JPH09510540A

JPH09510540A - プロテインａの内部コントロールを用いる分析装置及び免疫学的検定

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Publication number: JPH09510540A
Application number: JP7518177A
Authority: JP
Inventors: アルバートイーチュー
Original assignee: アルバートイーチュー
Priority date: 1993-12-29
Filing date: 1994-12-28
Publication date: 1997-10-21
Anticipated expiration: 2019-05-17
Also published as: US5541059A; WO1995018378A1; EP0737312A1; CA2179297A1; JP3526873B2

Abstract

(57)【要約】抗体又は抗原を含む疑いのある液体中の分析物抗体又は分析物抗原の検出の免疫学的検定に使用する分析装置及び方法。分析物抗体の検出に対し、装置は、分析物抗体に特異的であり、固相の第一領域に固定化された抗原及び固相の第二領域に固定化された非−抗体コントロール物質を含む。分析物抗原の検出に対し、装置は、前記分析物抗原に特異的であり、固相の第一領域に固定化された捕獲抗体及ひ固相の第二領域に固定化された非−抗体コントロール物質を含む。

Description

【発明の詳細な説明】プロテインＡの内部コントロールを用いる分析装置及び免疫学的検定発明の背景本発明の技術分野は、免疫学的検定装置の内部コントロール及び液体サンプル中の分析物の検出方法に関するものである。さらに特に、本発明は、免疫グロブリンのFcフラグメントに結合可能である、プロテインＡのような、非−抗体コントロール物質の使用に関する。これらの物質は、そのような検定装置及び方法において内部コントロールとして働き、検定に使用される試薬が機能して検定が適切に行われることを確実にする。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)又はＣ型肝炎ウイルス(HCV)抗原に対する抗体を検出する試験のような、抗原に特異的な抗体（以後“分析物抗体”と称する）を検出する免疫学的検定において、一般的に、分析物抗体を含む疑いのあるサンプルを、表面に固定化した特定の抗原を有する免疫学的検定装置表面に添加する。サンプルを添加した後、酵素、金属コロイド又は幾つかの他のマーカーでラベルしたヒトの抗体に特異的な抗体を添加する。患者サンプルからの分析物抗体が抗原に結合すると、ラベルした抗体も結合し、その結果、試験結果が陽性であることを示す。免疫学的検定が実験室の職員によりしばしば行われるため、人為的誤差が起こりうる。それ故、コントロールを用いて試験が適切に行われることを確実にする必要が有る。また、これらの免疫学的検定に使用される試薬はしばしば安定性が限られているため、試薬が適切に機能することを確実にするのにコントロールが必要である。一般的に、分析物抗体の存在を試験する場合、免疫学的検定装置は、ヒト免疫グロブリンＧ(IgG)、IgM、IgE又はIgAに向けられた抗体の内部コントロールを有するであろう。このように、患者サンプル（一般的には血漿又は血清）を免疫学的検定装置に添加する場合、免疫グロブリンは、サンプル中に存在する分析物抗体があるか否かに係わらず内部コントロールに結合するであろう。ラベルした抗体を添加する場合、内部コントロール及び抗原位置の両方にラベルが存在することは、試験したサンプル中に分析物抗体が存在していることを示している。抗体位置ではなく内部コントロールにラベルが存在することは、試験結果が陰性であることを示している。ラベルが内部コントロールに殆ど存在しないか全く存在しないならば、分析操作に間違いがあったか、一種以上の試薬が機能しなかったか又は免疫グロブリンを検出する系の感度以上にサンプルを希釈した場合である。患者サンプル中の特異的な抗原（以後“分析物抗原”と称する）を検出する免疫学的検定において、内部コントロールは、一般的に、検出する抗原と同じ抗原を含む。患者サンプルを免疫学的検定装置に添加する場合、サンプル中の任意の分析物抗原は、分析物抗原に特異的な、捕獲抗体が固定化されている免疫学的検定装置上の領域に結合する。分析物抗原に特異的な、ラベルした抗体を添加する場合、該抗体は患者サンプルから採取した任意の分析物抗原に結合し、内部コントロールの抗原に結合するであろう。免疫学的検定方法からサンプルを不用意にも抜かした場合でも内部コントロールはラベルした抗体に結合できると思われるため、該抗体はラベルした抗体を適切に添加及び機能させる調節をするが、サンプルを適切に添加する調節はしない。スタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureus)由来のプロテインＡは、免疫グロブリン、特にIgGのFc領域のC(H2)及びC(H3)ドメインに結合する能力を有する。擬免疫（非−抗体型）反応であるこの優性Fc相互作用に加え、プロテインＡは低い親和性により、ある免疫グロブリンクラスのFab領域に結合する。プロテインＡと免疫グロブリンの相互作用の型は、２つの主な実用上の利点を有する：第一に、抗体分子の抗原結合領域が関与しないため、抗原−抗体反応はいずれも影響されず、第二に、プロテインＡは幾つかの異なる種由来の免疫グロブリンと反応するため、免疫学的検定に広く適用できる可能性を有する。一方、プロテインＡは、免疫化学及び免疫組織化学に広く適用されることが分かっていながら、従来、免疫学的検定装置において内部検定コントロールとして使用されていなかった。これは恐らく研究者が、分析するサンプル中のIgGのFc 部分がプロテインＡコントロールに結合し、露出したIgGのFab部分のみを残すと思っているためであろう。IgGのFab部分はプロテインＡに結合しないため、誰も系が内部コントロールとして作用することを予想しないであろう。このように、プロテインＡは、安価かつ広く利用できるにも関わらず、従来、免疫学的検定装置においてコントロール物質として使用されてこなかった。免疫学的検定装置におけるプロテインＡの使用は、米国特許第4,169,138号公報に記載されており、この公報は抗原に結合する分析物抗体の検出法を開示し、ここで分析物抗体を含む疑いのあるサンプルを抗原をコートした表面に添加する。この特許の内容は、本明細書中に含まれるものとする。次に、水-不溶性の小さな粒子に結合するプロテインＡを添加する。粒子／プロテインＡ複合体は、存在するならば分析物抗体に結合し、その結果、分析物抗体が抗原に結合するならば眼に見える被膜を形成する。米国特許第3,966,898号公報は、本明細書中に含まれ、プロテインＡをラベルする方法を開示している。次に、ラベルしたプロテインＡを、抗原又はハプテンに結合するIgGを検出するのに使用する。前述の文献で、請求の範囲に記載の本発明を開示していると思われるものは一つもなく、先行技術であると推定されるものではない。該文献は背景の情報を得る目的で提供する。感度及び再現性を向上させながら、免疫学的検定装置の費用を削減しようとする継続的なニーズがある。検定コントロールに一般的に使用される抗体及び／又は抗原は、製造及び精製が労働集約的であるため、しばしば高価である。抗体をコントロールに使用する他の欠点は、感度がロットにより変化してしまうことであり、その結果実質的な品質管理試験を必要とする。ヒトIgGに対する抗体のように、ヒト血清中の抗体と結合する可能性を有するが、製造するのに安価で再現性があり信用できる源から得られる内部コントロールを有することが望ましいであろう。発明の概要前述の観点において、本発明の目的は、信用できかつ安価な内部コントロールを提供するとともに、サンプル中の分析物抗体又は分析物抗原を検出する分析装置及び方法を提供することである。本発明のこの及び他の目的及び特徴は、次に続く詳細な説明及び添付の請求の範囲から当業者には明白であろう。分析物抗体又は分析物抗原を含む疑いのある液体サンプル中の分析物抗体又は分析物抗原の検出の免疫学的検定に使用する分析装置及び方法を記載する。分析物抗体の検出に対し、装置は、分析物抗体が特異的であり、固相の第一領域に固定化された抗原及び固相の第二領域に固定化された非−抗体コントロール物質を含む。コントロール物質は免疫グロブリンのFcフラグメントに結合することができる。好ましい態様において、装置の固相は、１）上方及び下方表面を有する膜であって、上方表面が固定化抗原及びコントロール物質の領域を有する；及び２）膜の下方表面と接触している液体−トランスフェリング(transferring)中の吸収体を含んでおり、ヒト血清のようなサンプルを膜の上方表面に添加する場合、存在するならばサンプル中の分析物抗体が抗原に結合し、サンプル中のヒトIgG が、コントロール物質に結合する一方、サンプル残部が膜を通って吸収体に流れ込むようになっている。分析物抗原の検出に対し、装置は、前記抗原に特異的であり、固相の第一領域に固定化された捕獲抗体及び固相の第二領域に固定化された非−抗体コントロール物質を含む。本発明の方法の観点の一つにより、機能試薬が適切な順番で分析物抗体を検出する分析装置に添加されたかどうか決定できるようになる。該方法は、１）分析物抗体を含む疑いのある液体サンプルを、分析物抗体が特異的である抗原をそれぞれ固定化した第一及び第二の領域並びに非−抗体コントロール物質に施し；２）免疫グロブリンのFcフラグメントに結合可能なラベルした非−抗体物質を添加し；及び３）ラベルした物質の存在について第一領域を試験する工程を含む。