JPH06504765A

JPH06504765A - 新規抗血栓症物質

Info

Publication number: JPH06504765A
Application number: JP4501301A
Authority: JP
Inventors: スカボロ，ロバート　エム．
Original assignee: コー　セラピューティックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1990-11-16
Filing date: 1991-11-14
Publication date: 1994-06-02
Also published as: AU668079B2; AU9090591A; JP2002136296A; EP0557442A1; US5744584A; WO1992008472A1; CA2101759A1; US5679542A; EP0557442A4; US5342830A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■組■Ｕ ■」本発明は血小板粘着インヒビターに関する。さらに詳しくは、本発明は、フォノ・ピルプラント因子（ｖＷＦ）が血小板糖タンパク質ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体と結合するのを阻害し、したがって血小板−血管壁の粘着を防止するタン／ｆり質およびペプチドに関スる。これらのペプチドのいくつかはヘビ毒中に存在する。

１１Δ挟歪心臓血管系内の血栓症は、血管閉塞疾患の主要な機序であると考えられ、西欧社会における高い罹患率と死亡率の原因である。したがって、これらの多（の疾患を治療するため、抗血栓物質が広（使用されている（例えば、５ｔａｉｎら、以〃１１ａｔｉｏｎ、　ｇｏ巻、１５０１〜１５１３頁、　１９１１９年参照）。

し力ｓ（，４ｔずれのグループの薬剤も、すべての個体に対して完全（こ満足される薬剤ではな（、可能な治療剤のし／ｆ−１−リーへの追加ζま常に歓迎される。

血栓症発生の機序は複雑であるが、部分的に理解されて（する。アテローム性動脈硬化症班の破裂によるか、またｌｔ引き続く血管形成の間の該班の機械的除去のなどの初期外傷のために、血小板−非血小板相互作用によって血小板が損傷血管壁と粘着し、続いて血小板が凝集（血小板−血小板相互作用）するともにフィブリンの沈着が起こる。この現象の続発は、血漿タンパク質と、特定の血小板表面糖タンパク質レセプターとの相互作用によって制御される。血小板の粘着は、損傷に対する初期の反応であると考えられるから、粘着性血小板によって仲介される血栓症および／または再狭窄を予防もしくは改善するために、阻害するのに特に望ましい標的である。

未刺激の循環血小板は数種の粘着性タンパク質に対するレセプターを含有する。

このタンパク質の中で、ラミニンはＶＬＡ２およびＶＬＡ６と結合し、またコラーゲンはＶＬＡ２、ＧＰＩＶなどと結合する。血小板の内皮下層への初期の粘着は、血小板表面に存在するＧＰＩｂ−ＩＸ複合体の、特に動脈血管の閉塞部位に見られる高い剪断速度の条件下で血管壁に固定化される７オン・ビルプラント因子（ｖＷＦ）に対する結合によって仲介されていると考えられる。この血小板ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、一般に休止血小板上で機能するが、通常、血漿が含有するｖＷＦを捕捉しない。

通常の環境下では、動脈表面は血小板を粘着させる粘着性タンパク質リガンド（ｖｌＦ）を提供しないので、血小板の粘着は血管損傷の部位に捕捉されたｖＷＦに限定される。

捕捉されたｖｌＦＦの存在によって血小板の血管内皮への粘着が保持されると、血小板は活性化されて血小板凝集体を形成し得、これに付随して、活性化されたＧＰＩＩｂ−１１１ａレセプターによって、フィブリノーゲン（Ｆｇ）および血漿が含有するｖＷＦの結合が起こる。したがって、ＧＰＩｂ−ＴＸに捕捉されたｖＷＦの相互作用による未活性化血小板の粘着を特異的に阻害する物質は、特に、狭窄によって高い剪断応力がもたらされる血管内で血栓症が起こるのを阻害し得る。

ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、ＧＰＩＸと非共有結合的に複合したＩｂ表面メンプランのヘテロダイマー（ＩｂαとＩｂβ）で構成され、約２５，０００コピ一／血小板表面の密度で存在している。この複合体の欠除が、まれな先天的出血疾患であるベルナール・スリエ症候群の原因であることが分かっており、この症候群は、血小板表面に現れるＧＰＩｂ−ＩＸ複合体の欠除、および動脈と血小板の粘着不全を特徴とする。フォノ・ピルプラント病の特徴であるフォノ・ビルプラント因子の欠損も、動脈と血小板の粘着不全をもたらすことが分かつている。

ＧＰＩｂ−ＩＸ／ｖｌの相互作用を妨害できる物質が知られている。

Ｋｉｒｂｙら、Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、３４巻、７７０頁、１９７５年には、エバンスブルー染料が、ｖＷＦとホルムアルデヒド固定血小板とのりストセチンによって誘発される結合をインビトロで阻害することが報告されている。Ｇｅｒａｔｚら、　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅ　ｏｓｔａｓ’ｓ。

３９巻、４１１頁、１９７８年では芳香族アミジノ化合物類による同じ作用が証明されている。Ｐｈ１ｌｌｉｐｓら、叶■此　７２巻、　１８９８〜１９０３頁、１９８８年には、リストセチンによって誘発される血小板の凝集反応および血小板が豊富な血漿中での剪断力によって誘発される血小板の凝集反応は、先に発表された他の化合物より１０倍低い濃度でトリフェニルメチル化合物のアラリントリカルボン酸（ＡＴＡ）により有効に阻害されることを示した。またＡＴＡは、冠状動脈血栓症のインビボでの有効なインヒビターであることが立証されている（Ｓｔｒｏｎｙら、Ω１剋１旦ｔｏｎ　８０巻。

１１−２３頁（Ａｂｓｔｒａｃｔ）　１９８９年；　ＰＣＴ出願第ＷＯ３９１０４１６６号）。

また、ｖＷＦとＧＰＩｂ−ＩＸ複合体の結合反応は、Ｒｕａｎら、紅■」−ｂ１虹■ｕ４９巻、１５１１頁、１９８１年とＣａ１ｌｅｒらｌ　ＬＬＱＱ！！１　６１巻。

６９頁、１９８３年とに開示されているように、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体と免疫反応性のモノクローナル抗体類によって阻害される。これらの抗体は、ｖＷＦと血小板のりストセチン誘発結合反応を阻害する。Ｂｅａｋｅｒら、　社史４７４巻、６９０〜６９４頁、１９８９年には、これらの抗体もしくはその免疫反応性フラグメントの１つは、モルモット中でのＧＰＩｂの機能をインビボでブロックするが、ＡＤＰ、コラーゲンもしくはトロンビンによって誘発される血小板凝集反応に対しては全く効力を発揮しない。

