JPH0665220A - ７−置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリ ル）イソチオシアネート及びそれを含むアミン、アミ ノ酸、ペプチド、タンパク質測定用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】下記式 〔式中、ＲはＳＯ_２ＮＲ_１Ｒ_２（Ｒ_１及びＲ_２は水素原
子又はＣ_１〜３のアルキル基を示す〕で表される、７−
置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）イ
ソチオシアネート又はその塩。当該化合物を発蛍光剤と
して含有するアミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質
の測定用組成物、ペプチド、タンパク質の配列分析用組
成物、及びこれらの組成物を使用し、蛍光分析により定
量、分析することからなる当該物質の定量、分析方法。 【効果】アミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質を高
感度に測定できると共に、ペプチド、タンパク質の配列
を高感度に分析することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アミン、アミノ酸、ペ
プチド、タンパク質を検出、定量するための試薬とし
て、あるいは、ペプチド、タンパク質のアミノ酸配列を
分析するための試薬として用いることの出来る７−置換
−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）イソチ
オシアネ−ト又はその塩に関するものであり、更に詳し
くは、当該化合物を発蛍光剤として含有するアミン、ア
ミノ酸、ペプチド、タンパク質測定用組成物、又はペプ
チド、タンパク質の配列分析用組成物、更に、当該化合
物を発蛍光試薬として用いるアミン、アミノ酸、ペプチ
ド、タンパク質の検出、定量方法、及びペプチド、タン
パク質の配列分析法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、アミン、アミノ酸、ペプチド、タ
ンパク質を検出、定量するための試薬、あるいは、ペプ
チド、タンパク質のアミノ酸配列を分析するための試薬
としては、フェニルイソチオシアネ−トが知られてお
り、これまで汎用されてきた〔Ｐ．Ｅｄｍａｎ，Ａｃｔ
ａ Ｃｈｉｍ．Ｓｃａｎｄ．，４，２８３（１９５
０）；Ｐ．Ｅｄｍａｎ，Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｓｃａｎ
ｄ．，１０，７６１（１９５６）；Ｐ．Ｅｄｍａｎ，
Ｇ．Ｂｅｇｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１，８
０（１９６７）．〕。しかしながら、当該試薬は、吸光
度を検出をしなければならないため感度が悪いという難
点があり、更に高感度な検出、定量試薬の開発が望まれ
ていた。

【０００３】一方、高感度な検出を目指して、これまで
に種々の蛍光試薬が開発されており、例えば、フルオレ
セインイソチオシアネ−ト〔Ｈ．Ｍａｅｄａ，Ｈ．Ｋａ
ｗ−ａｕｃｈｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１，１８８（１９６８）〕、
４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノナフチルイソチオシアネ−
ト〔Ｈ．Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｔ．Ｔａｎｉｍｕｒａ，
Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｚ．Ｔａｍｕｒａ，Ｃｈｅｍ．
Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，１８，１４９８（１９７
０）．〕、Ｎ−ダンシルアニリノフェニルイソチオシア
ネ−ト〔Ｓ．−Ｗ．Ｊ−ｉｎ，Ｇ．−Ｘ．Ｃｈｅｎ，
Ｚ．Ｐａｌａｃｚ，Ｂ．Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉ−ｅｂ
ｏｌｄ，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８，１５０
（１９８６）；Ｈ．Ｈｉｒａｎｏ，Ｂ．Ｗｉｔｔｍａｎ
ｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ
−Ｓｅｙｌｅｒ，３６７，１２５９（１９８６）〕など
の蛍光試薬が開発されている。しかしながら、これらの
試薬についても、反応性、試薬の安定性などの点で各々
難点があり、また、試薬自体が蛍光を有しているなどの
欠点があり広く使われるには到っていないのが実情であ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】このような現状の中
で、本発明者は、高感度な検出、定量の可能な化合物及
び分析試薬を開発することを目標に鋭意研究を積み重ね
た結果、驚くべきことに、本発明者が長年にわたり携わ
り創製してきたベンゾフラザン骨格を有する蛍光試薬
〔ＡＢＤ−Ｆ，Ｔ．Ｔｏｙｏ’ｏｋａ，Ｋ．Ｉｍａｉ，
５６，２４６１（１９８４）；ＤＢＤ−Ｆ，Ｔ．Ｔｏｙ
ｏ’ｏｋａ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．Ｓａｉ−ｔｏ，
Ｓ．Ｕｚｕ，Ｋ．Ｉｍａｉ，Ａｎａｌｙｓｔ，１１４，
４１３（１９８３）．〕の４位又は７位をチオカルバミ
ル基で置換することにより得られる新規化合物が、アミ
ン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基に対
し、著しく高い反応性を有し、従って極微量のアミン、
アミノ酸、ペプチド、タンパク質が定量できることを見
出すと共に、更にペプチド、タンパク質のアミノ酸配列
の分析試薬としても用いられることを見出し、かかる知
見に基づいて本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち本発明は、下記の化１１の構造式

