JPH0672159B2 - 魚類の成長ホルモン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は硬骨魚類の成長ホルモンおよびそれを用いる魚
類の成長促進方法に関する。哺乳類の成長ホルモンは脳
下垂体において生産されるが、それらの活性ならびに構
造は公知である。たとえば、ヒト成長ホルモンについて
は、ユー・ジェイ・レヴィス（U.J.Lewis）らによって
ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイ
エティ（J.Am.Chem.Soc.），80 4429（1958）に、エイ
・エス・ハートリー（A.S.Hartreeによってバイオケミ
カル・ジャーナル（Biochem.J.），100 754 （1966）
に、シーエィチ・リー（C.H.Li）らによってアーチブス
・オブ・バイオケミストリイ・アンド・バイオフィジク
ス（サプルメント〔Arch.Biochem.Biophys.（Supp
l.），〕１ 327（1962）に報告されている。魚類の成
長ホルモンについても、これまでに単離されたという報
告は次のようなものがある。

ティラピアよりの単離例：エス・ダブリュー・ファーマ
ー（S.W.Farmer）ら、ジェネラル・アンド・コンパラテ
ィブ・エンドクリノロジイ（Gen.Comp.Endocrin.,30，
91 （1976）． チョウザメよりの単離例：エス・ダブリュー・ファーマ
ー（S.W.Farmer）ら、エンドレクリノロジィ（Endocrin
ology），108 377 （1981）． コイよりの単離例：エイ・エフ・クック（A.F.Cook）
ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリ
ノロジイ（Gen.Comp.Endocrin.），50 335（1983）． 本発明者らはサケ脳下垂体から成長ホルモンを抽出し、
それがポリペプタイドであることを同定し、分子量、Ｎ
末端からのアミノ酸配列等が哺乳類の成長ホルモンに似
ていることを見出し、また硬骨魚類での成長促進効果を
確認して本発明を完成させた。以下に本発明をさらに詳
細に説明する。

本発明に関する魚類の成長ホルモンはサケ科の魚類の脳
下垂体から塩基性水溶液によって抽出することができ
る。その理化学的性質は以下の通りである。

（ｉ）アミノ酸組成：第１表に記載したとおり。

（ii）Ｎ末端およびＣ末端は下記アミノ酸配列を有す
る。

Ｎ末端： H₂N−Ile−Glu−Asn−Gln−Arg−Leu−Phe−Asn−Ile−
Ala−Val−Ser−Arg−Val−Gln−His−Leu−His−Leu−
Leu−Ala−Gln−Lys−Met−Phe−Asn−Asp−Phe−Asp−
Gly−Thr−Leu−Leu− Ｃ末端： −Met−His−Lys−Val−Glu−Thr−Tyr−Leu−Thr−Val
−Ala−Lys−Cys−Arg−Lys−Ser−Leu−Glu−Ala−Asn
−Cys−Thr−Leu−OH （iii）分子量：約22,000 （iv）柴外線吸収スペクトル：λmax 277nm（第１
図）。

（ｖ）溶解性：アルカリ性水溶液に可溶。中性および酸
性水溶液に難溶か不溶。

（vi）塩基性酸性の区別：酸性ポリペプタイド （vii）等電点 5.6〜5.7 （viii）物質の色，形状：白色粉末 （ix）ポリアクリルアミド電気泳動：単一バンド。

本発明におけるサケの成長ホルモンの純度はSDSポリア
クリルアミド電気泳動（9.9％ポリアクリルアミド/0.1
％SDS）を用いて検定できる。

アミノ酸組成は本物質を20％定沸点塩酸中で、110℃に
て22時間加水分解し、LKB4400型アミノ酸自動分析計で
分析することができる。また該成長ホルモンのＮ末端か
らのアミノ酸配列の分析はApplied Biosystem社製 470
A型シークエンサーおよびSpectra Physics社製高速液体
クロマトグラフとの組合せによって実施できる。

本発明の成長ホルモンは、遡上した３〜４年齢の雌のシ
ロザケ（Oncorhynchus keta）の脳下垂体から、通常の
ポリペプチドの採取に用いられるアセトン抽出方法によ
って製造することができる。

具体的には、脳下垂体に、濃塩酸（35％）とアセトンの
混合液（10:90〜90:10）を加え、ホモゲナイザーを用い
て500〜2,000rpm,5〜20分間摩砕する。これに同じ塩酸
アセトン混合液を加え、撹拌後、冷凍遠心処理（10,000
〜20,000rpm,−５〜５℃,10〜60分間，以下同じ）を施
す。上清液を除き残渣にアセトン水溶液（50〜90％）を
加え、撹拌後、冷凍遠心処理を施す。残渣を水に懸濁さ
せ、これに飽和水酸化カルシウム水溶液を加えてpH（９
〜11）とし、撹拌後、冷凍遠心処理を行う。上清を水に
対して透析後、冷凍乾燥し、粉末を得る。粉末を水に懸
濁させ、NaOH水溶液でpH（５〜７）とし、遠心分離によ
り不溶物を除く、上清に塩酸を加えてpH5〜６とし、生
じた沈殿を遠心分離により得る。