ヒ）　ｖＷＰに対して免疫反応性のモノクローナル抗体は、高剪断速度下での血小板とコラーゲンの粘着をブロックする（Ｐｒｅｓｓｉｎａｕｄら、Ｊ　Ｌａｂ　Ｃ１ｎ　Ｍ　ｄ、１１２巻、５８〜６７頁、１９８８年、およびＣａｄｒｏｙら、Ｃｃｕ　ａｔｉｏｎ　８０：５ｕｐｐ１．　ｌｌ−２４，１９８９年）。

ブタのフォノ・ビルプラント因子に対するマウスのモノクローナル抗体は、内在の血小板の機能を発揮することな（、正常なブタに抗血栓の状態を誘発する（Ｂｅｌｌｉｎｇｅｒら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　、８４巻、８１００〜８１０４頁、１９８７年）。

グリコカリジンの４５ｋｄのタンパク質分解性フラグメント（ＧＰＩｂフラグメント）とその誘導体は、ｖＷＦと血小板の結合反応を阻害するので、これらのペプチドは、ヨーロッパ特許出願公開第３１７２７８号に示されているように抗血栓物質として使用し得る。オーストラリア特許出願第ＡＵ８７７７３７１５号に記載されているように、ｖＷＦのフラグメントも上記の結合反応を阻害する。Ｖｉｎｃｅｎｔｅら、Ｊ　Ｂ　ｏｌ　Ｃｈｅｗ、２６５巻、２７４〜２８０頁、１９９０年には、リストセチンおよびボトロセチンで誘発されるｖＷＰと血小板の結合反応をブロックする、ＧＰＩｂ由来のペプチドが開示されている。

本発明のペプチドは、ｖＷＦと、血小板が含有するＧＰＩｂ−ＩＸ複合体との結合を特異的に阻害することにより、抗血栓症法の別の方法を提供する。これらのペプチドは抗血栓治療に有用な薬剤である。

ｌ且ｑ皿示本発明は、抗血栓物質として有用な、内皮下層に対する血小板の粘着のペプチドインヒビターに関する。このようなタンパク質のい（つかはヘビの毒中に存在することが見出され、本発明はこれらのタンパク質の精製法を提供するものである。

さらに所望のインヒビターを含有するこれらの毒の同定法も示す。

したがって、１つの局面では、本発明は、ｖＷＦ／ＧＰＩｂ−ＩＸ相互作用のインヒビターである抗血栓物質に関する。より特定すれば、これらのペプチドは、　ＧＰＩｂ−ＩＸに結合して、ｖＷＦが結合するのをブロックすると考えられる。これらの抗血栓物質は、血小板抗粘着物質と総称する。本明細書に記載されているヘビ毒中に見出された血小板抗粘着物質は、各々１２〜１４ｋｄの２つの異なるサブユニットがジスルフィド結合されて構成される２４〜２８ｋｄのペプチドである。ペプチド抗粘着物質の２つの各サブユニット間には、有意な配列の相同性が存在する。

別の局面では、本発明は、本発明の血小板抗粘着物質を提供する、ヘビ毒を含む生物体液の同定方法に関する。

さらに他の局面では、本発明は、本発明の血小板抗粘着物質を用いて血栓症を予防もしくは改善する方法およびその抗粘着物質を含有する製薬組成物に関する。

図１は、ＮＨａＯＡｃグラディエンド溶離液を用いＣＭセファロースで精製されるＣＨＨＧＰＩｂインヒビターを２５４ｎｍの波長光の吸光度でモニターしているクロマトグラムを示す。

図２は、被検ＣＨＩ　ＧＰＩｂインヒビターのＲＰＬＣ（Ｃ４、アセトニトリル／　ＴＦＡグラディエンド溶離液）によるイオン交換精製性由来で、２１４ｎｍ波長光でモニターされている活性画分を示す。

図３は、図２に示す活性画分について実施した５ＯＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

図４は、Ｃ４カラムで精製されたＣＨＨ−ＢのＲＰＬＣクロマトグラムを示す。

図５は、０４カラムで精製されたＣＨＨ−ＡのＲＰＬＣクロマトグラムを示す。

図６は、シー・エイチ・ホリダス（Ｃ，Ｆｉ、　ｈｏｒｒｉｄｕｓ）のＧＰＩｂインヒビターのαおよびβ鎖のアミノ酸配列を示す。

図７は、ボトロセチンによって誘発される　＋２！ＩＩ−フォノ・ビルプラント因子の固定洗浄血小板への結合の、ＣＨＨ−Ｂ　ＧＰ！ｂインヒビターによる用量依存性阻害を示す。

図８は、セラステス・セラステス（堕ロｕＪゴ１匡旺且）　由来のＶＣＣＧＰＩｂインヒビターの０４カラムによる精製のＲＰＬＣクロマトグラムを示す。

図９は、ＰＲＰ中でのりストセチン誘発血小板凝集反応の、精製クロタラス・エイチ・ホリダス（江吐紅ｕｓ１１．ｈｏ■貝皿）抗粘着物質による用量依存性阻害（上方のグラフ）と、セラステス・セラステス抗粘着物質による凝集反応の用量依存性阻害とを示す。

光層ｍ様本発明の血小板抗粘着物質は、抗血栓物質としてのその挙動に関連する明白なインビトロでの特性をもっている。本発明の抗粘着物質はすべて、　ＡＤＰ、コラーゲンおよびトロンビンによって誘発される血小板凝集反応を阻害できないので、これはＧＰＩ［ｂ−１［Ｉａに結合するＦｇのインヒビターではな（、その血小板凝集反応を阻害しない。しかし、本発明の抗粘着物質は、Ａ１１ａｉｎ、　Ｊ、Ｐ、ら、Ｊ　Ｌａｂ　Ｃ１１ｎ　Ｍｅｄ、８５巻、３１８頁、１９７５年およびＲｅａｄ、　Ｍ、　Ｓ、ら、Ｊ　Ｃｉｎ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ、１０１巻、７４頁、１９８３年に記載されているような標準のアッセイでは未刺激の血小板の凝集反応を防止する。また本発明の抗粘着物質は、Ｒｕｇｇｅｒ　ｔ、　ｃ、　Ｍ、ら、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、７２巻、１−１２頁、１９８３年のアッセイのような櫟準アツセイを用いた場合、標識を付けたｖＷＦの洗浄血小板への結合を阻害する。

