それ
ぞれの画分についてリクロマトを繰り返し、TLA−H4
（0.01mg）、TLA−H5A（0.06mg）、TLA−H6（0.05mg）
およびTLA−H8（0.01mg）を単離した（第２図参照）。

実施例２ TLA−H4、TLA−H5A、TLA−H5CおよびTLA−H6の単離： TLA−144（93mg）を2.3mlの0.85％塩化ナトリウム溶
液に溶解し、予め0.1M酢酸アンモニウム緩衝液（pH4.
8）で平衡化させたファルマシア社製ゲル濾過用充填剤
セファデックスＧ−75を充填したカラム（1.6φ×96m
m）に注入し、同上の緩衝液を用い、流速7.4ml/時間で
溶出した。溶出液をA280nmでモニターしながら30分毎に
3.7mlずつ分画した。分子量5000〜15000の画分を分取
し、凍結乾燥し白色粉末状の抗腫瘍性蛋白TLA−Ｈ約0.7
4mgを得た。

このTLA−Ｈ約0.70mgを予め0.1％トリフルオロ酢酸で
平衡化させたバイオ・ラッド社製逆相系充填剤RP−304
カラム（4.6φ×250mm）に注入し、カラムを0.1％TFAで
洗浄後、アセトニトリル濃度を57％まで増加させ、流速
1.0ml/分で溶出した。溶出液をA220nmでモニターした。
アセトニトリル濃度32.0％、32.5％、33.0％および34.0
％で溶出される画分を集め、それぞれの画分についてリ
クロマトを繰り返し、TLA−H4（0.01mg）、TLA−H5A
（0.13mg）、TLA−H5C（0.07mg）およびTLA−H6（0.04m
g）を単離した。

実施例３ TLA−H5Aの構造解析： 30μｇのTLA−H5Aを0.1mlの0.05Mトリス・塩酸（pH9.
2）に溶解し、1.5μｇリシル・エンドペプチダーゼＣを
加え、37℃で15時間インキュベートしペプチド断片化し
た。

断片化したペプチドを予め0.1％トリフルオロ酢酸で
平衡化させた逆相系充填剤RP−304カラム（4.6φ×250m
m）に注入し、アセトニトリル濃度を95％まで増加さ
せ、流速1.0ml/分で分離溶出した。溶出液をA220nmでモ
ニターした。アセトニトリル濃度０％〜40％で分離溶出
された８種類のペプチドについて、0.1％チオグリコー
ル類を含む6N塩酸で20時間加水分解し日立835型アミノ
酸分析装置を用いてアミノ酸組成を分析した。また、ア
プライド・バイオシステムズ470A型プロテイン・シーケ
ンサーを用いて自動エドマン分解し、生成したフェニル
チオヒダントイン誘導化アミノ酸（PTH−アミノ酸）を
アプライド・バイオシステムズ120A型PTHアナライザー
を用いて分析しアミノ酸配列を解析した。

TLA−H5Aのアミノ酸組成分析結果（表１参照）、Ｎ末
端アミノ酸配列分析結果および８種類の構成ペプチドの
アミノ酸組成分析結果、アミノ酸配列分析結果から決定
したTLA−H5Aの一次構造を次に示す。

実施例４ TLA−H5Cの構造解析： 20μｇのTLA−H5Cを0.1mgの0.05Mトリス・塩酸（pH9.
2）に溶解し、1.0μｇのリシル・エンドペプチダーゼＣ
を加え、37℃で15時間インキュベートしペプチド断片化
した。

断片化したペプチドを予め0.1％トリフルオロ酢酸で
平衡化させた逆相系充填剤RP−304カラム（4.6φ×250m
m）に注入し、アセトニトリル濃度を95％まで増加さ
せ、流速1.0ml/分で分離溶出した。溶出液をA220nmでモ
ニターした。アセトニトリル濃度０％〜40％で分離溶出
された８種類のペプチドについて、0.1％チオグリコー
ル酸を含む6N塩酸で20時間加水分解し日立835型アミノ
酸分析装置を用いてアミノ酸組成を分析した。また、ア
プライド・バイオシステムズ470A型プロテイン・シーケ
ンサーを用いて自動エドマン分解し、生成したPTH−ア
ミノ酸をアプライド・バイオシステムズ120A型PTHアナ
ライザーを用いて分析しアミノ酸配列を解析した。

TLA−H5Cのアミノ酸組成分析結果（表１参照）、Ｎ末
端アミノ酸配列分析結果および８種類の構成ペプチドの
アミノ酸組成分析結果、アミノ酸配列分析結果から決定
したTLA−H5Cの一次構造を次に示す。

