JPS6157518A - 新規ペプチド - Google Patents
新規ペプチドInfo
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- JPS6157518A JPS6157518A JP59178503A JP17850384A JPS6157518A JP S6157518 A JPS6157518 A JP S6157518A JP 59178503 A JP59178503 A JP 59178503A JP 17850384 A JP17850384 A JP 17850384A JP S6157518 A JPS6157518 A JP S6157518A
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- Japan
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- aqueous solution
- peptide
- chicken
- formula
- molecular weight
- Prior art date
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- Granted
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明は、新規ペプチドの採取法に関し、更に詳しくは
、ニワトリ総後体由来の血中Ｃａ 濃度を低下させる
生理活性を有する新規ペプチドの採取法に関するもので
ある。
、ニワトリ総後体由来の血中Ｃａ 濃度を低下させる
生理活性を有する新規ペプチドの採取法に関するもので
ある。
カルシトニン（以下ｒＣＴＪと称する）は、鳥類、魚類
、同口類などの妃後体、哺乳類などの甲状腺に存在する
ペプチドホルモンである。このホルモンは、副甲状腺ホ
ルモンと拮抗する作用を示し、骨などに作用し血中０１
濃度を低下させる作用が知られている。従来知られ
ているＣＴは、３２個のアミノ酸よりなる単鎖のペプチ
ドで、アミノ基末ｆｌｌＡｃ以””Ｆｒ’Ｎ末ｆｍＪと
称ｆる）より ｘ番目とｒ番１０システィンがジスルフ
ィド結合をし、カルボキシル基末端（以下「Ｃ末端」と
称する）がプロリンアミドである点で共通している。現
在までのととる、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヒト、ラット、
サケ、ウナギからＣＴが抽出精製され、前記の構造上の
共通点を有しながら、動物種によジペプチド構造が少し
ずつ異なることが明らかにされている。
、同口類などの妃後体、哺乳類などの甲状腺に存在する
ペプチドホルモンである。このホルモンは、副甲状腺ホ
ルモンと拮抗する作用を示し、骨などに作用し血中０１
濃度を低下させる作用が知られている。従来知られ
ているＣＴは、３２個のアミノ酸よりなる単鎖のペプチ
ドで、アミノ基末ｆｌｌＡｃ以””Ｆｒ’Ｎ末ｆｍＪと
称ｆる）より ｘ番目とｒ番１０システィンがジスルフ
ィド結合をし、カルボキシル基末端（以下「Ｃ末端」と
称する）がプロリンアミドである点で共通している。現
在までのととる、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヒト、ラット、
サケ、ウナギからＣＴが抽出精製され、前記の構造上の
共通点を有しながら、動物種によジペプチド構造が少し
ずつ異なることが明らかにされている。
また、ＣＴのＮ末端より１番目と７番目のジスルフィド
結合を切断するとその生物活性がほとんど消失しく Ｈ
，Ｂ、 Ｂｒｅｗ＠ｒ、 Ｊｒ、、 Ｃ４ｍｌ、、
ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎＰｒｏｏ、、 ２７，６９０
（１９６Ｂ）、 ２８．３８３（１９６９）、）、こ
のジスルフィド結合をアミノスペリン酸を用いてエチレ
ン結合とすることによって生物活性が保持され（特公昭
５３−４１６７７）、ＣＴの１，７位の環状立体構造が
生物活性に必須であることが報告されている。
結合を切断するとその生物活性がほとんど消失しく Ｈ
，Ｂ、 Ｂｒｅｗ＠ｒ、 Ｊｒ、、 Ｃ４ｍｌ、、
ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎＰｒｏｏ、、 ２７，６９０
（１９６Ｂ）、 ２８．３８３（１９６９）、）、こ
のジスルフィド結合をアミノスペリン酸を用いてエチレ
ン結合とすることによって生物活性が保持され（特公昭
５３−４１６７７）、ＣＴの１，７位の環状立体構造が
生物活性に必須であることが報告されている。
最近、本発明者らはニワトリ妃後体からＣＴを抽出精製
し、得られたニワトリＣＴが、次式（Ｉ）： Ｈ−Ｃｙ ａ−Ａｌ ａ−８ａ ｒ−Ｌ（＋ １１−３
ｅ ｒ−’ｐｈ ｒ−Ｃｙ ａ−Ｖａ ｌ −ＬＱ