以下に述べるのは、本発明の血小板抗粘着物質が明確な試験結果を示すアッセイである。

ｌ）血小板のりストセチンまたはボトロセチンによる凝集の阻害：このアッセイでは、Ｂｒ　１ｎｋｈａｕｓ、　Ａ、　Ｍ、ら、Ｍｅｔｈ　Ｅｎ　ｒｈｏ　、１６９巻、１４９〜１４３頁、１９８９年に記載されているようにして調製した、ホルムアルデヒドで固定し洗浄した血小板を、Ｔｈｏｒｅｌｌ。

Ｌ、ら、…胆畦」■、　３５巻、４３１〜４５Ｇ頁、１９８４年に記載されているのと同様にして調製した精製ｖＷＰと混合し、次いで抗生物質のりストセチンまたはヘビ毒凝集素のボトロセチンによって凝集反応を開始させる。血小板に対する抗粘着活性を試験する物質の濃度を増大させたものを、凝集反応誘発物質を添加する前に、ｖＷＦの存在下、固定血小板とともに１分間インキュベートする。凝集反応は、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　（米国、ペンシルベニア州、ババータウン）が供給しているような市販の血小板凝集計（ａｇｇｒｅｇｏｓ＋ｅｔｅｒ）で測定され、ｖＷＦとＣＰＩｂ−ＩＸ複合体の結合反応の尺度となる。

（いくつかの試料は、固定血小板アッセイの代わりに、血小板が豊富な血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ　ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ）中で試験し得るが、前者の形態のアッセイは、高濃度の凝固酵素を含有するヘビ毒のような粗原料については好ましくない）。

２）−ｖＷＦの　ハ　との　ムの本発明の抗粘着物質は、放射性標識、ビオチンまたは他の方法で標識をつけたｖＷＦの血小板に対する、リストセチンもしくはボトロセチンによって誘発される結合反応もまた阻害する。血小板は洗浄された血小板として提供され得、アッセイは、Ｒｕｇｇｅｒｉら、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓ、７２巻、１〜１２頁、１９８３年（上記文献）に記載されているのと同様にして、ＥＬＩＳＡプレートに結合させたグリコカリジンに対して、または任意の適切な形態の血小板もしくはＧＰＩＸ−１ｂに対して実施し得る。

したがって一般に、本発明の抗粘着物質は、リストセチンもしくはボトロセチンで誘発された血小板凝集反応を阻害する性能を測定するアッセイと、リストセチンもしくはボトロセチンで誘発されたｖｌＦＦが血小板と結合するのを阻害する性能を測定するアッセイの両方で陽性である。しかし本発明の抗粘着物質は、フィブリノーゲンがＧＰｎｂ−Ｈａレセプターと結合するのを阻害しない。

の　の６ヘビ毒のような生物体液は、本発明の血小板抗粘着物質を含有するが、上記のような、固定し洗浄された血小板によるリストセチン／ボトロセチン誘発凝集反応の阻害アッセイ、またはｖＷＦの、血小板が含有するＧＰＩｂ−ＩＸ複合体への結合の阻害を測定するアッセイを用いて有効に同定される。

活性のある候補物質は、単離・精製された形態で血小板抗粘着物質を得るために精製工程に付される。サイズクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣのような各種のタンパク質精製法を使用し得るが、代表的で有効な方法は次のとおりである。

凍結乾燥された形態の粗毒約１０〜１０００■ｇを希酢酸（０，５Ｍ）で再構成し、次にセファデックスＧ−５０のようなサイジングカラムに入れ、次に同じ溶媒中で溶離する。酢酸を除（ために凍結乾燥した後、先に述べたような、固定され洗浄された血小板と精製ｖＷＦとのボトロセチンもしくはりストセチンで誘発された凝集のアッセイを利用して、各画分を抗粘着活性について検定する。

サイジングカラムから同定された活性画分を次に、そのヘビ毒中の抗粘着物質のイオン電荷によって、カルボ亭ジメチル（ＣＭ）−セファシルまたはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）　−セファシルのカラムに吸着させ、次に、イオン強度を増大させながら用いる酢酸アンモニウム緩衝液でカラムから溶離させる。カラムから得た画分を再び凍結乾燥して上記の揮発性塩を除き、次いで上記の血小板凝集アッセイを利用して検定する。（多くの粗ヘビ毒中に存在する凝固活性が活性画分から除去されたとき、場合によっては、この段階で、血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）を固定・洗浄された血小板の代わりに用い得る）。

イオン交換ステップから得た活性画分は次に、ＶｙｄａｃのようなＣａＲＰＬｃカラムの調製用逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）を用い、アセトニトリル（２〜７０％アセトニトリル）および０．１％ＴＦＡ／＋１２０を含有するグラディエンド液で溶離して精製し得る。グラディエンド液の濃度の勾配と流量は、通常の方法を用いて最適化される。活性画分は、この場合は血小板製剤としてＰＲＰを用い、前記の血小板凝集アッセイによって決定される。得られた活性画分をプールし、濃縮し、次いで分析用のＨＰＬＣもしくは５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて均質性について試験する。

