JP2001124773A

JP2001124773A - 標識特異的結合体およびこれを用いてなる免疫クロマトグラフ法、ならびに免疫クロマトグラフ用検査片

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Publication number: JP2001124773A
Application number: JP30479899A
Authority: JP
Inventors: Yasuyuki Tanaka; 康進田中; Shuji Senda; 修治千田
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2001-05-11

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】可磁化物質を含有した微粒子を用いることに
よって、検体中から被検物質を捕捉、濃縮して、高感度
に被検物質の検出ができる標識特異的結合体、および免
疫クロマトグラフ法、並びに免疫クロマトグラフ用検査
片を提供する。【解決手段】可磁化物質を水分散型高分子などの微粒
子に含有させ、さらに、その表面に被検物質と結合しう
る第一免疫体および標識剤を固定して標識特異的結合体
を作製する。標識剤としては酵素が好ましく、発色性化
学物質と組み合わせのためには、ペルオキシダーゼやア
ルカリフォスファターゼを用いることがさらに好まし
い。上記標識特異的結合体と第一免疫体とを結合させた
標識免疫複合体に磁石を用いて濃縮処理を施し、クロマ
ト法に供することによって、被検物質を検出感度よく検
出することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、可磁化物質を含有
した微粒子を利用した標識特異的結合体、およびこれを
用いてなる免疫クロマトグラフ法、ならびに免疫クロマ
トグラフ用検査片に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年食中毒菌として問題となっている大
腸菌Ｏ１５７をはじめとする病原性微生物を食品中や患
者から検出するには、多くの日数や煩雑な操作を要する
場合がある。さらに、疾患によっては緊急性が要求さ
れ、迅速な診断や菌の検出が要求される場合も多い。こ
れらの診断や検出には、標識化免疫測定法などの種々の
免疫測定法（イムノアッセイ）が好適に用いられてお
り、迅速かつ簡便にイムノアッセイが行える方法とし
て、免疫クロマトグラフ法も注目されているが、簡便性
や感度などの点において未だ充分なものが得られていな
いのが実状である。

【０００３】免疫クロマトグラフ法においては、検出対
象物の絶対量が検出感度に大きく影響を及ぼす。しかし
ながら、測定に用いる検出対象物の絶対量を増やすため
には、多くの検体を免疫クロマトグラフ法に供する必要
があり、結果として検出操作が煩雑になったり、操作時
間が長くなるという問題がある。

【０００４】さらに、検体の種類や由来によっては、検
出対象物以外の夾雑物が測定感度を低下させる要因とな
りうるので、測定に供する検出対象物の精製度合いを高
めることも重要となる。

【０００５】従って、検出対象物を高感度に検出するた
めには、検出対象物を検体から効率よく、かつ選択的に
集めて濃縮することが望ましい。また、測定結果を容易
に判定するためには、検出対象物の存在の有無をより明
瞭に肉眼で判別できることが必要である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便に検体
中から被検物質を捕捉し、しかも高感度に被検物質を検
出することができる標識特異的結合体、好ましくは免疫
クロマトグラフィ用の標識特異的結合体を提供すること
を目的とする。

【０００７】さらに、本発明は、簡便で精度の高い免疫
クロマトグラフ法、および該免疫クロマトグラフ法に好
適な免疫クロマトグラフ用検査片を提供することを目的
とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、（１）
可磁化物質を含有する微粒子の表面に、被検物質に対す
る第一免疫体および標識剤を固定した標識特異的結合
体、および（２）上記（１）記載の標識特異的結合体と
第一免疫体とを結合させた標識免疫複合体に、磁石にて
濃縮処理を施したのち、クロマト法に供することを特徴
とする免疫クロマトグラフ法、ならびに（３）吸水性基
材上に被検物質を結合しうる第二免疫体を固定化してな
る固定部を有し、被検液および上記（１）記載の標識特
異的結合体から得られる標識免疫複合体の溶液、標識特
異的結合体に標識剤として固定されている酵素に対する
発色性化学物質を含有する溶液を滴下するための滴下パ
ッドを設けてなる免疫クロマトグラフ用検査片、に関す
るものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明における被検物質とは、通
常の免疫反応により検出可能な物質であれば特に限定さ
れないが、細菌やその構成成分、細菌が産生する毒素、
タンパク質、ウイルス抗原および抗体、ならびにマイコ
プラズマなどが挙げられる。

