JPH07104346B2 - ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを測定するための免疫アッセイ方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、女性用の早期妊娠イン
ジケーターとして使用することができるヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン（ｈＣＧ）の新規で迅速なアッセイに関す
る。また、本発明はそのアッセイに有用な水性免疫試薬
組成物および試験キットにも関する。

【０００２】

【従来の技術】当該技術分野では、早期妊娠インジケー
ターとして低濃度のｈＣＧを迅速かつ正確に検出しうる
試験法を入手することに依然として変らぬ欲求がある。
このホルモンは、妊娠直後に女性内で濃度が上昇し、そ
の濃度が５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬほどの低濃度であっても
可能な限り早期にそれを検出することが望まれる。１０
分以内に感度のよい妊娠の指標を提供する目的で多くの
商業的試験が開発され市場に出されてきたが、すべての
試験がかかる試験を実施する医師および他の専門家によ
って設定されるすべての基準にうまく合致するとは限ら
ない。

【０００３】ｈｃＧの測定に有用なキットは、早くも１
９８８年にイーストマンコダック社（Ｅａｓｔｍａｎ
Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ）からＫｏｄａｋ Ｓｕｒ
ｅｃｅｌｌ（商標）ｈＣＧ−尿試験キットとして販売さ
れてきた。このキットは、５分以内に感度のよいアッセ
イを行うのに必要な各種の試薬および備品を含む。この
アッセイおよびキットに対するさらなる詳細は、例え
ば、米国特許第４，８７０，００７号明細書に記載され
ている。このアッセイは、２種以上の抗体（その一つは
アビジン−ビオチン結合を介して小粒子に固定化されて
いる）とｈＣＧの複合体を捕捉する微孔質膜を試験ウェ
ル中に担持する使い捨て試験デバイスを用いて実施され
る。リン酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウム
（１０ミリモル濃度）を含む洗液を使用して膜を介して
複合体から未複合体化物質が分離されている。

【０００４】後になって、ドデシル硫酸ナトリウムが少
なくとも０．０１重量％の量で存在する限り、それがｈ
ＣＧアッセイのバックグランドを低減させることが認め
られた（ヨーロッパ特許公開第３２８３８８号参照のこ
と）。好ましくないバックグランドでは、ｈＣＧ以外の
起源によって生ずる色素または他のシグナルが観察され
る。バックグランドが存在する場合、妊娠を早期に検出
することは不可能である。それが高すぎる場合には、試
験に際して偽陰性の許容できない指示をする可能性があ
る。

【０００５】さらなる改良がヨーロッパ特許公開第３２
８４１３号明細書に記載されており、それは洗液中の低
級アルキルスルフェート（例えば、デシル硫酸ナトリウ
ム）がドデシル硫酸ナトリウムを含む洗液の長期保存中
に見い出される結晶化の問題点を解決する。さらに、前
者の洗液に比べ６倍を超える量の低級アルキルスルフェ
ートが使用されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記の微孔質膜を用い
る免疫アッセイ（または、通常サンドイッチアッセイと
して知られている）を行うに際し、膜の限定された区域
（例えば、限定された円または模様）内に検出可能なシ
グナル（例えば、色素）を提供するアッセイを入手する
ことは望ましいことであった。その限定された区域以外
の膜はパックグランドを観察するのに使用することがで
きる。アッセイが適切に行われる場合には、バックグラ
ンドを無視することができるであろう。しかしながら、
早期アッセイでは限定された区域外の膜上の検出可能な
着色バックグランドの「輪（ｒｉｎｇ）」がしばしば見
られることが解っていた。このバックグランドは、早期
使用の前記改良方法によって完全には除去されない。

【０００７】さらに、早期アッセイの感度および迅速性
を改良する必要性がある。すなわち、妊娠１週間直後に
女性の尿に通常存在する５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬのｈＣＧ
を一様に検出することが望まれる。迅速法（すなわち、
２分以内）でこのような低量を検出することは、強く望
まれる課題であったが、既知のアッセイでは容易に達成
できなかった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】ｈＣＧのための既知のア
ッセイに付随する上記課題は、下記の工程： Ａ．被検体を、ｈＣＧの１つのエピトープ部位に向けら
れた第一抗体を上方に担持する微孔質膜と接触させる工
程、 Ｂ．得られた免疫複合体に、ｈＣＧの別のエピトープ部
位に向けられた第二抗体の水性組成物であって、前記第
二抗体が酵素に共役結合しておりかつこの共役結合が前
記組成物中で少なくとも２μｇ／mL、好ましくは２．５
〜５μｇ／mLの濃度で存在する水性組成物を直ちに接触
させる工程、 Ｃ．工程Ｂの直後に、得られたサンドイッチ複合体を、
低級アルコールスルフェートとイオン強度０．１〜１を
提供するのに十分な量で存在する塩とを含む溶液で洗浄
する工程、 Ｄ．工程Ｃの直後に、前記サンドイッチ複合体に、前記
酵素の存在下で色素を提供する組成物を接触させる工
程、そして Ｅ．工程Ｄの１分以内に、色素の存在を測定する工程、
を含んでなり、そしてアッセイを２分未満で実施するこ
とを特徴とする、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを測定す
るための免疫アッセイ方法によって解決することができ
る。