上記のまたは他の精製法によって得ることができる本発明の抗粘着物質には、下記のヘビからなる群から選ばれる毒から得られる物質が含まれる。すなわちアゲキストロトン・アクタス（Ａ　ｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ａｃｔｕｓ）　、アゲキストロトン・ノ＼リス・ブロモフイ（ｎＵ記μ溢東１１■吐■可且）、アゲキストロトン・コントルトリックス・モカセン（Ａ　ｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　ｍｏｋａｓｅｎ）、ビティス・アリエタンス（−旺匡口■）、ビティス・コーダリス（旧工匡組匡紅口）、ビティス・ガボニカ（Ｂｉｔｉｓ■ｂｏｎｉｃａ）　、ビティス・ジーーリノセロス（Ｂｉｔｉｓ　Ｈ，ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ）　、ボスロブス・アスｔ＜−（ＢＯ止％ａ°凹）、ボスロプス・アルタナータ（肢植匹■ａｌ　ｔｅｒｎａｔａ）〜ボスロブス・アトロックス（Ｂｏｔｈ■Ｂ　ａｔｒｏｘ）　、ボスロブス・コチアラ（Ｂ虹町工■ｃｏｔｉａｒａ）　、ボスロブス・ジャララカ（釦ｔｈｒ（狙几江■ｎ」）、ボスロブス・二ニーイーディ（釣■■、Ｂｕもｌ■）、ボスロプス・メデューサ（ｋ止、ゆ１判Ｌｕ）、ボスロブス・シュレグリ（肢■旦」」ｌ辻組且）、セラステスーセラステス（堕■追」憩１１旺鯨）　、セラステス・バイベラ（釦■ｓｔ」Ｉ山徨■）　、クロタルス・アダマンチュース（Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）　、シ・アルドックス（以厄工ａｘ、）、シー・バシリカス（Ｑ、血も１匡ｕ）　、シー・ジ１リスス・トトナタカス（Ｃ，剋杜■■包肋ル１眩ｕ）、シー・エイチ・ホリダス（Ｃ，１，ｈｏ■貝且）、シー・エム・モロスス（ｊ、、１、　ｍｏｌｏｓｓｕｓ）、シー・ルバー（Ｃ，■加「）　、シー・スフタラ９７、　（ｊ；、、　践ｌ紅社用）　、シー・ブイ・セレバルス（Ｃ，ｖ、　ｃ−ｅｒｅｂｅｒｕｓ）、シー・ブイ・ヘレリ（ｊ；、、　Ｘ、　ｈｅｌｌｅｒｉ）　ｓ　シー・ブイ・ルトスス（Ω、　ｖ、　ｔｕｔｏｓｕｓ）　、シー拳ブイ６オレガヌス（Ｃ１，！、　旺払■■）　、エキス・カリナツス・ツクレキ−（■ＩＬｉｊｃａｒｉｎａｔｕｓ　組ｃｈ肛並■）、エリステエコフイス・マクマホニ−（Ｅｒｉｓｔｌｃｏ　ｈｉｓ　＋＊ａｃｍａｈｏｎｉ）　、プソイドセラスシス・ハーシクス（ム鮭堕Ｂ」刃立り担匡ｔａｕｓ）　、シストルールス・エム・バルボーリ（ＳｉＳｔｒｕｒｕＳ罠、■１匹ｘｉ＞　、シストルールス・シー・ターゲミナス（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ　＜、、■組組江■）、トリメレスルス・フラボビリディス（’＋＊ｅｒｅｓｕｒｕｓ■■工■吐ム且）、トリメレスルス・グラミニウス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕ　ｕｓ肛ｇｌＢｅｕｓ）　ｓバイベラ・レベティナ（■鱈■」ｅｂｅ■ｕ）、バイペラ・アモンディテス（■匹口」ｌり説バ且）、バイペラ・バラスティナエ（■鱈ｎ］剣１旺組ｕ”）％およびバイベラ・アール・ルセリイ（■■ｎｒ、　ＬＬＬＬＬＬＬＬ）からなるヘビの群から選択される。

本発明の精製血小板粘着インヒビターは、次に標準法を用いて配列が決定される。全ペプチドは一般に、未変性タンパク質中のシスティン残基の還元とアルキル化によって配列を決定され得、この処理によって個々のサブユニットを分離し得る。個々のサブユニットはタンパク質分解反応によって消化されてフラグメントを生成しそのフラグメントはＲＰＬＣを用いて分離され、ついでそのタンパク質の配列が、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７３Ａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎａｔｏｒのような自動タンパク質シークエネーターを用いて決定される。

あるいはそのタンパク質の全配列は、ヘビの組織のクローン化ＤＮＡライブラリーから抗粘着物質をコードするＤＮＡを検索することによって決定され得る。このようなりＮＡを得る各種の方法が知られるが、抗粘着物質に対する部分的なアミノ酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドのプローブによってスクリーニングする方法、または精製抗粘着物質に対して調製された抗体を用いる発現スクリーニング法がある。

え　および　のム本発明の血小板抗粘着物質（ＦＡＡ）は、組換え法の使用を含む各種の方法で産生ずることができる。

未変性のＦＡＡまたはその変異体をコードする遺伝子は、各種の組換え系を用いて操作して発現し得る。適切な構造の発現系があれば、翻訳されたタンパク質をプロセシングしない宿主系を使用し得る。例えばその発現系は、任意の隣接配列を適切に修飾することにより、所望のＮ末端のすぐ前にＡＴＧ開始コドンを配置し、かつ所望のＣ末端の後に終止コドンを配置することによって構築される。次に所望のコーディング配列を、所望どおりに、原核もしくは真核の宿主内で機能する制御系に、作動可能な結合で連結される。現在、多数の制御系が当該技術分野で公知である。

ＦＡＡのプロセシングが所望の場合は、ある種の真核系が有利である。組換え宿主を選択するには注意しなければならない。この選択がプロセシングの性質を決定する。また、タンパク質分解酵素もしくはグリコジル化酵素により、切断またはグリコジル化され易いと考えられる位置の置換アミノ酸をコードするために遺伝子配列を改変することによって、プロセシングを中断し得る。例えばアルギニンまたはりシンをトレオニン残基で置換すれば、生成したペプチドは、それらの部位でトリプシンによって切断されにくくなる。あるいは、発現は、これらのペプチドのプロセシングを行うことができる酵素の欠乏する宿主内で行われ得る。

ＦＡＡをコードする遺伝子は、ＦＡＡをコードするＤＮＡで構築されたプローブまたは抗ＦＡＡ抗体が入手できれば得られるので、これらの遺伝子は、部位特異的突然変異誘発法で１つ以上のアミノ酸に対するコドンを置換することによって操作し得、ＦＡＡ活性を保持するこれらのペプチドのアナログをコードする配列を得ることができる。

