JPH0687792B2 - 体液の試料中の総−ビリルビンの測定のための方法および試薬 - Google Patents
体液の試料中の総−ビリルビンの測定のための方法および試薬Info
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- JPH0687792B2 JPH0687792B2 JP62056962A JP5696287A JPH0687792B2 JP H0687792 B2 JPH0687792 B2 JP H0687792B2 JP 62056962 A JP62056962 A JP 62056962A JP 5696287 A JP5696287 A JP 5696287A JP H0687792 B2 JPH0687792 B2 JP H0687792B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はビリルビン−オキシダーゼを用いる総−ビリル
ビンの測定のための方法ならびに試薬に関する。
ビンの測定のための方法ならびに試薬に関する。
従来の技術 臨床化学実験室での、殊に血清中でのビリルビン−測定
は、たとえば肝炎、肝硬変症、肝臓−／胆汁および溶血
性疾患の際の種々の病像の解明のための重量なパラメタ
である。新生児では最初の新生児期でいわゆる生物学的
黄疸が生じ、これは高すぎるビリルビン値の際致死また
は少なくとも脳障害作用を有する（核黄疸）。
は、たとえば肝炎、肝硬変症、肝臓−／胆汁および溶血
性疾患の際の種々の病像の解明のための重量なパラメタ
である。新生児では最初の新生児期でいわゆる生物学的
黄疸が生じ、これは高すぎるビリルビン値の際致死また
は少なくとも脳障害作用を有する（核黄疸）。
ビリルビンは血清中アルブミンに吸着して（α−ビリル
ビン）、１つの糖基（β−ビリルビン）、２つの糖基
（γ−ビリルビン）または共有結合でアルブミンに結合
して（δ−ビリルビン）存在する。β−プラスα−ビリ
ルビンは共役されたビリルビン、α−ビリルビンは共役
されていないビリルビンと呼ばれる。血清−総−ビリル
ビンは画分α−〜δ−ビリルビンから構成される。この
ための全般的な描写はクリニカル バイオケミストリー
（Clinical Biochemistry）17（1984年）、221〜229に
見られる。
ビン）、１つの糖基（β−ビリルビン）、２つの糖基
（γ−ビリルビン）または共有結合でアルブミンに結合
して（δ−ビリルビン）存在する。β−プラスα−ビリ
ルビンは共役されたビリルビン、α−ビリルビンは共役
されていないビリルビンと呼ばれる。血清−総−ビリル
ビンは画分α−〜δ−ビリルビンから構成される。この
ための全般的な描写はクリニカル バイオケミストリー
（Clinical Biochemistry）17（1984年）、221〜229に
見られる。
総−ビリルビンの測定はジエンドラシツク（Jendrassi
k）の記載した方法により（ジエンドラシツク、バイオ
ヒエミツシエ ツアイトシユリフト（Biochem.Z.）297
（1938年）、81）実施される。この際ビリルビンはコフ
エインの存在でジアゾ化されたスルフアニル酸を用いて
アゾ色素に接続される。この方法はいくつかの欠点を有
する：まず使用試薬が非常に不安定であり、直接測定前
に製造されねばならない。それにより試験は操作がめん
どうであり、自動化が困難である。さらにジエンドラシ
ツク−試験での亜硝酸塩の存在ならびにこの中での強い
酸性pHが、またジアゾニウム塩を用いる他の試験のよう
に、溶血性血清での障害に導く。
k）の記載した方法により（ジエンドラシツク、バイオ
ヒエミツシエ ツアイトシユリフト（Biochem.Z.）297
（1938年）、81）実施される。この際ビリルビンはコフ
エインの存在でジアゾ化されたスルフアニル酸を用いて
アゾ色素に接続される。この方法はいくつかの欠点を有
する：まず使用試薬が非常に不安定であり、直接測定前
に製造されねばならない。それにより試験は操作がめん