【０００９】また、本発明によれば、下記の工程： Ａ．ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンと第一抗体および第二
抗体とのサンドイッチ複合体を微孔質膜上で形成する工
程であって、その際、第一抗体を酵素に共役結合させか
つこの共役結合を少なくとも２μｇ／mL、好ましくは
２．５〜５μｇ／mLの濃度で、水性組成物中のヒト絨毛
性性腺刺激ホルモンと接触させる工程、 Ｂ．前記複合体を、低級アルコールスルフェートとイオ
ン強度０．１〜１を提供するのに十分な量で存在する塩
とを含む溶液で直ちに洗浄する工程、 Ｃ．工程Ｂの直後に、前記サンドイッチ複合体に、前記
酵素の存在下で色素を提供する組成物を接触させる工
程、そして Ｄ．工程Ｃの１分以内に、色素の存在を測定する工程、
を含んでなり、そしてアッセイを２分未満で実施するこ
とを特徴とする、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを測定す
るための免疫アッセイ方法も提供される。

【００１０】また、ｈＣＧに向けた抗体と酵素標識の結
合物であって、この結合物が少なくとも２μｇ／ｍＬの
量で存在するものを含む水性組成物からなる水性免疫試
薬を含んでなるｈＣＧの測定用診断試験キットも提供さ
れる。

【００１１】

【具体的な態様】本発明は、妊娠女性の尿中に一般的に
見い出されるｈＣＧの免疫アッセイである。このアッセ
イは抗体が抗原によるもう一つの抗体の複合体化を妨げ
ないように抗原の別個のエピトープ部位に向けられた２
種の抗体を用いて行われる。

【００１２】抗体は、モノクローナルまたはポリクロー
ナルであることができ、各種の市販元から入手できる
か、あるいは既知法で調製することができる。アッセイ
は、ｈＣＧを含むことが予想される被検体（一般に、限
定されるものでないが、尿）を、複合体化物質は残存さ
せるが、未複合体化物質および流体は迅速に排出する微
孔質膜と接触することによって行われる。このような膜
は、流体との接触中にその保全性を保有するいずれかの
天然または合成材料で構成することができる。一般的
に、これらの膜は、ポリマー材料、例えば、ポリエステ
ル類、ポリアミド類、ポリエチレンイミン類、ポリカー
ボネート類、セルロース性材料およびエチレン系不飽和
重合性モノマー類から製造される付加ポリマー類から作
製される。膜の細孔サイズは、アッセイに使用する粒子
（後述する）サイズに応じて変動するが、一般に、平均
細孔サイズは１〜１０μｍにある。

【００１３】特に有用な膜は、ポリアミドから作製され
る。限定されるものでないが、代表的な材料としては、
ポリヘキサメチレンドデカンジアミド（ナイロン６１
２）、ポリヘキサメチレンアジパミド（ナイロン６
６）、ポリヘキサメチレンセバカミド（ナイロン６１
０）、ポリ−ε−カプロラクタム（ナイロン６）、ポリ
−７−アミノヘプタンアミド（ナイロン７）およびそれ
らの混合物が挙げられる。これらの膜は平均細孔サイズ
５μｍを示すことが好ましい。

【００１４】本明細書で開示する膜は、アッセイを実施
する上で他の備品（ビーカー、ボトル、試験管または他
の容器）と組み合わせて使用することができる。膜は試
験デバイスに取り付けるが、当該技術分野で数多く知ら
れているのでその形状はそれほど重要でないであろう。
特に有用な試験デバイスは、米国特許第４，８３３，０
８７号および同４，９２１，６７７号明細書に記載され
ている。

【００１５】膜が試験デバイスに取り付けられる場合、
デバイスは、同時に対照アッセイが実施できるように１
以上の試験ウェルまたは区画を有することが好ましい。
好ましい試験デバイスでは、それぞれ膜を固定した３つ
の試験ウェルが存在し、これらの試験ウェルの２つは対
照アッセイ用に設計されている。

【００１６】微孔質膜は、被検体中に存在するいずれか
のｈＣＧと複合体を形成する第一抗体をそれらの上に担
持する。抗体は、膜に吸着するかまたは当該技術分野で
周知の反応性基を用いる方法で膜に共有結合することが
できる。しかしながら、ヨーロッパ特許公開第２００３
８１号明細書に記載されるものと異なり、この発明で使
用される抗体が膜の細孔内に埋没もしくは取り込まれな
いで、実質的にその外表面に存在するように考慮するこ
とが重要である。

【００１７】好ましくは、直接または間接（連結部分を
介して）的に抗体分子を付着するのに必要な表面反応性
基を担持するポリマーからなるポリマー粒子に抗体を共
有結合する。各種の粒子、反応性基および付着の化学的
方法は多すぎてここに挙げないが、当該技術分野で周知
である。

【００１８】従って、限定されるものでないが、一般に
ポリマー粒子はカルボキシ、エポキシ、アルデヒド、ハ
ロアルキル、活性化２−置換エチルスルホニル、ビニル
スルホニル、ビニルカルボニルおよび抗体の反応性アミ
ンまたはスルフヒドリル基と反応する当該技術分野で既
知の他の基を初めとする反応性基を担持する。好ましい
反応性基としては、カルボキシル、ハロアルキル、活性
化２−置換エチルスルホニルおよびビニルスルホニルが
挙げられる。特に有用なポリマー粒子は、次式によって
示されるポリマーからなる。