【０００６】

【化１１】

【０００７】〔式中Ｒは下記の化１２（但しＲ₁ 、Ｒ₂
は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基）である〕で
表わされる７−置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサ
ジアゾリル）イソチオシアネ−ト又はその塩を提供する
ことを目的とするものである。

【０００８】

【化１２】

【０００９】また、本発明は、前記化１１の構造式で表
される化合物を発蛍光剤として含有するアミン、アミノ
酸、ペプチド、タンパク質の定量用組成物を提供するこ
とを目的とするものである。

【００１０】また、本発明は、前記化１１の構造式で表
される化合物を含有するペプチド、タンパク質の配列分
析用組成物を提供することを目的とするものである。

【００１１】更に、本発明は、前記１１の構造式で表さ
れる７−置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾ
リル）イソチオシアネ−ト又はその塩を試料検体に加え
て反応させ、生じた蛍光誘導体の蛍光強度を測定するこ
とからなるアミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質の
定量方法、及びペプチド、タンパク質の配列分析方法を
提供することを目的とするものである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明の前記化合物は、
文献未載の新規化合物であり、例えば下記の反応式に沿
ってフルオロベンゾフラザンの中、４−フルオロ−７−
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルフォニル−２，１，３−ベ
ンゾオキサジアゾ−ル（以下ＤＢＤ−Ｆと略す）（特開
昭６０−７２８７４号）、又は、４−フルオロ−７−ア
ミノスルフォニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−
ル（以下ＡＢＤ−Ｆと略す）（特開昭６０−７２８７４
号）とアンモニアを反応させることにより、前記構造式
においてＲが下記の化１３である場合に該当する新規な
化合物４−アミノ−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルフ
ォニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ル（ＤＢＤ
−アミン）、又は前記構造式において、Ｒが−ＳＯ₂ Ｎ
Ｈ₂ である場合に該当する新規な化合物４−アミノ−７
−アミノスルフォニル−２，１，３−ベンゾオキサジア
ゾ−ル（ＡＢＤ−アミン）が得らる。

【００１３】

【化１３】

【００１４】更に、当該化合物のアミノ基をチオカルバ
ミル基と置換することによって、前記構造式において、
Ｒが−Ｎ−Ｒ₁ （但しＲ₁ Ｒ₂ は前記定義に同じ）であ
る場合に該当する本発明の化合物７−Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノスルフォニル−４−（２，１，３−ベンゾオキサ
ジアゾリル）イソチオシアネート（ＤＢＤ−ＮＣＳ）が
得られ、前記構造式において、Ｒが−ＳＯ₂ ＮＨ₂ であ
る場合に該当する本発明の化合物７−アミノスルフォニ
ル−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）イソ
チオシアネ−ト（ＡＢＤ−ＮＣＳ）が得られる。 〔反応式〕

【００１５】

【化１４】

【００１６】〔式中Ｒは下記の化１５（但しＲ₁ 、Ｒ₂
は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基）である〕

【００１７】

【化１５】

【００１８】上記反応に於いて、反応−Ｉに使用しうる
溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエ−テ
ル、アセトニトリル、ジオキサン、クロロホルム、ジク
ロルメタン、ベンゼン、トルエン、酢酸エチル等の不活
性有機溶媒が挙げられる。

【００１９】また、反応−ＩＩにおいて使用し得る溶媒
としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエ−テル、ア
セトニトリル、ジオキサン、クロロホルム、ジクロルメ
タン、ベンゼン、トルエン、酢酸エチル等の不活性有機
溶媒が挙げられる。

