JPH06510659A

JPH06510659A - 変更されたアロタイプ抗原決定基をもつヒト化抗体

Info

Publication number: JPH06510659A
Application number: JP4505594A
Authority: JP
Inventors: クラーク，マイケル　ロナルド
Original assignee: リンクスベイル　リミティド
Priority date: 1991-03-12
Filing date: 1992-03-12
Publication date: 1994-12-01
Also published as: CA2105980A1; GB9105245D0; WO1992016562A1; EP0575407A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１８、以下の段階。

（ａ）免疫グロブリンＨ鎖の定常領域を同定し。

（ｂ）その同定された定常領域内てアロタイプ抗原決定基の位置を決めるために、その同定された定常領域と、それと同一イソタイプの免疫グロブリンＨ鎖からの定常領域とを比較し：（Ｃ）アロタイプ抗原決定基をもつ上記の同定された定常領域のためのコート配列を得て。

（ｄ）少なくとも１つの上記アロタイプ抗原決定基をもたない分子をコードするように、そして、そのアミノ酸残基を、アロタイプ抗原決定基のための部位で、上記の同定された定常領域のものと異なるイソタイプの等価な免疫グロブリン定常領域内のその対応位置からのアミノ酸残基と同一にすることにより、上記コード配列を変更し。

（ｅ）上記分子を生産するために、発現系内で、上記の変更されたコード配列を使用する。

を含んで成る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分子調製方法。

１９　請求項１３に記載の医薬調製物を投与することを含んで成る、唐音の治療方法。

明細書変更されたアロタイプ抗原決定基をもつヒト化抗体本発明は、結合分子に関する。特に、本発明は、組み換え操作により生産された抗体に関する。

与えられた抗原に関しての、それらの高い特異性のために、抗体及び特にモノクロナール抗体（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ，、１９７５Ｎａｔｕｒｅ　２５飢４９５）は、科学的、商業的及び治療的に重要な結論を伴う非常に技術的な画期的躍進に相当した。

モノクロナール抗体は、特定の特異性をもつ生物学的に機能する抗体分子の１つの形態を分泌する単一の免疫グロブリン生産細胞を生ずる不死化細胞系を確立することにより作られる。

それらの特異性のため、モノクロナール抗体の治療的利用は、広範囲の疾患の治療に関して非常に有望である（　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｅ、Ｓ、Ｌｅｎｎｏｘ編集、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　１９８４．出版社Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）。抗体は、一般だ免疫グロブリンは、それらの種に対して特有の特徴をもっている。

治療的な目的のための、これらの外来のげっし類動物蛋白のヒト患者への反復投与は、有害な過敏症の反応を導き得る。これらのげっし類により誘導された抗体についてのさらなる問題は、それらがインビボにおける細胞の消耗時に、比較的効果が小さいということである。但し、ラットの［ｇＧ２ｂ抗体ＣＡＭＰＡＴＨ −ＩＧは、このルールに対する例外である。

従って、ヒト蛋白に特異的な特有の特徴をもつ治療的抗体の必要性か存在する。

不幸なことに、不死化ヒト化抗体生産細胞系は、確立するのが非常に難しく、そして低い収率の抗体（約１μｇ／ｍｌ）を与える。反対に、等価なげっし類動物細胞系は、多量の抗体（約１００μｇ／ｍｌ）を産生ずる。さらに、特定の特異性をもつヒト化抗体を生産しようと欲する場合は、興味のあるエピトープを有する免疫原により、ヒトを免疫化することが、実際的に、又は倫理的に行うことができない。

部分的には、この問題は、近年、非ヒト抗体の”ヒト化”のために、組み換えＤＮＡ技術の手法を使用することにより克服されてきた。

構造的には、最も簡単な抗体（［ｇＧ）は、ジスルフィド結合により相互に結合した４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含んで成る（図１を参照のこと）。このＩ、鎖は、２つのタイプ、カッパ又はラムダのいずれかから成る。１１及びし鎖のそれぞれは、低い配列可変性の領域であるアロタイプを生ずる定常領域（Ｃ）及び高い配列可変性の領域であるイディオタイプを生ずる可変領域（Ｖ）をもつ。抗体は、２つのＨ鎖を含んで成る尾の領域（Ｆｃ領域）をもつ。抗体は、それぞれ互いに結びついた■、及び■８領域をそれぞれにもつ２つの腕（Ｆ、ｂ領域）ももつ。この対の■領域は、それぞれの抗体相互間で異な、っており、そして共に、抗原を認識するだめの反応性をもつ。より詳細には、それぞれのＶ領域は、４つのフレームワーク領域（ＰＲ）により隔てられた３つの相補的抗原決定領域（ＣＤＲ）から作られる。このＣＤＲは、可変領域の最も可変性の部分てあり、ぞしてそれらが、クリティカルな抗原結合機能を遂行する。このＣＤＲ領域は、組み換え、突然変異及び選択を含む複雑な工程を経由して、多くの潜在能力のある生殖細胞系配列から作られる。抗原結合作用が、抗体全部のフラグメントにより行われることが見出されている。

結合フラグメントは、ｖＬ並びに一本のＨ鎖可変領域（旨）の■８を含んて成るＦ１フラグメントである。

“ヒト化”免疫グロブリンを創出することにおいて、非ヒト抗体の尾Ｐｃが、ヒト抗体のものと交換される。より完全なヒト化のためには、非ヒト抗体のＦＲが、ヒトのＰＲと交換される。この工程は、組み換えＤＮＡ技術を使用してＤＮＡレベルで行われる。しかしながら、これらのヒト化免疫グロブリンは、全ての問題を解決しない。なぜなら、免疫反応は、・患者自身の等価な抗体と比較したとき、■（すなわちイディオタイプの違い）領域及びＣ（アロタイプの違い）領域内で特定配列の違いを示すことができるので、患者がヒト抗体により治療されたときてさえも、処理抗体に対して高められ得るからである。このことは、上記患者の免疫系が、既に現れており、そしてそれ故、それらの配列の違いをもつ抗体に対して準備されている（例えば、患者がアロタイプの異なる免疫グロブリンを含む血液を前もって注入されることができる）ところでは、特に問題である。” マウス化ヒト抗体“を、マウスに注射するモデル系は、アロタイプのマツチングか、抗イデイオタイプ反応にクリティカルに影響を及ぼし得ることを示した（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎλ１．、　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｇ、、　Ｗａｌｄｍａｎｎ　Ｈ，、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　Ｍ、Ｓ、、　（１９８９）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１７０．２１５３−２１５７）。

、本出願人は、この問題の周辺の１つの解決策は、定常領域からのアロタイプの変化を除去することであると理解した。

イソタイプとして知られた、異なる免疫グロブリンＩｇＧ　、　Ｉｇｋｌ、ＩｇＡ　、　ＩｇＤ　、　ＩｇＢの列が在り、この列のＩｇＧが最も一般的に治療に使用される。イソタイプのサブクラスとして、ＩｇＧ１．１ｇＧ２．１ｇＧ３及び１ｇＧ４か存在する。

以下のような異なったイソタイプＩｇＧＩ　Ｘ　４１ｇＧ２　ｘ　１１ｇＧ３　Ｘ　＋３の間に分布するヒト免疫グロブリンの２４個の確認されたアロタイプが在る。

このアロタイプは、その蛋白配列内の別個の位置に見つけられた他のアミノ酸の置換に基ついている。これらの異なるアロタイプの抗原決定基は、与えられた、遺伝子対立形悪内での異なる組合せの中に見出されるが、理論的に存在し得る可能な組合せの全てが実際に観察されていない。