【００１０】細菌およびその構成成分としては、例えば
大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ菌、黄色ブドウ球菌、カン
ピロバクター菌、リステリア菌、ウェルシュ菌、腸炎ビ
ブリオ菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、クラミジア・ト
ラコマティス菌およびその構成成分などが挙げられる。

【００１１】細菌が産生する毒素としては、例えばベロ
トキシン、ストレプトリシンＯなどが挙げられる。

【００１２】タンパク質としては、例えばヒトトランス
フェリン、ラクトフェリン、ヒトアルブミン、ヒト免疫
グロブリン、マイクログロブリンおよびＣ反応性蛋白質
などが挙げられる。

【００１３】ウイルス抗原および抗体としては、例えば
Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｃ、ＨＢｅおよびＨＢｓ抗原な
らびに抗体、Ｃ型肝炎ウイルス抗原および抗体、ヒト免
疫不全ウイルス抗原および抗体、ロタウイルス抗原なら
びに抗体ならびにアデノウイルス抗原および抗体などが
挙げられる。

【００１４】本発明の標識特異的結合体は、可磁化物質
を含んだ水分散型高分子からなる微粒子の表面に、被検
物質に結合しうる第一免疫体と、酵素に代表される標識
剤を有するものである。本発明において用いる可磁化物
質は磁石を用いて集められる常磁性のものであれば特に
限定されないが、例えばγ−Ｆｅ₂Ｏ₃、Ｆｅ₃Ｏ₄、
（ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ₂Ｏ₃、Ｃｏ−γ−Ｆｅ₂Ｏ
₃、（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ₂Ｏ₃、ＳｒＯ・６Ｆｅ₂Ｏ
₃、ＢａＯ・６Ｆｅ₂Ｏ₃、（ＮｉＺｎ）Ｏ・Ｆｅ₂Ｏ
₃、（Ｍｎ・Ｚｎ）Ｏ・Ｆｅ₂Ｏ₃などが好ましく用い
られ、その中でも安定性の見地からγ−Ｆｅ₂Ｏ₃、Ｆ
ｅ₃Ｏ₄などがより好ましく用いられる。

【００１５】上記可磁化物質を含有する微粒子の粒子径
は、分散性や免疫クロマトグラフ法における展開性など
の観点から、好ましくは１０μｍ以下、さらに３μｍ以
下とすることが望ましく、得られた特異的結合体の精製
しやすさの観点から、好ましくは０．０１μｍ以上、さ
らに０．０３μｍ以上とすることが望ましい。

【００１６】上記微粒子の表面に固定化され、被検物質
と結合しうる第一免疫体とは、検出対象となる被検物質
と特異的に結合することができる物質をいう。具体的に
は、抗体または抗原（本発明における抗原には、タンパ
ク質、ペプチド、ハプテンなども含まれる）が挙げら
れ、検出対象の被検物質に応じてサンドイッチ法などで
用いることができる公知のものを適宜選択することがで
きる。

【００１７】具体的には、被検物質が抗原の場合には、
対応する抗体を第一免疫体として用いることができる。
この場合、第一免疫体と、後述する第二免疫体には、ポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体を使用する
ことができ、一方の免疫体がモノクローナル抗体である
場合には、もう一方の免疫体は当該モノクローナル抗体
とは異なる抗原決定基を認識するものが好ましい。

【００１８】また、被検物質が抗体の場合は、対応する
抗原を第一免疫体として用いることができる。この場
合、第一免疫体および第二免疫体として、対応する抗原
および被検物質である抗体に対する抗抗体（抗免疫グロ
ブリン抗体）をそれぞれ用いてもよい。

【００１９】本発明において用いる標識剤としては、例
えば酵素、蛍光標識体、ラジオアイソトープなどが挙げ
られ、これらのうち取り扱い性や作業性の点から酵素お
よび蛍光標識体が用いることが好ましい。このような標
識剤は単独で、あるいは２種類以上を混合して用いても
よく、なかでも発色反応を用いることにより容易に目視
判定が可能となる酵素を好ましく用いることができる。
さらに、酵素の中でも発色反応を用いて検出が可能な酵
素として認知されているペルオキシダーゼおよびアルカ
リフォスファターゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステラー
ゼ、グルコースオキシダーゼなどが好適に用いられる。
これらのうち安定性および酵素反応性の観点からペルオ
キシダーゼを用いることが好ましい。