【００２０】上記反応−Ｉは、通常−１０℃〜１００℃
の範囲内で行うことができるが、好ましくは０℃〜６０
℃である。反応−ＩＩは、通常１０℃〜２００℃の範囲
内で行うことができるが、好ましくは３０℃〜１５０℃
である。反応に要する時間は、反応温度、反応に供せら
れる化合物、溶媒等によって異なるが、反応−Ｉは、通
常は１分〜３０時間、好ましくは１時間〜２５時間の範
囲で、反応−ＩＩは、通常は３０分〜２０時間、好まし
くは１時間〜１０時間の範囲で適宜選択される。

【００２１】反応混合物からの目的物の単離、精製は、
常法に従って容易に行うことができる。例えば、生じる
沈殿の濾取、ジクロルメタン、クロロホルム 酢酸エチ
ル、アセトニトリルのごとき有機溶媒による抽出、ある
いは活性炭素、シリカゲル、イオン交換樹脂、テキスト
ラン架橋重合体、スチレンもしくはアクリル酸エステル
の多孔質重合体等を用いた各種のクロマトグラフィ−を
適用して行うことができる。

【００２２】出発物質のフルオロベンゾフラザンは既知
化合物であり、例えばＤＢＤ−Ｆ、ＡＢＤ−Ｆは、Ｔｏ
ｙｏ’ｏｋａ等の方法〔Ａｎａｌｙｓｔ，１１４，４１
３（１９８９）；Ａｎａｌ．ｃｈｅｍ．，５６，２４６
１（１９８４）〕に従って製造することができる。

【００２３】当該イソチオシアネ−トは、測定系に影響
を与えなければ、本発明化合物のイソチオシアネ−ト基
とイオン的に結合して塩を形成する基をすべて含み、そ
の塩としては硝酸、塩酸、過塩素酸などの塩を挙げるこ
とができる。

【００２４】本発明化合物は、それ自身では蛍光を示さ
ず、アミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ
基と選択的に反応結合した後、顕著な蛍光を示すことか
ら、その蛍光強度を測定すれば検体試料中のアミン、ア
ミノ酸、ペプチド、タンパク質を検出、定量することが
できる。

【００２５】本発明化合物又はその塩それ自体、あるい
は本発明化合物又はその塩を発蛍光剤として含有する組
成物を用いてアミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質
を定量する際、良好な反応性を期待するための好ましい
条件としては、試料に対し添加する本発明化合物又はそ
の塩の量は、アミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質
のアミノ基１モルに対し、１モル以上、特に１０〜１０
⁴ モルが好ましく、反応液は無水又は含水量の少ないア
セトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメ
チルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどが望まし
く、好ましくは無水であること、液性は酸性であるこ
と、好ましくは０〜７、反応温度は１分〜４時間、好ま
しくは１〜１２０分である。

【００２６】反応中の酸性度を維持するためには、トリ
フルオロ酢酸、塩酸、過塩素酸を用いることが挙げられ
る。アミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ
基と結合して得られた蛍光誘導体を励起させ、生じた蛍
光強度を測定するための励起波長及び蛍光波長として、
励起波長は４１０〜４９０ｎｍ、好ましくは４５０〜４
７０ｎｍ、蛍光波長は５３０〜６００ｎｍ、好ましくは
５４８〜５７０ｎｍを選ぶことができる。

【００２７】本発明化合物は、更に、アミノ酸、ペプチ
ド、タンパク質のアミノ基と反応結合した後、酸処理す
ることにより遊離チオカルバミルアミノ酸を生じるの
で、これを検出することによりアミノ酸、ペプチド、タ
ンパク質のＮ−末端アミノ酸の高感度検出、又は定量が
出来る。

【００２８】この反応の結果生じたアミノ酸が一個欠け
たペプチド、又はタンパク質のアミノ基は、更に、ＤＢ
Ｄ−ＮＣＳ、ＡＢＤ−ＮＣＳと反応し、これは上記酸処
理によりチオカルバミルアミノ酸を遊離する。このよう
にして、当該試薬をペプチド、又はタンパク質の高感度
なアミノ酸配列分析試薬として用いることがで出来る。

【００２９】当該アミノ酸の配列分析を行う際、良好な
閉環開裂反応を期待するための好ましい条件は、無水ト
リフルオロ酢酸などを用いること、反応液は、無水又は
含水量の少ないアセトニトリル、ジオキサン、テトラヒ
ドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトア
ミドが望ましく、好ましくは無水であること、反応温度
は、１分〜４時間、好ましくは１〜１２０分である。