ｕ−Ｑ ｌ ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−８ｏｒ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｕ−Ｌ６ｕ−Ｈ４ｓ−Ｌｙｇ−Ｌｏｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｔ
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ。
し、得られたニワトリＣＴが、次式（Ｉ）： Ｈ−Ｃｙ ａ−Ａｌ ａ−８ａ ｒ−Ｌ（＋ １１−３
ｅ ｒ−’ｐｈ ｒ−Ｃｙ ａ−Ｖａ ｌ −ＬＱ
ｕ−Ｑ ｌ ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−８ｏｒ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｕ−Ｌ６ｕ−Ｈ４ｓ−Ｌｙｇ−Ｌｏｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｔ
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ。
（式中、Ｃｙｓはシスティンを、ＡＩ＆はアラニンを、
Ｆ３ｅｒはセリンを、Ｌｅｎはロイシンを、Ｔｈｒはス
レオニンを、ｖａｌはバリンを、Ｇｌｙはグリシンを、
Ｌ７”はリジンを、Ｇｌｎはグルタミンを、Ｑｌｕはグ
ルタミン酸を、）（ｉｓはヒスチジンを、Ｔｙｒはチロ
シンを、ｐｒｏはプロリンを、Ａｒｇはアルギニンを、
Ａ’Ｐはアスパラギン酸を表す）で示される新規な構造
を有することを見い出し、特願昭５８−２３０５９３号
として既に出願している。
Ｆ３ｅｒはセリンを、Ｌｅｎはロイシンを、Ｔｈｒはス
レオニンを、ｖａｌはバリンを、Ｇｌｙはグリシンを、
Ｌ７”はリジンを、Ｇｌｎはグルタミンを、Ｑｌｕはグ
ルタミン酸を、）（ｉｓはヒスチジンを、Ｔｙｒはチロ
シンを、ｐｒｏはプロリンを、Ａｒｇはアルギニンを、
Ａ’Ｐはアスパラギン酸を表す）で示される新規な構造
を有することを見い出し、特願昭５８−２３０５９３号
として既に出願している。
更に１本発明者らはニットｖＢ後体の抽出精製の過程に
おいて抽出鞘部条件を種々検討した結果、ニワトリ鰓後
体を酸性水溶液で抽出した後、特定の処理を施すことに
よシ前記式ＣＩ）で示されるＣＴ（以下「ニワトリＣＴ
ＩＪと称する）と異なる今一つの０丁様の新規ペプチド
（以下［ニワトリＣＴＩ［Ｊと称する）が単離され、こ
のニワトリＣＴＩ［は、ジスルフィド結合が開裂されて
いるといり、従来知られているＣＴとは全く異なる構造
であるにもかかわらず、高いＣＴ活性を有することを見
い出し本発明を完成するに至った。
おいて抽出鞘部条件を種々検討した結果、ニワトリ鰓後
体を酸性水溶液で抽出した後、特定の処理を施すことに
よシ前記式ＣＩ）で示されるＣＴ（以下「ニワトリＣＴ
ＩＪと称する）と異なる今一つの０丁様の新規ペプチド
（以下［ニワトリＣＴＩ［Ｊと称する）が単離され、こ
のニワトリＣＴＩ［は、ジスルフィド結合が開裂されて
いるといり、従来知られているＣＴとは全く異なる構造
であるにもかかわらず、高いＣＴ活性を有することを見
い出し本発明を完成するに至った。
本発明のニワトリＣＴｎは、
次式（６）：
％式％
）［
（式中、７−Ｇｌｕはｒ−グルタミル基を表し、Ｃ７５
１Ａｌａ、 Ｓａｒ、 Ｌｅｕ、 Ｔｈｒ、 Ｖａｌ
、 Ｇ１７゜Ｌ７’ ％ Ｇｉｎ ％ Ｇｉｎ ｓ Ｈ
ｋ８５Ｔ７ｒ ５ｐｒｏ、Ａｒｇ及びＡｓｐは、前記と
同義である） で示されるものである。
１Ａｌａ、 Ｓａｒ、 Ｌｅｕ、 Ｔｈｒ、 Ｖａｌ
、 Ｇ１７゜Ｌ７’ ％ Ｇｉｎ ％ Ｇｉｎ ｓ Ｈ
ｋ８５Ｔ７ｒ ５ｐｒｏ、Ａｒｇ及びＡｓｐは、前記と
同義である） で示されるものである。
本発明１のニワ；ト、ＩＪ ＣＴ ｎの化学的性質は次
の如くである。
の如くである。
■ 物質の性状：白色粉末
■ 溶媒に対する溶解性：水、特に、酸性水溶液ニ可溶
、クロロホルム、四塩化炭素、ペン上Ｘヘキサンなどに
不溶 ■ 分子量：３．９８５ ■ 塩基性度二本発明のニワトリＣＴ Ｉｆ ＜ニワト
リ ＣＴ Ｉ ■ −欠講造式：前記式（［Ｉ） ■ 免疫学的性質；抗つナギＣＴ血清−及び抗サケＣＴ
Ｉ血清を用いて、本発明のニワトリＣＴ■が前記抗血
清と交差することを利用して検出し得る ■ 生物活性：３，０００〜７，０００ ＭＲＣＵ／
η性物活性測宝物活 性測定法１％酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０；０．１袋牛
血清アルブミン含有）水溶液を用いて適当に希釈後、更
に希釈した液数種を雄幼若うツ） （１００２前後）１
匹当シｏ、 ｉ−を尾静脈に注射し、注射１時間後に心
臓より血液を採取し、遠心分離して血清を採取し、血清
中のＣ１１濃度を分光学的方法（試薬：フコ−カルシウ
ム測定用キット）ニて測定し、Ｃａ 濃度を１０％低下