発現ベクターの構築と、適正なりＮＡ配列の組換え法による産生は、当該技術分野でそれ自体公知の方法で行われ得る。

発現は原核または真核系で行われ得る。原核系は、イー・コリ（Ｐ、、　凶」、）の各種の菌株で代表される場合が最も多い。

しかし他の微生物の菌株も使用し得、例えば、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｓ）のような桿菌類、シュードモナス（ム剥垂ｔｍｏｎａｓ）属の各種の種、または他の細菌菌株がある。

このような原核系では、宿主と適合性の種由来の複製起点および制御配列を含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、イー・コリは、一般に、ｐＢＲ３２２すなわちイー・コリの種由来のプラスミドの誘導体、またはｐＵＣシリーズのベクターを用いて形質転換される。通常用いられる原核制御配列は、本明細書では、リポソーム結合部位の配列とともに任意にオペレーターを有する転写開始のプロモーターを含有すると定義され、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）とラクトース（Ｉａｃ）のプロモーター系のような通常用いられるプロモーター系が含まれるが、原核生物と適合性のトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびλ由来ＰＬプロモーター系を使用し得る。

真核宿主に有効な発現系は、適切な真核遺伝子由来のプロモーターを含有する。

酵母に有効なある種類のプロモーターは、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼの合成を行うプロモーターを含む、解糖酵素合成を行うプロモーターを持っている。他のプロモーターとしては、ＹＥＰ１３から得られるエノラーゼ遺伝子またはＬｅｕ２遺伝子由来のプロモーターがある。

適切な哺乳類のプロモーターとしては、メタロチオネインプロモーター、ＳＶ４０由来の初期もしくは後期のプロモーター、またはポリオーマ、アデノウィルスＩＩ、ウシ乳頭層ウィルスもしくはトリ肉腫ウィルスのような他のウィルスプロモーターがある。適切なウィルスおよび哺乳類のエンハンサ−も使用し得る。植物の細胞が発現系として用いられる場合は、ツバリン合成のプロモーターが適切である。昆虫細胞もまた、バキユロウィルスに基づいた発現系とともに宿主として使用し得る。

発現系は、標準の方法を用い、当該技術分野で公知の標準の連結法および制限法を採用して、ＦＡＡをコードする配列に前記の制御要素を作動可能に連結することによって構築される。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、切断され、仕立てられ、所望の形に再連結される。

構築されたベクターで適切な宿主を形質転換させる。使用される宿主細胞によって、その細胞に適した標準の方法を用いて形質転換が実施される。形質転換された細胞は、次に、ＦＡＡをコードする配列の発現に有利な条件下で培養され、ついで組換え法で産生されたタンパク質が培養物から回収される。

組換え法による産生に加え、その推定配列が直接ペプチド合成を実施できる程度に充分に短いペプチドを、標準の固相法を用いて調製し得る。

したがって、本発明の適用範囲内の化合物は、当該技術分野で公知の手段、例えば固相ペプチド合成法によって化学的に合成し得る。この合成は、α−アミノ保護アミノ酸を用いてペプチドのカルボキシ末端から開始される。他の保護基が適切であっても、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）　保護基はすべてのアミノ基に対して使用することができる。例えばＢＯｃ−Ｖａｔ−ＯＨ，Ｂｏａ−Ｌｅｕ−０■、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯｌｌまたはＢｏａ−Ｔｙｒ−ＯＨ（すなわち選択されたＢＮＰアナログのカルボキシ末端のアミノ酸）は、クロロメチル化ポリスチレン樹脂の支持体に対してエステル化され得る。このポリスチレン樹脂の支持体は、架橋剤としてのジビニルベンゼンが約０．５〜２％となる、スチレンとのコポリマーが好ましく、この架橋剤によって、ポリスチレンポリマーはある種の有機溶媒に対して完全に不溶性になる（Ｓｔｅｗａｙｔら、跳■トハ追しカ廊１址玉匝匡岨ｉｓ、　１９６９年、米国、サンフランシスコのＷ、Ｈ，Ｆｒｅｅｓａｎ　Ｃｏ、、およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ　ＡｓＣｈｅｗ　Ｓａｃ、８５巻、２１４９〜２１５４頁、１９６３年参照）。またこれらのおよび他のペプチド合成法は、米国特許第３．８６２．９２５号、同第３．８４２．０６７号、同第３．９７２．１１５９号および同第４．１０５．６０２号に例示されている。

この合成は、手動法を用い得るが、または、例えばＡｐｌ）ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３ＯＡもしくは４３１Ａペプチド合成器（米国、カリフォルニア州、ホスターシティ）を、メーカー提供の指示マ二１アルに記載されている指示事項にしたがって用いて自動的に行い得る。

当然、自動合成法も配列の制御を行い得るので、上記のように遺伝子を改変することによって得られるアミノ酸配列に対する上記の改変は、この合成法を用いて得られる。さらに、置換アミノ酸は遺伝子によってコードする必要はない。従って、Ｄ型アミノ酸もしくはβアミノ酸が天然に存在しているアミノ酸の代わりに用いられ得る。

に・　る　の本発明の血小板抗粘着剤はまた、本発明の化合物に対して免疫特異的な抗血清を得るため、免疫化プロトコルに利用し得る。得られたＦＡＡ化合物は、次いで、マウス、ウサギなどの適切な哺乳類の被検体に注射し得る。適切なプロトコルは、血清中に抗体の産生を上昇させる計画にしたがって、アジュバントの存在下、免疫原を繰返し注射することを含む。免疫血清の力価は、当該技術分野で現在標準になっている免疫検定法を用い、本発明の化合物を抗原として用いることによって容易に測定することができる。

得られた抗血清は直接使用し得、またはモノクローナル抗体が、免疫化動物の末梢血液リンパ球もしくは膵臓を採集し、その抗体産生細胞を不死化し、次いで標準の免疫検定法を用いて適切な抗体産生体を同定することによって得ることができる。

比較的小さなハプテン類である本発明のいずれの化合物も、通常用いられるキーホールリンペットヘモシアニア　（ＫＬＨ）　ノような抗原として中性の担体、または血清アルブミン担体に有利に連結される。担体への連結は、当該技術分野で一般に公知の方法で行い得る。連結はジシクロへキシルカルボジイミド、または他のカルボジイミド脱水剤のような縮合剤を用いて実施し得る。この連結を行うのにリンカ−化合物も使用し得、同種の二官能性のリンカ−および異種の二官能性のり及笠亙圭夏盈月本発明の血小板粘着インヒビターは、血小板の粘着および血栓の生成を防止し、かつ血管形成術のような侵聾性方法を行った後の動脈の再狭窄を防止するのに治療上有用である。