例えば、ＩｇＧ１の４つの異なるアロタイプは、免疫系によって、見られる（すなわち区別される）ことができる。それらは、Ｇ１ｍ１．２．３及び１７である。あるいは、それらの組合せ、例えばＧｌｍ（１、１７）も、区別される。この４つの異なる単一アロタイプを、図２に示す。

抗体が他のヒト・イソタイプから精製されるならば、他のイソアロ久イブを区別することができる他の非ヒト棟内て、抗血清を作ることができる。そのための上記のような抗血清か存在するようなイソアロタイプは、非アロタイプと言われ、そして名称、例えばｎＧｌｍ（１）（これは、Ｇｌｍ（１）のイソアロタイプである）を与えられている。

このように、ヒト・イソアロタイプは、ヒト内で免疫原であるはずはないのたけれとも、異なる棟内ては、潜在的に認識されることができる。

前述の＋ｇＧ＋の異なるアロタイプについての、ヒト＋ｇＧｌの３つの共通の対立遺伝子の形が、異なった頻度を伴って、異なった人種グループ内で、すなわち、抗原決定基Ｇ１ｍ１．２．３及び１７に対して向けられたヒト抗血清とのそれらの反応性に基＜　Ｇｌｍ（３）、Ｇｌｍ（１，１７）、及びＧｌｍ（１，２，１７）内で生じている。将来のある時点に、１又はそれより多くのこれらの抗原決定基と反応する現存抗アロタイプをもつ患者は、ヒト化抗体による治療を必要とするであろう。明らかな解決方法及びｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｎａｔｕｒｅ（１＋Ｉａｇｅ、　Ｒ，Ｇ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８８）　３３３゜８０７ −８０８）へのレターに提案されたものは、抗体の異なる対立形態の全てを作ること、並びに治療のためにそれぞれの患者にアロタイプ・マツチングすることである。本出願人は、商業的には、これが良い提案ではないことを理解した。なぜなら、生産コストが増大し、そして調節を必要としながら、平行して幾つかの試薬を加工する必要があるからである。さらに、それぞれの患者は、異なるアロタイプへの反応についてテストされなければならないであろう。

従って、本出願人は、それぞれの治療抗体から上記アロタイプを全て取り除くことを目的とする。ヒト・アロタイプのＩｇＧｌ（１，２，１７）の配列を、図４（ａ、　ｂ　、　ｃ及びｄ）中に、他のヒト１ｇＧのイソタイプのサブクラスだめの配列と共に示す。この４つのイソタイプは、ドメインＣＨＩ　、ＣＨ２及びＣＨ３について非常に相同性があること、並びに主なイソタイプ間の違いは、イソタイプ間の長さ及び配列の両方において変化するヒンジ領域にある。ＩｇＧ１　のアロタイプの残基Ｇ１ｍ（１，２，１７）を、図４に記した。しかしながら、明確さを目的として、このアロタイプ部位Ｇ１ｍ（１）　（２）及び（１７）付近の配列を、それぞれのイソタイプについて以下に示す。

Ａｒｇ　Ａｓｐ又はＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ又はＭｅｔ　［ｇＧＩＡｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　ＩｇＧ２Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　［ｇＧ３Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　１ｇＧ４このように、部位（１）では、［ｇＧＩは、３５６位にアスパラギン酸若しくはグルタミン酸が、又は３５８位にロイシン若しくはメチオニンが在るかどうかに依存する幾つかのアロタイプとして存在することができる。

Ｇｌｕ　Ｇｌｙ又はＡｌａ　Ｌｅｕ　［ｇＧＩＧｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　［ｇＧ２Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　［ｇＧ３Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　［ｇＧ４このように、部位（２）では、ＩｇＧ１は、グリシン又はアラニンが４３１位に在るかとうかに依存する２つのアロタイプのいずれかとして存在することができる。

部位（１７）／（３）部位（３）及び（１７）は、同一部位でのとちらかの置換体である。

２１３　２＋４　２１５Ｌｙｓ　Ｌｙｓ又はＡｒｇ　Ｖａｌ　ＩｇＧＩＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　ＩｇＧ２Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＩｇＧ３Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　１ｇＧ４このように、部位（１７）／（３）では、［ｇＧｌは、リジン又はアルギニンが在るかとうかに依存する２つのアロタイプのいずれかとして存在することができる。アロタイプ（１７）及び（３）は、同時に存在することができない。なぜなら、それらが、同一位置でのどちらかの置換体を表しているからである。

Ｇｌｍ（１）及びＧｌｍ（２）の、前記他の対立遺伝子は、ヒト・アロタイプ反応を誘発しない。なぜなら、これら対立遺伝子が、この領域内で、他のＩｇＧサブクラスと相同であるからである。それ故、これらの対立遺伝子は、イソアロタイプと呼ばれる。なぜなら、それらは、異種抗血清（異なる種からの抗血清）によってのみ認識され、そしてそのイソタイプが他のサブクラスから精製されたときにのみ認識されるからである。

それ故、本出願人は、新たな対立遺伝子がイソアロタイプ抗原決定基からだけからなるように、その遺伝子、例えば、以下に記載するＣＡＭＰＡＴＨ−Ｉｔ（モノクロナール抗体遺伝子の部位特異的突然変異誘発により、新たな１ｇＧ１遺伝子を創りだすことを目的とする。本出願人により提供された教示に従うＩｇＧ１突然変異体の調製を、図３に図式Ｇ１ｍ（１）及びＧｌｍ（２）のためには、前記の変更は、前記他のイソアロタイプ残基による簡単な置換を含んで成る。しかしながら、Ｇｌｍ（１７）の場合には、リジンのアルギニンへの変換は、この残基が［ｇＧ３及び１ｇＧ４と相同であるという事実にもかかわらず、Ｇｌｍ（３）アロタイプとしての特定の別個のものにより認識されるアロタイプに、そのアロタイプを、幾つかの場合に、単に変更するだけであろう。このような見かけの矛盾が存在すると考えられる。なぜなら、このアルギニンは、ＣＨＩ　ドメイン又はヒンジ領域内の、非常に接近した他のＩｇＧ１の特異的な残基のコンチクスト内の３次構造のエピトープの中に見られるからである。このことは、リジンの交換に加えて、ＣＨＩ又はヒンジ内の他の残基が、新たなイソアロタイプを創るために、交換される必要があることを示している。　□先の又は続く記述は、具体的に、ＩｇＧ１及び特に、ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨモノクロナール抗体に向けられたものであるけれども、これと同様のアプローチが、他のヒト・・イソタイプ、例えば１ｇＧ２．１ｇＧ３及びカッパのイソアロタイプを創出するために使用されることができる。

このように、本発明は、第二結合分子から誘導するとがてきる第一結合分子てあって；第二結合分子が、免疫グロブリン、又はそれらの誘導体、構造的若しくは機能的類似物、相同的な分子ファミリーのメンバーであり、そして他のファミリー・メンバー内の等価な部位から構造的に区別されるｌ又はそれより多くの部位をもち：ここで、上記の第一結合分子が、上記の１又はそれより多くの部位の少なくとも１つて、上記第二結合分子に対してよりも、他のファミリー・メンバーに対して、より近い相同性をもつものを提供する。