【００１９】

【化２】

【００２０】上式中、Ａは、カルボキシル基またはその
塩もしくはこれらの基の前駆体を含む１種以上のエチレ
ン系不飽和重合性モノマー類に由来する反復単位を表
し、そしてＢは、Ａが誘導されるもの以外の１種以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー類に由来する反復単位
を表し、そしてｘは、０．１〜７０モル％である。好ま
しくは、Ｂは、スチレンもしくはスチレン誘導体、アク
リル酸もしくはメタクリル酸エステル、またはアクリロ
ニトリルから誘導され、ｘは、１〜２０モル％である。

【００２１】上記構造中、Ａは、アクリル酸、メタクリ
ル酸、イタコン酸、β−カルボキシエチルアクリレー
ト、β−カルボキシエチルメタクリレート、ｍ＆ｐ−カ
ルボキシメチルスチレン、メタクリルアミドヘキサン酸
またはＮ−（２−カルボキシ−１，１−ジメチルエチ
ル）アクリルアミド、あるいはそれらの塩または無水前
駆体、および当該技術分野で既知の他のモノマーから誘
導できる。

【００２２】最も好ましくは、Ａが誘導されるモノマー
は、次式によって示されるものである。

【００２３】

【化３】

【００２４】上式中、Ｒは水素、ハロゲンまたは炭素原
子数１〜３個のアルキルであり、Ｍは水素、アルカリ金
属イオンまたはアンモニウムイオンであり、そしてＬは
連結鎖中に炭素、窒素、酸素およびイオウからなる群よ
り選ばれる原子数８〜５０個を有する有機連結基であ
る。

【００２５】定義したようなモノマー類の具体的な態様
は、Ｒが水素またはメチルであり、Ｍが水素またはアル
カリ金属イオンであり、そしてＬがオキシ、チオ、イミ
ノ（−ＮＲ^１−）、カルボニルオキシ（−ＣＯＯ−）、
カルボニルイミノ（−ＣＯＮＲ^１−）、ウリレン（−Ｎ
Ｒ^１ＣＯＮＲ^１−）またはスルホニルイミノ（−ＳＯ_２
ＮＲ^１−）基（ここで、各Ｒ^１は独立して、水素、炭素
原子数１〜１０個のアルキル、炭素原子数４〜１０個の
シクロアルキルまたは炭素原子数６〜１４個のアリール
である）で連結されているかまたは末端が形成されてい
る２以上のアルキレンまたはアリーレンアルキレン基を
含んでなる。

【００２６】抗体は、当該技術分野で周知の化学試薬を
用いるのに必要な反応性基を担持するポリマー粒子に結
合することができる。表面カルボキシ基を有するこれら
の粒子では、付着は既知のカルボジイミド化合物、カル
バモイルオニウム化合物および他の既知の活性化剤を用
いて行うことができる。

【００２７】ポリマー粒子に付着した抗体からなる免疫
試薬は、被検体中の抗原との複合体化にそれらが利用で
きるように、いずれかの適当な方法で微孔質膜に適用さ
れる。膜に適用された被検体は、細孔を通して容易に排
液されるが、抗原は膜上の抗体と複合体化される。この
複合体化は接触とほぼ同時に起こり、数秒間で次のアッ
セイ工程、を始めるための操作を行う。通常の既知アッ
セイで行われるように第一抗体と抗原のインキュベーシ
ョンは不要である。

【００２８】次に、この複合体をｈＣＧに対する第二抗
体と酵素から形成される結合物と接触して膜上にサンド
イッチ複合体を形成する。抗体に酵素を付着させるため
の試薬および操作は、文献および販売元から容易に入手
できる。有用な酵素としては、ペルオキシダーゼ、アル
カリ性ホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、リゾチーム、β−アミラーゼおよび酸性ホスファタ
ーゼが挙げられる。ペルオキシダーゼおよびアルカリ性
ホスファターゼが好ましく、特にペルオキシダーゼが好
ましい。前記結合物は、少なくとも２μｇ／ｍＬ、好ま
しくは２．５〜５μｇ／ｍＬの濃度で水性組成物中に存
在する。より高い濃度も使用できるが、有利にはこれら
の量以上に著しく高めないことである。

【００２９】一般的に、前記結合物を含んでなる免疫試
薬組成物は、ｐＨ５〜９における１種以上の適当な緩衝
剤（後述されるような）で緩衝化される。組成物の任意
成分としては、非免疫学的タンパク質（すなわち、ｈＣ
Ｇと免疫反応によってバインディングしないタンパク
質）、例えばカゼイン、α−カゼイン、ウシ胎児血清、
およびブタガンマグロブリン、ならびに両性界面活性剤
が挙げられる。

【００３０】２種の抗体と抗原のサンドイッチ複合体
は、膜上に残存するが、流体と未複合体化物質は排出さ
れる。直ちに、サンドイッチ複合体は、少なくとも１回
特定の洗液で洗浄される。従って、サンドイッチ複合体
を形成するために抗原−第一抗体複合体と第二抗体のイ
ンキュベーションは必要ない。