させるのに必要な量を１０ｍＭＲＣ（Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ）Ｕと定義する。
、クロロホルム、四塩化炭素、ペン上Ｘヘキサンなどに
不溶 ■ 分子量：３．９８５ ■ 塩基性度二本発明のニワトリＣＴ Ｉｆ ＜ニワト
リ ＣＴ Ｉ ■ −欠講造式：前記式（［Ｉ） ■ 免疫学的性質；抗つナギＣＴ血清−及び抗サケＣＴ
Ｉ血清を用いて、本発明のニワトリＣＴ■が前記抗血
清と交差することを利用して検出し得る ■ 生物活性：３，０００〜７，０００ ＭＲＣＵ／
η性物活性測宝物活 性測定法１％酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０；０．１袋牛
血清アルブミン含有）水溶液を用いて適当に希釈後、更
に希釈した液数種を雄幼若うツ） （１００２前後）１
匹当シｏ、 ｉ−を尾静脈に注射し、注射１時間後に心
臓より血液を採取し、遠心分離して血清を採取し、血清
中のＣ１１濃度を分光学的方法（試薬：フコ−カルシウ
ム測定用キット）ニて測定し、Ｃａ 濃度を１０％低下
させるのに必要な量を１０ｍＭＲＣ（Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ）Ｕと定義する。
■ 薬効持続性：本発明のニワトＩＪＣＴｎ＞ブタＣＴ
（測定法）
６ｐｍｏｌＣＴ相当のＣＴ水溶液をラットに静注し血清
中Ｃ＾ 濃度の経時変化を測定する。
中Ｃ＾ 濃度の経時変化を測定する。
本発明のニワトリＣＴｎは、次のようにしてＦＩＪ ｌ
ｆｆ１後体から採取することができる。
ｆｆ１後体から採取することができる。
即ち、トリ館後体を酸性水溶液で抽出した後、次の処理
（ａ）及び（ｂ）二 （ａ） 抽出液をカチオン交換樹脂に接触せしめ、吸
着した塩基性画分を水溶液で溶出させる（ｂ） ゲル
クロマトグラフィーによシ分子量３５００〜６０００の
両分を回収する のうち、少なくとも１糎の処理を施すことによシ採取す
ることができる。
（ａ）及び（ｂ）二 （ａ） 抽出液をカチオン交換樹脂に接触せしめ、吸
着した塩基性画分を水溶液で溶出させる（ｂ） ゲル
クロマトグラフィーによシ分子量３５００〜６０００の
両分を回収する のうち、少なくとも１糎の処理を施すことによシ採取す
ることができる。
抽出原料としては、ニワ） ＋７の庵後体を用いる。
鰓後体は貯化前後からその存在が認められ、甲状腺及び
上皮小体の下方において総頚動脈に隣接し、成鶏では直
径１筒径度の球状の臓器である。ニワトリの週今により
、ｎ後体の重量、ＣＴ含量は変化する。大量・均質なニ
ワトリが入手可能なこと、蝿後体が適度な大きさであり
摘出が容易なことなどを考慮すると、ニワトリとしては
、ブロイラ一種６〜８０週令のものを用いることが好ま
しい。
上皮小体の下方において総頚動脈に隣接し、成鶏では直
径１筒径度の球状の臓器である。ニワトリの週今により
、ｎ後体の重量、ＣＴ含量は変化する。大量・均質なニ
ワトリが入手可能なこと、蝿後体が適度な大きさであり
摘出が容易なことなどを考慮すると、ニワトリとしては
、ブロイラ一種６〜８０週令のものを用いることが好ま
しい。
出発原料か・らのＣＴの抽出は、次のようにして行うこ
とができる。
とができる。
例えば、出発原料をその約５〜１０倍量（重量比）の酸
性水溶液、好ましくは、揮発性の酸性水溶ｙ＜例えば、
酢酸、ギ酸などの水溶液）中で破砕・混和し、ニワトリ
ＣＴＩ及び■を含む憑濁液を得る。この場合、用いる酸
性水溶液は、声１〜５であることが好ましい。次いで、
この溶液を遠心することＫより、中間層にやや透明なＣ
Ｔ抽出液が形成される。ここで、沈澱物は、主に鰐後体
の組織片及び不溶物であり、上層部は、主に脂肪の白色
のかたまりである。中間層を採取し、次の処理工程に供
する。
性水溶液、好ましくは、揮発性の酸性水溶ｙ＜例えば、
酢酸、ギ酸などの水溶液）中で破砕・混和し、ニワトリ
ＣＴＩ及び■を含む憑濁液を得る。この場合、用いる酸
性水溶液は、声１〜５であることが好ましい。次いで、
この溶液を遠心することＫより、中間層にやや透明なＣ
Ｔ抽出液が形成される。ここで、沈澱物は、主に鰐後体
の組織片及び不溶物であり、上層部は、主に脂肪の白色
のかたまりである。中間層を採取し、次の処理工程に供
する。
以上のようにして得られる抽出物の精製は、前述の処理
（乳）又は（ｂ）によシ行うことができるが、（ｌＬ）
及び（ｂ）を組み合わせることが好ましく、処理（ｂ）
を施した後、処理（ａ）を行うことが更に好ましい。
（乳）又は（ｂ）によシ行うことができるが、（ｌＬ）
及び（ｂ）を組み合わせることが好ましく、処理（ｂ）
を施した後、処理（ａ）を行うことが更に好ましい。
処理（ａ）においては、抽出液又はその処理液を、カチ
オン交換樹脂、例えばＳＰ−セファデックス又はカルボ
キシメチルセルロースを用いたクロマトグラフィーに付
して、塩基性画分を回収する。
オン交換樹脂、例えばＳＰ−セファデックス又はカルボ