この第一結合分子も、免疫グロブリン又はそれらの誘導体、構造的若トくは機能的類似物であることができる。他のファミリー・メンバー内の等価な部位から構造的に区別される上記のｌ又はそれより多くの部位は、アロタイプの違いを生ずる定常領域内にあることができる・この第一結合分子は、イソアロタイプの抗原決定基を全て含んて成ることかてきる。

上記の第二結合分子は、ＩｇＧ１．１ｇＧ２、［ｇＧ３．１ｇＡ２、ＩｇＥ　、カッパのＬ鎮又はそれらの誘導体、構造的若しくは機能的類似物から成るクループから選ばれることかできる。第二結合分子が［ｇＧＩである場合は、アロタイプの違いは、本明細書中に記載した１又はそれより多くの部位（１）　（２）　（３）又は（１７）に在ることができる。第二結合分子が［ｇＧ２である場合は、アロタイプの違いは、部位（２３）に在ることができる。第二結合分子が［ｇＧ３である場合は、アロタイプの違いは、１又はそれより多くの部位（ＩＩ）　（５）　（１３）　（１４）　（１０）　（６）　（２４）　、（２１）　（＋５）　（＋６）　（２６）又は（２７）に在ることができる。部位（２３）に在ることができる。第二結合分子が１ｇＡ２である場合は、アロタイプの違いは、ｌ又はそれより多くの部位（１）又は（２）に在ることができる。

第二結合分子がカッパのし鎖である場合は、アロタイプの違いは、ｌ又はそれより多くの部位（１）　（２）又は（３）に在ることができる。

上記の部位は、刊行物（例えば、Ｅｕｒ、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　１９７６．６：５９９−６０１を参照のこと。アロタイプのための表記及びヒト免疫グロブリンの関連記号の調査）の中に、よく記載されている。

本発明は、１若しくはそれより多くの賦形剤と一緒になった先に定義された又は本明細書に記載された如き第一結合分子を含んで成る医薬調製物も提供する。この医薬調製物は、前記第一結合分子のカクテルを含んで成ってもよい。

そしてまた、本発明により、先に定義された又は本明細書に記載された如き第一結合分子の生産方法も提供される。

これらの方法は、以下の段階：ａ）上記第二結合分子内で、他のファミリー・メンバー内の等価な部位から構造的に区別されるｌ又はそれより多くの部位を同定すること：ｂ）上記の１又はそれより多くの部位の少なくとも１つて、上記第二結合分子に対してよりも、他のファミリー・メンバーに対して、より近い相同性をもつように、上記の第一結合分子を作ること、を含んで成る。

この第一結合分子は、上記第二結合分子をコードする遺伝子配列を提供すること、及び上記の１又はそれより多くの部位をコードする遺伝子配列のそれらの部分を変更することにより、作られることができる。この遺伝子配列は、オリゴヌクレオチドのプライマーを使用した部位特異的突然変異誘発により変更されることができる。

この変更された遺伝子配列は、クローニング・ベクター又は発現ベクターに取り込まれることができる。この発現ベクターは、細胞を形質転換するために使用されることができる。この細胞は、上記の変更された遺伝子配列を発現するよう誘導されることができる。

それ故、本発明は、上記の変更された遺伝子配列を取り込むクローニング・ベクター及び発現ベクターを提供する。そしてまた、先に定義された発現ベクターにより形質転換された細胞も提供する。

そしてまた、上記第一結合分子を含む細胞培養液及び細胞培養生産物も提供する。ぞしてまた、組み換えにより生産された上記第一結合分子も提供する。

このように、本発明は、定常領域が特定のイソタイプから成り、モして１又はそれより多くのアロタイプ抗原決定基をもつ免疫グロブリン１（鎖の定常領域の一部分又は全体から得ることができるアミノ酸配列を含んで成る分子を提供する。

ここで、上記のアミノ酸配列は、上記定常領域のアミノ酸配列に実質的に相同であるが、そのアミノ酸残基を、アロタイプ抗原決定基の部位で、異なるイソタイプの他の等価な免疫グロブリン定常領域内のその対応位置からのアミノ酸残基と同一にすることにより、上記のアロタイプの抗原決定基の少なくとも１つをもたないように変更されている。

Ｌ記分子は、ヒト免疫グロブリンの定常領域の部分又は全体から得られるアミノ酸配列を含んて成ることかてきる。

上記分子は、」１記アミノ酸配列と一緒になったｌ又はそれより多くのポリペプチドを含んで成ることもできる。

上記ポリペプチドは、機能的な生物学的ドメインを含んて成ることがてきる。このドメインは、何らかの生物学的機能を仲介するようなものであることがてきる。この機能的な生物学的ドメインは、結合ドメインを含んて成ることがてきる。

この結合ドメインは、他のポリペプチドと相互作用する能力をもってあろう。この相互作用は、非特異的又は特異的であってもよい。

上記ポリペプチド、生物学的ドメイン、結合ドメイン、免疫グロブリン様結合ドメイシは、上記定常領域に対して同し源又は異なる源から得ることができる。

上記定常領域は、イソタイプＩｇＧの免疫グロブリン由来のものであってもよい。このイソタイプのサブクラスは、ＩｇＧ＋でることができ、そしてこの分子は、もはや、ｌ又はそれより多くの、アロタイプの抗原決定基ｌ、２．３及び１７をもたなくてもよい。このイソタイプのザブクラスは、１ｇＧ２であってもよく、そしてこの分子は、もはや、アロタイプの抗原決定基２３をもたなくてもよい。このイソタイプのサブクラスは、＋ｇｃ３てあってもよく、そしてこの分子は、もはや、アロタイプの抗原決定基１１．５．１３．１４．１０．６．２４．２Ｉ、１５．１６．２６及び２７をもたなくてもよい。

上記の定常領域は、イソタイプＩｇＡ２の免疫グロブリン由来のものであってもよく、そしてこの分子は、もはや、アロタイプの抗原決定基ｌ及び２をもたなくてもよい。

本発明は、定義された分子を含んで成る医薬調製物も提供する。

本発明は、定義された分子を含んで成る試薬も提供する。

本発明は、定義された分子をコードするヌクレオチド配列も提供する。

本発明は、前記のように届けられたヌクレオチド配列を含んで成るクローニング及び発現ベクターも提供する。

本発明は、先に定義されたクローニング又は発現ベクターを含んで成る宿主細胞も提供する。

本発明は先に定義された分子の調製方法であって、以下の段階（ａ）免疫グＤプリンＨ鎖の定常領域を同定し、（１＋）上記の同定した定常領域内で、アロタイプの抗原決定基の位置を決めるために、その同定した定常領域と、それと同一イソタイプの免疫グロブリンＨ鎖からの定常領域とを比較し。

（Ｃ）アロタイプの抗原決定基をもつ上記の同定された定常領域のためのコート配列を得て。

（ｄ）少なくとも１−）の−に記のアロタイプの抗原決定基をもたない分子をコーＩ・するように、そして、そのアミノ酸残基を、アロタイプ抗原決定基のための部位で、Ｌ記の同定された定常領域のものと異なる、イソタイプの等価な免疫グロブリン定常領域内のその対応位置からのアミノ酸残貼と同一にすることにより、上記のコード配列を変更し。