図面の簡単な説明図１は、円状コントロール物質領域及び円状抗原領域を有する免疫学的検定装置の膜表面を示す。図２は、棒状コントロール物質領域及びコントロール物質領域のいずれかの側に２つに分かれた抗原領域を有する免疫学的検定装置の膜表面を示す。図３は、環の縁にあるコントロール物質及び環の縁内の抗原領域を有する免疫学的検定装置の膜表面を示す。図４は、点状で環状に存在するコントロール物質及び点状で環状に存在する縁内の抗原を有する免疫学的検定装置の膜表面を示す。図５は、中央の水平方向のバーであるコントロール物質並びに第一及び第二抗原の２本の垂直方向のバーを有する免疫学的検定装置の膜表面を示す。図６は、水平方向バーであるコントロール物質及び抗原の垂直方向バーを有する免疫学的検定装置の膜表面を示す。図７は、中央の捕獲抗体領域、上方の抗原領域及び下方のコントロール物質領域を有する免疫学的検定装置の膜表面を示す。好ましい態様の説明本発明は、非−抗体コントロール物質を使用する免疫学的検定装置及び方法を含む。本明細書中で使用される、用語“非−抗体コントロール物質”は、IgGのF cフラグメントに特異的に結合可能なタンパク質又は他の分子を指称する。コントロール物質は、IgG又は特異的な抗原に対する抗体の代わりに内部コントロールとして使用される。好ましい態様において、コントロール物質はプロテインＡである。好ましい態様の以下の詳細な説明においては、プロテインＡを用いて行われる。しかしながら、本発明は免疫グロブリンのFc領域に結合可能である他の非−抗体物質、天然物又は組換えの使用も含むよう理解される。例えば、ストレプトコッカスバクテリア(streptococcus bacteria)から単離されるプロテインＧも多くのタイプのIgGの定常領域と結合する。プロテインＧは、IgG抗体を検出、定量及び精製するのに使用されてきた。本発明は、サンプル中の分析物抗原の検出に固相上に固定化された抗原を利用する任意の免疫学的検定装置のフォーマットにおいて使用できる。例えば、固相は96-ウェルミクロ滴定プレートのウェルであることが可能であり、普通免疫学的検定に使用される。プロテインＡは一つ以上のウェルの表面にコートすることができ、一方、抗原はウェル残部にコートされる。本発明は、普通、当該技術分野において使用されているビーズ型の免疫学的検定フォーマットにおいて使用されるであろう。このフォーマットにおいて、検定コントロールビーズはプロテインＡによりコートされ、一方、テストビーズは抗原でコートされる。本発明の好ましい態様の一つは、膜-ベースの免疫学的検定装置を使用することである。膜-ベース免疫学的検定装置は、一般的に、吸収体及び吸収体の上方表面を覆う透過膜層を含む。該装置は診断技術分野において広く使用されており、例えば、米国特許第5,006,464号公報に記載されており、この公報の内容は本明細書中に含まれるものとする。本明細書中で使用される、用語“膜”は、本発明を実施するのに使用される抗原及びプロテインＡを固定化可能な任意の材料を含み、液体サンプルが通過できるものである。該材料としては、選択された抗原に直接又は間接的に結合可能である繊維ガラス、ナイロン、ニトロセルロース、並びに他の天然及び合成物質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の膜−ベース具体物である吸収体は、例えば毛管現象により、多孔性膜を通して液体を引き出すのに有用である、公知かつ従来使用されていた任意の吸収材料を使用することができる。有用な公知の材料としては、セルロースアセテート繊維、ポリエステル、ポリオレフィン又は他の吸収材料が挙げられる。本発明の検定中に使用される液体を吸収するのに十分な体積を提供するものとして選択できる、商業的に利用可能な濾紙層を使用することが便利であることも分かった。膜層及び吸収体は、普通、少なくとも膜表面部分が曝されるよう、開口部を有する囲い中に含まれる。該装置は、装置の機能を向上させる追加的な部品、例えば、サンプルの膜中の流れを改良する部品を有してもよい。該膜は当該技術分野において公知の方法を用いて前処理して、サンプル又は免疫学的検定試薬が膜表面に非−特異的に結合するのを避けてもよい。膜−ベース免疫学的検定装置において、当該技術分野において公知の技術を用いて、抗原を膜に施す。本明細書中に使用される、用語“抗原”は、免疫応答を引き出すことが可能な任意の物質を指し、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、肝炎ウイルス抗原(HCV,HBV,HAV)、トキソプラズモシスゴンジー（Toxoplsmosis gond ii）、サイトメガロウイルス(Cytomegalovirus)、ヘリコバクターピロリ(Heli cobacter pylori)、ルベラ(Rubella)等を含むが、これらに限定されない。