どうであり、自動化が困難である。さらにジエンドラシ
ツク−試験での亜硝酸塩の存在ならびにこの中での強い
酸性pHが、またジアゾニウム塩を用いる他の試験のよう
に、溶血性血清での障害に導く。
総−ビリルビンの測定のための他の方法はスカンド．ジ
エイ．クリン．ラブ．インベスト．（Scand.J.Clin.La
b.Invest.）29、Suppl.126（1972年）、アブストラクト
11,12に記載されている。この際ビリルビンはジアゾニ
ウム化合物を用いて、アゾ−ビリルビンに接続され、色
形成が測定される。共役されていないビリルビンの遊離
は清浄剤−添加により行う。ジエンドラシツク−方法と
同様に、この測定は溶血性血清中で妨げられる。たとえ
ばインジカンのような血清の他の成分も尿毒症患者血清
中しばしば総−ビリルビンの高すぎる値が見出される。
エイ．クリン．ラブ．インベスト．（Scand.J.Clin.La
b.Invest.）29、Suppl.126（1972年）、アブストラクト
11,12に記載されている。この際ビリルビンはジアゾニ
ウム化合物を用いて、アゾ−ビリルビンに接続され、色
形成が測定される。共役されていないビリルビンの遊離
は清浄剤−添加により行う。ジエンドラシツク−方法と
同様に、この測定は溶血性血清中で妨げられる。たとえ
ばインジカンのような血清の他の成分も尿毒症患者血清
中しばしば総−ビリルビンの高すぎる値が見出される。
総−ビリルビンの測定のための他の方法はクリニカル
エンツイーモロジー（Clinical Enzymology）２（1984
年）、97〜107のセレクラツド トピツクス（Selected
Topics）に記載されている。それによりビリルビンがビ
リルビン−オキシダーゼ（E.C.1.3.3.5）と反応し、ビ
リルビンの吸光度減少を410〜480nmで測定する。この方
法は溶血性−ないしは尿毒症患者血清により妨げられな
い。しかし、反応の最終点がそのつど使用される試料に
依存して、しばしば１〜２時間後初めて達成されること
が不利である。その重要な理由は、酵素反応のアルブミ
ン−結合ビリルビンがほとんど入手できず、アルブミン
からのその解離が非常にゆつくり進行するのみである
か、（δ−ビリルビンの場合）ほとんど進行しないこと
にあつた。それによりこの方法も実験室での慣用分析、
殊に自動システムの使用のために適していない。
エンツイーモロジー（Clinical Enzymology）２（1984
年）、97〜107のセレクラツド トピツクス（Selected
Topics）に記載されている。それによりビリルビンがビ
リルビン−オキシダーゼ（E.C.1.3.3.5）と反応し、ビ
リルビンの吸光度減少を410〜480nmで測定する。この方
法は溶血性−ないしは尿毒症患者血清により妨げられな
い。しかし、反応の最終点がそのつど使用される試料に
依存して、しばしば１〜２時間後初めて達成されること
が不利である。その重要な理由は、酵素反応のアルブミ
ン−結合ビリルビンがほとんど入手できず、アルブミン
からのその解離が非常にゆつくり進行するのみである
か、（δ−ビリルビンの場合）ほとんど進行しないこと
にあつた。それによりこの方法も実験室での慣用分析、
殊に自動システムの使用のために適していない。
それゆえ、この方法を、アルブミン−結合ビリルビンも
完全に共に含まれるように改良することが何度も試みら
れた。
完全に共に含まれるように改良することが何度も試みら
れた。
西ドイツ国特許第3239236号明細書から界面活性剤、芳
香族カルボン酸、スルフアニルアミドまたはプロテアー
ゼ（プロナーゼＰ）の添加下に、ビリルビン−オキシダ
ーゼを用いるビリルビンを測定する方法は公知である。
プロテアーゼ−および殊にプロナーゼＰ−のようなプロ
テアーゼ混合物の使用は、この際、この酵素が蛋白質ビ
リルビン−オキシダーゼを分解し、それにより反応試薬
の貯蔵時間またはインキユベーシヨン（恒温保持）時間
に応じてビリルビン−オキシダーゼ活性の減少が生じる
という著しい欠点を有する。この方法の検査は、それに
