JPH06507716A - Ｈｌａ型判定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ）ＩＬＡ型判定 技術分野 本発明の技術分野はＨＬＡ型判定に関する。

背景 種々の理由のためにヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を型判定できることに実質的な興 味が存在する。多くの情況において、特定の肛Ａ対立遺伝子が特定の疾病に対す る敏感性に関連していることが見出された。

たとえば、１（ＬＡ−、Ｂ２７は、強直性を髄炎及び関連する疾患に関連してい る。宿主に器官を移植する場合、その器官は拒絶の危険性を最少にするために、 適合されることが所望される。　ＨＬＡ型判定はまた、系統、疫学及び同様のも のを決定することにも通用できる。

クラス■及びクラス■に分けられるＨＬ＾抗原の広範な種類が存在する９個々の クラスにおいては、多型性領域が存在する。それらの部位は、特定のＨＬＡ対立 遺伝子に対して特異的であり、そして他のＨＬＡ対立遺伝子とそのＨＬ＾対立遺 伝子とを区別できる抗血清又はモノクローナル抗体の調製を可能にするであろう 、免疫応答を誘発するであろうエピトープを供給できるし、又は供給できないか も知れない。

この情況は、肛Ａ−８７又は他のＨＬＡ対立遺伝子と交差反応しないように、Ｈ ＬＡ−８２７に対して特異的であるモノクローナル抗体が容易に利用できない、 ＨＬＡ−Ｂ　２７とＨＬＡ−ＢＴとの間の交差反応性により例示される。

哺乳類は二倍体であるので、特定のグループの個々に関してＨＬＡ抗原の対が存 在するであろう、従って、特定のＨＬＡ対立遺伝子を特異的に決定できない場合 、２種の異なった対立遺伝子が存在するか、又は交差反応を観察するかいづれか を確かめることはできない、従って、実質的な交差反応性が他のＨＬ＾対立遺伝 子に関して観察される、特定のＨＬＡ対立遺伝子の正確な検出を可能にするであ ろう方法を開発することに実質的な興味が存在する。

Ｘ産文藍 Ｓａｋａｇｕｃｈｉ　など、、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍ−ｕｎｏｌｏｇｙ、２１　：　 １９３　〜２０７（１９８Ｂ）　は、肛＾−８２７の決定におけるモノクローナ ル抗体の使用及びＩＴＬＡ−８２７の検出のための二重決定イムノアッセイを記 載する。　Ｖｉｌｌａｒなと、。

Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｉｗｍｕｎｏｌ、　１９　：　１８３５〜３９（１９８９）は、 種々の源からのクラス１分子の検出を記載する。　Ｔｏｘｉａｄｉｓ　ａｎｄ　 Ｇｒｏｓｓｅｌｌｉｌｄ、　ＶＯＸ　Ｓａｎｇ　５６　：Ｉ９６〜９９（１９８ ９）は、ＨＬＡクラスＩタンパク質の検出を記載する。

Ｆｅｒｒｅｉｒａなど、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｎ、　Ａｃｔａ、　１７４　： 　２０７〜ＩＨ１９８８）は、血清における肛ＡクラスＩ抗原の検出のためへの 固相酵素イムノアッセイの使用を記載する。

発明の要約 ２種のタンパク質問を区別するレセプターが利用できない、多望性タンパク質の 正確な検出のための単純な早い方法論が提供される。

たとえば、抗体は、ＨＬＡ−Ｂ７とＨＬＡ−Ｂ２７との間を容易に区別しない。

ＨＬＡ−８２７は、肛＾−Ｂ７と反応するが、しかしＨＬＡ　Ｂ２７とは反応し ないモノクローナル抗体を用いてＨＬＡ−８７を除去し、そして旧、＾−８７及 び−Ｂ２７に対して特異的な高い親和性のモノクローナル抗体により旧、Ａ−８ ２７について溶出液をアッセイすることによって検出される。