抗原を直接膜に施すか又は微粒子上にコートすることができ、該コートされた微粒子は膜にトラップされる。抗原は、曝露した膜表面部分のみに施される。プロテインＡも、曝露した膜表面の異なる領域の膜に施される。プロテインＡの濃度は臨界的ではなく、通常、１mg/mlで十分である。曝露表面領域の残部を、IgGを含まず、かつサンプル及びプロテインＡ複合体に非−特異的に結合するのを妨げる任意の溶液、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)の溶液でブロックできる。抗原及びプロテインＡコントロールを膜上に固定化した後、分析物抗体の試験に使用するまで免疫学的検定装置を包装して保管できる。一般的な非−競争免疫学的検定において、分析物抗体を含む疑いのあるヒト血漿、血清、又は処理済全血のようなサンプルを、暴露した膜の全表面に添加し、固定化された抗原及びプロテインＡを有する領域が両方ともサンプルにより覆われるようにする。サンプル中に存在するならば、分析物抗体は抗原に結合するであろう。サンプル中に存在するIgGは、Fc領域を介してプロテインＡコントロールと結合するであろう。サンプルの性質及び使用する膜のタイプにより、洗浄緩衝液を添加し、外に付着したサンプルを膜を通して濯ぐ必要があるかもしれないし、ないかもしれない。次に、免疫グロブリンのFc領域に結合可能な非−抗体物質である、プロテインＡのような、検出される任意のマーカーでラベルしたものを膜に添加する。患者サンプルを不用意にも抜かした場合でも、抗体複合体はプロテインＡコントロールに結合するため、非−抗体複合体を使用するのが好ましい；その結果、サンプルを適切に添加することは調節されないであろう。放射性物質、酵素又は金属複合体マーカーのような、プロテインＡと接合する従来の任意のマーカーで、プロテインＡをラベルしてもよい。免疫学的物質とラベル間での接合体の形成は、以下のものにより周知である；例えば、（ａ）放射性ラベル−米国特許第3,646,346号公報、ハンター(Hunter) ら、ネイチャー(Nature)142(1962),945（ｂ）酵素ラベル−米国特許第3,654,090 号公報、第3,791,931号公報、第3,817,838号公報、ウィルソン(Wilson)ら、免疫蛍光法及び関連する染色技術、ナップ(Knapp.,W.)ら編、L.Sevier-North Hollan d，バイオ-メディカルプレス(Bio-Medical Press)、ニューヨーク−アムステルダム(New York-Amsterdam)、1978,215-224ページ（ｃ）蛍光冷却ラベル−米国特許第3,996,345号公報（ｄ）放射性ラベル−米国特許第4,062,733号公報（ｅ）蛍光又は酵素ラベル−米国特許第4,067,959号公報（ｆ）化学ルミネセンスラベル−米国特許第4,104,029号公報（ｇ）非−酵素触媒ラベル−米国特許第4 ,160,645号公報（ｈ）酵素対ラベル−米国特許第4,233,402号公報、化学的に導入した蛍光ラベル−米国特許第4,720,450号公報及び（ｉ）酵素非−イオン性電荷ラベル−米国特許第4,287,300号公報；これらは全て本明細書中に含まれるものとする。又、米国特許第4,366,241号公報に開示されているラベルを使用してもよく、この公報の内容は本明細書中に含まれる。上で参照した米国特許第3,96 6,898号公報はプロテインＡをラベルする種々の方法を記載している。好ましい態様において、プロテインＡを、コロイド金属、好ましくはコロイド金を用いてラベルする。コロイド金ラベルの使用は周知である。例えば、走査型電子顕微鏡、1981、II、9-31ページ、“免疫細胞化学”、ポーラック(Polak,J.N .)ら編、ブリストル、ロンドン、ボストン(1982)82-112ページ、及びジャーナルオブニューロサイエンスメソッド、7(1983)、1-18ページを参照のこと。目視により検出でき、その結果、放射性同位体のような、他のタイプのマーカーを検出するのに必要な装置を必要としないため、コロイド金粒子マーカーは、他の従来マーカーと比較して使用が簡単である。さらに、酵素とは異なり、コロイド金粒子マーカーは、基質を添加する追加的な工程を必要としない。ラベルしたプロテインＡを免疫学的検定装置の膜に添加する場合、ラベルしたプロテインＡは、プロテインＡコントロールに結合しているIgGのFc領域と、抗原に結合している分析物抗体のFc領域に結合するであろう。