【００３１】洗液は、炭素原子数６〜１０個の低級アル
コールスルフェート（直鎖もしくは分岐）および、一般
にアルカリ金属もしくはアンモニウムであるカチオンを
含む水性緩衝化溶液である。代表的なスルフェート類と
しては、デシル硫酸アンモニウム、デシル硫酸ナトリウ
ム、オクチル硫酸ナトリウム、デシル硫酸ルビジウム、
ヘキシル硫酸ナトリウムおよびヘプチル硫酸カリウムが
挙げられる。デシル硫酸ナトリウムが好ましい。

【００３２】スルフェートは、洗液中に少なくとも１．
５重量％、好ましくは１．８〜４重量％（総溶液重量基
準）の濃度で存在する。この溶液は、１種以上の適当な
緩衝剤を用いてｐＨ５〜９に緩衝化される。

【００３３】洗液は、０．１〜１のイオン強度を有し、
０．４〜０．７のイオン強度が好ましい。必要なイオン
強度は、緩衝剤によって部分的に提供される可能性があ
るが、また、１種以上の一価もしくは二価の水溶性塩の
存在によっても提供される。有用な塩は、アルカリ金
属、アルカリ土類金属またはアンモニウムカチオンを有
する、例えば、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、ヨ
ウ化カリウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化マ
グネシウム、塩化カルシウムおよび当業者に自明の他の
化合物が挙げられる。一価の塩（例えば、アルカリ金属
塩）が好ましい。

【００３４】従って、このような塩１種以上が所定のイ
オン強度を提供するのに十分量で存在する。イオン強度
が１種以上の塩によってのみ提供される場合には、イオ
ン強度が洗液中の緩衝剤または他の成分に由来するアニ
オンによって部分的に提供される場合よりもその塩濃度
が高くなるであろうと理解される。

【００３５】直ちに（すなわち、インキュベーションま
たは何等かの遅延を伴うことなく）、膜上の洗浄された
サンドイッチ複合体は、酵素の存在下で色素を提供する
組成物と接触される。この組成物は、一般に、酵素に対
する基質または酵素が存在する場合に別個に供給された
基質に作用して色素を生成する１種以上の試薬類を含
む。色素は、基質自体の化学反応から生成されるか、あ
るいは酵素によって酵素学的に転化される２種以上の他
の化合物の反応生成物から生成されてもよい。各使用酵
素について適当な基質は、当業者に自明であろう。

【００３６】特に好ましい態様では、酵素標識がペルオ
キシダーゼであり、過酸化水素と適当な色素生成組成物
を加えてペルオキシダーゼがサンドイッチ複合体中に存
在する膜上に色素シグナルを提供する。ペルオキシダー
ゼと共に使用する試薬類としては、トリアリールイミダ
ゾールロイコ染料、他のイミダゾール化合物ならびにベ
ンジジンおよびベンジジン誘導体が挙げられる。

【００３７】色素提供（または生成）組成物の添加には
２ないし３秒かかるが、サンドイッチ複合体が存在する
場合には膜に殆ど同時に色素が見られる。一般的に、色
素シグナルは被検体中のｈＣＧ量の存在を評価するのに
数秒から１分以内で視覚的にまたは分光光度計を用いて
評価される。負対照と正対照（存在する場合）もまた、
同時もしくはその後２ないし３秒内で評価できる。ある
場合には、オペレーターがその時間内に他の任務を行っ
ているかも知れないので色素シグナルを直ちに観察でき
ない可能性があることを理解する必要がある。しかしな
がら、この改良が常に利点を発揮しないとはいえ非常に
短時間で色素シグナルを観察できることは重要な点であ
る。

【００３８】好ましい態様では、ヒト絨毛性性腺刺激ホ
ルモンの測定用免疫アッセイは次の工程を含んでなる。 Ａ．ｈＣＧに向けた第一抗体を塗布した微孔質膜であっ
て、前記第一抗体が、次式

【００３９】

【化４】

【００４０】（上式中、Ａは、カルボン酸基またはその
塩もしくはその基の前駆体を含む１種以上のエチレン系
不飽和重合性モノマーに由来する反復単位を表し、そし
てＢは、Ａが誘導されるもの以外の１種以上のエチレン
系不飽和重合性モノマーに由来する反復単位を表し、そ
してｘは、０．１〜７０モル％を表す）で示されるポリ
マーからなるポリマー粒子に共有結合した微孔質膜を尿
試料と接触する工程、 Ｂ．得られた免疫複合体を、ｈＣＧに向けた第二抗体の
水性組成物であって、前記抗体が酵素に結合されてお
り、かつその結合物が前記組成物中に２．５〜５μｇ／
ｍＬの濃度で存在する水性組成物と直ちに接触する工
程、 Ｃ．工程Ｂの直後に、得られたサンドイッチ複合体を、
デシル硫酸ナトリウムおよびイオン強度０．４〜０．７
を提供するのに十分量で存在する一価の塩を含んでなる
溶液で洗浄する工程、 Ｄ．工程Ｃの直後に、前記サンドイッチ複合体を前記酵
素の存在下で色素を提供する組成物と接触する工程、な
らびに Ｅ．工程Ｄの１分以内に、色素の存在を測定する工程。

【００４１】この発明の実施に際して使用される試薬
類、溶液および膜は、個別にまたは診断試験キットの構
成要素として供給することができる。より具体的には、
ｈＣＧの測定用の有用な診断試験キットは、ｈＣＧに向
けられた抗体および酵素標識の結合物を含む（この結合
物は少なくとも２μｇ／ｍＬの量で存在する）水性組成
物を含んでなる。