キシメチルセルロースを用いたクロマトグラフィーに付
して、塩基性画分を回収する。
該クロマトグラフィーは、好ましくは水溶媒にて行われ
るが、低級アルコール、アセトンの如き親水性有機溶媒
の添加された水溶液においても行うことができる。
るが、低級アルコール、アセトンの如き親水性有機溶媒
の添加された水溶液においても行うことができる。
カチオン交換樹脂としてＳＰ−セファデックスを用いる
場合、溶離液としては、−８〜１１の塩基性水溶液、通
常、ピリジン水溶液、アンモニア水溶液などを用いる。
場合、溶離液としては、−８〜１１の塩基性水溶液、通
常、ピリジン水溶液、アンモニア水溶液などを用いる。
カチオン交換樹脂としてカルボキシメチルセルロースを
用いる場合、溶離液と し゛ては、声３．〜６の・酸性
水溶液、 通常、ギ酸水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液
、酢酸アンモニウム水溶液などを用いる。
用いる場合、溶離液と し゛ては、声３．〜６の・酸性
水溶液、 通常、ギ酸水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液
、酢酸アンモニウム水溶液などを用いる。
処理（ｂ）のゲルクロマトグラフィーは、例えば酢酸、
炭酸水素アンモニウム、ギ酸アンモニウムの如き揮発性
緩衝液中で行うことが好ましい。カラムの例としては、
Ｂｉｏ−ｇｅｌ Ｐ １０及びセファデックスＧ５０が
挙げられる。
炭酸水素アンモニウム、ギ酸アンモニウムの如き揮発性
緩衝液中で行うことが好ましい。カラムの例としては、
Ｂｉｏ−ｇｅｌ Ｐ １０及びセファデックスＧ５０が
挙げられる。
本°発明の採取法には、前記処理に、
次の処理（Ｃ）及び／又は（ｄ）：
（Ｏ） 目的物含有水溶液に親水性有機溶媒を添加し
て高分子量体を沈澱せしめ除去する （ｄ） 高速液体クロマトグラフィーによ、９ＣＴ様
生理活性を有する両分を回収する を組み合わせることが更に好ましい。
て高分子量体を沈澱せしめ除去する （ｄ） 高速液体クロマトグラフィーによ、９ＣＴ様
生理活性を有する両分を回収する を組み合わせることが更に好ましい。
処理（０）においては、本発明のニワトリｃＴＩＩ（分
子量３，９８５）を沈澱させず、それ以上の高分子量を
沈澱させるに足る充分量の親水性有機溶媒（例えば、低
級アルコール、アセトンなど）を前記抽出液に添加して
、高分子量体を除去する。
子量３，９８５）を沈澱させず、それ以上の高分子量を
沈澱させるに足る充分量の親水性有機溶媒（例えば、低
級アルコール、アセトンなど）を前記抽出液に添加して
、高分子量体を除去する。
処理（ｄ）の高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰ
ＬＣＪと称する）は、常法に従って行うことができ、ギ
酸アンモニウム（１ｏｍＭ〜１．ＯＭ）−アセトニトリ
ル、水−アセトニトリル−１０％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）（９０： １０二１〜４０：６０：１）（体蹟比
）などの溶媒を用いて直線型濃度勾配溶出し、カルシト
ニン様生理活性を有する両分を回収する。
ＬＣＪと称する）は、常法に従って行うことができ、ギ
酸アンモニウム（１ｏｍＭ〜１．ＯＭ）−アセトニトリ
ル、水−アセトニトリル−１０％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）（９０： １０二１〜４０：６０：１）（体蹟比
）などの溶媒を用いて直線型濃度勾配溶出し、カルシト
ニン様生理活性を有する両分を回収する。
本発明の採取法においては、前述の処理を全て組み合わ
せ、（Ｃ）、（ａ）、０）、（ｄ）の順に行うことが最
も好ましい。
せ、（Ｃ）、（ａ）、０）、（ｄ）の順に行うことが最
も好ましい。
以上の各精製工程における各画分の検定は、抗つナギＣ
Ｔ血清が本発明のニワトリＣＴｎと交差反応すること利
用して、放射性免疫検定法を用い、適宜、生物活性測定
法を併用した。
Ｔ血清が本発明のニワトリＣＴｎと交差反応すること利
用して、放射性免疫検定法を用い、適宜、生物活性測定
法を併用した。
放射性免疫検定法では、抗原であるウナギＣＴを用いて
、ウサギに数回免疫し、免疫後、採血して抗血清を得る
。ここで、本放射性免疫検定法とは、ウナギＣＴの抗体
（抗血清）に対し、本発明のニワトリｃＴＩＩと放射線
標識抗原との競争反応によシ本発明のニワトリＣＴ■量
を検出する方法である。一方、標識抗原は、ウナギＣＴ
のチロシン部分に放射性ヨウ素（Ｉ）を結合するクロラ
ミンＴ法又はペルオキシダーゼ法によシ作製できる。
、ウサギに数回免疫し、免疫後、採血して抗血清を得る
。ここで、本放射性免疫検定法とは、ウナギＣＴの抗体
（抗血清）に対し、本発明のニワトリｃＴＩＩと放射線
標識抗原との競争反応によシ本発明のニワトリＣＴ■量
を検出する方法である。一方、標識抗原は、ウナギＣＴ