この沈殿物を酢酸アンモニウム水溶液（pH8〜10,0.05〜
0.5M）に溶かし、セファデックスカラムクロマトグラフ
ィーにかける。平衡化、溶出には同じ酢酸アンモニウム
水溶液を用いる。活性画分を集めて凍結乾燥を行い、白
色粉末を得る。

この白色粉末をTSK gel ODS−12Tカラム（東洋曹達工業
社製）上で高速液体クロマトグラフィーにかけ最終的精
製をし、活性画分を凍結乾燥する。これにより純度約10
0％の成長ホルモンポリペプチドが得られる。

成長ホルモン活性はニジマスを用い、実施例に示した方
法で測定する。

本発明の成長ホルモンは、硬骨魚類（Osteichthyes）の
成長を促進することができ、とくに、マス，サケを含む
ニシン類（Clupeiformes）の養殖などに有用である。腹
腔内投与の場合、魚体重1g当り0.01〜0.1μｇの成長ホ
ルモンポリペプチドを４〜７日おきに投与すれば魚類の
成長を促進することができる。

実施例 （１） シロザケの成長ホルモンの抽出と精製 ３〜４年令の雌のシロザケ（Oncorhynchus keta）脳下
垂体50gに濃塩酸（35％）とアセトンの1:28の混合液50m
lを加え、ホモゲナイザーを用いて1,000rpmにて10分間
摩砕した。これに250mlの上記と同じ組成の塩酸アセト
ン混合液を加え、０℃にて１時間撹拌した後、冷凍遠心
（15,000rpm,−４℃,30分間）した。上清液を除いた後
に残渣に300mlの80％アセトン水溶液を加え、０℃にて
１時間撹拌し、上記と同様に冷凍遠心した。得られた残
渣を300mlの水に懸濁させ、これに飽和水酸化カルシウ
ム水溶液を加えてpH10とし、４℃にて１時間撹拌した
後、再び上記と同様に冷凍遠心を行い上清を分離した。
この上清を水に対して透析後、凍結乾燥を行って約850m
gの粉末を得た。この粉末を250mlの水に懸濁させ、0.1N
水酸化ナトリウム水溶液でpH10.3とし、遠心分離により
不溶物を除いた。上清に0.1N塩酸を加えてpH5.66とし、
生じた沈殿を遠心分離により分離した。この沈殿を再び
250mlの水に懸濁し、上記と同様の操作をもう一度繰返
して60mgの沈殿物を得た。

この粉末を2mlの0.1M酢酸アンモニウム水溶液（pH9.0）
に溶かし、0..1M酢酸アンモニウム水溶液（pH9.0）で平
衡化したセファデックスＧ−75カラム（1.9φ×66cm）
に通塔した。上記と同じ酢酸アンモニウム水溶液で溶出
させ、2mlずつの分画を得た。第２図に示すＢ分画を集
め、透析した後に凍結乾燥して、20mgの白金粉末を得
た。0.5mgの白色粉末を、1M尿素を含む0.1％トリフルオ
ロ酢酸溶液100μに溶かし、TSK gel ODS−120Tカラム
中のゲルに注射した。0.1％トリフルオロ酢酸を含む20
−60％（v/v）アセトニトリルで、40℃で1ml/分の速度
で40分間溶出を行った。成長ホルモンの存在を220nmで
検出した。成長ホルモンは55％アセトニトリルで溶出さ
れるのでその溶液を凍結乾燥し、純度ほぼ100％の白色
粉末の成長ホルモンポリペプチドを得た。

（２） 分子量の測定 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（9.9％ポリアクリ
ルアミド/0.1％SDS）で上記成長ホルモンを展開した。
標準蛋白としてBOH Chemicalsの標準タンパクマーカー
（分子量14.3万,28.6万,42.9万,57.2万）を使用して得
られる検量線によると分子量は約22,000と算出された
（第３図）。また同時に該成長ホルモンは単一バンドを
与えた。

（３） Ｎ末端からのアミノ酸配列の分析 シロザケより得られた上記成長ホルモン40μｇを0.1％
ラウリル硫酸ナトリウム水溶液に溶かし、470Aシークエ
ンサー（Applied Biosystem社）とSP8000高速液体クロ
マトグラフ（Specta Physics社）でＮ末端からの構成ア
ミノ酸を分析したところ、下記のとおり33番目のアミノ
酸残基までが決定された。