（ｅ）１−記分子を生産するために、発現系内で、」１記の変更されたコ−１・配列を使用すること。

を含んで成る方法を提供する。

本発明は、先に定義されたような医薬調製物を投与することを含ん１成る、ｗ者の治療方法も提供する。

もちろん、より少ないアロタイプの抗原決定基をもつ分子を作るために使用され得る多くの異なる戦略が存在する。

治療に任用な抗体をコー１−する遺伝子は、一般的に、幾つかの異なる形態の１つにおいて利用可能である。それらは、好適な発現ベクター内に、選ばれたクローン化定常領域ＤＮＡ配列と一緒に再りローンニーンクするのに好適な、それぞれの末端に制限部位をもつクローン化可変領域ＤＮＡ配列として、利用されることができる。

これか、横築物ＴＦ５７−１９、八１ＴＦＩ２＋及び１ｔｌＴＦ１２３のために本明細書に記載された戦略である。あるいは、■及びＣ領域を一緒に含む完全な免疫グロブリンＤＮＡ配列、例えば、完全なヒト化又はヒト抗体のｃＤＮＡのクローンとして、それらを利用することができる。

上記クローン化免疫グロブリンが得られるところの形態がとんなものてあっても、その次の段階は、そのＤＮＡ配列から、その定常領域のアミノ酸配列を予言することである。このＤＮＡ配列は、分子生物学者に馴染みのある・様々な戦略を使用して得られることができる。

上記の予言されたアミノ酸配列は、次に、アロタイプとして変化することが知られているアミノ酸配列についてチェックされるであろう。この配列内に存在するいずれのイソアロタイプも、変更されずに残されることかできる。存在するいかなるアロタイプも、突然変異誘発されることができる。

次の段階は、イソアロタイプを模倣するために、そのアロタイプをどんなアミノ酸配列に突然変異誘発するかを決めることである。

これは、他の免疫グロブリンのイソタイプのその対応領域を用いて、その配列を整列させることにより行われる。全ての既知アロタイプについて、ｌ又はそれより多くの他のイソタイプが、その相同領域のための不変配列をもつことか見出されている。次にこれらの配列の１９が、問題のアロタイプ内に行われるべき変更のための基盤を形成するように選ばれることができる。定常領域のためのアミノ酸配列を予言したとき、現存ＤＮＡのクローンを変更すること、又はこの配列をコートするであろう新たなりＮＡのクローンを創出することか必要である。さらに、これを達成するために、分子生物学者に利用可能な幾つかの戦略が在る。本明細書中に記載された例であるＣＡＭＰＡＴＨ−１１−１構築物の場合には、上記ガンマ−１の定常領域が、λｌ１３ＴＧ１３１一本鎖ファーソ・ベクター内でクローン化された。突然変異原性オリゴヌクレオチドか合成れ、これは、上記の一本鎖に広く相同的であるか、そのクリティカルなアミノ酸のためにコドンを変更する必要のある塩基変化を含んでいる。突然変異誘発を、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｈｉｇｈ　Ｗｙｃｏｍｂｅ、　Ｂｕｃｋｓからの商業的キットを使用して行った。あるいは、上記の予言された配列をコードする完全に人工的な遺伝子を合成することも可能であろう。

一旦突然変異誘発され又は新しく合成されると、この遺伝子は、難なく発現される。利用可能な多くの異なる発現ベクターが存在する。これらの幾つかは、制限された細胞タイプにおける発現に好適である。また、この目的のために発現ベクターを選び、そして改造することは、当業者の標準的な技術の専門知識の範囲にある。本明細書中に記載されたＣＡＩＩＦＡＴ）ｌ−ＩＨの構築の場合には、ｐＳＶｇｐｔ及びｐＳＶｎｅｏの修飾物が使用された。これらのベクターは、リンパ球内での発現を可能にする好適なプロモーター及びエンハンサ−配列に隣接するＤＮＡフラグメントをコードする、免疫グロブリンの可変及び定常領域のために便利なりローエンタ部位をもっている。このベクターは、ＤＮＡフラグメントをコードする可変又は定常領域の、簡単な、独立した、置換を可能にする。このように、幾つかの好適な可変領域が、新たな特異性を生じさせるために、上記ベクター内にサブクローニングされることができ、又は新たなイソタイプ若しくはアロタイプを生しさせるために、この可変領域は、保存され、そしてその定常領域が、交換されることができる。他のヘクター系も難なく利用できる。

アロタイプを全てイソアロタイプに突然変異誘発することにより、Ｈ鎖定常領域からアロタイプを取り除いた場合には、そのし鎖が免疫反応の刺激をもたらすと考えることが好ましい。

最も一般的なカッパＬ鎖のアロタイプは、その一般集団内のＫｍ（３）である。

それ故、この一般的なカッパし鎖のアロタイプを利用することが十分であることができる。なぜなら、この集団の比較的少ないメンバーが、それを外来のものと見るであろうからである。

あるいは、ラムダＬ鎖のアロタイプは、存在しない。それ故、それらは、Ｈ鎖定常領域から得られる脱アロタイプ分子と組み合わせて使用されることができる。

上記のカッパし鎖が利用された場合は、上記アロタイプｋｍ（１，２）が、初めに、アロタイプＫｍ（１）に突然変異誘発されることができよう。このＬ　６ＪＬアロタイプＫｍ（１）は、特定のＨ鎖のクラス及びサブクラスと一緒に、しばしば弱く認識されるにすぎず、そしてそのように、治療的使用において大きな問題を引き起こすことはないであろう。

本発明がより十分に理解されるように、例により、そして限定されることな（、より詳細に、態様を記述する。

以下の図を参照できよう（本明細書中に既に上述した）。

図１は、［ｇＧ抗体の構造を説明し：図２は、ＩｇＧＩ抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨに関してのアロタイプを示し：図３は、ＩｇＧＩ突然変異体の調製を図式的に示し：図４は、１ｇＧ２．３及び４の単一アロタイプ例（これらの他のサブクラスのとれも、ＩｇＧ１アロタイプに関して、同一残基をカバーするアロタイプ残基をもたない）に整列されたＩｇＧＩ　Ｇｌｍ（１，２，１７）のアロタイプ配列を示す。

図５は、クローニング部位及び修飾ポリリンカーを示す、ヒトのガンマ−１定常領域を含むＭ１３ＴＧＩ３１クローニングベクターを示し；図６は、元のＨｕ４ｖＨＨｕＧＩ　ｐＳＶｇｐｔ発現ベクター及びその修飾された変異体を示し：図７は、［ｇＧ＋の特異性についての、突然変異体ｌ、２及び野生型ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨの抗体の異なる濃度をテストするＥＬＩＳＡ検定の結果を示す：図８は、ヒト抹消血液リンパ球を使用した、自動的な補体仲介溶菌テストの結果を示し：そして、図９は、ＣＤ３活性化インターロイキン−２が広まったヒト未分化胚芽細胞のエフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）を使用した、抗体依存性の細胞仲介細胞毒性検定（ＡＤＣＣ）を説明する。

部位特異的突然変異誘発のために使用された出発抗体は、ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨであった、それは、Ｇｌｍ（１，１７）対立遺伝子抗原決定基を担持するＩｇＧ１のためのヒト定常領域配列を含むカッパＬ鎖をもつモノクロナール抗体である。ＩｇＧＩのコード領域の全体は、旧３ベクター内でクローン化された約２．３ｋｂの旧ｎｄｌｌｌ−Ｓｐ旧制限フラグメントとして存在する。クローニング部位及び修飾ポリリンカーを示すヒトのガンマ−１定常領域を含むＭ１３ＴＧ１３１クローニングベクターを図５に示す。