【００３０】得られたチオカルバミルアミノ酸の蛍光誘
導体を励起させ、生じた蛍光強度を測定するための励起
波長及び蛍光波長として、励起波長は３５０〜４５０ｎ
ｍ、好ましくは３７０〜４２０ｎｍ、蛍光波長は４８０
〜５３０ｎｍ、好ましくは４９０〜５２０ｎｍを選ぶこ
とができる。

【００３１】本発明の化合物は多くの特徴を有するが、
列記すると次の如くである。 （１）アミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミ
ノ基との反応性が高いために、検出限界を大幅に低下さ
せることができる。 （２）溶液状態での安定性が高い。有機溶媒中では室温
中１週間以上も安定である。

【００３２】（３）アミン、アミノ酸、ペプチド、タン
パク質との誘導体の安定性が高い。反応液中の条件下で
は冷蔵庫中で一週間以上も安定である。 （４）アミノ酸、ペプチド、タンパク質との誘導体を酸
にて閉環開裂させて得たチオカルバミルアミノ酸も安定
性が高く、更に、当該チオカルアミルアミノ酸を高感度
に検出、定量出来る。 （５）超微量のペプチド、タンパク質のアミノ酸配列分
析が出来る。

【００３３】本発明化合物は、前述の特性から１０^-10
ないし１０^-8Ｍのアミン、アミノ酸、ペプチド、タンパ
ク質の蛍光定量分析、ならびにペプチド、タンパク質の
アミノ酸配列分析に応用できるばかりでなく、広く生体
組織試料を対象とし、顕微鏡の視野内でアミン、アミノ
酸、ペプチド、タンパク質を検出するような組織学的検
査、膜、細胞、組織等の生体中のアミン、アミノ酸、ペ
プチド、タンパク質の検出と配列分析、これら生体構成
部分の構造と機能の関係についての検討、種々の分泌液
その他の臨床試料中のアミン、アミノ酸、ペプチド、タ
ンパク質の定量を基礎とした代謝、臨床分析それらの自
動化の基礎等、生化学、分子遺伝学、生理学及び基礎、
臨床にわたる医学的研究、ヒュ−マンゲノム解析など非
常に広範囲の応用が可能である。

【００３４】

【実施例】本発明の化合物について、次に実施例をあげ
て更に具体的に本発明を説明するが、本発明はその要旨
を越えない限り以下の実施例に制約されるものではな
い。

【００３５】実施例１４−アミノ−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルフォニル
−２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ルの合成 ４−フルオロ−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルフォニ
ル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ル５０ｍｇを１
５ｍｌのアセトニトリルに溶解させた後、室温にて０．
１ｍｌの２８％アンモニアを加えた。室温にて一晩攪拌
反応させた後、反応液を減圧凝縮し、黄色結晶を得た。
これをアセトニトリルにて再結晶し、融点２１４−２１
７℃の淡黄色の結晶２８ｍｇを得た。

【００３６】 元素分析値 Ｃ₈ Ｈ₁₀Ｎ₄ Ｏ₃ Ｓとして Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ 理論値（％） ３９．６７ ４．１６ ２３．１４ １３．２３ 実測値（％） ３９．８９ ４．０２ ２３．０７ １３．１７

【００３７】ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２４２（Ｍ⁺ ） ＮＭＲ（ＣＤ₃ ＣＮ，９０ＭＨｚ）λ（ｐｐｍ）：２．
７４（６Ｈ，ｓ），６．０３（２Ｈ，ｂｒｏａｄ
ｓ），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９１Ｈｚ） ＵＶ λ^ethanol _max ｎｍ（ε）：２２９（１９．０×
１０³ ），２５２（１１．４×１０³ ），４２４（７．
２×１０³ ） １Ｒ（ＫＢｒ）（ｃｍ^-1）：３４５０，３３５０，１６
３０，１５５５

【００３８】実施例２４−アミノ−７−アミノスルフォニル−２，１，３−ベ
ンゾオキサジアゾ−ルの合成 ４−アミノスルフォニル−７−フルオロ−２，１，３−
ベンゾオキサジアゾ−ル１００ｍｇを、３０ｍｌのアセ
トニトリルに溶解させた後、室温にて０．２ｍｌの２８
％アンモニア水を加えた。室温にて一晩反応させた後、
反応液を減圧凝縮した。残渣をアセトニトリル−クロロ
ホルムにて再結晶し、融点２３７−２３８℃の黄橙色の
結晶６０ｍｇを得た。