【００２０】前記微粒子に第一免疫体および酵素を結合
する方法としては、従来からよく知られている方法、例
えば共有結合法や物理吸着法、イオン結合法などを用い
ることができるが、結合後の第一免疫体および酵素の脱
離がなく安定である点から共有結合法を採用することが
好ましい。

【００２１】このようにして得られた標識特異的結合体
中に含まれる第一免疫体と酵素の総固定量は、微粒子の
乾燥重量１ｇあたり０．１〜２００ｍｇ程度とすること
が好ましく、その量は上記の範囲内で使用する第一免疫
体や酵素の種類、活性の程度によって適宜変更すること
ができる。また、微粒子の表面積を勘案すると全固定量
としては、微粒子の乾燥重量１ｇあたり２００ｍｇ以下
が好ましく、さらに１５０ｍｇ以下とすることが好まし
く、被検物質の検出の迅速性や感度、再現性の観点か
ら、１ｍｇ以上が好ましく、特に３ｍｇ以上がさらに好
ましい。ここで本発明における微粒子の「乾燥重量」と
は、一定量の微粒子を１２０℃で２時間乾燥させた後の
重量をいう。

【００２２】本発明の標識特異的結合体は、可磁化物質
を含むために検体から被検物質を磁石を用いて選択的に
単離することができる。さらに、標識特異的結合体上の
第一免疫体に被検物質を結合させた標識免疫複合体を免
疫クロマトグラフ法に供することによって、被検物質と
結合しうる第二免疫体を固定化した固定部を設けた吸水
性基材上で、この標識免疫複合体を捕捉することができ
る。

【００２３】上記のように第二免疫体を固定するための
吸水性基材は、被検物質を含有する検体（被検試料）、
例えば細菌の培養液や血清、血液、尿、便、唾液などを
吸収できるもの、検体液および標識特異的結合体液を吸
収するものであれば特に限定されない。好ましい吸水性
基材としては、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフ
ィルター、ニトロセルロースフィルター、その他多孔質
材料などが挙げられる。また、吸水性基材の形状は、被
検物質を展開できる形状であれば特に限定されるもので
はなく、例えば、矩形のシート状やロッド状のものが好
ましい。これらの基材は適度な吸水速度を有すると共
に、標識特異的結合体による発色性化学物質の発色の目
視確認性にも優れるものである。

【００２４】前記被検物質と結合しうる第二免疫体と
は、検出対象の被検物質と特異的に結合することができ
る物質をいう。具体的には、抗体または抗原（タンパク
質、ペプチド、ハプテンなども含む）などが挙げられ、
検出対象となる被検物質に応じてサンドイッチ法などで
用いられる公知のものを適宜選択することができる

【００２５】具体的には、被検物質が抗原の場合には、
対応する抗体を第二免疫体として用いることができる。
この場合、固定部に固定化する第二免疫体と、標識特異
的結合体の構成要素として用いる第一免疫体には、ポリ
クローナル抗体およびモノクローナル抗体を使用するこ
とができ、一方の免疫体がモノクローナル抗体である場
合には、もう一方の免疫体は当該モノクローナル抗体と
は異なる抗原決定基を認識するものが好ましい。

【００２６】また、被検物質が抗体の場合には、対応す
る抗原を第二免疫体として用いることができる。この場
合、第一免疫体および第二免疫体として、対応する抗原
および被検物質である抗体に対する抗抗体（抗免疫グロ
ブリン抗体）をそれぞれ用いてもよい。

【００２７】本発明において、迅速かつ高感度な免疫ク
ロマトグラフ法を行うために、微粒子表面に標識剤とし
ての酵素を固定しているが、固定される酵素は目的に応
じて適宜変更することができる。標識剤として酵素を用
いる場合、被検物質の検出の迅速性や感度、再現性の観
点から、微粒子の乾燥重量１ｇあたり０．５ｍｇ以上が
好ましく、さらに１ｍｇ以上とすることが望ましい。ま
た、固定化の最大量としては検出時の特異性や再現性の
点から１００ｍｇ以下とすることが好ましい。