上記のＩｇＧ１コード領域は、コード番号Ｈ３ＩＧＣＣ４の下て、ＥへＩＢＬ配列データヘースにエンターされている。そのアクセス番号は、ＡＣＪＯＯ２２８である（このデータヘースからの印刷結果を付属資料ｌとして本明細書に取り込む）。この配列は、Ｇｌｍ（１，１７）アロタイプのためのものである。これは、上記コート領域の全てを含む５’Ｈｉｎｄｌ１１部位（Ａ）ＡＧＣＴＴから２００９塩基をカッ１−する。しかしなか呟それは、５ｐｈ１部位までの３°非コード領域の幾つかを含んでいない。上記ＥＭＢＬデータヘースにより提供された配列は、上方のＤＮＡ鎖のものである。

ＣＨＩ　ドメインは、ヌクレオチド２１０に始まり、そしてヌクレオチド５０３に終わる。突然変異原性オリゴヌクレオチドＭＯＩ及び問４は、ヌクレオチド４８６〜５１０にハイブリダイズする。ヒンジ領域は、ヌクレオチド８９２に始まり、そしてヌクレオチド９３６に終わる。ＣＨ２１・メインは、ヌクレオチド１４８１に始まり、そしてヌクレオチド１８０３に終わる。突然変異原性オリゴヌクレオチロ１０２は、ヌクレオチド１５１５〜１５４３にハイブリダイズする。

ポリＡ尾のための必須シグナルヌクレオチド１９０２〜１９０８により提供される。

へ１１３ＴＧ１３１内ては、ＩｇＧ１コード領域が、２２６０ヌクレオチドのフラグメントとして存在し、この中で、最後の２５１　ヌクレオチドは、非コードであり、そしてそれ故、必須ではない。従って、本発明の態様は、上記ＥＭＢＬ配列データベースにより提供された配列情報を用いて行うことかできる。しかしながら、上述のＳｐｈ＋制限部位が、上記の３°末端の非必須の非コード領域に存在することは、注目されるべきである。それ故、上記ＥＭＢＬ配列データベースにより提供された配列データが使用された場合は、他の制限部位が、利用されなければならないであろう。

部位特異的突然変異誘発（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｃｏｄｅ　ＲＰＮ、　１５２３．　ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｌｃ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＵＫのキットの形で、供給されるような取扱説明書及び試薬を使用して実施された）を使用して、Ｇｌｍ（１）　前立遺伝子に対応する配列が、［ｇＧのための他のサブクラス内に見つけられたその対応する配列に（ＣＨ３ドメイン内の位置３５６−３５８て、　ＡＳＰ　Ｇｌｕ　ＬｅｕをＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔに）変換された。

使用された突然変異原性オリゴヌクレオチドは、ａ）λＩＱＩ　（Ｇｌｍ（＋７）をＧｌｍ（３）に変換するための）５’　ＣＴＣＴＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＣＴＣＴＴＧ　ＴＣＣＡＣＣＴ　３゜ｂ）　＆Ｉ０２　（Ｇｉｍ（１）をそのイソアロタイプｎＧ１ｍ（１）に変換するための）５°ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＴＣＡ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＣＧＧＧ　ＡＴＧ　ＧＧ　３’　；及び、ｃ）　ＭＯ４（Ｃ旧領域内でＬｙｓをＴｈｒに交換することにより、Ｇｌｍ（３）を取り除く）５°　ＣＴＣＴＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＧＴＣＴＴＧ　ＴＣＣＡＣＣＴ　３’製造者の推奨する取扱説明書に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　８５０　ＬｉｎｃｏＩｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。

９４４０４　ＵＳＡ）により供給された自動合成装置及びオリゴ精製カラムを使用して、上記オリゴヌクレオチドを合成し、そして次に精製した。標準的な取扱説明書に及びキットを使用したＳａｎｇｅｒ　Ｄｉｄｅｏｘｙ配列決定（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、Ｓ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，、（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　７４５４６３）により、突然変異誘発を検査した。この新たに・形成されたアロタイプ配列が全てのヒト内で発見された、このＧｌｍ（１）の変更形態に反応する免疫グロブリンは、存在するはずはない。追加的にそして同様に、Ｇｌｍ（１７）アロタイプ抗原決定基に反応可能なりジン残基を、Ｇ１ｍ対立遺伝子に対応するアルギニン残基に変換した（ｌｙｓ　２１４−Ａｒｇ；突然変異体ｌ）。

これらの３つの交換基を担持する突然変異体の、この新たな定常領域のための遺伝子を配列決定し、ＣＡＡＩＰＡＴＩ−ＩＩ（のＶ−領域を含む発現ベクターに取り込み、そして共同トランスフェクションにより導入されているＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨのし鎖と一緒に発現させた。

Ｉ　ｇＧ２と等価であり、そして抗−Ｇｌｍ（１７）及び抗−Ｇｌｍ（３）抗血清の両方と反応できないはずであるＨ鎖を作るために、突然変異体ｌのＧｌｍ（３）と関係するクリティカルなアルギニン残基をトレオニン残基により置き換えることにより、さらなる突然変異体を作った（突然変異体２）。

突然変異体２も配列決定し、ＣＡＡＩＰＡＴＩ（−１１−１のし鎖を含む発現ベクター内て再クローニングした。

この２つの突然変異体のどちらかを含む増殖培養液の上澄みを、次に、ヒｌｉｇＧ＋のカッパ生産物の発現について分析した。

上記突然変異誘発は、上記のオリゴヌクレオチドにより、導入された。図６に示す修飾されたＨｕ４ｖＨＧｌｐＳＶｇｐｔベクターを、２つの異なる”付着末端 ”ｂａｍ旧及びＮｏｔｌの使用の可能性のために、上記突然変異誘発ての上記発現ベクターへのサブクローニングを単純化するために使用した。発現ベクター並びに■８領域の配列及び、ＹＯプラット形質細胞腫細胞内でのし鎖と一緒になった発現は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎＬ、、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｍ、Ｒ，Ｗａｌｄｍａｎ　Ｈ，、Ｗｉｎｔｅｒ　Ｇ、　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３２．３２３− ３２７に記載されたものと全て同じである。

それらのアロタイプ及び生物学的なエフェクター機能を決定するための生物検定のだ・めの精製抗体を得るために、その陽性培養液から、大量のＩｇＧ１生産物の生産者を選択した。

例ｌＩｇＧ１タイプの抗体が上記突然変異体により生産されることを確認するために、Ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　１ｍｍｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ（ＥＬＩＳＡ（エリザ））を行った。抗−ＣＡｌｔｌＦＡＴ）Ｉ−イディオタイプ抗体（ＹＩＤＩ３．９）により被覆されたマイクロタイター・プレートを使用して、これをテストした。野生型ＣＡＭＦＡＴ）ｌ−１１−１抗体が対照として役立った。ビオチンをラベルされ抗ヒト・カッパ試薬又は抗ヒト［１ｇＧ試薬（それぞれ、モノクロナールＮＨ３／４１及びＮＨ３／＋３０　、但し、他の好適な試薬が、一般的に利用できる）により検出し、そして次にストレプト・アビジン・ワサビダイコン・ペルオキシダーゼにより発色させた。図７は、ＴＦ　５７− １９（”野生型”ＣＡＡＩＰＡＴＩ−ＩＨ抗体、○）八ＩＴＦ１２１（突然変異体ｌ、△）八ＩＴＦ　１２３　（突然変異体２、口）及び、標票として既知量の野生型ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ（マ）について、得られた結果を説明する。この濃度を推定し、そして出発希釈液をＰＢＳ／１０ｍｇ／ｍ１ＢｓＡ中で５０μｇ／ｍｌに調整した。この出発希釈液を８回の２倍希釈液を調製するために使用した。