任意の特別なメカニズムに限定されることなく、プロテインＡコントロール領域で結合している抗体は、IgG免疫複合体によりプロテインＡへのさらなる結合に利用できるFcフラグメントを未だ有しているという仮説を立てる。結果として、さらなる結合に利用できるFab領域のみによりプロテインＡコントロールに結合しているFc領域の全部を有するというより、免疫複合体は一種の抗体を含み、コントロールに結合するFc領域により、プロテインＡ複合体と結合するのに利用できるFc領域を有する第二抗体と複合体を形成する。検定を行った後、抗原及びプロテインＡコントロールの領域の両方でラベルが検出される場合、サンプルは分析物抗体を含有し、試験は陽性である。抗原領域ではなく、プロテインＡコントロール領域でラベルが検出される場合、試験は陰性である。もし、ほとんど又は全くラベルが検出されないならば、免疫学的検定操作に間違いがあったか、一種以上の試薬が不完全であったか、又はIgGを検出する系の感度以上にサンプルを希釈した場合である。本発明は、サンプル中の分析物抗原を検出する固相に固定化された捕獲抗体を利用するサンドウィッチ型免疫学的検定フォーマットにも使用できる。この態様において、分析物抗原の一つのエピトープに特異的なモノクローナル捕獲抗体を固相領域の一部に固定化し、一方、プロテインＡを固相の第二領域に固定化する。分析物抗原を固相の第三領域に接種する。ヒト血清のような患者サンプルを装置に添加する場合、サンプル中に存在するならば分析物抗原は捕獲抗体に結合し、サンプル中のIgGはプロテインＡに結合するであろう。次に、分析物抗原の第二エピトープに特異的なラベルした第一抗体及びIgGに特異的なラベルした第二抗体を含有するモノクローン抗体カクテルを添加する。ラベルした第一抗体は、陽性の試験結果を示す捕獲された任意の分析物抗原に結合し、固相の第三領域に接種した分析物抗原も同様である。膜上に接種した分析物抗原は、ラベルした第一抗体を適切に機能させる試験のコントロールとして働く。このように、検定が正しく行われかつ試薬が適切に機能したならば、この領域は常にラベルの存在を示すべきである。ラベルした第二抗体は、プロテインＡに結合しているIgGに結合するであろう。モノクローン抗体カクテルを使用するよりも、ラベルした第一及び第二抗体を、サンプル添加後、続いて添加できる。別のフォーマットにおいて、サンプル及びラベルした第一抗体を一緒に前もって混合し、固相に同時に添加できる。次に、ラベルした第二抗体を添加する。種々の他の検定と交換することは、当業者にとって、容易に明白であろう。ラベルした第一及び第二抗体を、コロイド金属で、該技術分野において公知であり、上の引用文献記載の方法を用いてラベルするのが好ましい。互いに交差反応しないように、２つの抗体を選ぶ。それ故、サンプル中に分析物抗原が存在しないならば、捕獲抗体のサイトにおいて染色を生じないことにより、試験結果が陰性であることが示されるであろう。サンプル中のIgGが結合しかつ抗−ヒトIgG −コロイド金属複合体によりラベルされるため、プロテインＡのサイトのみが染色される。検定中にサンプルを不用意にも抜かしてしまった場合、複合体中の IgGの濃度は、サンプルと比較して非常に低いため、プロテインＡコロイド金に結合しているラベルはほとんどないかゼロであろう。このようにして、不適切な検定操作をコントロールする。もし、ヒトのIgGに特異的なラベルした抗体を使用せずに分析物抗原に特異的な一種のラベルした抗体を使用するならば、プロテインＡは、サンプルからのIg Gにすでに結合しているFc結合サイトの殆どを有しているため、内部コントロールとして働くラベルした抗体により、プロテインＡのサイトにおいて十分には染色されないであろう。このように、サンドウィッチ型免疫学的検定において、分析物抗原に対するラベルした抗体と接合しているヒトIgGに特異的なラベルした抗体を使用するのが好ましい。本明細書中に記載した発明がさらによく理解されるよう、次に続く実施例及び図の詳細な説明を述べる。これらの実施例及び図は例示する目的のみであり、いかなる方法においても本発明の範囲を制限しないように解釈されるものと理解されるべきである。実施例１免疫学的検定装置膜上へのプロテインＡコントロールの接種図１を参照し、20mMリン酸緩衝食塩水中の1mg/mlプロテインＡ溶液0.5μlをEY （商標）FASTCHEK（商標）装置１の膜２上に接種し、10分から２時間まで乾燥する。使用するならば、他の希釈剤のpH範囲は６から8.5の間であることが好ましい。一旦膜上に接種及び乾燥したら、疎水性プロテインＡは検定中に洗い落とされることはないであろう。接種したプロテインＡ３は膜表面で丸い領域を覆う。膜上に接種する場所はどこでもよいが、図１に示したように、免疫学的検定装置の縁５が好ましい。これは、膜の中心部分がHIV １及びHIV ２又はHCVのような、接種した抗原４を含むためである。