【００４２】この試験キットの任意成分としては、本明
細書で開示した洗液、色素生成組成物、本明細書で開示
した膜（または、ｈＣＧに対する適当な免疫試薬を含
む）を含む試験デバイス、ピペット、フィルター、説明
書およびアッセイに有用な他の適当な試薬または備品を
含む。

【００４３】

【実施例】以下の例は、本発明を具体的に説明する目的
のものであり、本発明の範囲を限定するものでない。す
べてのパーセンテージは、別に指示しない限りは重量に
よる。

【００４４】例１：ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのアッ
セイ この例は、迅速アッセイによるｈＣＧの検出についての
本発明の実施例を具体的に示す。材料 使用したＳｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイ
スは、それぞれＦｌｕｏｒａｄ（商標）ＦＣ１３５非イ
オン界面活性剤（３Ｍ、０．０５ｇ／ｍ^２）を塗布した
ＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（商標）微孔質膜（５μｍ、Ｐａｌ
ｌ Ｃｏｒｐ）を含ませた。

【００４５】免疫試薬は、活性化剤として１−（１−ピ
ロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロライドを用い
ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンシルチオ）
プロピオン酸〕（モル比、９７．６：２．４）の粒子に
アフィニティー精製ヤギ抗−ｈＣＧアルファポリクロー
ナル抗体（ＯＥＭ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｔｏｍｓ Ｒｉ
ｖｅｒ，Ｎ．Ｊ．）を共有結合することによって調製し
た。この抗体を結合させる操作は次のとおりであった。

【００４６】微量遠沈管中で、ポリマー粒子懸濁液（固
体３％）を２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸緩
衝液中前記活性化剤（０．１モル濃度）と混合した。こ
の管の蓋をし、室温で１０分間回転させた。ポリクロー
ナル抗体（１３．２ｍｇ／ｍＬ）の溶液（８１０μＬ）
をこの管に加え、次いで室温で１８時間回転させた。得
られた免疫試薬は、理論量で約９９％抗体がポリマー粒
子に共有結合していた。

【００４７】グリシン緩衝液（０．１モル濃度、ｐＨ
８．５）中前記免疫試薬（０．９％）、ポリアクリルア
ミド（５％）、Ｕｖｉｔｅｘ（商標）色素（０．０１
％）およびチメロサール防腐剤（０．０１％）を含む溶
液を試験ウェルの一つの膜上の限定区域にのせた（試料
ウェルと称する）。

【００４８】ヤギガンマーグロブリンを同様な操作を用
い同じタイプの粒子に共有結合し、得られた免疫試薬を
試験ウェルの別の膜上にのせた（負対照ウェルと称す
る）。第３の試験ウェル（正対照ウェルと称する）は、
同じタイプの粒子ビーズに共有結合し、予めｈＣＧ抗原
をバインディグさせた抗体を含めた。

【００４９】試験溶液は、リン酸緩衝溶液（１５０ミリ
モル濃度の塩化ナトリウム、５０ミリモル濃度のリン酸
ナトリウム、ｐＨ６．２）、ウシ血清アルブミン（０．
７％）およびマーシオレート（０．０１％）の溶液中に
ｈＣＧ（５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬ）を含めた。

【００５０】抗−ｈＣＧモノクローナル抗体（Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｍｉｌｅｓ）
の結合物は、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５ページ（１９７９）に記
載の方法に従って調製した。この結合物を、Ｌｏｎｚａ
ｉｎｅ（商標）Ｃ両性界面活性剤（０．１％、Ｌｏｎｚ
ａ Ｃｏｒｐ）を含むＭｅｄｉｘ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓ
ｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＭｅｄｉｘＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎ
ｃ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）
と混合した。この水性組成物の最終結合体濃度は、３．
３８μｇ／ｍＬであった。

【００５１】洗液は、リン酸ナトリウム（０．１モル濃
度、ｐＨ７．２）、デシル硫酸ナトリウム（１００ミリ
モル濃度、２．７％）、塩化ナトリウム（０．３モル濃
度）およびチメロサール（０．０１％）から調製した。
この洗液のイオン強度は、約０．６であった。

【００５２】色素提供組成物は、２−（４−ヒドロキシ
−３−メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキ
シフェニル）−イミダゾールロイコ染料（０．００５
％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン酸ナト
リウム緩衝剤（５ミリモル濃度、ｐＨ６．８）、ジエチ
レントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）、４′
−ヒドロキシアセタニリド（２ミリモル濃度）および過
酸化水素（１０ミリモル濃度）を含めた。

【００５３】アッセイ操作 ｈＣＧ（５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬ）含有試験溶液（１５０
μＬ）を試験デバイスの３つの試験ウェルに加え、流体
を膜を通して排液した。標識抗体を含有する緩衝化組成
物（１滴、約４０μＬ）を、各試験ウェルに加え、次い
で排液した。それぞれの試験ウェルを２度洗浄（各約３
００μＬ）し、次いで排液した。次に、各試験ウェルに
色素提供組成物（５０μＬ）を加え、次いで排液した。
室温で短時間インキュベーションし、膜上の色素濃度を
評価し、１０が最高濃度を示しそして０が最低濃度を示
す色素濃度のカラーチャートに対して採点した。試験ウ
ェルに塗布した組成物のを取り囲む周辺域をバックグラ
ンドとして評価した。アッセイは３度行った。