特定Ｂ樺の記載 サンプル中の２種の多望性抗原の１種の正確な検出のための方法及び組成物が提 供され、ここで前記抗原は２種の抗原間を区別するための有用なレセプターを有 さないことにより特徴づけられ、そして前記抗原は多くのグループの抗原、通常 実質的に１０以上の抗原のメンバーであり、そして多くのエピトープと共有する ことにおいて抗原間に実質的な交差反応性が存在し、そして抗原間の差異は１つ のみ又は数個のアミノ酸を包含するなど微妙である。典型的なこの情況は、ＨＬ Ａ−８２７の検出であり、ここで本発明は方法を実施し又は結果を検出するため の特別な装置を特に必要としないで、単純且つ効果的な手段を提供する。前記方 法は、サンプル、特に血液サンプル又はそれに由来するサンプルからのＨＬＡ− Ｂ７抗原を非−妨害レベルに特異的に消耗せしめるように、結合成分、通常モノ クローナル抗体を第１段階として使用する０次に、得られるＨＬＡ−８７消耗媒 体が、Ｂ２７及びＢ７に対して高い親和性を有する第二結合成分、通常モノクロ ーナル抗体と共に組合される。結合成分と存在するいづれかのＢ２７との間での 免疫複合体の形成は、サンプル中に可溶性Ｂ２７の存在を示す場合に検出される 。

標的抗原に結合し、又は異なったＨＬ＾対立遺伝子に関して必要な相違点を有す るいづれかの結合成分が使用され得る。結合成分は、抗体、いづれかのイソタイ プ、たとえばＩｇＧ、　ＺｇＭ、等そのフラグメント、たとえばＦａｂ、　Ｆ（ ａｂ　’　）ｚ、　Ｆｖ、等、結合ペプチド、Ｔ−細胞レセプター又は同様のも のを包含する。大部分、モノクローナル抗体が最っとも便利であるが、交差反応 性の問題を例示し、ここでその問題とは、ＨＬＡ−８２７に関する利用できるモ ノクローナル抗体がこの対立遺伝子と他の対立遺伝子とを特異的に区別すること ができないことである。モノクローナル抗体に関して、類似する交差反応性を有 する他の結合成分が置換され得ることが理解される。

第１段階において、サンプル、通常血液、血清、血漿又は尿が、従来の処理、た とえば緩衝液における稀釈、ｉｌｌ縮、濾過又はいづれの特定の分離をも包含し ない他の全体的な処理にゆだねられ得る。

サンプルは比較的小さく、一般的には約１μｍ以下でなく、そして一般的には約 ５００　μｍを越えず、一般的には約１０〜２００μｌの範囲内で存在する。稀 釈は通常５倍以上でなく、より通常には２倍以上ではなく、そして濃縮は通常必 要でないであろう。

次に、サンプルがＨＬＡ−８７と反応性であるが、しかしＩＩＬＡ−８２７とは 有意に反応せず、但しいづれか他のＩ（ＬＡ対立遺伝子と交差反応することがで きる抗体と接触せしめられる。抗体のための有意な要因は、それがＨＬＡ−Ｂ７ とＨＬＡ−Ｂ　２７とを区別することができることである。この能力を明白に有 する多くの抗体は満足のいくものであることがわかっていないが、＾ＴＣＣカタ ログ及び他の貯蔵のカタログに多くの満足する抗体が存在する。適切な場合、精 製されたポリクローナル抗血清が使用され得、ここで前記抗血清は）ＩＬＡ−８ ７に応答して調製され、そして次にＨＬＡ−Ｂ７とＨＬＡ−Ｂ２７との間で交差 反応性であるいづれかの抗体が除去される。これは、支持体、たとえばアガロー ス、５ｏｐｈａｄｅｘ＋　ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ナイロン膜又は同 様のものにランダムに結合される。ＨＬＡ−８２７を含んで成るアフィニティー カラムに前記抗血清を通すことによって達成され得る。