【００３９】 元素分析値 Ｃ₆ Ｈ₆ Ｎ₄ Ｏ₃ Ｎ₄ Ｓとして Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ 理論値（％） ３３．６５ ２．８２ ２６．１７ １４．９７ 実測値（％） ３３．７３ ２．８１ ２６．００ １４．９４

【００４０】ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２１４（Ｍ⁺ ） ＮＭＲ（ＣＤ₃ ＣＮ，９０ＭＨｚ）λ（ｐｐｍ）：５．
６６（２Ｈ，ｂｒｏａｄ ｓ），６．０８（２Ｈ，ｂｒ
ｏａｄ ｓ），６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９１Ｈ
ｚ），７．７３（１Ｈ，ｄ，７．９１Ｈｚ） ＵＶ λ^ethanol _max ｎｍ（ε）：２２９（２０．４×
１０³ ），４２１（６．３×１０³ ） １Ｒ（ＫＢｒ）（ｃｍ^-1）：３４８０，３３６０，３２
５０，１６４０，１５５０

【００４１】実施例３７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルフォニル−４−（２，
１，３−ベンゾオキサジアゾリル）イソチオシアネ−ト
（ＤＢＤ−ＮＣＳ）の合成 ４−アミノ−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルフォニル
−２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ル２００ｍｇを、
１５ｍｌのアセトニトリルに溶解させた後、室温にて１
ｍｌの３０％チオホスゲン−ベンゼン溶液を滴下した。
これを５時間還流した後、反応液を減圧凝縮した。残渣
を２０ｍｌのクロロホルムで２回抽出し、これを濾過、
濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカ
ゲルＧ２００、１５ｇ、溶離液クロロホルム）に付し
た。ＤＢＤ−ＮＣＳに相当する分画を集め、濃縮し、得
られた黄白色残渣をベンゼン−ｎ−ヘキサンにて再結晶
し、融点１２２−１２４℃の淡黄白色の結晶６１ｍｇを
得た。

【００４２】 元素分析値 Ｃ₉ Ｈ₈ Ｎ₄ Ｏ₃ Ｓ₂ として Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ 理論値（％） ３８．０３ ２．８４ １９．７２ ２２．５６ 実測値（％） ３８．４０ ２．８６ １９．５７ ２２．４７

【００４３】ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２８４（Ｍ⁺ ） ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ，９０ＭＨｚ）λ（ｐｐｍ）：２．
９５（６Ｈ，ｓ），７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４７
Ｈｚ），７．９８（１Ｈ，ｓ，Ｊ＝７．４７Ｈｚ） ＵＶ λ^ethanol _max ｎｍ（ε）：２２１（１５．７×
１０³ ），２６６（１１．５×１０³ ），３７６（１
１．７×１０³ ） １Ｒ（ＫＢｒ）（ｃｍ^-1）：２０５０，１９７０，１６
１０，１５４０

【００４４】実施例４７−アミノスルフォニル−４−（２，１，３−ベンゾオ
キサジアゾリル）イソチオシアネ−ト（ＡＢＤ−ＮＣ
Ｓ）の合成 ４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサ
ジアゾ−ル３００ｍｇを、１５ｍｌのアセトニトリルに
溶解させた後、室温にて２ｍｌの４０％チオホスゲン−
ベンゼン溶液を滴下した。これを２時間還流した後、反
応液を減圧凝縮した。残渣を２０ｍｌのクロロホルムで
２回抽出し、これを濾過、濃縮し、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィ−（シリカゲルＧ２００、１５ｇ、溶離
液クロロホルム）に付した。ＤＢＤ−ＮＣＳに相当する
分画を集め、濃縮し、残渣をベンゼン−ｎヘキサンにて
再結晶し、融点１７９−１８１℃の淡黄白色の結晶７２
ｍｇを得た。

【００４５】 元素分析値 Ｃ₇ Ｈ₄ Ｎ₄ Ｏ₃ Ｓ₂ として Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ 理論値（％） ３２．８２ １．５７ ２１．８８ ２５．０２ 実測値（％） ３２．９４ １．７１ ２１．８０ ２４．７８