図２を参照し、上記方法と同じ方法で、プロテインＡをEY（商標）FASTCHEK（商標）装置１の膜２上に接種する。しかしながら、この態様において、接種したプロテインＡ３は、EY（商標）FASTCHEK（商標）装置１の中央にバーを形成する。この態様により、２種の異なる抗原を接種でき、一方がバーの上の４であり、他方がバーの下の６である。この種の装置を用いて、同一サンプル中で２種の異なる分析物抗体の存在を試験できる。他の態様において、図５に示したように、抗原バーの間に水平に置かれたプロテインＡ３のバーと一緒に、２種の異なる抗原を平行なバー４及び６の形態で接種することができる。別の態様において、プロテインＡは、EY（商標）FASTCHEK（商標）装置１の縁５の周囲に（図３に示したように）開円３又は（図４に示したように）点状に存在する円を形成するよう接種することができる。これらの態様により、サンプルが膜の全表面に添加されることが確実になる。図６を参照し、プロテインＡをバー３の形態で接種することができ、かつ、抗原を第二のバー４の形態で接種し、プラスの符号を形成するよう、プロテインＡの中央で交差させることもできる。検定操作の後、“−”符号の形でレッドゾーンの存在が試験結果が陰性であることを示し、“＋”符号で試験結果が陽性であることを示す。実施例２コロイド金とプロテインＡ複合体の製造コロイド金は、本明細書中に含まれるフォールク（Faulk.W.P.）らの免疫化学 (Immunochem.)8:1081(1981)の方法により製造される金のゾルを含む。簡単に要約すると、0.01％のクロロ−金酸溶液を含む蒸留水100mlを１％のクエン酸三ナトリウム４mlと混合し、15分間沸騰する。該溶液は520nmにおける光学濃度が約１のときに黄色から赤に変化する。プロテインＡ／コロイド金の複合体は、コロイド金溶液100mlと水中に溶解したプロテインＡの0.006mg/ml溶液100mlを混合することにより製造できる。プロテインＡは、凍結乾燥した形態で商業的に入手可能であり、直接水に溶解させることができる。又、複合体を0.05％NaN₃で希釈した1-3%のBSA中でより保存安定な形態で製造することができる。実施例３抗体検出検定実施例１に記載したように、プロテインＡ及び抗体を接種した後、免疫学的検定装置をヒト血清又は血漿中の分析物抗体の存在を試験するのに使用する。１％ BSA又は他の阻止緩衝液２滴を膜表面に添加し、膜中に吸収させる。次に、ヒト血清又は血漿１滴を膜中に吸収させる。次に、実施例２で製造したプロテインＡ −コロイド金の複合体２滴を添加する。ラベルしたプロテインＡが膜を通って吸収した後、プロテインＡコントロール３に赤い斑点が現れる。これは、適当な試験処理が続いたことを示している。抗原４上の赤い斑点は、添加したサンプルに分析物抗体が含まれていたことを示す。実施例４抗原検出検定図７を参照し、上記の実施例１と同じ方法で、プロテインＡ３をEY（商標）FA STCHEK（商標）装置の膜２上に接種する。捕獲抗体７は、典型的には分析物抗原の１つのエピトープに特異的なモノクローン捕獲抗体であり、当該技術分野において公知の方法を用いて固相の他の領域上に固定化する。分析物抗原８も膜上に固定化する。プロテインＡ、抗原及び捕獲抗体を接種した後、免疫学的検定装置をヒト血清又は血漿中の分析物抗原の存在を試験するのに使用する。１％BSA又は他の阻止緩衝液２滴を膜表面に添加し、膜中に吸収させる。次に、ヒト血清又は血漿１滴を膜中に吸収させる。次に、分析物抗原のエピトープに指向する抗体をラベルした第一のコロイド金及びヒトIgGに特異的な抗体をラベルした第二のコロイド金を有するモノクローン抗体カクテルを添加する。ラベルしたモノクローン抗体カクテルが、膜を通って吸収した後、プロテインＡコントロール３上に赤い斑点が現れる。これは、適当な試験方法が続いたことを示す。分析物抗原８上の赤い斑点は、分析物抗原に特異的なモノクローン抗体が適切に機能したことを示している。捕獲抗体上の赤い斑点は試験したサンプルが分析物抗体を含んでいることを示している。

Claims

【特許請求の範囲】１．第一分析物抗体を含有する疑いのある液体サンプル中で該抗体を検出する免疫学的検定に使用する分析装置であって、（ａ）固相、（ｂ）第一分析物抗体が特異的であり、前記固相の第一領域に固定化されている、第一抗原；及び、（ｃ）前記固相の第二の領域上に固定化されている非−抗体コントロール物質、該コントロール物質は免疫グロブリンのFcフラグメントに結合可能である、を含む前記装置。２．固相が、下方表面と上方表面を有する透過膜を含み、第一及び第二領域が膜の上方表面に位置する請求項１記載の装置。３．固相が、ミクロ滴定プレートを含み、第一及び第二領域がミクロ滴定プレートのウェルに位置する請求項１記載の装置。４．