次に、溶出液が、可溶性ＨＬＡ−８２７に結合するその能力について分析される 。

サンプルが、支持体に結合される抗−ＨＬＡ−８７を含んで成るアフィニティー カラムに通され、抗−旧、Ａ−８７と共に直接的に、ビーズ又は粒子、たとえば 磁気粒子に共有又は非共有結合される抗−１１ＬＡ−Ｂ７と共に間接的に混合さ れ、抗−ＨＬＡ−８７と共に混合され、そしてカラム、マイクロタイターウェル 、又は他の容器のいづれかにおいて、支持体に結合される抗−マウスＩｇ抗体と 接触せしめられ、又は抗−ＨＬＡ−ＢＴと共に混合され、リガンド、たとえばビ オチンにより接合され、次に上記のように支持体に結合されるアビジン又はスト レプタビジン（“ストレプト／アビジン”）に接触せしめられ得る。（ここで、 “直接的に又は間接的に”とは、問題の分子、たとえば抗−肛＾−Ｂ７が、固体 支持体に直接的に、たとえばスペーサーアームを通して共有結合され、又は固体 支持体に直接的に結合される中間体分子、たとえば問題の分子に対する抗体に結 合されることを意味する。）個々の情況において、混合物は、抗−１（ＬＡ−８ ７の実質的な複合体形成及びサンプル媒体からのＨＬＡ−８７−抗−ＨＬＡ−Ｂ ７複合体の分離を提供するために十分な量の抗−ＨＬＡ−８７を使って十分な時 間、接触せしめられ、又はインキュベートされる。

支持体、便利にはポリサツカリド、より特定には５ｅｐｈａｒｏｓｅに結合され るレセプターを用いてのアフィニティーカラムの使用が特定の興味の対象である 。　５ｅｐｂａｒｏｓｅは、いづれか便利な手段、たとえば臭化シアン、カルボ ジイミド、ブロモアセチル、ｐ−カルボキシフェナシルプロミド又は同様のもの により活性化され得る０次に、レセプターは、支持体に結合される官能価の性質 に依存して、従来の手段に従って支持体に結合され得る。臭化シアン及び他の活 性ハリドは活性化のために必要ではないが、ところがカルボキシル基はカルボジ イミドにより活性化され得る。活性化された支持体と抗体との反応の後、いづれ かの未反応官能価が、アルカノールアミン、たとえばエタノールアミンにより停 止され得る。抗体の量は一般的にバックされたゲル０．５１当たり約０．２〜２ ■であろう。

他方、抗−１’１ＬＡ−Ｂ７抗体により被覆された１〜５μの磁気ビーズ（１０ ”〜１０７個のビーズ）が、血清検体１００μｍと共に周囲条件下で５〜３０分 間インキュベートされる。ビーズは、磁気フィルター、ソレノイド又は同様のも のを用いて分離され得る。

サンプルが存在しているいづれかの）ＩＬＡ−８７を少なくとも実質的に消耗さ れた後すぐに、サンプルはＢ２７の存在についてアッセイされ得る０種々のアッ セイがＨＬＡ−８２７の存在の検出のために使用され得る。多くの５ＴＡＴアツ セイ方法が所望により使用され得る。　１９９１年１月２３日に出願されたアメ リカ特許出願番号第６６４，９４１号に記載されるような５ＴＡＴ試験カートリ ツジの使用が特に興味の対象である。

このアッセイは、非多孔性領域により分離される測定領域を有する多孔性フィル ターを用いる。フィルター又は膜は、サンプルを吸収するように作用し、そして 膜を通してサンプルの流れを提供する吸着剤層により支持される。所望には、膜 及び吸着剤層は、種々の特徴を有する流れ調節層により分離される。膜の性質に 依存して、膜は、膜の孔サイズを実質的に減じるであろう、被膜により流体が存 在する側上で被覆され得る。