【００２８】なお、本発明において微粒子への第一免疫
体および酵素の固定量は、固定後の遊離のタンパク質を
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法を用いて測定
することにより算出する。

【００２９】上記した本発明の標識特異的結合体は、本
発明の検査方法に供する場合、緩衝液に分散させて使用
することができる。ここで使用する緩衝液としては、ホ
ウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などが挙げられ、
第一免疫体および酵素を失活させない緩衝液、ｐＨなら
びに塩濃度を適宜選択する。

【００３０】次に、本発明の免疫クロマトグラフ法を用
いた被検物質の検査方法について、以下に説明する。

【００３１】サンプルチューブにとった検体に、標識特
異的結合体を加えて穏やかに振盪すると、検体中に被検
物質が存在すると、本発明の標識特異的結合体に捕捉さ
れ、標識免疫複合体が形成される。次に、サンプルチュ
ーブの側面に磁石を外側から接触させると、標識特異的
結合体がサンプルチューブ内面の壁に集められる。続い
て、ピペットなどを用いて液相を吸い取り、除去したの
ち、緩衝液を加えて標識免疫複合体を再懸濁する。この
標識免疫複合体の懸濁液を免疫クロマトグラフ法に供す
る。

【００３２】図１に免疫クロマトグラフに用いる検査片
の一態様を示した。

【００３３】図１において、検査片を構成する吸水性基
材３は不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルタ
ー、ニトロセルロースフィルター、その他多孔質材料な
どの材質からなり、一実例として６ｍｍ×６０ｍｍ程度
の短冊状に切断した吸水性基材を用いることができる。
滴下パッド２は前記した方法で濃縮して緩衝液に懸濁し
た標識免疫複合体を滴下する箇所であり、濾紙、ポリエ
ステルなどの吸液性の素材からなる。固定部２は、第二
免疫体（０．１〜１０μｇ程度）をライン状に塗布した
領域である。

【００３４】滴下パッド２と固定部１との間の距離は、
２〜２０ｍｍ、好ましくは３〜１５ｍｍ程度とする。こ
のような範囲内であれば、酵素による発色感度が良好
で、測定時間も長くならずに適切である。

【００３５】図１において、滴下パッド２にピペットな
どを用いて前記の方法で緩衝液に懸濁した標識免疫複合
体（２０〜２００μｌ程度）を滴下する。この標識免疫
複合体懸濁液は図１の右から左（矢印の方向）に吸水性
基材３上を展開していく。このときの吸水性の程度（展
開速度）は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断した吸水性基材の
片端部を水に浸漬し、１分間経過後の吸水距離（展開距
離）が０．５〜１０ｃｍ程度のものが好ましい。固定部
１では、標識免疫複合体中の被検物質が第二免疫体と反
応して標識免疫複合体が捕捉され、第二標識免疫複合体
が形成される。次に、発色性化学物質（酵素基質）を含
む液（２０〜２００μｌ程度）を滴下パッド２にピペッ
トなどを用いて滴下する。

【００３６】発色性化学物質は、標識剤として標識特異
的結合体に固定した酵素と反応して発色しうる基質であ
ればよく、例えば、固定化する酵素がアルカリフォスフ
ァターゼの場合には、ｐ−ニトロフェニルフォスフェー
ト、５−ブロモ−４−クロロ−３−ホスフェート／ニト
ロブルーテトラゾリウム、ファーストレッド／ナフトー
ル、ＡＳ−ＴＲフォスフェートなどが挙げられる。ま
た、固定化する酵素はペルオキシダーゼの場合には、
２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリ
ン）−６−スルホン酸、ｏ−フェニレンジアミン、３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、
ｏ−ジアニジジン、５−アミノサリサイクリックアシッ
ド、３，３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−
エチルカルバゾール、４−クロロ−１−ナフトールなど
が挙げられ、発色性および無毒性という観点からＴＭＢ
が好ましく用いられる。この発色性化学物質は標識特異
的結合体に固定した標識剤によって発色する性質を持つ
化学物質である。発色性化学物質は、固定部１にて第二
標識免疫複合体中の酵素と反応し、ライン状の発色帯を
生じる。この発色帯を目視、または画像解析装置などを
用いて読み取り、検体中に被検物質が存在するか否かを
判定する。

【００３７】

【実施例】以下、本発明の実施例を挙げ、さらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定され
るものではない。