【００５４】結果を３度の試験のそれぞれについて特定
の試験ウェル中に見られる可視色素濃度として下記表１
に示す。

【００５５】

【表１】

【００５６】これらのデータは、３度の別々のアッセイ
において非常に低濃度のｈＣＧ（５０ｍＩ．Ｕ．）が本
発明のアッセイによってゼロのバックグランドで容易に
検出できることを示す。さらに、このアッセイは２分未
満で実施できた。

【００５７】例２：異なる試薬を用いるｈＣＧのアッセ
イ この例は、例１に記載したのと異なるポリマー粒子ポリ
クローナル抗体を結合した免疫試薬を用いる本発明の実
施例を具体的に示す。

【００５８】材料 Ｓｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイスは、そ
れぞれＦｌｕｏｒａｄ（商標）ＦＣ１３５非イオン界面
活性剤（３Ｍ、０．０５ｇ／ｍ^２）を塗布したＬｏＰｒ
ｏｄｙｎｅ（商標）微孔質膜を含むものを使用した。

【００５９】使用したポリマー粒子は、ヨーロッパ特許
公開第３２３６９２号（１９８９年７月１２日公開）明
細書に記載されるような既知の出発原料および乳化重合
法を用いて製造したポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２
−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕（モル
比、９５．５：４．５）からなる。

【００６０】試薬は、ヨーロッパ特許公開第３２３６９
２号（上述）に記載の方法に準じて上記の粒子にアフィ
ニティー精製ヤギ抗−ｈＣＧアルファポリクローナル抗
体（ＯＥＭ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｔｏｍｓ Ｒｉｖｅ
ｒ，Ｎ．Ｊ．）を共有結合させて調製した。すなわち、
前記粒子懸濁液を微量遠沈管中でホウ酸緩衝液（０．１
モル濃度、ｐＨ８．５）と混合した。ポリクローナル抗
体（１３．２ｍｇ／ｍＬ）の溶液（８１０μＬ）を前記
管に加え、次いで室温にて１８時間回転した。得られた
免疫試薬は、理論量約９９％の抗体がポリマー粒子に共
有結合していた。

【００６１】グリシン緩衝液（０．１モル濃度、ｐＨ
８．５）中免疫試薬（０．９％）、ポリアクリルアミド
（５％）、Ｕｖｉｔｅｘ（商標）色素（０．０１％）お
よびマーシオレート防腐剤（０．０１％）を含む組成物
（２μＬ）を試験ウェルの一つの膜の限定区域（中心ス
ポット）にのせた（試料ウェルと称する）。

【００６２】試験溶液は、リン酸緩衝溶液（１５０ミリ
モル濃度塩化ナトリウム、５０ミリモル濃度リン酸ナト
リウム、ｐＨ６．２）ウシ血清アルブミン（０．７％）
およびマーシオレート（０．０１％）の溶液中ｈＣＧ
（５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬ）を含めた。

【００６３】抗−ｈＣＧモノクローナル抗体（Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｍｉｌｅｓ）
の結合物は、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５（１９７９）に記載の方
法を用いて調製した。この結合物を、Ｌｏｎｚａｉｎｅ
（商標）Ｃ両性界面活性剤（０．１％、Ｌｏｎｚａ Ｃ
ｏｒｐ）を含有するＭｅｄｉｘ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎ
ｃ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）
と混合した。この水性組成物の最終結合体濃度は、約
３．３８μｇ／ｍＬであった。

【００６４】洗液は、リン酸ナトリウム（０．１モル濃
度、ｐＨ７．２）、デシル硫酸ナトリウム（１００ミリ
モル濃度、２．７％）、塩化ナトリウム（０．３モル濃
度）およびチメロサール（０．０１％）から調製した。
この洗浄のイオン強度は、約０．６であった。

【００６５】色素提供組成物は、２−（４−ヒドロキシ
−３−メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキ
シフェニル）イミダゾールロイコ染料（０．００５
％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン酸ナト
リウム緩衝剤（５ミリモル濃度、ｐＨ６．８）、ジエチ
レントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）、４′
−ヒドロキシアセタニリド（２ミリモル濃度）および過
酸化水素（１０ミリモル濃度）を含めた。

【００６６】アッセイ それぞれｈＣＧ５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬを含有する試験溶
液（１５０μＬ）を、上記粒状試薬を含むＳｕｒｅｃｅ
ｌｌ（商標）試験デバイスの試験ウェルに加え、流体を
膜を通して排液した。ペルオキシダーゼ標識抗体（約４
０μＬ）を直ちに加え、次いで排液した。膜上の得られ
たサンドイッチ複合体を、排液しながら直ちに、洗液で
２度（各毎に３００μＬ）洗浄し、膜から未複合体化物
を除去した。直ちに色素提供組成物（５０μＬ）を加
え、膜を通して排液した。１分後、膜上に形成された色
素を評価し、１０が最高色素濃度を示す０〜１０の番号
が付されたカラーチャートに対して採点した。膜上の色
素を取り囲む周辺域をバックグランドとして評価した。

【００６７】８種のアッセイ結果は、低レベル（５０ｍ
Ｉ．Ｕ．／ｍＬ）のｈＣＧの測定において許容できる色
素生成（例１で測定したような平均１．９のシグナル）
と無視できるバックグランドを示した。さらに、これら
のアッセイは、２分未満に終了した。