より、ビリルビンの完全な検出に成功しなかつた。
香族カルボン酸、スルフアニルアミドまたはプロテアー
ゼ（プロナーゼＰ）の添加下に、ビリルビン−オキシダ
ーゼを用いるビリルビンを測定する方法は公知である。
プロテアーゼ−および殊にプロナーゼＰ−のようなプロ
テアーゼ混合物の使用は、この際、この酵素が蛋白質ビ
リルビン−オキシダーゼを分解し、それにより反応試薬
の貯蔵時間またはインキユベーシヨン（恒温保持）時間
に応じてビリルビン−オキシダーゼ活性の減少が生じる
という著しい欠点を有する。この方法の検査は、それに
より、ビリルビンの完全な検出に成功しなかつた。
ケミカル アブストラクツ（Chemical Abstracts）CA10
2:20074eから、ビリルビンおよびアルブミン間の結合を
解消するために、試料を界面活性剤ならびに詳述されて
いないプロテアーゼおよび／またはリパーゼで前処理す
ることは公知である。これによりナトリウム−ラウリル
スルフエート（ナトリウム−ドデシルスルフエート、SD
S）を用いてこのような添加物なしのもの（19％）より
も著しく多くのビリルビン（試料中に含有される総ビリ
ルビンの89％）が検出されることに成功するが、しかし
また完全ではない。それによりアルブミン−結合ビリル
ビンの種々の含量を有する試料のためにも適用できる、
定量試験のためにこの方法は同様に適していない。
2:20074eから、ビリルビンおよびアルブミン間の結合を
解消するために、試料を界面活性剤ならびに詳述されて
いないプロテアーゼおよび／またはリパーゼで前処理す
ることは公知である。これによりナトリウム−ラウリル
スルフエート（ナトリウム−ドデシルスルフエート、SD
S）を用いてこのような添加物なしのもの（19％）より
も著しく多くのビリルビン（試料中に含有される総ビリ
ルビンの89％）が検出されることに成功するが、しかし
また完全ではない。それによりアルブミン−結合ビリル
ビンの種々の含量を有する試料のためにも適用できる、
定量試験のためにこの方法は同様に適していない。
クリニカル エンツイーモロジー２、（1984年）97〜10
7、ワルター デ グリユーター（Walter de Gryter）
＆ Co.ベルリン／ニユーヨークのセレクラツド トピ
ツクスには、ナトリウム−ドデシルスルフエートのよう
な陰イオンの界面活性剤の存在での測定を実施すること
が提案されている。アルブミン結合ビリルビンの完全な
遊離のために、しかし界面活性剤の非常に高い濃度（30
0モルSDS/モルアルブミン）が必要であり、これは他方
しかし既に最も短時間後にビリルビン−オキシダーゼを
さらに不活性化する。わずかな界面活性剤濃度で、界面
活性剤不含の反応試薬と比較してアルブミン分離の改良
が見出され、しかしアルブミン−結合ビリルビンの完全
な遊離は慣用分析のために要求できるインキユベーシヨ
ン時間内に（たとえば30分間円）達成されない。
7、ワルター デ グリユーター（Walter de Gryter）
＆ Co.ベルリン／ニユーヨークのセレクラツド トピ
ツクスには、ナトリウム−ドデシルスルフエートのよう
な陰イオンの界面活性剤の存在での測定を実施すること
が提案されている。アルブミン結合ビリルビンの完全な
遊離のために、しかし界面活性剤の非常に高い濃度（30
0モルSDS/モルアルブミン）が必要であり、これは他方
しかし既に最も短時間後にビリルビン−オキシダーゼを
さらに不活性化する。わずかな界面活性剤濃度で、界面
活性剤不含の反応試薬と比較してアルブミン分離の改良
が見出され、しかしアルブミン−結合ビリルビンの完全
な遊離は慣用分析のために要求できるインキユベーシヨ
ン時間内に（たとえば30分間円）達成されない。
この種の界面活性剤の使用の際、その他に試料に依存し
て、著しい、２時間までかかる反応潜行が生じることが
示される。これは同様に慣用分析での総ビリルビンの酵
素測定法の使用を妨げる。
て、著しい、２時間までかかる反応潜行が生じることが
示される。これは同様に慣用分析での総ビリルビンの酵