種々の膜が使用され得る。但し、ガラス繊維膜及びナイロン膜が他のタイプの膜 よりも実質的に卓越しているように見えることが見出された。便利には、ガラス 膜が、アッセイ工程を妨害しないが、しかし所望する流速を提供するアクリルポ リマーにより噴霧され得る。適用されるアクリルポリマーの量は実験的に決定さ れ得るが、但し、一般的には、その量は約０．１〜１■／ｃｌＩｚの範囲であり 、そしてガラス膜は約０．２〜５μの範囲の孔サイズを有する０種々の層領域の 分離は、非多孔性テープ又は他の便利なバリヤーを用いることによって達成され 得る。さらに、ストリップが種々の領域における部分の目に見える表示を提供す るためにバリヤー上に供給され得る。

個々のサンプルのために、所望には次の３種の領域が存在するであろう：　（１ ）　ＨＬＡ−８２７に結合する抗体接合体に対して特異的な抗−免疫グロブリン 抗体により被覆された又はＩｇが抗−ＨＬＡ−８２７のイソタイプのものである 抗−ｒｇにより被覆された工程上の陽性領域；（２）　ＦＩＬＡ−Ｂ２７及びＩ ＩＬＡ−Ｂ７と交差反応するが、しかし他のＨＬＡとは交差反応しないモノクロ ーナル抗体により被覆された試験領域；及び（３）ＨＬＡ−８７の消耗のために 使用されるのと同じ抗−肛へ一８７モノクローナル抗体により被覆された工程上 の陰性領域、　ＨＬＡ−８２７陽性である検体は、最初の２つのウェルにおいて 色の進行を示す（但し、第３のウェルにおいては示さない）；ＨＬＡ−Ｂ７陽性 及びＨＬＡ−Ｂ　２７陰性である検体（ここでＨＬＡ−８７は適切に消耗されて いる）又はＢ７／Ｂ２７陰性検体は、第１ｔＩＩ域において陽性の結果を単に示 し；そしてＢ７陽性であり、そして適切に吸収されていない検体はすべての３種 の領域において陽性であろう。

肛＾−８２７の存在が決定される態様は、本発明において臨界ではない、たとえ ばＨＬＡ−８７及び１（ＬＡ−８２７と交差反応する酵素接合抗体、たとえば抗 −β□−ミクログロブリン抗体又は抗−ＨＬＡ　Ｈ鎖車型性抗体が、便利な洗浄 溶液、たとえば緩衝水性媒体、たとえばＰＢＳにより膜を洗浄した後に添加され 得る。基質の添加に基づいて色の生成を可能にする種々の酵素が利用できる。広 範であることが見出されている酵素は、ホースラディシュペルオキシダーゼ、ア ルカリホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、β− ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、それらのウレアーゼ組合せ又は同 様のものを包含する。それらの酵素の個々は、市販されており、そして集中的な 色の形成を提供する種々の基質が報告されている。放射性同位体、螢光色素、染 色ビーズ、化学発光及び同種のものを用いての他の検出方法が使用され得る。

酵素接合体を含む溶液が５ＴＡＴ試験カートリツジに添加され、存在するいづれ かのＩＩＬＡ−８２７への結合を提供される。第１段階は抗−）ＩＬＡ−８２７ を添加し、続いて抗−抗体が添加される２段階を用いることができるが、通常、 この追加の段階を追加することに利点は存在せず、その結果、実際問題として、 ２段階の添加は使用されないであろう、接合体の添加の後、膜は上記のように適 切な洗浄溶液により洗浄され、いづれかの非特異的に結合された接合体が除去さ れ、続いて、基質及び必要とされるいづれかの追加の因子を含む溶液が添加され る。十分な時間の後、特に種々の領域を比較することによって、色の存在又は不 在を観察し、サンプルが肛Ａ−８２７陽性又は陰性であるかどうかを決定するこ とができる。