のチロシン部分に放射性ヨウ素（Ｉ）を結合するクロラ
ミンＴ法又はペルオキシダーゼ法によシ作製できる。
次に、本発明のニットＩＪＣＴｎ抽出液又は各工程の各
両分（被検体）を適宜希釈した数種の溶液と前記で得ら
れた抗つナギＣＴｍ清とを良く反応させ（４℃、１夜）
、抗体と結合していない ニーウナギＣＴ及び抗体と結
合した ニーウナギＣＴを分離後、どちらかの量をｒ−
カウンターで測定することによシ、被検体中に含まれる
相対的なα活性が求められる。この放射性免疫検定法に
よれば、検定によって消費されるＣＴ量が生物活性検定
法に比し、約１／１００に低減されるばかりか、手技が
簡単である、定量性・再現性が優れている、検定の所要
時間が短かい、などの利点を有し、放射性免疫検定法は
本発明のニット！ｊｃＴｎの分離・精製を容易、かつ、
迅速ならしめることができる。
両分（被検体）を適宜希釈した数種の溶液と前記で得ら
れた抗つナギＣＴｍ清とを良く反応させ（４℃、１夜）
、抗体と結合していない ニーウナギＣＴ及び抗体と結
合した ニーウナギＣＴを分離後、どちらかの量をｒ−
カウンターで測定することによシ、被検体中に含まれる
相対的なα活性が求められる。この放射性免疫検定法に
よれば、検定によって消費されるＣＴ量が生物活性検定
法に比し、約１／１００に低減されるばかりか、手技が
簡単である、定量性・再現性が優れている、検定の所要
時間が短かい、などの利点を有し、放射性免疫検定法は
本発明のニット！ｊｃＴｎの分離・精製を容易、かつ、
迅速ならしめることができる。
本発明によれば、新規ペプチドを提供するととができ、
この新規ペプチドは、ジスルフィド結合が開裂されてい
るという、従来知られているＣＴとは全く異なる構造で
あるにもかかわらず、高いＣＴ活性を有することから、
医薬品として有用であると考えられる。即ち、ＣＴは強
力な骨吸収抑制作用を有することから、高Ｃａ血症、骨
ベージェット病、骨粗鋲症の治療、胃酸分泌及び膵液分
泌抑制作用を有することから、消化性潰瘍、急性膵炎に
対する効果、抗炎症作用を有することから慢性関節リウ
マチに対する効果など広範な薬効が期待されている。
この新規ペプチドは、ジスルフィド結合が開裂されてい
るという、従来知られているＣＴとは全く異なる構造で
あるにもかかわらず、高いＣＴ活性を有することから、
医薬品として有用であると考えられる。即ち、ＣＴは強
力な骨吸収抑制作用を有することから、高Ｃａ血症、骨
ベージェット病、骨粗鋲症の治療、胃酸分泌及び膵液分
泌抑制作用を有することから、消化性潰瘍、急性膵炎に
対する効果、抗炎症作用を有することから慢性関節リウ
マチに対する効果など広範な薬効が期待されている。
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらによシ制限されるものではない。
発明はこれらによシ制限されるものではない。
実施例Ｉ
Ａ）出発原料
１０週会食肉用二ワ１７３，３８４匹を放血し、直ちに
、門後件を摘出した。脂肪をできる限シ除去し、ドライ
アイスで凍結した。得られたｎ後件は約１７９．１１ｆ
であった。
、門後件を摘出した。脂肪をできる限シ除去し、ドライ
アイスで凍結した。得られたｎ後件は約１７９．１１ｆ
であった。
Ｂ）抽出工程
前記方法で得られた鯰後件を小分けしく約５００匹分）
、それぞれについてＩＮ酢酸（鯰後件重量の５倍ｆｌ（
重量比・））に浸漬し、ポリトロンでホモジナイズし、
遠心分離（９，０００ｒｐＬｎ３０分間）した。次に、
脂肪を含まないように、中間層を採取し、この抽出液の
一部を凍結乾燥した。
、それぞれについてＩＮ酢酸（鯰後件重量の５倍ｆｌ（
重量比・））に浸漬し、ポリトロンでホモジナイズし、
遠心分離（９，０００ｒｐＬｎ３０分間）した。次に、
脂肪を含まないように、中間層を採取し、この抽出液の
一部を凍結乾燥した。
この凍結乾燥粉末の一部を０．１Ｎギ酸に溶解し、生物
活性を測定したところ、１．０〜１．２ ＭＲＣＵ／匹
にニワトリ）であった。
活性を測定したところ、１．０〜１．２ ＭＲＣＵ／匹
にニワトリ）であった。
Ｃ）精製工程
前記のようにして得た目的生理活性物質を含む酢酸水溶
液９００ ｍｔにアセトン１８００ｍｇを徐々に添加後
、−夜放録し、高分子量体を沈澱させた。
液９００ ｍｔにアセトン１８００ｍｇを徐々に添加後
、−夜放録し、高分子量体を沈澱させた。
遠心分離（９，００Ｏｒｐｍ、 ３０分間）後、上精液
を採取した。
を採取した。
この上清液を、ＳＰ−セファデックスＣ−２５を充填し
、ＩＮ酢酸で平衡化したカラム（直径３、２ ｃｍ Ｘ
高さ２２ｃＩｎ）上に注入した。このとき、ＳＰ−セフ
ァデックスに吸着しない酸性画分は除去され、目的生理
活性物質を含む塩基性画分はｓｐ−セファデックスＣ−
２５にイオン的に吸着される。次いで、２Ｍピリジン水
溶液（ｐＨ１０） ３００ｍ１でｓｐ−セファデックス
に吸着した塩基性画分からニワ）ｌＪｃＴｎを含む両分
を溶出した。この溶出液はＣＴの生理活性が認められた