このような治療法を行うのに適した症状には、限定はないが、アテローム性動脈硬化症および動脈硬化症、急性心筋梗塞、慢性不安定狭心症、一過性脳虚血発作、末梢血管の疾病、動脈血栓症、子がん前症、塞栓症、ならびに血管形成術、頚動脈血管内膜切除術、血管移植片の吻合術および心臓血管器具（例えば留置カテーテルもしくはシャント“体外循環装置″）の長期間の使用の後に起こる、再狭窄および／または血栓症が含まれる。これらの症候群は各種の狭窄性と閉塞性の血管障害を示すが、これらの障害は、血小板の粘着で始まり、次いで血小板が活性化され、血管壁の新生内膜層の血管平滑筋）　が増殖して、再狭窄に至る原因である強方な成長因子を含有する、血小板顆粒の内容物が放出され、続いて損傷した動脈の管壁に血小板血栓が生成すると考えられる。

本発明の血小板粘着インヒビターは、不安定狭心症および動脈の塞栓症もしくは血栓症における動脈血栓の形成の防止もしくは停止、ならびに心筋梗塞（Ｍｌ）およびＭｌが起こった後の壁在性血栓生成の治療もしくは防止に使用し得る。本発明の血小板粘着インヒビターは、血小板が粘着し、続いて動脈の再閉塞が起こるのを阻害するために、ストレプトキナーゼまたはプラスミノーゲン活性化因子のような血栓崩解剤とともに投与し得る。

さらに、これらの抗血栓剤は、器官の移植が原因で起こる血栓症と再狭窄を抑制するのに使用し得、そして血栓症によって仲介される器官の拒絶反応および移植で誘発されるアテローム性動脈硬化症の防止に使用し得る。

血小板粘着インヒビターの投与量は、所望の作用と治療計画によって広範囲に変化させ得る。一般に投与量は約０．００１〜１０■ｇ／Ｋｇ個体の体重である。

投与は、好ましくは、静脈投与のような非経口で、毎日、１週間まで、または１，２ケ月間）　もしくはそれ以上行うが、治療のスヶジー−ルによって変化り得る。゛血小板粘着インヒビターのペプチドフラグメントを使用する場合は、鼻内、舌下などのような他の経路を利用し得る。

注射剤は次のような通常の形態で調製し得る。すなわち液体の溶液または懸濁液、注射に先立ち溶液または懸濁液にするのに適した個体の形態、またはエマルシヨンである。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システィン塩酸塩などである。さらに、目的により、注射用医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤、ｐＨ緩衝剤などを含有し得る。目的により、吸収促進製剤（例えばリポソーム類）を利用し得る。

以下に記載する実施例は例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。

実施例！ハ　を　るヘビ　の日アッセイを行うために、精製ヒトｖＷＦをｓ　Ｔｈｏｒｅｌｌらの前期文献の方法を用いて、ヒト血漿の冷却沈降物から調整し、Ｂｒ１ｎｋｈｏｕｓおよびＲｅａｄの前期文献に記載されているのと同様にして、ホルムアルデヒドで固定し洗浄した血小板を調製しアッセイした。リストセチン（１，５ｍｇ１票１最終濃度）またはボトロセチン（１０μｇ７ｍ１最終濃度）を用いて血小板凝集反応を開始させた。

Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ社（米国、ミズーリ州、セントルイス）またはＭｉａｍｉ　Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ　Ｌａｂｓ社（米国、ユタ州、ソルト・レーク市）から入手した７３種の凍結乾燥したヘビの粗毒液の１０ｗ＋ｇ／＠ｌ蒸留水溶液を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０およびｃｅｎｔｒｉｃａｎ−３０（ＹＭ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）のマイクロコンセントレータ−（Ａｗｌｃａｎ社、米国、マサチューセッツ州、ダンバーズ）を用いテ調製用限外濾過に付した。濾液（１０μｌと５０μｌの試料）および保持液（１０μｌと５Ｏｕ１の試料）両方を、調製した固定・洗浄血小板を精製ｖＷＰとともに使用する、血小板凝集アッセイに試験試料として使用した。阻害活性は、ＣｅｎｔｒＩｃｏｎ −１０および同一３０の限外濾過で得た保持液試料にのみ見い出された。結果を表１に示す。