このグラフの傾きは、ＣＡＭＰＡＴＨ−イディオタイプ抗体が、野生型ＣＡＡＩＰＡＴＨ−ＩＨのものと等しい程度まで、突然変異体ｌ及び２を認識すること、並びにテストされた全ての３つの抗体が、上記標準と同じ濃度で存在することをはっきりと示している。

例２突然変異体の、補体により仲介された、抹消血液リンパ球の自動的な溶菌能力をテストした。

健康なドナーからのヒト抹消血液単核細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ”グランエンド（Ｎｙｅｇｇａｒｄ　＆　Ｃｏ、、　ＡＳ、　０ｓｌｏ、　Ｎｏｒｗａｙ）上て、６０ｍ１の脱フィブリン血液から単離した。この細胞ペレットをｌＡＩＤＭｌｓｃｏｖｅ’　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ、　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　５ｃｏｔｌａｎｄ）内で洗浄し、そしてその細胞を、Ｓ　Ｉ　Ｃｒにより、ラベルした。このテストで使用した抗体の出発希釈液は、ＰＢＳ、　ＩＯｕ　ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ中、５０μｇ／ｍｌであった（希釈液１）。希釈液１を、さらに、２倍希釈液を８回、希釈し、Ｉ／＋２８の最終希釈液とした。上記と同し方法で希釈された野生製抗体を対照として使用した。

結果を図８に示す。見られる如く、両方の抗体変異体は、上記血液単核細胞の溶菌において、野生型と非常に近い結果を示した。上Ｂ代突然変異体の効果は、はとんと同しである。

例３上記の突然変異体抗体が、エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）としての、ＣＤ３により活性化されインターロイキン−２により拡大されたヒト未分化胚芽細胞を使用した抗体依存性・細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ）の能力があるか否かを、調査するために、実験を行った。細胞を増殖させ、そしてＲｉｅｃｈｍａｎｎ　Ｌ、、　Ｃ１ａｒｋ　Ｍ、Ｒ，、Ｗａｌｄｍａｎｎ　Ｈ，、ｌ’／１ｎｔｅｒＧ、、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３２２．３２３−３２７に記載されたように、本質的に、エフェクター及び標的の両方として使用した。

標的細胞（Ｔ）の調製５ｍｌの未分化胚芽細胞（３ｘ　１０　’細胞）を、Ｓ　Ｉ　Ｃｒにより１時間、ラベルした。１時間後、この細胞を洗浄し、そして１００μｍのＩＭＤＭ１％ＢＳＡ内の６つの等しい部分として、突然変異体ｌ及び２並びに対照の抗体１００μｍを含む６　Ｘ　１０　ｍｌの試験管に移した。この試験管を室温で１．５時間、インキュベートした。この細胞を１０ｍ１のＩ＆ＩＤλ１１％ＢＳＡて洗浄し、そして１．５ｍｌの１ＡＩＤＩｔ１１％ＢＳＡに再懸濁した。

エフェクター細胞（Ｅ）の調製ラベルされていない未分化胚芽細胞（２Ｘ　１０　”）を、［ＭＤＭ　Ｉ％ＢＳＡ培地中て、１００：Ｉ及び３０１に希釈した。この比ｔｏｏ：Ｉ及び３０．１を本検定におけるエフェクター／５１Ｃｒラベル標的の最終的な絶対比とした。

検定ｗｅｌｌ当たり全量２００μｌをもつマイクロタイター・プレート内で、検定を行った。このように、２　Ｘ　１０’の濃度の標的１００μｌを、すなわち２　ｘ　１０３の全細胞をそれぞれのｗｅｌｌに移した。１００・ｌのＥＴのために、２　Ｘ　１０’のエフェクター１００μ＋をｗｅｌｌ当たりすなわち２　ｘ　１０５ブレーテイングした。３０１のＥ：Ｔのために、６Ｘ　１０５のエフェクター１００μｌを、すなわち６　ｘ　１０’の全細胞をそれぞれのｗｅｌｌに移した。

比５ｌＣｒ放出の効果の百分率を、以下のように計算した。

％比Ｃｒ放出・（テスト放出ｃｐｍ−自然ｃｐｍ）　ｘ　１００（全ｃｐｍ−自然ｃｐｍ　）ｃｐｍ・カウンター上で測定された１分間当たりの放射能カウント結果を図９に示す。この図は、全てのテストされた抗体が、クロムを放出することを示している。野生型ＴＦ　５７−１９及び突然変異体２（ＭＴＰ１２３）は、はとんと同じレベルで放出した。しかしながら、突然変異体１（ＭＴＦ１２１）は、わずかに高い放出を示している。

これらの結果は、上記突然変異体が、野生型ＣＡＩＩＰＡＴＨ−ＩＨ抗体に比へて生物学的な活性をもっていることをはっきりと示している。

例４０ｘｏｉｄ（Ｗ）１０／［ＶＩＳＳ認可剤、試験コード番号６０２７）からのモノクロナール試薬を使用した、それらのＧｌｍ（３）アロタイプの反応性に特異的な検定において、上記抗体をテストした。これらのテストを、２回繰り返して行った。

抗＝ＣＡＭＰＡＴＨイディオタイプＹＩＤＩ３．９．４抗体キャプティブ（ｃａｐｔｉｖｅ）により、マイクロタイター・プレートを被覆し、そして３列の４　ｘ　４　ｗｅｌｌに分割した。この３列のそれぞれに、ＰＢＳ　Ｉ％ＢＳＡ中の、４％５倍希釈の抗体ＴＦ５７−１９　、ＭＴＦ　１２１及びＭＴＦ１２３（５０ｔｔ　ｇ／ｍｌ）並びにＰＢＳ／ＢＳＡの対照溶液のそれぞれを添加した。

室温で４５分間インキュヘーション後、上記抗体溶液を取り出し、そして、（ｉ）第一列に、１５００希釈のビオチン・ラベル抗−Ｇ１ｍ（３）を加え。

（１１）第二列に、カッパし鎖に特異的な１１００希釈のビオチン・ラベル抗体（ＮＨ３／旧）を加え、そして、（ｉｉｉ）第三列に、ヒトＩｇＧ１に特異的な１　：　１０００希釈のビオチン・ラベル抗体（ＮＨ３／１３０）を添加する。

ストレプト・アビジン・ワサビダイコン・ペルオキシダーゼにより、上記マイクロタイター・プレートを発色させた。

この結果を表１に説明する。本結果の数値は、１００倍した、ＥＬＩＳＡプレート・リーダーにより測定された吸光度（０，Ｄ）を表し、すなわち、１２は、０，１２の０．０を、そして７０は、０．７０の０．Ｄを表している。

この結果は、サンプル１〜３が全て、ＩｇＧ１（前記の例１も参照のこと）及びカッパし鎖に特異的な抗体と反応することをはっきりと示している。対照は、陰性である。しかしながら、Ｇｌｍ（３）特異性についての検定においては、ＭＴＦ１２１（突然変異体ｌ）のみが反応性を示し、一方、野生型ＴＦ５７−１９　、八１ＴＦＩ２３（突然変異体２）及びＰＢＳ／ＢＳＡ対照は、いかなる反応も示さなかった。