次の例は例示目的であって、本発明を限定するものではない。

叉輩 鼾 ＨＬＡ　Ｂ２７試験 ■、患者の血清１００　ｍｌに、ＨＬＡ−Ｂ７及びＨＬＡ−Ｂ　４０とは交差反 応するが、しかしＨＬＡ−Ｂ２７　（Ｉｎｃｓｔａｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ）とは反応しない０．５■／１の抗−Ｂ７抗体１〜４μＩを添加する。室温で５ 〜１０分間、撹拌し、そしてインキュベートする。

２、前記混合物に、ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉ ｃｓ、　Ｉｎｃ、。

Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ、　４３４０Ｄ）により被覆された磁気ビーズ２００〜６ ００　ｕ　Ｉを添加する。管にフタをし、そして室温で２０〜３０分間、ロッカ ー上で混合する。

３、すべての磁気ビーズを完全に下方に下げるために、２〜４分間、さかさまの 位置で強い磁石の表面上に管を置く。

４．５ＴＡＴカートリツジに前記上清液２００　ｕ　ｌを移す。（Ｓａｎｇ　Ｓ ｔａｔＭｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ＋　ＣＡ、）、排 水を完全にする。　［５ＴＡＴカートリツジは、０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７，２ ）において１■／蒙１の濃度で抗体により被覆されたナイロン膜を有する３個の ミニウェル（Ａ、Ｂ、Ｃ）を含む、ミニウェルＡは、正常なりギ血清により１： ５０に稀釈されたヤギ抗−マウス抗体（Ｊｏｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｕｒａｔｕｒｉ ｅｓ）により被覆される。

ミニウェルＢは、抗−ＨＬＡ　Ｂ　７／Ｂ２７モノクローナル抗体（Ｃ１ｏｎｅ ＳＶ９０．１）　ニより被覆される。ミニウェルＣは、ＨＬＡ　Ｂ７／Ｂ４０特 異的モノクローナル抗体（Ｉｎｃｓｔａｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により被 覆する〕。

５．５ＴＡＴカートリツジに抗体接合体（１％カゼイン及び０．１％Ｔｗｅｅｎ 　２０を含む、０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７，２）において５Ｍｇ／ｍｌに稀釈さ れたアルカリホスファターゼに接合された抗−β−２−ミクログロブリンヤギ抗 体）　２００μＩを添加する一完全に排水する。

６、個々のカートリッジに洗浄溶液（０，１％Ｔｗｅｅｎ　２０を含む０．１Ｍ のＰＢＳ　、　ｐＨ７，２目」ｌを添加する。完全に排水する。

７、色素体基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（Ｓａｎｇ　５ｔａｔ　Ｍｅｄｉｃ ａｌ　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎ））２００μｍを添加する。３〜４分間、進行 せしめる。

８、結果を読み取る。

跋駿慧来■照釈 最初のミニウェル（ミニウェルＡ）のみにおいての青−灰色環の進行は、肛ＡＢ ２７のために陰性試験である。

第１（Ａ）及び第２（Ｂ）ミニウェルにおける青−灰色環の進行、及び環を示さ ないか又は第２（Ｂ）ミニウェルにおけるよりも薄い環を示す第３（Ｃ）ミニウ ェルにおける青−灰色環の進行は、ＨＬＡ−８２７のための陽性試験である。

１１皇丼照 第１のミニウェル（ミニウェルＡ、進行上陽性の対照）に色の進行が存在しない か又はすべてのミニウェルに不均質の色の進行が存在する場合、試験は無効であ る。