【００６８】例３：結合物レベルに対応するサンドイッ
チアッセイ この例は、酵素標識抗体３．３７５μｇ／ｍＬを用いる
本発明を同一の結合物１．１２５μｇ／ｍＬを用いる既
知のアッセイと比較して示す。本発明のアッセイの感度
は、ヨーロッパ特許公開第３２８４１３号（上述）明細
書の例１に記載の既知アッセイよりも有意に高い感度を
示すことが明らかとなった。

【００６９】材料 使用したポリマー粒子は、上記の出発原料および乳化重
合法を用いて製造したポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−
ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モル比、９７．
６：２．４）からなる。Ｓｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い
捨て試験デバイスは、それぞれＦｌｕｏｒａｄ（商標）
ＦＣ１３５非イオン界面活性剤（３Ｍ、０．０５ｇ／ｍ
^２）を塗布したＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（商標）微孔質膜を
含むものを使用した。

【００７０】免疫試薬は、活性化剤として１−（１−ピ
ロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロライドを用い
前記粒子にアフィニティー精製ヤギ抗−ｈＣＧアルファ
ポリクローナル抗体（ＯＥＭ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｔｏ
ｍｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｎ．Ｊ．）を共有結合することによ
って調製した。この抗体を結合させる操作は次のとおり
であった。微量遠沈管中で、ポリマー粒子懸濁液（固体
３％）を２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝
液中前記活性化剤（０．１モル濃度）と混合した。この
管の蓋をし、室温で１０分間回転させた。ポリクローナ
ル抗体（１３．２ｍｇ／ｍＬ）の溶液（８１０μＬ）を
この管に加え、次いで室温で１８時間回転させた。得ら
れた免疫試薬は、理論量で約９９％抗体がポリマー粒子
に共有結合していた。

【００７１】グリシン緩衝液（０．１モル濃度、ｐＨ
８．５）中前記免疫試薬（０．９％）、ポリアクリルア
ミド（５％）、Ｕｖｉｔｅｘ（商標）色素（０．０１
％）およびチメロサール防腐剤（０．０１％）を含む溶
液を試験ウェルの一つの膜上の限定区域にのせた（試料
ウェルと称する）。

【００７２】ヤギガンマーグロブリンを同様な操作を用
い同じタイプの粒子に共有結合し、得られた免疫試薬を
試験ウェルの別の膜上にのせた（負対照ウェルと称す
る）。第３の試験ウェル（正対照ウェルと称する）は、
同じタイプの粒子に共有結合し、予めｈＣＧ抗原をバイ
ンディグさせた抗体を含めた。

【００７３】試験溶液は、リン酸緩衝溶液（１５０ミリ
モル濃度の塩化ナトリウム、５０ミリモル濃度のリン酸
ナトリウム、ｐＨ６．２）、ウシ血清アルブミン（０．
７％）およびマーシオレート（０．０１％）の溶液中に
ｈＣＧ（５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬ）を含めた。

【００７４】抗−ｈＣＧモノクローナル抗体（Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｍｉｌｅｓ）
の結合物は、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５ページ（１９７９）に
記載の方法に従って調製した。この結合物を、Ｌｏｎｚ
ａｉｎｅ（商標）Ｃ両性界面活性剤（０．１％、Ｌｏｎ
ｚａＣｏｒｐ）を含むＭｅｄｉｘ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓ
ｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉ
ｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）と混合した。この水性組成物の最終結合体濃度は、
３．３７５μｇ／ｍＬであった。

【００７５】対照溶液は、酵素標識結合物１．１２５μ
ｇ／ｍＬを含むものを同様に調製した。洗液は、リン酸
ナトリウム（０．１モル濃度、ｐＨ７．２）、デシル硫
酸ナトリウム（１００ミリモル濃度、２．７％）、塩化
ナトリウム（０．３モル濃度）およびチメロサール
（０．０１％）から調製した。この洗液のイオン強度
は、約０．６であった。

【００７６】色素提供組成物は、２−（４−ヒドロキシ
−３−メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキ
シフェニル）イミダゾールロイコ染料（０．００５
％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン酸ナト
リウム緩衝剤（５ミリモル濃度、ｐＨ６．８）、ジエチ
レントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）、４′
−ヒドロキシアセタニリド（２ミリモル濃度）および過
酸化水素（１０ミリモル濃度）を含めた。

【００７７】アッセイ それぞれｈＣＧ５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬを含有する試験溶
液（１５０μＬ）を、上記免疫試薬を含むＳｕｒｅｃｅ
ｌｌ（商標）試験デバイスの試験ウェルに加え、流体を
膜を通して排液した。ペルオキシダーゼ標識抗体（約４
０μＬ）を直ちに一組の試験デバイスに加え、次いで排
液した。対照結合組成物も同様に別の一組の試験デバイ
スに加えた。各デバイスの膜上で得られたサンドイッチ
複合体を、排液しながら直ちに洗液で２度（各毎に３０
０μＬ）洗浄し、膜から未複合体化物を除去した。直ち
に、色素提供組成物（５０μＬ）を加え、膜を通して排
液した。１分後、膜上に形成された色素を評価し、１０
が最高色素濃度を示す０〜１０の番号が付されたカラー
チャートに対して採点した。膜上の色素を取り囲む周辺
域をバックグランド濃度として評価した。