（以下余白）Ｂｕｎｇａｒｕｓ　ｆａｓｃｉａヒｕｓＤｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ　ｊａｍｅｓｏｎｉＮａｊａ　ｎａｊａＮａｊａ　ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａＮｏセｅｃｈｉｓ　ｓｃｕセａｔ＋ｕＥｉ　！１ｃｕｔ＋ａＩ＋ｕ１３０ｐｈｉｏｐｈａｇｕｇ　ｈａｎｎａｈＰｓｅｕｄｅｃｈｉｓ　ｐｏｒｐｈｙｒｉａｃｕｓＰｓｅｕｄｏｎａｊａ　ヒａＸｔ、±１ｉｓ　ヒｅｘｔｉｌｉｓＴｒｏｐｉｄｅｃＭｓ　ｃａｒｉｎａヒｕｓム壽−ユ狙　鳴ｒ（１）Ｂ１セｉｓ　ａｒｉｅヒａｎｓ　＋Ｂ１仁ｉｓ　ｃａｕｄａｌｉｓ　＋Ｂ１ヒ±ｓ　ｇａｂｏｎｉｃａ　＋Ｂ１Ｂ１セミｇ、ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ　＋Ｂｉｊｉｓ　ｎａｓｉｃｏｒｎｕｓＣａｕｓｕｓ　ｒｈｏｍｂｅａｅｕｓＣｅｒａｓＬｅＢ　ＣｅｒａＳセｅｓ　＋Ｃｅｒａｓヒｅｓ　ｖｉｐｅｒａ　＋Ｅｃｈｉｓ　ｃａｒｉｎａセｕｓ　５ｏｃｈｕｒｅｃｋｉ　”Ｅｃｈｉｓ　ｃａｒｉｎａｔｕｓ　１ｅａｋｙｉ　＋Ｅｒ１ｓｅｉｃｏｐｈｉｓ　ｍａｃｍａｈｏｎｉ　＋Ｈｙｐｎａｌｅ　ｈｙｐｎａｌｅ　＋ｐｓｅｕａｏｃｅｒａｓヒｅｓ　ｐｅｒｓｉｃｕｓ　＋Ｖｉｐｅｒａ　ａｍｍｏｎｄｙｔｅｓ　＋Ｖｉｐｅｒａ　ａｓｐｉｓＶｉｐｅｒａ　ｂｅｒｕｓ紅　１（味己　）Ｖｉｐｅｒａ　１ｅｂｅｌ：ｉｎａ　＋Ｖｉｐｅｒａ　ｐａｌａｓセ１ｎａｅ　＋Ｖｉｐｅｒａ　ｒ、　ｒｕｓｓｅｌｌｉ　＋Ｑ譚沖島上＝１Ａｇｋｉｓｅｒｏｄｏｎ　ａｃｕｔｕｓ　÷Ａｇｋｉｓセｒｏｄｏｎ　ｂｉｌｉｎｅａｔｕｓＡｇｋｉｓ仁ｒｏｃｉｏｎ　ｃ、ｃｏｎヒｏｒ仁ｒｉｘＡｇｋｉｓセｒｏｄｏｎ　ｃ、ｌａヒ１ｃｉｎｃセｕｓＡｇｋｉｓｅｒｏｄｏｎ　ｃ、　ｍｏｋａｓｅｎ　＋Ａｇｋｉｓセｒｏｄｏｎ　ｈ＝　ｂｌｏｍｈｏｆｆｉ　＋Ａｇｋｉｓヒｒｏｄｏｎ　ｐ、１ｅｕｃｏｓセｏｍａＡｇｋｉｓヒｒｏｄｏｎ　ｐ、ｐｉｓｃｉｖｏｒｏｕｓＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｄｏｓｊｏｍａＢｏヒｈｒｏｐｓ　ａｌｔ−ｅｒｎａｔｕｓ　＋ＢＯセｈｒｏｐｓ　ｃｏＩ−ｉａｒａ　＋ＢＯセｈｒｏｐｓ　ｊａｒａｒａｃａ　＋Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ｌａｎｓｂｅｒｇｉＢｏｅｈｒｏｐｓ　ｍｅｄｕｇａ　＋ＢＯセｈｒｏｐｓ　ｎａｓｕセａＢＯＩ−ｈｒＯｐ！ｉ　ｎｅｗｉｅｄｉ　＋ＢＯヒｈｒｏｐｓ　ｐｒａｄｏｉＢＯヒｈｒｏｐｓ　ｓｃｈｌｅｇｌｉ　＋Ｃｒｏヒａｌｕｓ　ａｄａｍａｎｅｅｕｓ　＋Ｃｒｏセａｌｕｓ　ａｔｒｏｘ　＋Ｃｒｏヒａｌｕｓ　ｂａｓｉｌｉｃｕｓ　＋Ｃｒｏヒａｌｕｓ　ｃｅｒａｓｅｅｓ　＋Ｃｒｏセａｌｕｓ　ｄ＋　ｄｕｒｒｉｓｕｓ　＋Ｃｒｏｅａｌｕｓ　ｄ、ヒ０仁０ｎａｅａＣｕ１９　”Ｃｒｏｅａｌｕｓ　ｄ、ｊｅｒｒｉｆｉｃｕｓ４　１（比ｔ　）Ｃｒｏａヒｌｕｓ　ｈ、ｈｏｒｒｉｄｕｓ　＋Ｃｒｏ亡ａｌｕｓ　ｍ、ｍｏｌｏｓｓｕｓ　＋Ｃｒｏセａｌｕｓ　ｒ、ｒｕｂｅｒ　＋Ｃｒｏｅａｌｕｓ　ｓｃｕ亡ａｌａしＵＳ　＋Ｃｒｏ亡ａｌｕｓ　ｖ、ｃｅｒｅｂｅｒｕｓ　＋Ｃｒｏｅａｌｕｓ　ｖ、ｃｏｎｃｏｌｏｒＣｒｏｅａｌｕｓ　ｖ、ｈｅｌｌｅｒｉ　＋Ｃｒｏ亡ａｌｕｓ　ｖ、１ｕｅｏｓｕｓ　＋Ｃｒｏｅａｌｕｓ　ｖ、ｏｒｅｇａｎｕｓ　＋Ｃｒｏｊａｌｕｓ　ｖ、ｖｉｒｉｄｉｓ　＋Ｓｉｓセｎ１ｒｕｓ　Ｃ，ヒｅｒｇｅｍｉｎｕｓ　＋Ｓｉｓヒｒｕｒｕｓ　ｍ、ｂａｒｂｏｕｒｉ　＋’ｒｒｉｍｅｒｅｓｕｒｅｓ　ａｌｂｏｌａｂｒｉｓ　＋Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｅｌｅｇａｎｓ　＋Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｆ″１ａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ　＋Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｇｒａｍｉｎｅｕｓ　＋Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｐｕｒｐｕｒｅｏｍａｃｕｌａヒｕｓ　＋ＴｒｉｍｅｒｅＳｕｌ：ｕｓ　ｗａｇｌｅｒ±抗粘着活性は５ＶｉｐｅｒｉｎａｅおよびＣｒ０ｔａｌｉｎａ８の全種でＣよな（一部の種にみられたが、試験したＥｌ　ａｐｉｄａｅの全種にはみられなかった。

実ＪＬＩＬＬＣｒｏｔａｌｕｓ　ｈｏｒｒｉｄｕｓ　ｈｏｒｒｉｄｕｓ　からのハ　の０．５Ｍ酢酸７．０ｗｌ中、ｍ上ｕしＬｄ士組如工己カ４毒５００ｍｇ　（Ｍｉａｍｉ　Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ　Ｌａｂｓ、　Ｌｏｔ　＃ＣＨ１８ＳＺ）の溶液を、０．５Ｍ酢酸で平衡化したセフ１デックスＧ−５０（ｆｉｎｅ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　２゜５　ｘ　１００ｃｍ＞のカラムにかけ、溶出した。カラムは、流速２５ｉ＋１７時で溶出し、５ｍ１画分を採集した。各面分の１０μｌを１ｏ画分１グループとしてプールしく即ち、画分１−１０．１１−２０．２１ −３０等）、分析のために凍結乾燥した。この凍結乾燥画分は、蒸留水５００μ ｌ中に再懸濁し、そしてその適量をとり、精製ｖＷＦで再構築された固定化洗浄血小板の、リストセチンで誘発される血小板凝集の阻害活性を測定した。このアッセイにより活性のある阻害画分（３１−４０）をプールし、凍結乾燥することにより、白色非結晶粉末９５ｍｇを得た。