【００４６】ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２５６（Ｍ⁺ ） ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ，９０ＭＨｚ）λ（ｐｐｍ）：５．
３４（２Ｈ，ｂｒｏａｄ ｓ），７．１２（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝７．２５Ｈｚ），８．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２
５Ｈｚ）， ＵＶ λ^ethanol _max ｎｍ（ε）：２１４（２１．０×
１０³ ），２６３（１４．２×１０³ ），３７１（１
１．８×１０³ ） １Ｒ（ＫＢｒ）（ｃｍ^-1）：２０５０，１９８０，１６
２０，１５４０

【００４７】実施例５アミノ酸の高速液体クロマトグラフィ−による分析 アミノ酸（５０μＭ）を含む緩衝液（ｐＨ１０．０）９
０μｌとＤＢＤ−ＮＣＳ１０ｍＭを含むアセトニトリル
溶液１０μｌとを混合した検体試料を用意した。この検
体試料を５５℃で２分間反応させ、次に、これに１Ｍ酢
酸１８０μｌを加えて反応を止めた。この検体試料を５
μｌ採り、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｍカラムに
て、０、０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
−水の容量比２３：７７の溶離液から容量比５２：４８
の溶離液にて３０分間の勾配溶離し、蛍光光度計Ｆ−１
０００（日立製作所製）を用いて励起波長３８５ｎｍ、
蛍光波長５０５ｎｍで蛍光強度を測定した。結果を図１
に示す。

【００４８】なお、アミノ酸として次の５種類のアミノ
酸を対象として、その検出限界を求めた。 ・アスパラギン酸 ・アラニン ・チロシン ・イソロイシン ・フェニルアラニン

【００４９】図１は、本発明の化合物の一つであるＤＢ
Ｄ−ＮＣＳと、アミノ酸であるアスパラギン酸、アラニ
ン、チロシン、イソロイシン、フェニルアラニンと反応
させた際に得られた高速液体クロマトグラムである。図
中、１は、アスパラギン酸、２は、アラニン、３は、チ
ロシン、４は、イソロイシン、５は、フェニルアラニ
ン、の各々ＤＢＤ−チオカルバミン酸誘導体である。

【００５０】図１から明らかなように、本発明化合物
は、アミノ酸を高感度に検出、定量するための試薬とし
て有用であることが分った。本発明化合物のＡＢＤ−Ｎ
ＣＳについても、同様の結果が得られた。また、アミ
ン、ペプチド、タンパク質についても、同様の結果が得
られた。

【００５１】実施例６ペプチドの高速液体クロマトグラフィーによる分析 本発明の化合物の一つであるＤＢＤ−ＮＣＳを発蛍光剤
として、ペプチドであるアラニル−アラニル−アラニン
と反応させ、酸にて閉環開裂、遊離アミノ酸検出という
手順を繰り返して、ペプチドのアミノ酸配列を分析し
た。

【００５２】すなわち、１ｍＭのアラニル−アラニル−
アラニン溶液（２０μｌ）に１００ｍＭのＤＢＤ−ＮＣ
Ｓ（２０μｌ、アセトニトリル溶液）を加え、５０℃で
２分間加熱する。これにベンゼン１００μｌを加え、攪
拌後遠心し、ベンゼン層を取り除く。水層を窒素ガスに
て乾燥する。これをトリフルオロ酢酸５０μｌにて溶解
し、５０℃にて１５分間加熱する。

【００５３】次いで、窒素ガスにてトリフルオロ酢酸を
蒸発乾燥させる。これに蒸留水５０μｌ、ベンゼン５０
μｌを加え攪拌後、上層のベンゼン層を採取し、これを
窒素ガスにて乾燥する。残渣を５０％トリフルオロ酢酸
水溶液２０μｌにて溶解し、８０℃にて１０分間加熱す
る。溶媒を窒素ガスにて乾燥した後、残渣をアセトニト
リル−水（１００μｌ）にて溶解し、そのうち１０μｌ
を高速液体クロマトグラフィーに注入する。カラムは、
逆相用カラムを用い、溶離は、イミダゾール・硝酸緩衝
液とアセトニトリルとの混液によるグラジエント溶離に
よった。検出波長は、５００ｎｍであり、励起波長は、
３８０ｎｍとした。