素測定法の使用を妨げる。
発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は従つて、上記の欠点を有さず、容易に実
施でき、および自動化でき、試料中のアルブミン−結合
ビリルビンの高い配分でも正確な結果を生じる、総ビリ
ルビンの測定のための方法を開発することであつた。
施でき、および自動化でき、試料中のアルブミン−結合
ビリルビンの高い配分でも正確な結果を生じる、総ビリ
ルビンの測定のための方法を開発することであつた。
問題点を解決するための手段 この課題は試料をスブチリシンと共にインキユベートす
ることを特徴とする、ビリルビン−オキシダーゼを用い
る、体液中の総−ビリルビンの測定法により解決する。
ることを特徴とする、ビリルビン−オキシダーゼを用い
る、体液中の総−ビリルビンの測定法により解決する。
スブチリシン（EC3.4.21.14）は血清−プロテアーゼを
包含し、これはたとえばバシルス スブチリス（Bacill
us subtilis）（スブチロペプチダーゼＡ）または類縁
微生物（スブチロペプチダーゼＢおよびＣ）から単離さ
れる（M.オツテセン（Ottesen）、I.スベンドセン（Sve
ndsen）1970年、メソツズ イン エンツイーモロジー
（Methods in Enzymology）19、199〜215）。
包含し、これはたとえばバシルス スブチリス（Bacill
us subtilis）（スブチロペプチダーゼＡ）または類縁
微生物（スブチロペプチダーゼＢおよびＣ）から単離さ
れる（M.オツテセン（Ottesen）、I.スベンドセン（Sve
ndsen）1970年、メソツズ イン エンツイーモロジー
（Methods in Enzymology）19、199〜215）。
たとえばプロナーゼＰ、エンドプロテイナーゼArg C、
パパイン、ブロメライン、トリプシンまたはキモトリプ
シンのような他のプロテアーゼの添加により、ビリルビ
ンを完全に検出することに成功しないので、本発明によ
る方法で総−ビリルビンを測定できることは特に驚異的
である。その他にこのプロテアーゼの使用の際、おそら
く蛋白質加水分解により、反応潜行ならびにビリルビン
−オキシダーゼの脱活性が観察される。
パパイン、ブロメライン、トリプシンまたはキモトリプ
シンのような他のプロテアーゼの添加により、ビリルビ
ンを完全に検出することに成功しないので、本発明によ
る方法で総−ビリルビンを測定できることは特に驚異的
である。その他にこのプロテアーゼの使用の際、おそら
く蛋白質加水分解により、反応潜行ならびにビリルビン
−オキシダーゼの脱活性が観察される。
これに対してスブチリシンは、驚異的に短時間でビリル
ビンをそのアルブミン結合から完全に遊離し、および短
時間後（約１分）また反応潜行はもはや生じない。
ビンをそのアルブミン結合から完全に遊離し、および短
時間後（約１分）また反応潜行はもはや生じない。
その他にビリルビン−オキシダーゼはスブチリシンのプ
ロテアーゼ−活性にもかかわらず、少なくとも37℃で30
分間内に新たに不活性化しない。この原因は公知でな
い。
ロテアーゼ−活性にもかかわらず、少なくとも37℃で30
分間内に新たに不活性化しない。この原因は公知でな
い。
本発明による方法の実施は、試料（たとえば血しようま
たは血清）をスブチリシンとインキユベートすることに
より行う。インキユベーシヨン時間はこの際広い範囲内
で変化できる。必要な最低インキユベーシヨン時間は主
に温度に依存し、たとえば20℃で約５分より多くなく、
37℃で約３分である。たとえば20または30分のようなよ
り長いインキユベーシヨン時間がしかし同様に、測定結
果を変えることなしに可能である。
たは血清）をスブチリシンとインキユベートすることに
より行う。インキユベーシヨン時間はこの際広い範囲内
で変化できる。必要な最低インキユベーシヨン時間は主
に温度に依存し、たとえば20℃で約５分より多くなく、
37℃で約３分である。たとえば20または30分のようなよ