実施例５ TLA−H6の構造解析： 15μｇのTLA−H6を0.1mlの0.05Mトリス・塩酸（pH9.
2）に溶解し、0.75μｇのリシル・エンドペプチダーゼ
Ｃを加え、37℃で15時間インキュベートしペプチド断片
化した。

断片化したペプチドを予め0.1％トリフルオロ酢酸で
平衡化させた逆相系充填剤RP−304カラム（4.6φ×250m
m）に注入し、アセトニトリル濃度を95％まで増加さ
せ、流速1.0ml/分で分離溶出した。溶出液をA220nmでモ
ニターした。アセトニトリル濃度０％〜40％で分離溶出
された８種類のペプチドについて、0.1％チオグリコー
ル酸を含む6N塩酸で20時間加水分解し日立835型アミノ
酸分析装置を用いてアミノ酸組成を分析した。また、ア
プライド・バイオシステムズ470A型プロテイン・シーケ
ンサーを用いて自動エドマン分解し、生成したPTH−ア
ミノ酸をアプライド・バイオシステムズ120A型PTHアナ
ライザーを用いて分析しアミン酸配列を解析した。

TLA−H6のアミノ酸組成分析結果（表１参照）、Ｎ末
端アミノ酸配列分析結果および８種類の構成ペプチドの
アミノ酸組成分析結果、アミノ酸配列分析結果から決定
したTLA−H6の一次構造を次に示す。

実施例６ TLA−H6Dの合成：使用した樹脂は粒径100−200メッシュのクロロメチル
化されたポリスチンレンビニルベンゼン樹脂である（１
％ジビニルベンゼンで架橋、樹脂1g当たり0.64ミリモル
のクロライドを含有）。ポリペプチドを合成するに当た
り21ミリモルのBoc−Leu−OHをエチルアルコール20ml、
水6mlへ溶解し、炭酸セシウム水溶液にてpH7とし、減圧
濃縮し、乾燥させた。これにDMF126mlを加え、12.8ミリ
モルのクロロメチル化樹脂を加え、50℃にて24時間処理
し、エステル化した。得られた結合アミノ酸樹脂を濾過
し、90％DMF、DMF、エチルアルコールにて順次洗浄し、
かつ乾燥した。

この結合アミノ酸樹脂6gを固相合成反応容器に入れ下
記スケジュール１に従って Boc−Arg（Tos）−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Val−OH、B
oc−Leu−OH、Boc−His（Tos）−OH、Boc−Leu−OH、 Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Ser（Bzl）−OH、Boc−Glu
（OcHex）−OH、Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH、Boc−Gln−O
H、Boc−Ile−OH、Boc−Asn−OH、Boc−Tyr（C12−Bz
l）−OH、Boc−Asp（OcHex）−OH、 Boc−Ser（Bzl）−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Thr（Bzl）
−OH、Boc−Arg（Tos）−OH、 Boc−Gly−OH、Boc−Asp（OcHex）−OH、Boc−Glu（OcH
ex）−OH、Boc−Leu−OH、 Boc−Gln−OH、Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH、Boc−Gly−O
H、Boc−Ala−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Ile−OH、 Boc−Leu−OH、Boc−Arg（Tos）−OH、Boc−Gln−OH、B
oc−Gln−OH、Boc−Asp（OcHex）−OH、 Boc−Pro−OH、Boc−Pro−OH、 Boc−Ile−OH、Boc−Gly−OH、 Boc−Glu（OcHex）−OH、 Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH、Boc−Asp（OcHex）−OH、Boc
−Gln−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH、 Boc−Ala−OH、Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH、Boc−Val−O
H、Boc−Asn−OH、Boc−Glu（OcHex）−OH、 Boc−Ile−OH、Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Asp（OcHe
x）−OH、 Boc−Ser（Bzl）−OH、 Boc−Pro−OH、Boc−Glu（OcHex）−OH、Boc−Val−O
H、Boc−Asp（OcHex）−OH、 Boc−Leu−OH、Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Ile−OH、B
oc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH、 Boc−Gly−OH、Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Leu−OH、B
oc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH、 Boc−Val−OH、Boc−Phe−OH、 Boc−Ile−OH、Boc−Gln−OH、 Boc−Met−OH、を順次、当量のDCCを用いてカップリングさせた。各カ
ップリング反応後、少量の樹脂をニンヒドリンで試験
し、陽性青色となった場合には、カップリング不完全で
あるとして同一の保護形アミノ酸を用い反応を繰り返し
た。この際、添加剤としてＮ−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールまたはｐ−ニトロフェノールを加えた。その結
果、中間体TLA−H6Dペプチド樹脂が得られた。