【００３８】実施例１（標識特異的結合体（酵素−抗体
固定化微粒子）の作製）１）第一免疫体の固定第一免疫体としての抗体を、微粒子（直径１〜２μｍ，
γ−Ｆｅ₂Ｏ₃とＦｅ ₃Ｏ₄を含むカルボキシル化ポリ
スチレン粒子）に以下のようにして固定した。

【００３９】上記微粒子を遠心分離にて沈殿させたの
ち、固形分濃度が５重量％となるよう１０ｍＭ−ホウ酸
緩衝液（ｐＨ８．２）に分散した。この分散液３ｍｌ
に、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０ｍ
ｇ／ｍｌ、１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２））
０．５ｍｌ、ヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ポリク
ローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．２））２ｍｌを加えて１０℃で３時間反応さ
せたのち、洗浄液として１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．２）を加えて遠心分離を行い、同緩衝液で固形分濃
度５重量％に調整した。

【００４０】２）酵素の固定次いで、上記にて作製した抗体を固定した微粒子懸濁液
３ｍｌに、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩、１０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．２））１ｍｌ、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ
（以下、ＨＲＰと略す。１０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ−ホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．２））２ｍｌを加えて１０℃で３
時間反応させた後、洗浄液として１０ｍＭ−ホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．２）を加えて遠心分離を行った。同緩衝液
で固形分濃度２重量％に調整し、ヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ
１５７：Ｈ７ポリクローナル抗体およびＨＲＰを固定化
した微粒子を作製した。

【００４１】３）抗体および酵素の固定量の測定以上のようにして作製したヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５
７：Ｈ７ポリクローナル抗体およびＨＲＰを固定化した
微粒子について、抗体および酵素の固定後の上清をタン
パク定量し、その値から微粒子の乾燥重量１ｇあたりの
各固定量を算出した。

【００４２】タンパク定量はタンパク定量−色素結合法
（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）を用いて、以下のようにして行
った。

【００４３】固定化抗体および酵素量の定量には、Ｃｏ
ｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＧ−
２５０による色素結合法を用いた。実際の測定は、市販
キットである『ＣｏｏｍａｓｓｉｅＰｒｏｔｅｉｎ
ＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ』（ＰＩＥＲＣＥ社製）を
使用した。測定法は付属の手順書に従った。

【００４４】検量線は、濃度既知の抗体および酵素の溶
液を用いて上記の試薬にて発色させた後、５９５ｎｍの
吸光度を測定することによって作成した。適宜希釈した
抗体および酵素の固定化後サンプルの上清を、上記の試
薬にて発色させた後、５９５ｎｍの吸光度を測定、検量
線から抗体および酵素の濃度を算出した。

【００４５】測定は室温（２５℃）で行った。反応時間
には特に限定がないが、発色後９０分以内に吸光度測定
を実施した。その結果、上記にて作製した微粒子の乾燥
重量１ｇあたりの抗体の固定量は６ｍｇ、酵素の固定量
は１ｍｇであった。

【００４６】４）抗体および酵素の固定された微粒子の
酵素活性の測定上記２）で作製したヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７
ポリクローナル抗体およびＨＲＰを固定化した微粒子に
ついて、その酵素活性を測定した。基質液として市販の
ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ
ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）ＭｅｍｂｒａｎｅＰｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｙｓｔｅｍ（Ｋｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓＩｎｃ．社製）を使用した。

【００４７】キュベット内で、上記の基質液３．３ｍｌ
に対して、酵素および抗体を固定し、０．０１２５重量
％に希釈した微粒子の分散液０．１ｍｌを混合し、２５
℃で反応後、分光光度計で５８０ｎｍにおける１分間の
吸光度上昇を測定した。吸光度を１分間に１上昇させる
活性を１Ｕ（ユニット）と定義し、微粒子の乾燥重量１
ｇあたりの活性を測定した。

【００４８】その結果、固定されたＨＲＰの活性は、微
粒子の乾燥重量１ｇあたり５６００Ｕであった。

【００４９】５）免疫クロマトグラフ用検査片の使用ａ）検査片の作製図２に一実例として作製した免疫クロマトグラフ用検査
片の概略模式図を示した。

【００５０】ニトロセルロースメンブレン（孔径１２μ
ｍ、２００μｍ厚、６ｍｍ×６０ｍｍ）の一端から３０
ｍｍの箇所にヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ポリク
ローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４））を１．５μｌ、ディスペンサーを用い
てライン状に塗布して固定部１を設けた。