。
、ＩＮ酢酸で平衡化したカラム（直径３、２ ｃｍ Ｘ
高さ２２ｃＩｎ）上に注入した。このとき、ＳＰ−セフ
ァデックスに吸着しない酸性画分は除去され、目的生理
活性物質を含む塩基性画分はｓｐ−セファデックスＣ−
２５にイオン的に吸着される。次いで、２Ｍピリジン水
溶液（ｐＨ１０） ３００ｍ１でｓｐ−セファデックス
に吸着した塩基性画分からニワ）ｌＪｃＴｎを含む両分
を溶出した。この溶出液はＣＴの生理活性が認められた
。
これ以後の実験では、前記溶出液を濃酢酸で中和し、凍
結乾燥して用いた。この凍結乾燥粉末５００りをＩＮ酢
酸１５−に溶解し、予めセファデックスＧ −５０（Ｆ
ｉｎ＠）を充填し、ＩＮ酢酸で平衡化したカラム（直径
３．０ｃｎｔＸ高さ１５０ｃＩｎ）上に、この溶液を注
入した。このとき、溶出条件は溶離液ＩＮ酢酸、溶出速
度２７ ｍｌ／ ｈであった。溶出液を１５ｍｔ１本ず
つ分画採取し、放射性免疫検定法による活性画分（画分
陳４８〜５３）ｔ−回収した。
結乾燥して用いた。この凍結乾燥粉末５００りをＩＮ酢
酸１５−に溶解し、予めセファデックスＧ −５０（Ｆ
ｉｎ＠）を充填し、ＩＮ酢酸で平衡化したカラム（直径
３．０ｃｎｔＸ高さ１５０ｃＩｎ）上に、この溶液を注
入した。このとき、溶出条件は溶離液ＩＮ酢酸、溶出速
度２７ ｍｌ／ ｈであった。溶出液を１５ｍｔ１本ず
つ分画採取し、放射性免疫検定法による活性画分（画分
陳４８〜５３）ｔ−回収した。
これを凍結乾燥し、粉末１７．４ ｒＰＩを得た。
前記検定法から算出された免疫学的に反応した本発明の
ニワトリｃＴｎ量は２１９μ？（３３８４匹相当）であ
った。
ニワトリｃＴｎ量は２１９μ？（３３８４匹相当）であ
った。
溶液を以下の測定条件に従いＩ（ＰＬＯに付した。
測定条件：
カラム；東洋曹達工業■製ＴＳＫ ＧＥＬ ＣＭ ２５
Ｗ（４，６箇φＸ２５０ｓｍ） 流 速； ２． Ｏｍｅ／ｍｉｎ 差 圧： ａ ５ Ｋｑ／ｃｙ４ 溶離液二Ａ液（１０ｍＭギ酸アンモニウム：アセトニト
リル＝９ ： １ ） （＋）８４．Ｏ）Ｂ“液（１，
０Ｍギ酸アンモニウム：アセトニトリル＝９ ： １
） （ｐＨ４，０）をサンプル注入１分後、Ａ液から
Ｂ液 へ直線型濃度勾配溶出（１４０分） 得られた結果に訃いて、放射性免疫検定法に基づく活性
と吸光測定法による２８０℃ｍにおけるペプチド由来の
吸光度とが一致した。更に、同様に以下の条件にて試料
を三つに分けてＨＰＬＣを緑シ返した。
Ｗ（４，６箇φＸ２５０ｓｍ） 流 速； ２． Ｏｍｅ／ｍｉｎ 差 圧： ａ ５ Ｋｑ／ｃｙ４ 溶離液二Ａ液（１０ｍＭギ酸アンモニウム：アセトニト
リル＝９ ： １ ） （＋）８４．Ｏ）Ｂ“液（１，
０Ｍギ酸アンモニウム：アセトニトリル＝９ ： １
） （ｐＨ４，０）をサンプル注入１分後、Ａ液から
Ｂ液 へ直線型濃度勾配溶出（１４０分） 得られた結果に訃いて、放射性免疫検定法に基づく活性
と吸光測定法による２８０℃ｍにおけるペプチド由来の
吸光度とが一致した。更に、同様に以下の条件にて試料
を三つに分けてＨＰＬＣを緑シ返した。
測定条件：
カラム：ケムコ社製Ｃｈｅｍｅｏｇｏｒｂ ５０ＤＳ−
Ｉｆ（４，６同φＸ２５０ｍ） 溶出液： ０．５ ｍｅ１本 流速； １． Ｏｍ／ｍｔｎ 差 圧：１４０Ｋｑ／ｉ４ 溶離液；Ａ液（水ニアセトニトリル＝１０％ＴＦＡ＝９
０：１０：１） Ｂ液（水ニアセトニトリル：１０チ ＴＦＡ＝４０：６０：１） をサンプル注入８分後、Ａ液からＢ液 へ直線型濃度勾配溶出（１６０分） その結果、活性画分（保持時間８４分）にペプチドに基
づく強い吸光度（ＡＮ８０ ＊ Ａ、、。）が認められ
た。この活性画分を凍結乾燥して活性粉末３６．１μ２
を得た。この粉末の生物活性は、５３．００ＭＲＣＵ／
ηであった。
Ｉｆ（４，６同φＸ２５０ｍ） 溶出液： ０．５ ｍｅ１本 流速； １． Ｏｍ／ｍｔｎ 差 圧：１４０Ｋｑ／ｉ４ 溶離液；Ａ液（水ニアセトニトリル＝１０％ＴＦＡ＝９
０：１０：１） Ｂ液（水ニアセトニトリル：１０チ ＴＦＡ＝４０：６０：１） をサンプル注入８分後、Ａ液からＢ液 へ直線型濃度勾配溶出（１６０分） その結果、活性画分（保持時間８４分）にペプチドに基
づく強い吸光度（ＡＮ８０ ＊ Ａ、、。）が認められ
た。この活性画分を凍結乾燥して活性粉末３６．１μ２
を得た。この粉末の生物活性は、５３．００ＭＲＣＵ／
ηであった。
以上のようにして得られた活性粉末のアミノ酸分析値を
表１に示す。
表１に示す。
測定法は活性粉末３．５μ？を゛６Ｎ塩酸を用いて１１
０℃で２２時間加水分解し、脱塩酸後５０μｔの０．２
Ｎクエン酸緩衝ｔｉ、（〆ｌ ３．２５ ）に溶解し
、全量を分析に供した。
０℃で２２時間加水分解し、脱塩酸後５０μｔの０．２
Ｎクエン酸緩衝ｔｉ、（〆ｌ ３．２５ ）に溶解し
、全量を分析に供した。
更に、主としてニワトリＣＴ Ｉとの類似性を利用し、
公知の蛋白決定法により前記式（６）に示す新規ペプチ
ドのアミノ酸配列が決定された。
公知の蛋白決定法により前記式（６）に示す新規ペプチ