固相が免疫学的検定ビーズを含む請求項１記載の装置。５．第一及び第二の領域が点状形態である請求項２記載の装置。６．（ｄ）第二分析物抗体が特異的であり、固相の第三領域に固定化されている、第二抗原をさらに含む請求項２記載の装置。７．前記第一及び第三領域が点状形態であり、前記第二領域が、前記第一及び第三領域間に水平に配置する棒状形態である請求項６記載の装置。８．前記第一領域が点であり、前記第二領域が、前記第一領域を取り囲む開円の形態である請求項２記載の装置。９．前記第一領域が第一バーの形態であり、第二領域が、前記第一バーを横断する第二バーの形態である請求項２記載の装置。 10．さらに、前記膜の低いほうの表面に接触する液体−トランスフェリング中の吸収体を含む請求項２記載の装置。 11．前記抗原が、ヒト免疫不全ウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原、トキソプラズモシスゴンジー(Toxoplamosis gondii)、サイトメガロウイルス(Cytomegaloviru s)、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)及びルベラ(Rubella)から成る群から選ばれる請求項１記載の装置。 12．前記非−抗体コントロール物質が、天然プロテインＡ、組換えプロテインＡ、天然プロテインＧ、及び組換えプロテインＧから成る群から選ばれる請求項１記載の装置。 13．前記非−抗体コントロール物質がプロテインＡである請求項１記載の装置。 14．分析物抗原を含有する疑いのある液体サンプル中で該抗原を検出する免疫学的検定に使用する分析装置であって、（ａ）固相、（ｂ）固相の第一領域に固定化されている捕獲抗体であって、前記分析物抗原に特異的である前記捕獲抗体及び、（ｃ）前記固相の第二領域に固定化されている非−抗体コントロール物質であって、免疫グロブリンのFcフラグメントに結合可能な前記コントロール物質、を含む前記装置。 15．（ｄ）固相の第三領域に固定化されている分析物抗原をさらに含む請求項14 記載の装置。 16．前記固相が、下方表面と上方表面を有する透過膜を含有し、前記第一及び第二領域が、前記膜の上方表面に位置している請求項14記載の装置。 17．前記固相がミクロ滴定プレートを含有し、前記第一及び第二領域が前記ミクロ滴定プレートのウェルに位置している請求項14記載の装置。 18．前記固相が免疫学的検定ビーズを含有する請求項14記載の装置。 19．さらに前記膜の下方表面と接触する液体−トランスフェリング中の吸収体を含有する請求項16記載の装置。 20．前記非−抗体コントロール物質が、天然プロテインＡ、組換えプロテインＡ、天然プロテインＧ及び組換えプロテインＧから成る群から選ばれる請求項14記載の装置。 21．前記非−抗体コントロール物質がプロテインＡである請求項14記載の装置。 22．分析物抗体を含有する疑いのある液体サンプル中で該抗体を検出するのに使用する分析装置に、適切な順番で、機能的試薬が添加されているかどうかを決定する方法であって、前記装置が、（ａ）固相、（ｂ）前記分析物抗体が特異的であり、前記固相の第一領域に固定化されている抗原、及び（ｃ）前記固相の第二領域に固定化されている非−抗体コントロール物質であって、免疫グロブリンのFcフラグメントに結合可能な前記コントロール物質、を含み；次の工程：前記第一及び第二領域に、前記液体サンプル及び免疫グロブリンのFcフラグメントに結合可能なラベルした非−抗体物質を施し；そして、前記のラベルした物質の存在について前記第一領域を試験することを含む前記方法。 23．前記固相が下方表面及び上方表面を有する透過膜を含有し、前記第一及び第二領域が前記膜の上方表面に位置する請求項22記載の方法。 24．前記固相がミクロ滴定プレートを含有し、前記第一及び第二領域が前記ミクロ滴定プレートのウェルに位置する請求項22記載の方法。 25．前記固相が免疫学的検定ビーズを含む請求項22記載の方法。 26．前記装置がさらに前記膜の下方表面と接触する液体−トランスフェリング中の吸収体を含有する請求項23記載の方法。 27．前記抗原が、ヒト免疫不全ウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原、トキソプラズモシスゴンジー(Toxoplasmosis gondii)、サイトメガロウイスル、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)、及びルベラ(Rubella)から成る群から選ばれる請求項22記載の方法。 28．前記非−抗体コントロール物質が、天然プロテインＡ、組換えプロテインＡ、天然プロテインＧ及び組換えプロテインＧから成る群から選ばれる請求項22記載の方法。 29．