【００５４】図２は、アラニル−アラニル−アラニンの
アミノ酸配列を決定する際に得られた一回目の手順に於
ける高速液体クロマトグラムであり、図中１は、遊離し
たアラニンのＤＢＤ−チオカルバミン酸である。本発明
化合物のＡＢＤ−ＮＣＳについても、同様の結果が得ら
れた。

【００５５】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明化合物は、
それ自身では蛍光を示さず、アミン、アミノ酸、ペプチ
ド、タンパク質のアミノ基と選択的に反応結合した後、
顕著な蛍光を示すことから、その蛍光強度を測定するこ
とによって、検体試料中のアミン、アミノ酸、ペプチ
ド、タンパク質を高感度に検出、定量することができ
る。

【００５６】また、本発明化合物は、前記のアミノ基と
反応結合した後、酸処理することにより遊離チオカルバ
ミルアミノ酸を生じるので、これを検出することにより
アミノ酸、ペプチド、タンパク質のＮ−末端のアミノ酸
を高感度に検出、定量することができる。

【００５７】更に、本発明のアミン、アミノ酸、ペプチ
ド、タンパク質測定用組成物、及びペプチド、タンパク
質の配列分析用組成物は、前記本発明の特性を利用し
て、これらの物質を簡便、かつ高感度に検出、定量する
ための試薬として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明化合物のＤＢＤ−ＮＣＳとアミノ酸を反
応させて得られた高速液体クロマトグラムを示す。

【符号の説明】

１ アスパラギン酸のＤＢＤ−チオカルバミン酸誘導体 ２ アラニンのＤＢＤ−チオカルバミン酸誘導体 ３ チロシンのＤＢＤ−チオカルバミン酸誘導体 ４ イソロイシンのＤＢＤ−チオカルバミン酸誘導体 ５ フェニルアラニンのＤＢＤ−チオカルバミン酸誘導
体

【図２】アラニル−アラニル−アラニンのアミノ酸配列
を決定する際に得られた高速液体クロマトグラムを示
す。

【符号の説明】

１ 遊離したアラニンのＤＢＤ−チオカルバミン酸

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】 ７−置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリ ル）イソチオシ アネート及びそれを含むアミン、アミ ノ酸、ペプチド、タンパク質測 定用組成物

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の化１の構造式 【化１】 〔式中Ｒは下記の化２（但しＲ₁ 、Ｒ₂ は水素原子又は
   炭素数１〜３のアルキル基）である〕で表わされる７−
   置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）イ
   ソチオシアネート又はその塩。 【化２】
2. 【請求項２】 下記の化３の構造式 【化３】 〔式中Ｒは下記の化４（但しＲ₁ 、Ｒ₂ は水素原子又は
   炭素数１〜３のアルキル基）である〕で表わされる７−
   置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）イ
   ソチオシアネ−ト又はその塩を発蛍光剤として含有する
   ことを特徴とするアミン、アミノ酸、ペプチド、タンパ
   ク質測定用組成物。 【化４】
3. 【請求項３】 下記の化５の構造式 【化５】 〔式中Ｒは下記の化６（但しＲ₁ 、Ｒ₂ は水素原子又は
   炭素数１〜３のアルキル基）である〕で表わされる７−
   置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）イ
   ソチオシアネ−ト又はその塩を発蛍光剤として含有する
   ことを特徴とするペプチド、タンパク質の配列分析用組
   成物。 【化６】
4. 【請求項４】 下記の化７の構造式 【化７】 〔式中Ｒは下記の化８（但しＲ₁ 、Ｒ₂ は水素原子又は
   炭素数１〜３のアルキル基）である〕で表わされる７−
   置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）イ
   ソチオシアネ−ト又はその塩を試料検体に加えて反応さ
   せ、生じた蛍光誘導体の蛍光強度を測定することを特徴
   とするアミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質の定量
   方法。 【化８】
5. 【請求項５】 下記の化９の構造式 【化９】 〔式中Ｒは下記の化１０（但しＲ₁ 、Ｒ₂ は水素原子又
   は炭素数１〜３のアルキル基）である〕で表わされる７
   −置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）
   イソチオシアネ−ト又はその塩を試料検体に加えて反応
   させ、次いで、酸処理して遊離した蛍光誘導体の蛍光強
   度を測定することを特徴とするペプチド、タンパク質の
   配列分析方法。 【化１０】