H₂N−Ile−Glu−Asn−Gln−Arg−Leu−Phe−Asn−Ile−
Ala−Val−Ser−Arg−Val−Gln−His−Leu−His−Leu−
Leu−Ala−Gln−Lys−Met−Phe−Asn−Asp−Phe−Asp−
Gly−Thr−Leu−Leu− Ｃ末端からのアミノ酸配列の分析 シロザケより得られた上記成長ホルモンをシアノゲンブ
ロマイドで分解し、断片を回収して、上記Ｎ末端と同様
にアミノ酸分析を行ったところ、下記のとおりＣ末端の
23個のアミノ酸残基が決定された。

Ｃ末端： −Met−His−Lys−Val−Glu−Thr−Tyr−Leu−Thr−Val
−Ala−Lys−Cys−Arg−Lys−Ser−Leu−Glu−Ala−Asn
−Cys−Thr−Leu−OH （４） 紫外部吸収スペクトルの測定 上記成長ホルモンの紫外部吸収は、0.1M酢酸アンモニウ
ム水溶液（pH9.0）中で、UVIDEC Ｉ型分光検出器（日
本分光社）によって測定した（第１図）。吸収極大は27
7nmであった。

（５） 魚類成長ホルモン活性の測定 孵化後４〜７ヶ月齢（８〜10g）のニジマス（１群５
匹）を個体識別し、それぞれの腹腔内にシロザケより単
離された成長ホルモン，シロザケPRL（プロラクチ
ン），食塩をそれぞれ１μｇずつ３日おきに５回投与し
た。水温3.5〜7.5℃、長日（電燈光17時間照射）の条件
下に、ニジマスの体重の1.5％量のエサを朝夕２回に分
けて与えて飼育した。第１回目の投与から20日後のニジ
マスの体重増加を第２表に示す。

この結果は本発明の成長ホルモンがニジマスの成長を促
進することを明らかに示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、硬骨魚類の成長ホルモンの紫外線スペクトル
を示す。 第２図は、シロザケ脳下垂体を塩酸とアセトンの混合溶
媒で処理した後にアルカリ性水溶液で抽出した分画のセ
ファデックスＧ−25カラムでの溶出パターンを示す。 第３図は、SDSポリアクリルアミド電気泳動で、泳動距
離からサケの成長ホルモンの分子量を算出した図を示
す。標準タンパクマーカーはBDH Chemical社製product
No.44223 2Uを用いた。分子量14.3K,28.6K,42.9Kおよ
び57.2Kは、それぞれモノマー，ダイマー，トリマーお
よびテトラマーに相当する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有するポリペプタイ
   ドである硬骨魚類の成長ホルモン （ｉ）アミノ酸組成 下記表に記載のとおり。 （ii）Ｎ末端およびＣ末端は下記アミノ酸配列を有す
   る。 Ｎ末端： H₂N−Ile−Glu−Asn−Gln−Arg−Leu−Phe−Asn−Ile−
   Ala−Val−Ser−Arg−Val−Gln−His−Leu−His−Leu−
   Leu−Ala−Gln−Lys−Met−Phe−Asn−Asp−Phe−Asp−
   Gly−Thr−Leu−Leu− Ｃ末端： −Met−His−Lys−Val−Glu−Thr−Tyr−Leu−Thr−Val
   −Ala−Lys−Cys−Arg−Lys−Ser−Leu−Glu−Ala−Asn
   −Cys−Thr−Leu−OH （iii）分子量 約22,000 （iv）等電点 5.6〜5.7 （ｖ）アルカリ性水溶液に可溶。中性および酸性水溶液
   に難溶または不溶。
2. 【請求項２】下記の理化学的性質を有するポリペプタイ
   ドである硬骨魚類の成長ホルモンを魚類に投与して、該
   魚類の成長を促進する方法。 （ｉ）アミノ酸組成 下記表に記載のとおり。 （ii）Ｎ末端およびＣ末端は下記アミノ酸配列を有す
   る。 Ｎ末端： H₂N−Ile−Glu−Asn−Gln−Arg−Leu−Phe−Asn−Ile−
   Ala−Val−Ser−Arg−Val−Gln−His−Leu−His−Leu−
   Leu−Ala−Gln−Lys−Met−Phe−Asn−Asp−Phe−Asp−
   Gly−Thr−Leu−Leu− Ｃ末端： −Met−His−Lys−Val−Glu−Thr−Tyr−Leu−Thr−Val
   −Ala−Lys−Cys−Arg−Lys−Ser−Leu−Glu−Ala−Asn
   −Cys−Thr−Leu−OH （iii）分子量 Ａ約22,000 （iv）等電点 5.6〜5.7 （ｖ）アルカリ性水溶液に可溶。中性および酸性水溶液
   に難溶または不溶。
3. 【請求項３】魚類がニシン（Clupeiformes）に属する魚
   類であることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の
   方法。