前記非−抗体コントロール物質がプロテインＡである請求項22記載の方法。 30．前記のラベルした非−抗体物質が、ラベルした天然プロテインＡ、組換えプロテインＡ、天然プロテインＧ及び組換えプロテインＧから成る群から選ばれる請求項22記載の方法。 31．前記のラベルした非−抗体物質がプロテインＡである請求項22記載の方法。 32．前記のラベルした非−抗体物質が金属コロイドである請求項22記載の方法。 33．前記液体サンプルを、ラベルした非−抗体物質の添加前に、前記の第一及び第二領域に添加する請求項22記載の方法。 34．分析物抗体を含有する疑いのある液体サンプル中で該抗体を検出する分析方法であって、ａ）前記サンプルを分析装置に添加し、前記装置が、ｉ．固相、 ii．前記分析物抗体が特異的であり、固相の第一領域に固定化されている抗原、及び iii．固相の第二領域に固定化されている非−抗体コントロール物質であって、前記コントロール物質が免疫グロブリンのFcフラグメントに結合可能であることを含み、ｂ）免疫グロブリンのFcフラグメントに結合可能なラベルした非-抗体物質を前記装置に添加し、及びｃ）前記固相の第一及び第二領域でラベルした物質の存在を試験することを含む、前記方法。 35．前記固相が、下方表面及び上方表面を有する透過膜を含み、前記第一及び第二領域が前記膜の上方表面に位置する請求項34記載の方法。 36．前記固相がミクロ滴定プレートを含み、前記第一及び第二領域が前記ミクロ滴定プレートのウェルに位置する請求項34記載の方法。 37．前記固相が、免疫学的検定ビーズを含む請求項34記載の方法。 38．前記装置がさらに前記膜の下方表面に接触する吸収体を含有する請求項34記載の方法。 39．前記抗原が、ヒト免疫不全ウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原、トキソプラズモシスゴンジー(Toxoplasmosis gondii)、サイトメガロウイスル、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)、及びルベラ(Rubella)から成る群から選ばれる請求項34記載の方法。 40．前記非−抗体コントロール物質が、天然プロテインＡ、組換えプロテインＡ、天然プロテインＧ及び組換えプロテインＧから成る群から選ばれる請求項34記載の方法。 41．前記非−抗体コントロール物質がプロテインＡである請求項34記載の装置。 42．前記のラベルした非−抗体物質が、ラベルした天然プロテインＡ、組換えプロテインＡ、天然プロテインＧ及び組換えプロテインＧから成る群から選ばれる請求項34記載の方法。 43．前記のラベルした非−抗体物質がプロテインＡである請求項34記載の方法。 44．ラベルした前記の非−抗体物質が金属コロイドである請求項34記載の方法。 45．前記液体サンプルを、ラベルした非−抗体物質の添加前に、前記分析装置に添加する請求項34記載の方法。 46．分析物抗原を含有する疑いのある液体サンプル中で該抗原を検出する分析方法であって、ａ）サンプル並びに免疫グロブリンに特異的なラベルした第一抗体及び分析物抗原に特異的なラベルした第二抗体を含むカクテルを分析装置に添加し、前記装置が、ｉ．固相、 ii．前記固相の第一領域に固定化されている捕獲抗体であって、前記捕獲抗体が前記分析物抗原に特異的であり、及び iii．前記固相の第二領域に固定化されている非−抗体コントロール物質であって、前記コントロール物質が免疫グロブリンのFcフラグメントに結合可能であることを含み、ｂ）前記固相の第一領域にラベルした抗体の存在を試験することを含む、前記方法。 47．前記固相が、下方表面及び上方表面を有する透過膜を含み、前記第一及び第二領域が前記膜の上方表面に位置する請求項46記載の方法。 48．前記固相がミクロ滴定プレートを含み、前記第一及び第二領域が前記ミクロ滴定プレートのウェルに位置する請求項46記載の方法。 49．前記固相が、免疫学的検定ビーズを含む請求項48記載の方法。 50．前記装置がさらに前記膜の下方表面に接触する液体−トランスフェリング中の吸収体を含有する請求項47記載の方法。 51．前記の非−抗体コントロール物質が、天然プロテインＡ、組換えプロテインＡ、天然プロテインＧ及び組換えプロテインＧから成る群から選ばれる請求項46 記載の方法。 52．前記非−抗体コントロール物質がプロテインＡである請求項46記載の方法。 53．前記捕獲抗体及び前記ラベルした第一抗体がモノクローン抗体であって、前記捕獲抗体が前記分析物抗原の第一エピトープに対する特異性を有し、前記ラベルした第一抗体が前記分析物抗原の第二エピトープに対する特異性を有する請求項46記載の方法。 54．前記ラベルした第一及び第二抗体のラベルが金属コロイドである請求項46記載の方法。