【００５１】このメンブレンをウシ血清アルブミン（以
下、ＢＳＡと略す）１重量％、およびポリオキシエチレ
ン（１０）オクチルフェニルエーテル０．１重量％、サ
ッカロース１重量％からなる水溶液中に１０分間浸漬し
たのち、４０℃で２時間乾燥させることによってブロッ
キングを行い、検査片上に検体や標識特異的複合体が非
特異的に吸着することを防止した。

【００５２】次いで、このメンブレンの裏側（固定部と
しての抗体塗布面の反対側）に、ポリエステルフィルム
（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて積層した。

【００５３】続いて、上記にて得た検査片の一端から０
ｍｍと１８ｍｍの２箇所に、ポリエステル不織布（７×
７ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）を貼り合わせて、滴下パッド
２および滴下パッド４を設けた。両滴下パッド間の間隔
は１１ｍｍであった。

【００５４】さらに、検査片の一端より５０〜６０ｍｍ
の箇所に吸水用のパッドとしてガラス繊維性の吸水材
（１０ｍｍ×１０ｍｍ、厚さ５ｍｍ）を貼り合わせて免
疫クロマトグラフ用検査片を作製した。この検査片を１
００個作製して、以下の被検物質の検出に用いた。

【００５５】ｂ）試薬の調製ｉ）被検液Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ＰＯＳＩＴＩＶＥＣＯ
ＮＴＲＯＬ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．社製）を、Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ−ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）
（１３７ｍＭＮａＣｌ、８．１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、
２．６８ｍＭＫＣｌ、１．４７ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄ｐＨ
７．４）中に、表１に示した各濃度で分散させた被検液
を調製した。

【００５６】ｉｉ）標識特異的結合体液前記にて作製した抗体および酵素を固定化した微粒子
を、１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）で０．０１
２５重量％となるよう希釈して、標識特異的結合体液を
調製した。

【００５７】ｉｉｉ）発色性化学物質液（基質液）発色性化学物質液として、下記の組成からなる溶液を作
製した。なお、以下、％とあるのは全て重量％を意味す
るものである。０．０２％ＴＭＢ、０．００５％Ｈ₂Ｏ
₂、１０％ジメチルホルムアミド、０．１２％硫酸デキ
ストラン、０．１Ｍ塩化アンモニウム緩衝液、ｐＨ８．
０

【００５８】６）被検物質の検出ａ）標識特異的結合体による被検物質の捕捉上記にて調製した被検液１ｍｌをプラスチック製のサン
プルチューブ（エッペンドルフ社製、１．５ｍｌ容）に
とり、次いで、ここに標識特異的結合体液０．１ｍｌを
加えたのち、ロータリーシェーカーを用いて２５℃で３
０分振盪することによって、標識特異的結合体に固定し
た第一免疫体に被検物質を結合させて標識免疫複合体を
形成させた。

【００５９】次に、磁石（ＭＰＣ−Ｍ、Ｄｙｎａｌ社
製）に該サンプルチューブを取り付け、壁面に標識免疫
複合体を回収した。ピペットを用いて液相を除去した
後、ＢＳＡ溶液（０．１重量％、ＰＢＳ溶液）１ｍｌを
加え、ボルテックスミキサーを用いて標識免疫複合体を
再懸濁することにより洗浄した。再び磁石（ＭＰＣ−
Ｍ、Ｄｙｎａｌ社製）に該サンプルチューブを取り付
け、壁面に標識免疫複合体を回収した。ピペットを用い
て液相を除去した後、ＢＳＡ溶液（０．１重量％、ＰＢ
Ｓ溶液）０．１ｍｌを加え、標識免疫複合体を再懸濁し
て得られた液を検体液とした。

【００６０】ｂ）酵素免疫クロマトグラフ法図２の滴下パッド２に５０μｌの検体液を滴下し、次い
で、１００μｌの発色性化学物質液を滴下した。滴下終
了１０分後に固定部１での発色の有無を観察した。青紫
色の発色を陽性とした。結果を表１に示した。なお、表
中の判定基準は以下の通りである。