ドのアミノ酸配列が決定された。
表１ 本発明のニワトリα■のアミノ酸組成＊ チロシ
ン（Ｔｙｒ）を１．ＯＯに換算して求めた。
ン（Ｔｙｒ）を１．ＯＯに換算して求めた。
＊＊ Ｃ７Ｍの測定法二過ギ酸酸化後のアミノ酸分析
（Ｓ、Ｍｏｏｒｅ、 Ｊ 、 Ｂｌｏｌ、Ｃｈａｍ、
２３８．２３５（１９６３））実施例２ 実施例１と同様にして、ニワ） ＩＪ ｆｍｍ鉢体５０
０匹）よシ本発明のニワトＩＪｃＴＩＩ金含む抽出酢酸
水溶液６２５ゴを得た。
（Ｓ、Ｍｏｏｒｅ、 Ｊ 、 Ｂｌｏｌ、Ｃｈａｍ、
２３８．２３５（１９６３））実施例２ 実施例１と同様にして、ニワ） ＩＪ ｆｍｍ鉢体５０
０匹）よシ本発明のニワトＩＪｃＴＩＩ金含む抽出酢酸
水溶液６２５ゴを得た。
この溶液を、予めＩＮ酢酸で平衡化したｓｐ −セファ
デックスＣ−２５カラム（直径Ｚ、 Ｏａｎ Ｘ高さ１
７ｄ）に注入した。次いで、２Ｍピリジン溶液で溶出し
た。この溶出骸中に本発明のニワトリＣＴｎが含まれて
いた。
デックスＣ−２５カラム（直径Ｚ、 Ｏａｎ Ｘ高さ１
７ｄ）に注入した。次いで、２Ｍピリジン溶液で溶出し
た。この溶出骸中に本発明のニワトリＣＴｎが含まれて
いた。
この溶出液１２０ｍにアセトン２４０−を添加′し、−
夜放置後、遠心分離（９，００Ｏｒｐｍ、 ３０分間
）シ、上清液を採取し、凍結乾燥して粉末１００キを得
た。
夜放置後、遠心分離（９，００Ｏｒｐｍ、 ３０分間
）シ、上清液を採取し、凍結乾燥して粉末１００キを得
た。
この凍結乾燥粉末をＩＮ酢酸に溶解して約１−の溶液と
し、セファデックスＧ −５０（Ｆｉｎ・）カラム（直
径１．２ ｃｍ Ｘ高さ１０３ ｃｍ ）に注入したこ
のとき、溶出条件は溶離液ＩＮ酢酸、溶出速度５、７
ｍｌ／ ｈ であった゛。放射性免疫検定法による活性
画分を回収し、これを凍結乾燥して凍結乾燥粉末ｚ、
ｏ ｑを得た。前記検定法から算出された免疫学的に反
応した本発明のニワ）ＩＪＣＴｎ−ｉは５５μ？であっ
た。 この粉末を実施例１と同様の方法にて高速液体ク
ロマトグラフィー操作を実施し、ニワ１ＪｃＴＨの活性
粉末５μｍを得た。この粉末の生物活性は４，８００Ｍ
ＲＣＵ／Ｗであった。
し、セファデックスＧ −５０（Ｆｉｎ・）カラム（直
径１．２ ｃｍ Ｘ高さ１０３ ｃｍ ）に注入したこ
のとき、溶出条件は溶離液ＩＮ酢酸、溶出速度５、７
ｍｌ／ ｈ であった゛。放射性免疫検定法による活性
画分を回収し、これを凍結乾燥して凍結乾燥粉末ｚ、
ｏ ｑを得た。前記検定法から算出された免疫学的に反
応した本発明のニワ）ＩＪＣＴｎ−ｉは５５μ？であっ
た。 この粉末を実施例１と同様の方法にて高速液体ク
ロマトグラフィー操作を実施し、ニワ１ＪｃＴＨの活性
粉末５μｍを得た。この粉末の生物活性は４，８００Ｍ
ＲＣＵ／Ｗであった。
更に、アミノ酸分析を行うとともに、常法のアミノ酸配
列決定法に基づいてアミノ酸配列を決定し、この活性粉
末が本発明のニワトリＣＴＩＩであることを確認した。
列決定法に基づいてアミノ酸配列を決定し、この活性粉
末が本発明のニワトリＣＴＩＩであることを確認した。
実施例３
実施例１と同様にして、ニワトリ鯰後件（５００匹）よ
シ、本発明のニワトリＣＴｎを含む抽出酢酸溶液６２５
−を得、凍結乾燥して粉末１．５２を得た。
シ、本発明のニワトリＣＴｎを含む抽出酢酸溶液６２５
−を得、凍結乾燥して粉末１．５２を得た。
この粉末をＩＮ酢酸１５−に溶解した後、遠心分離（３
，００Ｏｒｐｍ、 ２０分間）して、その上清液をセフ
ァデックスＧ −５０（Ｆｉｎｅ）カラム（直径１、２
ｃｍ Ｘ高さ１０３ ｃｒｆＩ）に注入した。
，００Ｏｒｐｍ、 ２０分間）して、その上清液をセフ
ァデックスＧ −５０（Ｆｉｎｅ）カラム（直径１、２
ｃｍ Ｘ高さ１０３ ｃｒｆＩ）に注入した。
この活性画分をＳＰ−セファデックスＣ−２５カラムに
注入し、実施例１と同様にして、ＣＴ活性を有する粉末
１．０岬を得な。
注入し、実施例１と同様にして、ＣＴ活性を有する粉末
１．０岬を得な。
この粉末を実施例１と同様の方法にて高速液体クロマト
グラフィー操作を実施し、ＣＴの活性粉末４μｔ を得
た。この粉末の生物活性は５．１００ＭＲＣＵ／岬であ
った。
グラフィー操作を実施し、ＣＴの活性粉末４μｔ を得
た。この粉末の生物活性は５．１００ＭＲＣＵ／岬であ
った。
更に、アミノ酸分析を行うとともに、実施例１と同様に
してアミノ酸配列を決定し、この活性粉末が本発明のニ
ワトリＣＴＩｒであることを確認した。
してアミノ酸配列を決定し、この活性粉末が本発明のニ
ワトリＣＴＩｒであることを確認した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 トリ鰓後体を酸性水溶液で抽出した後、 次の処理（ａ）及び（ｂ）： （ａ）抽出液をカチオン交換樹脂に接触せしめ、吸着し
た塩基性画分を水溶液で溶出させる （ｂ）ゲルクロマトグラフィーにより分子量３５００〜