ミニウェルＣにおける色の進行は、肛＾Ｂ７（又はＢ４０の除去が不完全であり 、又は血清検体における抗−マウスＩｇＧ抗体に関連する妨害が存在することを 示す。

箱１− マイクロ細胞毒性により前もって表現型分離された個人から収集された３０種の 検体を、急速アッセイ（ＨＬＡ　Ｂ２７）により試験した。

細胞毒性 Ｂ２７＋／Ｂ７＋　Ｂ２７＋／ＢＴ−Ｂ２７−／Ｂ７＋　Ｂ２７−／ＢＴ−）Ｉ ＬＡ　Ｂ２７５ＴＡＴ 陽性　４　１０　０　０ 陰性　０　０　５　１５ 無効　０　０　１　０ 好ましい態様は、１又は複数の環として免疫グロブリンを有することであり、こ こで中心から外部の方に濃度傾斜が存在する。比較的高い免疫グロブリン濃度中 心領域及び実質的に低い濃度の外部周囲を有することが特に所望される。この態 様は、１９９１年１月２３日に出願されたアメリカ特許出願第６６４．９４１号 に記載される。濃度傾斜は、膜に対して圧縮される多孔性スタブを用いることに よって容易に達成され得、その結果、サンプルに存在する免疫グロブリンの有意 な割合が中心領域に比較的高い濃度を創造し、そして中心領域のまわりに実質的 に低い濃度を創造する。

膜を通してのサンプルの流速は、膜上での抗体とサンプルとの接触のために少な くとも約１０〜１２０秒である。同様に、酵素接合体の流れ及び体積の速度は、 種々の領域における酵素接合体との接触のために１０〜１２０秒である。最後に 、基質の流れ及び体積の速度は、基質と酵素との反応のために１０〜１２０秒で あろう。

便利には、上記の３種類の領域を有する５ＴＡＴ試験カートリツジ、カラムのた めの充填剤、酵素接合体及び適切な場合、他の試薬、たとえば洗浄溶液、酵素基 質及び同様のものを含んで成るキットが提供される。

本発明の方法は、他のＨＬＡからの妨害を伴わないで、個々の８２７）ＩＬＡ型 を正確に決定するための単純な効果的方法を提供することが上記結果から明白で ある。従って、早い診断が一定の疫病に対する個人の傾向から製造され得る。そ の工程は、単純であり、実施又は測定のために複雑な装置を必要とせず、そして 熟練していないオペレータにより容易に実施され得る。

本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は個々の個人の出版物又は発 明出願が引用により特異的且つ個々に示されるような程度に引用により本明細書 に組込まれる。