【００６１】＋＋＋：固定部１にライン状の発色が明瞭に見られる。＋＋：固定部１にライン状の発色が見られる。 −：固定部１にライン状の発色が見られない。

【００６２】

【表１】

【００６３】表１の結果から明らかなように、菌数が１
０⁵細胞数／ｍｌで陽性反応が検出され、菌数０では発
色せず、非特異的な発色は認められなかった。

【００６４】比較例１（標識特異的結合体による被検物
質の濃縮を行わない場合との比較）１）標識特異的結合体の作製実施例１と同一の標識特異的結合体を作製した。

【００６５】２）試薬の調製ａ）被検液実施例１と同一の被検液を調製した。

【００６６】ｂ）標識特異的結合体液前記１）で作製した標識特異的結合体を、１０ｍＭ−ホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）で０．０１２５重量％となる
よう希釈して、標識特異的結合体液とした。

【００６７】ｃ）発色性化学物質液実施例１と同一の発色性化学物質液を作製した。

【００６８】３）被検物質の検出前記ａ）で調製した標識特異的結合体液、前記ｂ）で調
製した被検液および前記ｃ）で調製した発色性化学物質
液を用い、被検物質の濃縮を行うことなく実施例１と同
様の検査片を用いて免疫クロマトグラフ法に供した。

【００６９】図２に示す滴下パッド２に５０μｌの被検
液を滴下したのち、続いて、２５μｌの標識特異的結合
体液を滴下パッド２に滴下した。さらに滴下パッド４に
発色性化学物質液１００μｌを滴下した。

【００７０】滴下終了１０分後に固定部１での発色の有
無を観察した。青紫色の発色を陽性とした。結果を表２
に示した。なお、表中の判定基準は以下の通りである。

【００７１】＋：固定部１に薄いライン状の発色が見られる。 ±：固定部１に極めて微弱なライン状の発色が見られ
る。 −：固定部１にライン状の発色が見られない。

【００７２】

【表２】

【００７３】前記表１と表２との比較から明らかなよう
に、実施例１と同一の標識特異的結合体を用いても磁石
を用いた被検物質の濃縮を行なわなければ、固定部１で
の発色は極めて薄かった。従って、標識特異的結合体を
用い、被検物質を選択的に結合させたのち、これを濃縮
することによって、被検物質を高感度に検出できると共
に、検出結果を目視にて容易に判定できることが明らか
である。

【００７４】比較例２（標識剤（酵素）を固定しない標
識特異的結合体の使用との比較）１）標識特異的結合体の作製実施例１において標識剤（酵素）を固定しないこと以外
は、実施例１と同様にして、標識剤（酵素）を固定しな
い標識特異的結合体を作製した。

【００７５】２）試薬の調製ａ）被検液実施例１と同一の被検液を調製した。

【００７６】ｂ）標識特異的結合体液前記１）で作製した標識特異的結合体を、１０ｍＭ−ホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）で０．０１２５重量％となる
よう希釈して、標識特異的結合体液とした。

【００７７】３）被検物質の検出ａ）標識特異的結合体による被検物質の捕捉前記２）で調製した被検液および前記２）で調製した標
識特異的結合体液を用いて、実施例１と同様に標識特異
的複合体と被検物質を結合させ、標識免疫複合体を回収
し、標識免疫複合体液を得た。

【００７８】ｂ）免疫クロマトグラフ法図２の滴下パッド２に５０μｌの検体液を滴下し、滴下
終了１０分後に固定部１での微粒子由来の茶色発色の有
無を観察した。茶色の発色を陽性とした。結果を表３に
示した。なお、表中の判定基準は以下の通りである。

【００７９】＋：固定部１に薄いライン状の発色が見られる。 ±：固定部１にきわめて微弱なライン状の発色が見られ
る。 −：固定部１にライン状の発色が見られない。

【００８０】

【表３】

【００８１】前記表１および表３の結果から明らかなよ
うに、酵素を固定しない標識特異的結合体を使用する
と、固定部１での発色は極めて薄かった。従って、標識
特異的結合体に酵素を固定することによって、被検物質
の存在が明瞭となり、容易に目視で判定できることが明
らかである。