このTLA−H6Dペプチド樹脂0.5gにアニゾール3ml、無
水フッ化水素20mlを加え、−20℃60分間、０℃60分間反
応させ、減圧濃縮しジエチルエーテル300ml加え30分間
撹拌し、濾過しジエチルエーテル200mlで洗浄し、５％
酢酸200mlにて抽出し、樹脂を濾過し、水100mlで洗浄し
た。濾洗液を逆相カラムクロマトグラフィー、YMC−AM3
24ODS 1cm×25cmBIO−RAD RP−304 4.6mm×25cmにて
２回精製し、ポリペプチドを得た。得られたポリペプチ
ドはHPLCによる重ね打ちにより実施例１で得られたTLA
−H6と一致し、そのアミノ酸分析値は理論値と一致し
た。

アミノ酸分析加水分解:6N塩酸−１％フェノール、110℃24時間分析方法:PICO−TAG（逆相−PTCアミノ酸）＊基準アミノ酸（）内理論値 Asp:7.6（８）,Glu:11.4（11）， Ser:2.9（３）,Gly:4.3（４）， His:0.9（１）,Arg:3.0（３）， Thr:6.5（７）,Ala:2.1（２）， Pro:3.1（３）,Tyr:1.0（１）， Val:3.8（４）,Met:0.9（１）， Ile:6.9（７），＊Leu:9.0（９）， Phe:1.8（２）,Lys:6.8（７）但し、工程10でBoc−Gln−OH、Boc−Asn−OHの場合は全
て添加剤を用い、Boc−Arg（Tos）−OH、Boc−Leu−O
H、Boc−Ile−OH、Boc−Asn−OH、Boc−Glu−OHの場合
は塩化メチレンの代わりに30％DMF−70％塩化メチレン
（V/V）を用い、２回目以降のカップリングの場合は塩
化メチレンの代わりにDMF、ジメチルスルホキシド、１
−メチル−２−ピロジノン、または塩化メチレンとの混
合溶媒を用い、反応時間を最大10時間まで延長した。

実施例７ユビキチン（Sigma社製）5mgを0.05M酢酸緩衝液0.8ml
に溶解し、カルボキシペプチダーゼP17μｇを加え37℃
で15時間インキュベートした。

反応液を予め0.1％TFAで平衡化させた逆相系充填剤RP
−304カラム（4.6φ×250mm）に注入し、アセトニトリ
ル濃度を43％まで増加させ、流速1.0ml/分で溶出した。
溶出液をA220nmでモニターした。アセトニトリル濃度33
％〜34％で溶出される画分を分取し、更に同一カラムで
繰り返し精製し、TLA−H6E（2.6mg）を単離した。

TLA−H6Eのアミノ酸分析値は、ユビキチンのＣ末端ア
ミノ酸３残基が欠落した誘導体の理論値と一致した。

TLA−H6Eのアミノ酸組成： Asx7,2（７）,Thr6,8（７）,Ser2.7（３）， Glx13.0（12）,Pro3.2（３）,Gly4.0（４）， Ala2.0（２）,Val4.0（４）,Met1.0（１）， Ile7.0（７）,Leu9.3（９）,Tyr1.0（１）， Phe2.0（２）,Lys7.3（７）,His1.0（１）， Arg3.1（３）

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性蛋白質TLA−ＨのTSK−G2000SWを用い
た高速ゲル濾過法による分析結果を示した図である。第２図は抗腫瘍性蛋白質TLA−Ｈの逆相系充填剤RP−304
を用いた高速液体クロマトグラフィー法による精製結果
を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:90） (72)発明者柳義和大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番 98号住友製薬株式会社内 (72)発明者諏訪和志兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号住友製薬株式会社内 (56)参考文献Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 14，Ｎｏ．10（1975），Ｐ．2214−2218

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ
酸配列からなる抗腫瘍性蛋白質。
【請求項２】トキソプラズマ原虫由来の請求項（１）記
載の抗腫瘍性蛋白質。
【請求項３】逆相液体クロマトグラフィーを用いること
を特徴とする請求項（１）乃至（２）記載の抗腫瘍性蛋
白質の精製方法。
【請求項４】請求項（１）乃至（２）記載の蛋白質を有
効成分とする抗腫瘍剤。