【００７８】本発明と対照（対照結合組成物を使用）の
両方に対する結果（色素濃度の読み）を下記表２に示
す。本発明が対照アッセイを陵駕する有意に高い感度を
示す本発明では相当高い色素シグナルが得られた。さら
に、この発明のアッセイは上記感度を約２分のアッセイ
時間内で与える。

【００７９】

【表２】

【００８０】例４：ｈＣＧアッセイにおける洗液の比較 この例は、ｈＣＧアッセイで使用する塩含有洗液の重要
性を具体的に示す。対照洗液は対照アッセイで使用した
ものであり、そして得られた色素シグナルは１分未満に
代え５分のインキュベーション後に評価したことを除
き、例１に記載した材料および操作に準じて２種のアッ
セイを行った。対照洗液は、塩化ナトリウムを含めなか
った。

【００８１】結果は、対照アッセイが試験デバイスの試
験ウェルに許容できないバックグランドシグナル現われ
ることを示す。洗液中に塩を含めて行ったアッセイは、
試験試料ウェルおよび負対照ウェルの双方においてバッ
クグランドを無視できることを示す。

【００８２】これらの色素シグナルは、塩を含む洗液で
示されるバックグランドのより良好な改良を証明するた
めに、５分のより長い時間において評価した。多くのよ
り早い色素評価時間（例えば、１分以内）は、その時間
内でアッセイ感度が非常に擾れているので、商業上設定
された時間である。しかしながら、医院や診療所で妊娠
を試験する多くのオペレーターは、同時に種々の仕事を
行う可能性があるので供されたｈＣＧアッセイを長びか
せるかも知れない。従って、オペレーターは理想的な状
況下で行われるようにすぐさま色素シグナルを評価しな
いかも知れない。

【００８３】

【発明の効果】この発明の免疫アッセイは、迅速かつ高
感度であり、そのため妊娠の信頼できる早期インジケー
ターとして５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬ程度の低レベルのｈＣ
Ｇを検出する。本アッセイは、２分未満、一般に１分か
からないで実施できるので、医院や診療所に適する高い
作業性を与える。さらに、膜が検出支持体として使用さ
れ、特にバックグランドが検出区域を取り囲む着色
「環」の状態を呈する場合の既知アッセイでよく観察さ
れるバックグランドが、実質的に低減もしくは除去され
る。

【００８４】これらの利点は、重要な特徴を組み合わせ
るこの発明によって達成される。サンドイッチの１つの
抗体を膜上に配置し、好ましくは膜上に残存する小さな
ポリマー粒子に結合される。さらに、アッセイで使用さ
れる酵素標識抗体結合物は、既知アッセイで使用される
低濃度（例えば、１．１２５μｇ／ｍＬ以下）に比し、
少なくとも２μｇ／ｍＬの量存在する。抗原と２種の抗
体間で形成されるサンドイッチ複合体は、低級アルコー
ルスルフェートおよび塩を含み、イオン強度が０．１〜
１を示す洗液を用いて膜上で洗浄される。アッセイの各
工程は、流体が膜を通して迅速に排液され、そして目的
の複合体がその表面に捕捉されるので、ある工程の直後
に行われる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の工程： Ａ．被検体を、ｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）
   の１つのエピトープ部位に向けられた第一抗体を上方に
   担持する微孔質膜と接触させる工程、 Ｂ．得られた免疫複合体に、ｈＣＧの別のエピトープ部
   位に向けられた第二抗体の水性組成物であって、前記第
   二抗体が酵素に共役結合しておりかつこの共役結合が前
   記組成物中で２．５〜５μｇ／mLの濃度で存在する水性
   組成物を直ちに接触させる工程、 Ｃ．工程Ｂの直後に、得られたサンドイッチ複合体を、
   低級アルコールスルフェートとイオン強度０．１〜１を
   提供するのに十分な量で存在する塩とを含む溶液で洗浄
   する工程、 Ｄ．工程Ｃの直後に、前記サンドイッチ複合体に、前記
   酵素の存在下で色素を提供する組成物を接触させる工
   程、そして Ｅ．工程Ｄの１分以内に、色素の存在を測定する工程、 を含んでなり、そしてアッセイを２分未満で実施するこ
   とを特徴とする、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを測定す
   るための免疫アッセイ方法。
2. 【請求項２】 下記の工程： Ａ．ｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）と第一抗体
   および第二抗体とのサンドイッチ複合体を微孔質膜上で
   形成する工程であって、その際、第一抗体を酵素に共役
   結合させかつこの共役結合を２．５〜５μｇ／mLの濃度
   で、水性組成物中のｈＣＧと接触させる工程、 Ｂ．前記複合体を、低級アルコールスルフェートとイオ
   ン強度０．１〜１を提供するのに十分な量で存在する塩
   とを含む溶液で直ちに洗浄する工程、 Ｃ．工程Ｂの直後に、前記サンドイッチ複合体に、前記
   酵素の存在下で色素を提供する組成物を接触させる工
   程、そして Ｄ．工程Ｃの１分以内に、色素の存在を測定する工程、 を含んでなり、そしてアッセイを２分未満で実施するこ
   とを特徴とする、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを測定す
   るための免疫アッセイ方法。