【００８２】比較例３（標識剤（酵素）を固定しない標
識特異的結合体を使用し、かつ被検物質の濃縮を行わな
い場合との比較）

【００８３】１）標識特異的結合体の作製実施例１において標識剤（酵素）を固定しないこと以外
は、実施例１と同様にして、標識剤（酵素）を固定しな
い標識特異的結合体を作製した。

【００８４】２）試薬の調製ａ）被検液実施例１と同一の被検液を調製した。

【００８５】ｂ）標識特異的結合体液前記１）で作製した標識特異的結合体を、１０ｍＭ−ホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）で０．０１２５重量％となる
よう希釈して、標識特異的結合体液とした。

【００８６】３）被検物質の検出ａ）免疫クロマトグラフ法前記１）で調製した被検液および前記１）で調製した標
識特異的結合体液を用い、被検物質の濃縮を行うことな
く免疫クロマトグラフ法に供した。

【００８７】図２に示すの滴下パッド２に５０μｌの被
検液を滴下したのち、続いて、２５μｌの標識特異的結
合体液を滴下パッド２に滴下した。滴下終了１０分後に
固定部１での微粒子由来の茶色発色の有無を観察した。
茶色の発色を陽性とした。結果を表４に示した。なお、
表中の判定基準は以下の通りである。

【００８８】 ±：固定部１にきわめて微弱なライン状の発色が見られ
る。 −：固定部１にライン状の発色が見られない。

【００８９】

【表４】

【００９０】前記表１および表４の比較から明らかなよ
うに、標識特異的結合体に酵素を固定せず、かつ標識特
異的結合体による被検物質の濃縮操作を行なわなけれ
ば、固定部１での発色は極めて薄かった。従って、酵素
を固定した標識特異的結合体を用いて、被検物質を濃縮
することによって、被検物質の存在を明瞭に目視で判定
できるようになった。

【００９１】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、高感度な
被検物質の検出を維持するための酵素免疫クロマトグラ
フ用の標識特異的結合体が提供することができる。ま
た、これを用いることによって、免疫クロマトグラフ用
検査片を作製し、より明瞭に検体中の被検物質の存在を
目視にて容易に判定することができるという効果を発揮
するのである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の標識特異的結合体を用いた酵素免疫
クロマトグラフ法に使用する検査片の一態様を示す概略
模式図（平面図）である。

【図２】実施例１で作製した免疫クロマトグラフ用検
査片の概略模式図（平面図）である。

【符号の説明】

１固定部２滴下パッド３吸水性基材４滴下パッド５吸水用パッド（吸水材）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】可磁化物質を含有する微粒子の表面に、
被検物質と結合しうる第一免疫体および標識剤を固定し
た標識特異的結合体。
【請求項２】該微粒子が可磁化物質を含んだ水分散型
高分子からなる請求項１記載の標識特異的結合体。
【請求項３】標識剤がペルオキシダーゼまたはアルカ
リフォスファターゼのうち少なくとも一つからなる請求
項１記載の標識特異的結合体。
【請求項４】微粒子の直径が０．０１〜１０μｍであ
る請求項２記載の標識特異的結合体。
【請求項５】請求項１記載の標識特異的結合体と第一
免疫体とを結合させた標識免疫複合体に、磁石にて濃縮
処理を施したのち、クロマト法に供することを特徴とす
る免疫クロマトグラフ法。
【請求項６】該標識特異的結合体が可磁化物質を含ん
だ水分散型高分子からなる請求項５記載の免疫クロマト
グラフ法。
【請求項７】該標識特異的結合体の標識剤がペルオキ
シダーゼまたはアルカリフォスファターゼのうち少なく
とも一つからなる請求項５記載の免疫クロマトグラフ
法。
【請求項８】該標識特異的結合体を構成する微粒子の
直径が０．０１〜１０μｍである請求項５記載の免疫ク
ロマトグラフ法。
【請求項９】吸水性基材上に被検物質を結合しうる第
二免疫体を固定化してなる固定部を有し、被検液および
請求項１記載の標識特異的結合体から得られる標識免疫
複合体の溶液、標識特異的結合体に標識剤として固定さ
れている酵素に対する発色性化学物質を含有する溶液を
滴下するための滴下パッドを設けてなる免疫クロマトグ
ラフ用検査片。
【請求項１０】滴下パッドが二つ以上設けられている
請求項９記載の免疫クロマトグラフ用検査片。