り長いインキユベーシヨン時間がしかし同様に、測定結
果を変えることなしに可能である。
インキユベーシヨンを行つた後、ビリルビン−オキシダ
ーゼを添加し、総−ビリルビンを測定する。測定のため
に次のことが殊に重要である： ａ）ビリルビン−吸着帯の吸光度減少の測定（約410〜4
80nm）、（上記セレクテツドトピツクスまたはヨーロツ
パ特許出願公開第005637号明細書） ｂ）ビリルビン−酸化の間の酸素消費の測定、 ｃ）MBTHの存在での色素形成の測定 （西ドイツ国特許出願公告第3436005号明細書、タカラ
−シユゾウ）。
ーゼを添加し、総−ビリルビンを測定する。測定のため
に次のことが殊に重要である： ａ）ビリルビン−吸着帯の吸光度減少の測定（約410〜4
80nm）、（上記セレクテツドトピツクスまたはヨーロツ
パ特許出願公開第005637号明細書） ｂ）ビリルビン−酸化の間の酸素消費の測定、 ｃ）MBTHの存在での色素形成の測定 （西ドイツ国特許出願公告第3436005号明細書、タカラ
−シユゾウ）。
H2O−の代わりにH2O2−発生ビリルビン−オキシダーゼ
を使用し、またたとえばメタノールからのホルムアルデ
ヒドのカタラーゼ−触媒形成およびアンモニウムイオン
およびアセチルアセトンの存在で吹込まれたホルムアル
デヒドからのジヒドロルチジン色素の発生またはペルオ
キシダーゼの存在でフエノール、アニリン、ナフチルア
ミンのナフトールとのMBTH−Ｓの酸化カツプリングによ
る比色定量的なH2O2の測定を確定の根底とする。ａ）に
よる測定を特に有利に行う。
を使用し、またたとえばメタノールからのホルムアルデ
ヒドのカタラーゼ−触媒形成およびアンモニウムイオン
およびアセチルアセトンの存在で吹込まれたホルムアル
デヒドからのジヒドロルチジン色素の発生またはペルオ
キシダーゼの存在でフエノール、アニリン、ナフチルア
ミンのナフトールとのMBTH−Ｓの酸化カツプリングによ
る比色定量的なH2O2の測定を確定の根底とする。ａ）に
よる測定を特に有利に行う。
有利な実施形ではスブチリシンおよびビリルビン−オキ
シダーゼを同時に試料とインキュベートする。ビリルビ
ン含量はたとえば最初の吸光度およびインキユベーシヨ
ン後測定された吸光度との差異により確定される；検量
のために公知ビリルビン含量を有する標準を共に導く。
シダーゼを同時に試料とインキュベートする。ビリルビ
ン含量はたとえば最初の吸光度およびインキユベーシヨ
ン後測定された吸光度との差異により確定される；検量
のために公知ビリルビン含量を有する標準を共に導く。
反応成分の種類および濃度ならびにpH−価および本発明
による方法の際の緩衝液容量のような反応条件は、本発
明による反応試薬に関する次の記載に相応する。
による方法の際の緩衝液容量のような反応条件は、本発
明による反応試薬に関する次の記載に相応する。
本発明の他の対象は、ビリルビン−オキシダーゼおよび
場合によりこれとは別にスブチリシンを含有する、水性
緩衝液から成ることを特徴とする、総−ビリルビンの測
定のための反応試薬である。
場合によりこれとは別にスブチリシンを含有する、水性
緩衝液から成ることを特徴とする、総−ビリルビンの測
定のための反応試薬である。
水溶液のpH−価は有利に4.5〜9.5、特に６〜９である。
pH−価の測定のために、挙げられたpH−範囲で十分な緩
衝液容量を有するようなpH−価にある、全ての緩衝物質
が重要である。リン酸塩−トリス−、トリシン、ヘペス
−、MES−および酢酸塩−緩衝液が特に好適である。緩
衝物質の濃度は有利に0.01〜１モル/l、有利に0.05〜0.
2モル/lである。酵素活性を包含する、この濃度記載な
らびに全ての他のここに挙げられた濃度記載は試験での
最終濃度である。
pH−価の測定のために、挙げられたpH−範囲で十分な緩
衝液容量を有するようなpH−価にある、全ての緩衝物質
が重要である。リン酸塩−トリス−、トリシン、ヘペス
−、MES−および酢酸塩−緩衝液が特に好適である。緩
衝物質の濃度は有利に0.01〜１モル/l、有利に0.05〜0.