この結果は、上記アロタイプ反応において認識された部位をこれらの部位の部位特異的突然変異誘発により取り除くことがアロタイプの免疫反応の問題を克服できることを、はっきりと説明している。

本例は、ＩｇＧ＋のみの突然変異誘発に言及したものであるけれども、者には明らかであろう。

例５赤血球凝集抑制を使用した従来のアロタイプ実験において、上記抗体をテストした。Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ、　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　５ｅｒｖｕｓｅ（ＰＯＢＯＸ　９１９０．１００６　ＡＤ　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により供給された試薬を使用して、本実験を実施した。

ヒト血液０型ＲＨ（Ｒｈｅｓｕｓ　Ｄ）の赤血球を洗浄し、そして次に、以下に記すように、既知アロタイプ抗体をもつ以下の３つの関連抗−ＲｈＤヒト血清の中の１つにより、部分を別々にラベルした。

（１）抗−Ｄ　Ｇｌｍ（ａｚ）　＝　Ｇｌｍ（１，１７）（２）抗−Ｄ　Ｇｌｍ（ｘ）　＝　Ｇｌｍ（２）（３）抗−Ｄ　Ｇｌｍ（ｆ）　□　Ｇｌｍ（３）抗− Ｒｈ抗体による赤血球細胞の被覆詰められて洗浄された赤血球細胞の１容を、３７°Ｃて６０分間、４容の抗−Ｒｈ血清及び４容の（リン酸塩）バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）と共にインキュベートした。１５分毎に振とうにより上記細胞を混合した。

インキュヘーション後、被覆細胞をＰＢＳにより４回洗浄し、そして保存液中に４°Ｃて保存した（但し、被覆赤血球細胞は、１週間ＰＢＳ中に４°Ｃて保存することができる）。

次に、それぞれの抗血清のための推奨希釈を使用して、以下のＩｇＧ１アロタイプに対する４つの抗血清により、これらの被覆赤血球細胞を凝集させた。

（１）抗−Ｇｌｍ（ｚ）−抗−Ｇｌｍ（＋７）　ｌ／３０希釈（２）抗−Ｇ踊（ａ）　＝抗−Ｇ１ｍ（１）　１／３０希釈（３）抗−Ｇｌｍ（Ｘ）　”抗−Ｇｌｍ（２）　ｌ／２０希釈（４）抗−Ｇｌｍ（ｆ）−抗−Ｇｌｍ（３）　１／３０希釈野生型ＣＡｈｌＰＡＴＨ−ＩＨＴＦ５７−１９又は変更ガンマ−１定常領域をもつ異なるＶＡ八へＰＡＴＨ−ＩＨ構築物（ＭＴＦＩ２１　、　ＭＴＦ１２３）を、前記抗血清による前記赤血球の凝集阻害に対するそれらの能力について、次にテストした。

この阻害抗体を、５％のウシ胎児血清を含むリン酸塩バッファー生理食塩水中の０．５　ｍｇ／ｍｌ　、０．２５ｍｇ／ｍｌ及び０．１２５ｍｇ／ｍｌ　の濃度で、用いた。アロタイプＧ１ｍ（ｚａｘ）又はＧｌｍ（ｆ）　［Ｇｌｍ（１，１，１７）若しくはＧｌｍ（３）１のＩｇＧ１を含む対照血清も、本実験に含み、そしてｌ０１２０及び４０分の１に希釈して使用した。それが生じたところでは、阻害は、上記ＣＡ八へＰＡＴＨ−ＩＨ抗体についてぼ０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、最も容易に見られ、そして０．２５ｍｇ／ｍｌについては非常に弱（、そして０．１２５ｍｇ／ｍｌでは全く阻害が見られなかった。・　対照血清は、テストした３つの希釈の全てて阻害された。最も高い濃度についての結果を以下に示す。

アロタイプ　ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ構築物　対照血清ＴＨ５７−＋９　ＭＴＦ１２１　ＭＴＦ１２３　Ｇｌｍ（１，２，１７）　Ｇｌｍ（３）上記結果は、それ故、アロタイプＧ１ｍ（１，１７）をもつ元の野生型ＣＡ八ＩＰＡＴ）１−ＩＨ抗体ＴＦ５７−１９と一致する。新たな突然変異体λＩＴＦ１２１は、アロタイ ″ｊ、Ｇ１ｍ（３）をもつが、突然変異体ＭＴＦＩ２３は、ＩｇＧ＋のアロタイプ源であるＧｌｍ（１，２，３，１７）のいずれのためのアロタイプをもつことがなく、すなわち、［ｇＧｌのアロタイプをもたないよってある。

当業者は、標準的な技術に従い、医薬製造のために、本明細書により提供される結合分子を使用することができるであろう。同様に、標準的な手順に従って、この医薬を使用することができる。

表１付属資料ｌ−シート（ａ）Ｈ３［ＧＣＣ４２００９塩基ヒトミｇ生殖細胞系ｇ−ｅ−ａ　領域ａ：ガンマー１定常領域１０　ＨＳＩＧＣＣ４標準：　ＤＮＡ：　ＰＲＩ：　２００９　塩基対ＡＣＪＯ０２２８；ＤＴ　１９９０−４−２３（最新の参照）ＤＴ　１９９０−７−１８（取り込み）ＤＥ　ヒト１ｇ生殖細胞系ｇ−ｅ−ａ　領域ａ：ガンマー１定常領域ＢＫＷ　定常領域；ガンマ−免疫グロブリン：生殖細胞系；ＫＷ　ヒンジｅｘｏｎ　：免疫グロブリン；免疫グロブ、リンＨ鎖ＷＯ８ホモ種（ヒ１−）Ｏ３真核生物；後生生物並界、を椎動物門：を椎動物亜門：四肢、唾乳類、真獣亜綱：霊長類ＲＮ［１］（塩基１−２００９）ＲＡ　ε１ｌｉｓｏｎ　ＪＡＶ、、　Ｂｅｒｓｏｎ　Ｂ、Ｊ、、　Ｈｏｏｄ　Ｌ、Ｅ、　：ＲＴ　”、ヒト免疫グロブリンＣ−ガンマ−１遺伝子の核酸配列”。

ＲＴＲＬ　核酸Ｒｅｓ、　ｌｏ：４０７１−４０７９（１９８２）ＲＮ　［２］（塩基４６９−１０７０　、＋４５６−１８２１）ＲＡ　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｎ、、　Ｕｅｄａ　Ｓ、、　０ｂａｔａ　Ｍ、、　Ｎ１ｋａｉｄｏ　Ｔ、。

ＲＡ　Ｎａｋａｉ　Ｓ、、Ｈｏｎｊｏ　Ｔ、：ＲＴ　”ヒト免疫グロブリンガンマ遺伝子の構造。

ＲＴ　遺伝子ファミリーの進化に関する含み”。

ＲＬ　細胞２９：６７１−６７９（１９８２）ＣＣ［＋］及び［２１は、４つのガンマ遺伝子間のヌクレオチドの相ＣＣ違が、他の場所よりもヒンジ領域内でより大きいことを報告ＣＣしている。［２］は、ガンマ−２、ガンマ−３、ガンマ −４、ガンマＣＣ擬遺伝子、並びにガンマ遺伝子の５゛フランキング、ｃｈ２及びＣＣｃｈ３　ドメインのヒンジ領域も報告している。