６０００の画分を回収する のうち、少なくとも１種の処理を施すことを特徴とする 次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｃｙｓはシステインを、Ａｌａはアラニンを、
Ｓｅｒはセリンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｔｈｒはスレ
オニンを、Ｖａｌはバリンを、Ｇｌｙはグリシンを、Ｌ
ｙｓはリジンを、Ｇｌｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグル
タミン酸を、Ｈｉｓはヒスチジンを、Ｔｙｒはチロシン
を、Ｐｒｏはプロリンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓ
ｐはアスパラギン酸を、γ−Ｇｌｕはγ−グルタミル基
を表す） で示される新規ペプチドの採取法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59178503A JPH0678357B2 (ja) | 1984-08-29 | 1984-08-29 | 新規ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59178503A JPH0678357B2 (ja) | 1984-08-29 | 1984-08-29 | 新規ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6157518A true JPS6157518A (ja) | 1986-03-24 |
| JPH0678357B2 JPH0678357B2 (ja) | 1994-10-05 |
Family
ID=16049600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59178503A Expired - Lifetime JPH0678357B2 (ja) | 1984-08-29 | 1984-08-29 | 新規ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0678357B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63502322A (ja) * | 1985-12-19 | 1988-09-08 | モロニイ，トーマス・ジヨセフ | 引出しケ−ス |
| JP2007512284A (ja) * | 2003-11-26 | 2007-05-17 | ウニフェルシテット ベルン | 骨吸収上昇の治療のための植物抽出物 |
| CN105146566A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-12-16 | 刘全生 | 一种从乌鸡中提取活性肽的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60123500A (ja) * | 1983-12-08 | 1985-07-02 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規カルシトニン及びその採取法 |
-
1984
- 1984-08-29 JP JP59178503A patent/JPH0678357B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60123500A (ja) * | 1983-12-08 | 1985-07-02 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規カルシトニン及びその採取法 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63502322A (ja) * | 1985-12-19 | 1988-09-08 | モロニイ，トーマス・ジヨセフ | 引出しケ−ス |
| JP2007512284A (ja) * | 2003-11-26 | 2007-05-17 | ウニフェルシテット ベルン | 骨吸収上昇の治療のための植物抽出物 |
| JP4787166B2 (ja) * | 2003-11-26 | 2011-10-05 | ウニフェルシテット ベルン | 骨吸収上昇の治療のための植物抽出物 |
| CN105146566A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-12-16 | 刘全生 | 一种从乌鸡中提取活性肽的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0678357B2 (ja) | 1994-10-05 |
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