2モル/lである。酵素活性を包含する、この濃度記載な
らびに全ての他のここに挙げられた濃度記載は試験での
最終濃度である。
１〜50U/ml、有利に２〜20U/ml、特に有利に５〜10U/ml
の活性のスブチリシンを使用する。
の活性のスブチリシンを使用する。
ビリルビン−オキシダーゼ（たとえばタカラシユゾウ、
日本在から入手できる）は0.005〜20U/ml、有利に0.05
〜5U/mlの活性に使用する。
日本在から入手できる）は0.005〜20U/ml、有利に0.05
〜5U/mlの活性に使用する。
本発明による最も有利な反応試薬は緩衝された水溶液中 ビリルビン−オキシダーゼ0.05〜5U/ml 緩衝物質、pH6〜９ 0.05〜0.2モル/l および場合によりこれとは別に スブチリシン ２〜20U/ml を含有する。
他の実施形に挙げられた反応成分は少なくとも１つの支
持体材料上にまたは中に含浸されて存在する。支持体材
料として吸収可能なまたは膨潤可能なまたはフイルム形
成性支持体材料、たとえば紙およびたとえばテイーバツ
グ用紙またはガラス繊維羊毛状物のような類似の羊毛状
物質のような試験条片のために公知の支持体材料が使用
できる。その際反応成分をいくつかの互いに接触する支
持体に分割する。第一の支持体がスブチリシンおよび他
の、これと接触する支持体がビリルビン−オキシダーゼ
を含有する場合が特に有利であると示される。
持体材料上にまたは中に含浸されて存在する。支持体材
料として吸収可能なまたは膨潤可能なまたはフイルム形
成性支持体材料、たとえば紙およびたとえばテイーバツ
グ用紙またはガラス繊維羊毛状物のような類似の羊毛状
物質のような試験条片のために公知の支持体材料が使用
できる。その際反応成分をいくつかの互いに接触する支
持体に分割する。第一の支持体がスブチリシンおよび他
の、これと接触する支持体がビリルビン−オキシダーゼ
を含有する場合が特に有利であると示される。
次例および図面につき本発明をさらに詳述する。
第１図は本発明による方法とDPD−方法（スカンド、ジ
エイ、クリン、ラブ、インベスト、上記参照）間の方法
比較を示す。
エイ、クリン、ラブ、インベスト、上記参照）間の方法
比較を示す。
第２図はプロテアーゼ／清浄剤の添加の際のビリルビン
−オキシダーゼを用いるビリルビン測定のための反応潜
行の比較を示す。
−オキシダーゼを用いるビリルビン測定のための反応潜
行の比較を示す。
実施例 例１ 総−ビリルビンの測定（１工程試験） 試料（血清または標準）30μｌおよび緩衝液（0.05モル
/l Na-リン酸塩pH7.5）500μｌを一緒にピペツトで入れ
る。溶液の吸光度は436nmで測定する。反応はスブチリ
シンおよびビリルビン−オキシダーゼから成る混合物50
μｌの添加により開始する（スブチリシン−最終濃度:1
0U/ml、ビリルビン−オキシダーゼ−最終濃度:0.1U/m
l）。
/l Na-リン酸塩pH7.5）500μｌを一緒にピペツトで入れ
る。溶液の吸光度は436nmで測定する。反応はスブチリ
シンおよびビリルビン−オキシダーゼから成る混合物50
μｌの添加により開始する（スブチリシン−最終濃度:1
0U/ml、ビリルビン−オキシダーゼ−最終濃度:0.1U/m
l）。
37℃で10分間のインキユベーシヨン後新たに436nmで吸
光度を測定する。開始および最終吸光度の差異から、試
料のビリルビン濃度を公知ビリルビン含量の共に導かれ
た標準を用いて確定される因子を介して算出する。
光度を測定する。開始および最終吸光度の差異から、試
料のビリルビン濃度を公知ビリルビン含量の共に導かれ
た標準を用いて確定される因子を介して算出する。
例２ 総−ビリルビンの測定（２工程試験） 試料（血清または標準）30μｌおよび緩衝液（0.05モル
/l Na-リン酸塩、pH7.5）500μｌにスブチリシン溶液
（最終濃度10U/ml）20μｌをピペツトで入れる。37℃で
10分間のインキユベーシヨン後、吸光度を436nmで測定
する。反応はビリルビン−オキシダーゼ（最終濃度0.1U
/ml）20μｌの添加により開始する。５分後新たに436nm
で吸光度を読み取り、開始−および最終吸光度間の差異
から試料のビリルビン−含量を、公知ビリルビン含量の
共に導かれる標準を用いて確定される、因子を介して算
出する。
/l Na-リン酸塩、pH7.5）500μｌにスブチリシン溶液
（最終濃度10U/ml）20μｌをピペツトで入れる。37℃で
10分間のインキユベーシヨン後、吸光度を436nmで測定
する。反応はビリルビン−オキシダーゼ（最終濃度0.1U
/ml）20μｌの添加により開始する。５分後新たに436nm
で吸光度を読み取り、開始−および最終吸光度間の差異
から試料のビリルビン−含量を、公知ビリルビン含量の
共に導かれる標準を用いて確定される、因子を介して算
出する。
例３ DPD−方法との比較 種々の試料（血清）を用いて例２およびDPD−方法（モ
ノテスト（Monotest） 10ベーリンガー マンハイム
（Boehringer Mannheim）Gm6H、Best.−Nr.12394）によ
るビリルビンを比較した。結果を第１図に示す。
ノテスト（Monotest） 10ベーリンガー マンハイム
（Boehringer Mannheim）Gm6H、Best.−Nr.12394）によ
るビリルビンを比較した。結果を第１図に示す。
相関係数は Ｒ＝0.985である。
退行均衡として ｙ＝1.13×−0824が生じた。
例４ 種々のプロテアーゼの使用の際の測定値変化 例２による測定の際スブチリシンの箇所で使用した（第