本発明は十分に記載されて来たが、多くの変更及び修飾が本発明の範囲内で実施 されることは、当業者に明らかであろう。

フロントページの続き （７２）発明者　チャン、チン　ハイ アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０２４゜ロス　アルトス、ラニーメート 　ドライブ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．第２抗原の可能性ある存在下で第１抗原の存在を決定するための方法であっ て、ここで前記第１及び第２抗原は多くのエピトープを共有する抗原の多型性グ ループのメンバーであり、そして前記第１及び第２抗原間を区別できる有用なレ セプターが存在しないことによって特徴づけられ： 前記生理学的サンプルと、少なくとも前記第２抗原に結合するが、しかし前記第 １抗原への結合親和性を実質的に有さない第１結合成分とを組合し、そして第２ 抗原消耗サンプルを供給するために前記結合成分により形成される複合体から前 記サンプルを分離し；前記第２抗原消耗サンプルと、前記第１及び第２抗原とは 交差反応性であるが、しかし前記グループの他の抗原とは実質的に交差反応性で はない第２結合成分とを組合し、それによって複合体が存在するいづれかの第１ 抗原と前記第２結合成分との間で形成し；そして 前記第２結合成分により第１抗原複合体の存在を検出することによって前記第１ 抗原の存在を決定することを含んで成る方法。
2. ２．生理学的サンプル中のＨＬＡ−Ｂ２７の存在を決定するための方法であって ： 前記生理学的サンプルと、ＨＬＡ−Ｂ７にも結合するが、しかしＨＬＡ−Ｂ２７ への結合親和性を実質的に有さない第１結合成分とを組合し、そしてＨＬＡ−Ｂ ７消耗サンプルを供給するために前記結合成分により形成される複合体から前記 サンプルを分離し；前記ＨＬＡ−Ｂ７消耗サンプルと、ＨＬＡ−Ｂ７及びＨＬＡ −Ｂ２７とは交差反応性であるが、しかし他のＨＬＡとは実質的に交差反応しな い第２結合成分とを組合し、それによって複合体が存在するＨＬＡ−Ｂ２７と前 記第２結合成分との間で形成し；そして 前記第２結合成分によりＨＬＡ−Ｂ７複合体の存在を決定することによって前記 ＨＬＡ−Ｂ２７の存在を決定することを含んで成る方法。
3. ３．少なくとも前記第２結合成分がモノクローナル抗体である請求の範囲第２項 記載の方法。
4. ４．前記第１結合成分が固体支持体に結合される請求の範囲第２項記載の方法。
5. ５．前記固体支持体がポリサッカリドカラム充填剤である請求の範囲第４項記載 の方法。
6. ６．前記固体支持体が磁気ビーズである請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．前記サンプルが血清、血漿又は血清である請求の範囲第２項記載の方法。
8. ８．前記サンプルが尿である請求の範囲第２項記載の方法。
9. ９．生理学的サンプル中のＨＬＡ−Ｂ２７の存在を決定するための方法であって ： 前記サンプル、ＨＬＡ−Ｂ２７に結合するが、しかしＨＬＡ−Ｂ２７への結合親 和性を実質的に有さない第１抗体、及び磁気ビーズをインキュベートし、ここで 前記第１抗体は前記磁気ビーズに結合され、又は結合されるようになり、それに よってＨＬＡ−Ｂ７が前記磁気ビーズに結合されるようになり； ＨＬＡ−Ｂ７消耗サンプルを供給するために前記磁気ビーズを分離し、前記ＨＬ Ａ−Ｂ７消耗サンプルと、次の３種の領域：ＨＬＡ−Ｂ７及びＨＬＡ−Ｂ２７と は交差反応性であるが、しかし他のＨＬＡとは実質的に交差反応しない第２抗体 が結合される第１領域；前記第１抗体が結合される第２領域；及びクラスＩＨＬ Ａに対する抗体及び検出可能シグナルを供給するそれができるラベルを含んで成 る抗体複合体に対する抗体が結合される第３領域を有する膜を含んで成るアッセ イシステムを組合し； 前記抗体接合体により前記膜に結合される前記抗体との複合体形成の存在を決定 し、それによって、前記第１及び第３領域における陽性結果及び前記第２領域に おける陽性結果が前記サンプル中のＨＬＡ−Ｂ２７の存在を示すことを含んで成 る方法。
10. １０．少なくとも前記第２抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第９項記 載の方法。
11. １１．前記膜がナイロン膜である請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．前記ラベルが酵素である請求の範囲第９項記載の方法。
13. １３．少なくとも２つの次の領域：ＨＬＡ−Ｂ７及びＨＬＡ−Ｂ２７と交差反応 するが、しかし他のＨＬＡ抗原とは実質的に交差反応しない第１抗体が結合され る第１領域；ＨＬＡ−Ｂ７と反応するが、しかしＨＬＡ−Ｂ２７とは反応しない 第２抗体が結合される第２領域を含んで成る膜。
14. １４．前記膜がナイロン膜である請求の範囲第１３項記載の膜。
15. １５．前記膜が流速を調節するためにアクリルポリマーにより被覆される請求の 範囲第１４項記載の膜。
16. １６．少なくとも２つの次の領域：第１及び第２抗原と交差反応するが、しかし 他の抗原グループとは実質的に交差反応しない第１抗体が結合される第１領域； 前記第２抗原とは反応するが、しかし前記第１抗原とは反応しない第２抗体が結 合される第２領域を含んで成る膜であって、前記抗原及び前記グループが、多く のエビトープを共有する多型性グループの抗原のメンバーであり、そして前記第 １及び第２抗原間を区別できる有用なレセプターが存在しないことによって特徴 づけられる膜。
17. １７．請求の範囲第１３項記載の膜及びＨＬＡ−Ｂ７及びＨＬＡ−Ｂ２７と交差 反応性の抗体の酵素接合体を含んで成るキット。