ＣＣＣＣ本エントリーは、ガンマ−３、ガンマ−１、擬エブンロン及びアＣＣルファ −１遺伝子を含む多重遺伝子領域（領域ａ）の一部てあＣＣる。より多くのコメントについてはセグメントｌを見よ。

キー　場所／限定ＦＴ　ＣＤＳ　２１０．．５０３ＦＴ　／ｎｏｔｅ□”　Ｉｇガン？−Ｉ　Ｈ鎖付属資料１−続きシート（ｂ）ＦＴ　ｃ−領域ｃｈｉ　ドメイン（２１２てのａａ）”ＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　５６３．．５６３ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ＝（［１］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝”Ｔ　ｉｎ　ＩＩ］：　ｃ　ｉｎ　［２ドＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　５９３．．５９３ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ（［１］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ□”ｃ　ｉｎ　［１］；　ｔ　ｉｎ　［２ドＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　６１４．．６１４ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ□（［１］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝”Ｇ　ｉｎ　［１］；　ａ　ｉｎ　［２Ｊ”ＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　６３３１．６３３ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ（［＋］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝”Ｇ　ｉｎ　［１］；　ｇｇ　ｉｎ　［２ドＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　６４３．．６４３ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ（［＋］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ□ ”Ｇ　ｉｎ　［１］：　ａ　ｉｎ　［２］”ＦＴ　、ｃｏ口ｆｌ　ｉｃｔ　６５４．．６５４ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ□（［１］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝−Ｇ　ｉｎ　［＋］＋　ａ　ｉｎ　［２ドＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　６８４．．６８４ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ（［１］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝ ”Ｃｉｎ　［１］：　ｃｃ　ｉｎ　［２ドＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　６９２．．６９２ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ・（［１］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝” Ｇ　ｉｎ　［１］：　ａ　ｉｎ　［２］”ＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　７６５．．７６６ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ（［１］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ□−Ａａ　ｉｎ　［１］：　ａ　ｉｎ　［２ドＦＴ　ＣＤＳ　８９２．．９３６ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝”　［ｇ　ガン７−Ｉ　Ｈ鎖ＦＴ　ｃ−領域ヒンジ” ＦＴ　ＣＤＳ　１０５５．、ｌ３８４ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝”　Ｉｇ　ガン？−Ｉ　Ｈ鎖ＦＴ　ｃ−領域ｃｈ２　ドメインＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　１４７５．、Ｉ４７５ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ（［＋］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ−−Ｃｉｎ　［１］；　ｃｃ　ｉｎ　［２，ドＦＴ　ＣＤＳ　１４８１．、＋８０３ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝”　Ｉｇ　ガン？−Ｉ　Ｈ鎖ＦＴ　ｃ−領域ｃｈ３　ドメインＦＴ　ｃｏｎｆｌｉｃｔ　１５７８．．１５７８ＦＴ　／ｃｉｔａｔｉｏｎ（［１］、　［２］）ＦＴ　／ｎｏｔｅ＝”Ｔ　ｉｎ　［１］：　ｃ　ｉｎ　［２ドＳＱ　＋配列２００９塩基対：　４１８　Ａ：　６９８　Ｃ：　５６６　ｃ；　３２７　Ｔ：　０他。

Ｑ付属資料ｌ−続きシート（ｃ）付属資料１−続きシート（ｄ）国際調査報告ｆｃｔｍ　ＰＣＴ／ｌ５ｋｎＩＯｌ＊ｕ＋＋９請盲１１ａ闇制御２１１　、　Ｐｋｌ　２８０Ｖ９＋国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　５／１０１５／１３　ＺＮＡ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８Ｃ１２Ｒ１：９１）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．定常領域が、特定のインタイブのものであり、そして１又はそれより多くのアロタイプ抗原決定基をもつ、免疫グロブリンＨ鎖の定常領域の一部分又は全体から得られるアミノ酸配列を含んで成る分子であって、上記アミノ酸配列が、上記定常領域のアミノ酸配列に実質的に相同であるが、そのアミノ酸残基を、アロタイプ抗原決定基の部位で、異なるインタイプの他の等価な免疫グロブリン定常領域内のその対応位置からのアミノ酸残基と同一にすることにより、上記アロタイプ抗原決定基の少なくとも１つをもたないように変更されているような分子。
２．ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部分又は全体から得られるアミノ酸配列を含んで成る、請求項１に記載の分子。
３．上記アミノ酸配列と一緒に、１若しくはそれより多くのポリペプチドを含んで成る、請求項１又は請求項２に記載の分子。
４．上記ポリペプチドが、機能的・生物学的なドメインを含んで成る、請求項３に記載の分子。
５．上記の機能的・生物学的なドメインが、結合ドメインを含んで成る、請求項４に記載の分子。
６．上記結合ドメインが、免疫グロブリン様の結合ドメインである、請求項５に記載の分子。
７．上記免疫グロブリン様結合ドメイン及び上記アミノ酸配列が、同一の又は異なる源から得られる、請求項６に記載の分子。
８．上記の定常領域が、インタイプＩｇＧの免疫グロブリン由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子。
９．上記インタイプのサブクラスがＩｇＧ１であり、そしてその分子が、もはや、１又はそれより多くのアロタイプ抗原決定基１、２、３及び１７をもっていない、請求項８に記載の分子。
１０．上記インタイプのサブクラスがＩｇＧ２であり、そしてその分子が、もはや、アロタイプ抗原決定基２３をもっていない、請求項８に記載の分子。
１１．上記インタイプのサブクラスがＩｇＧ３であり、そしてその分子が、もはや、１又はそれより多くのアロタイプ抗原決定基１１、５、１３、１４、１０、６、２４、２１、１５、１６、２６及び２７をもっていない、請求項８に記載の分子。
１２．上記の定常領域が、インタイブＩｇＡ２の免疫グロブリン由来であり、そしてその分子か、もはや、アロタイプ抗原決定基１及び２のいずれか又は両方をもっていない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子。
１３．請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分子を含んで成る医薬調製物。
１４．請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分子を含んで成る試薬。
１５．請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分子をコードするヌクレオチド配列。
１６．請求項１５に記載のヌクレオチド配列を含んで成る、クローニング又は発現ベクター。
１７．請求項１６に記載のクローニング又は発現ベクターを含んで成る、宿主細胞。
１８．以下の段階；（ａ）免疫グロブリンＨ鎖の定常領域を同定し；（ｂ）その同定された定常領域内でアロタイプ抗原決定基の位置を決めるために、その同定された定常領域と、それと同一インタイプの免疫グロブリンＨ鎖からの定常領域とを比較し：（ｃ）アロタイプ抗原決定基をもつ上記の同定された定常領域のためのコード配列を得て；（ｄ）少なくとも１つの上記アロタイプ抗原決定基をもたない分子をコードするように、そして、そのアミノ酸残基を、アロタイプ抗原決定基のための部位で、上記の同定された定常領域のものと異なるインタイプの等価な免疫グロブリン定常領域内のその対応位置からのアミノ酸残基と同一にすることにより、上記コード配列を変更し；（ｅ）上記分子を生産するために、発現系内で、上記の変更されたコード配列を使用する；を含んで成る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分子調製方法。
１９．請求項１３に記載の医薬調製物を投与することを含んで成る、患者の治療方法。