２図）： 曲線1:プロテアーゼなし 曲線2:最終プロテアーゼArg C 4mg/ml 曲線3:パパイン 4mg/ml 曲線4:ブロメライン 4mg/ml 曲線5:トリプシン 20mg/ml 曲線6:キモトリプシン 4mg/ml 曲線7:SDS 0.1％ 曲線8:例２（比較測定） 第２図からSDSを用いて本発明による作用が達成されな
いことが示される。たとえばトリプシンまたはキモトリ
プシンのような他の血清プロテアーゼを用いて反応潜行
の明らかな減少は達成されない。その他にこのプロテア
ーゼはこれが付加的になおビリルビン−オキシダーゼを
攻撃し、それにより測定結果を変造するという欠点を有
する。
２図）： 曲線1:プロテアーゼなし 曲線2:最終プロテアーゼArg C 4mg/ml 曲線3:パパイン 4mg/ml 曲線4:ブロメライン 4mg/ml 曲線5:トリプシン 20mg/ml 曲線6:キモトリプシン 4mg/ml 曲線7:SDS 0.1％ 曲線8:例２（比較測定） 第２図からSDSを用いて本発明による作用が達成されな
いことが示される。たとえばトリプシンまたはキモトリ
プシンのような他の血清プロテアーゼを用いて反応潜行
の明らかな減少は達成されない。その他にこのプロテア
ーゼはこれが付加的になおビリルビン−オキシダーゼを
攻撃し、それにより測定結果を変造するという欠点を有
する。
第１図は本発明による方法とDPD−方法の比較を示し、
第２図はプロテアーゼ／清浄化剤の添加の際のビリルビ
ン−オキシダーゼを用いるビリルビン測定の反応潜行を
時間の経過に沿つて比較した図である。
第２図はプロテアーゼ／清浄化剤の添加の際のビリルビ
ン−オキシダーゼを用いるビリルビン測定の反応潜行を
時間の経過に沿つて比較した図である。
Claims (7)
- 【請求項１】ビリルビン−オキシダ−ゼを用いる体液の
試料中の総−ビリルビンの測定のための方法において、
試料をスブチリシンと共にインキュベートすることを特
徴とする、体液の試料中の総−ビリルビンの測定のため
の方法。 - 【請求項２】インキュベーションをスブチリシンを用い
て、ビリルビン−オキシダーゼの存在で行う、特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】スブチリシンを１〜50U/mlの活性で使用す
る、特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 - 【請求項４】インキュベーションを水性の、緩衝された
溶液中で行う、特許請求の範囲第１項から第３項までの
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】ビリルビン−オキシダーゼの存在での体液
の試料中の総−ビリルビンの測定のための試薬におい
て、 ビリルビン−オキシダーゼ 0.005〜20U/ml 緩衝物質、pH4〜9.5 0.01〜1.0モル/l および場合によりこれとは別に スブチリシン １〜50U/ml を含有することを特徴とする、体液の試料中の総−ビリ
ルビンの測定のための試薬。 - 【請求項６】ビリルビン−オキシダーゼ 0.05〜5U/ml 緩衝物質、pH4〜9.5 0.05〜0.2モル/l および場合によりこれとは別に スブチリシン ２〜20U/ml を含有する、特許請求の範囲第５項記載の試薬。
- 【請求項７】反応成分を少なくとも吸収可能、膨潤可能
なまたはフィルム形成性支持体材料上にまたはその中に
含有する、特許請求の範囲第５項または第６項記載の試
薬。
Applications Claiming Priority (2)
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| DE3608453.0 | 1986-03-14 | ||
| DE19863608453 DE3608453A1 (de) | 1986-03-14 | 1986-03-14 | Verfahren zur enzymatischen bestimmung von bilirubin im serum |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62220199A JPS62220199A (ja) | 1987-09-28 |
| JPH0687792B2 true JPH0687792B2 (ja) | 1994-11-09 |
Family
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| EP (1) | EP0238914B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0687792B2 (ja) |
| AT (1) | ATE56990T1 (ja) |
| DE (2) | DE3608453A1 (ja) |
| ES (1) | ES2018179B3 (ja) |
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| JPH0771515B2 (ja) * | 1989-12-18 | 1995-08-02 | 日本商事株式会社 | ビリルビンの光学的測定法および測定用試薬 |
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| ES2305023T3 (es) * | 2000-10-31 | 2008-11-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Metodos para el analisis de componentes no proteinaceos usando una proteasa de una cepa de bacilo. |
| EP1201752A1 (en) * | 2000-10-31 | 2002-05-02 | Roche Diagnostics GmbH | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a Bacillus strain |
| AU758744B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-03-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a bacillus strain |
| JP5491203B2 (ja) * | 2007-03-05 | 2014-05-14 | アドヴァンスト リキッド ロジック インコーポレイテッド | 過酸化水素小滴ベースのアッセイ |
| US20080300790A1 (en) * | 2007-05-29 | 2008-12-04 | James Kirunda Kakaire | Environmental data delivery - edd |
| CN104749009B (zh) * | 2015-03-30 | 2018-05-04 | 上海云泽生物科技有限公司 | 用于免疫分析的免疫抑制剂药物提取试剂 |
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|---|---|---|---|---|
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| DE2801505A1 (de) * | 1978-01-12 | 1979-07-19 | Siemens Ag | Druckgasisolierte hochspannungsleitung |
| US4211844A (en) * | 1978-05-19 | 1980-07-08 | Eastman Kodak Company | Bilirubin-specific fungal enzyme preparation |
| JPS5664788A (en) * | 1979-10-27 | 1981-06-02 | Unitika Ltd | Method for imparting enzyme activity to solid surface |
| DE3249743C2 (ja) * | 1982-02-18 | 1990-10-04 | Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Nagoya, Aichi, Jp | |
| JPS59125899A (ja) * | 1982-12-29 | 1984-07-20 | Nippon Shoji Kk | 酵素法による直接ビリルビン測定用試薬および測定法 |
| US4600689A (en) * | 1983-11-21 | 1986-07-15 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Novel bilirubin oxidase, its production and use |
| JPS61502443A (ja) * | 1984-07-28 | 1986-10-30 | ベツクマン インスツルメンツ インコ−ポレ−テツド | 新規な試薬およびその使用方法 |
-
1986
- 1986-03-14 DE DE19863608453 patent/DE3608453A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-02-24 US US07/017,662 patent/US4895799A/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-06 AT AT87103214T patent/ATE56990T1/de active
- 1987-03-06 DE DE8787103214T patent/DE3765147D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-06 ES ES87103214T patent/ES2018179B3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-06 EP EP87103214A patent/EP0238914B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-13 JP JP62056962A patent/JPH0687792B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62220199A (ja) | 1987-09-28 |
| DE3608453A1 (de) | 1987-09-17 |
| US4895799A (en) | 1990-01-23 |
| ATE56990T1 (de) | 1990-10-15 |
| DE3765147D1 (de) | 1990-10-31 |
| ES2018179B3 (es) | 1991-04-01 |
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| EP0238914B1 (de) | 1990-09-26 |
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