この物質を、５ｍｌの０．０１Ｍ　Ｎｔ１４０ＡｅＳｐＨ４，ｓ中に溶解し、そして０．ＯＩＭ〜０．５Ｍ　ＮＨａＯＡｃＳｐＨ６，５で平衡化したカルボキシメチルセファクリルカラム（２，２ｘ１３ｃ■）にかけ、画分（１２鵬ｌ）を採取した。このカラムは、Ｕｖ膜吸収より画分を同定するため、２５４ｒｖ／１．ＯＡＵＰＳでモニターした（図１）、ＵＶ吸収画分は、画分毎に凍結乾燥しく各２０μｌ）、蒸留水１ｍｌ中に再懸濁し、そしてその血小板凝集を阻害する能力を測定した。画分１３〜１７が阻害活性を示し、そして過剰のＮＨＪＯＡＣを除くため、各面分をＨ２Ｏを用いて３＠凍結乾燥した。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動く非還元）によるピーク阻害画分の分析により、Ｍｒ＝　２３−２８ｋｄに泳動する２種の主要タンパクが認められた。これらの画分（１００μｇ）を、逆相Ｃ１液体り０７トグラフイー　（Ｖｙｄａｃ　２１４ＴＰ５４．０．４６Ｘ　２５ｃｍ、流速１．０謹ｌ／分、３００Ａ、　１５％アセトニトリル７０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）〜７０％アセトニトリルのグラジェント溶出３０分’）で分析すると、２つの主要なＵＶ　（２１４ｎ■）吸収ピークが認められ（図２）、これを集め、そして乾燥した。５ＤＳ−ＰＡＧＥによるこれら２つのピークを再分析すると、より速＜　ＨＰＬＣ溶出するピークは、Ｃ■−Ａ　（２４，９分）として、Ｍｒ−２３ｋｄに泳動され、そしてより遅（溶出するピークは、ＣＨＩＩ−Ｂ　（２５，６分）として、Ｍｒｇ２５ｋｄに泳動された（図３）。還元５ＤＳ−ＰＡＧＥでは、ＣＨＨ−ＡおよびＣＨＨ−Ｂは２つの別個のタンパク鎖Ｍｒ＝１２−１５ｋｄに分解された。未変性のＣＨＩ−ＡおよびＣＨＨ−Ｂは、共に、洗浄系のボトロセチンおよびリストセチンで誘発される血小板凝集を阻害し、モして。

血小板に富む血漿中の凝集も同程度に阻害した。

ＣＨＨ−ＡおよびＣｕ１ｌ−Ｂのイオン変換画分からの分取精製は、分析用分析と同じグラジェント溶出条件を用いて、セミ分取Ｃ４（２１４７Ｐ５１０．３．５璽ｌ／分）カラム上で行った。図４は、精製されたＣＨＨ−Ｂの分析Ｃａ　ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、そして図５は、ＣＨＢ−Ａのクロマトグラムを示す。（各図の３４分におけるピークは雑音（ａｒｔｉｆａｃｔ））。

精製タンパク質（ＣＨＩＩ−Ｂ）の一部を還元し、そしてアルキル化した（６Ｍグアニジン・ＨＣＩ、　０．２５Ｍ　トリス−１１ＣＩ、　２０鵬Ｍ　ＥＤＴＡ、２０１Ｍジチオストレイトール（ＤＴＴ）を含む、ｐＨ７，５，８時間２５℃ ）。過剰のヨードアセトアミドをこの還元タンパク質に加え、室温で８時装置いた。還元された、およびアルキル化された鎖は、それぞれ、Ｃ４逆相ＨＰＬＣを用いて分離した。より速く溶出するサブユニット（ＣＨＨ−Ｂ−β）およびより遅く溶出するサブユニット（ＣＨＨ−Ｂ−ａ　）は、それぞれ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅ■４７３Ａタンパク質シークエンサーを用いて、Ｎ末端配列分析（エドマン分解）を行った。

ＣＨＩ−８−αについては、エドマン分解を３７回繰り返すことにより、以下のＮ末端アミノ酸配列が得られた。Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙ　ｓ−Ｐ　ｒｏ −Ｓ　ｅｒ−Ｇ　１ｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅ　ｒ−Ｔｙｒ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｙ　５−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　１　ｕ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａ　１ａ−Ａｓｐ−Ａ　ｌ　ａ− Ｇ　１　ｕ−Ａｒｇ−o ｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓａ　１２７個のアミノ酸からなるこの鎖の完全なアミノ酸配列を図６に示す。

ＣＨＨ−Ｂ−βについては、２７回のサイクルにより、以下のＮ末端アミノ酸配列を得た。Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ −Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−旧ｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ− Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ− Ｌｙｓ−Ｐｈｅｏ　この鎖の完全なアミノ酸配列は図６を示す。

精製ペプチドＣＨＨ−Ｂは、Ｒｕｇｇｅｒｉら（前述）の方法に従って、ｖＷＦ血小板結合アッセイで試験した。結果は、図７に示す。結合阻害は、用量依存的であり、そして精製ＣＨ■−Ｂ濃度が２００ｎＭ未満で、ｖＷＦの洗浄血小板への結合を抑制する。

支凰且１Ｃｅｒａｓｔｅｓ　ｃｅｒａｓｔｅｓ　か１の　のＣｅｒａｓｔｅｓ　Ｃｅｒａｓｔｅｓ毒（Ｍｉａｍｉ　Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ　Ｌａｂｓ、　Ｌｏｔ　＃ＣＣｌ２５Ｚ）　５００ｍｇノ０．５Ｍ酢酸溶液５．０ｍｌを、Ｏ，ＳＭノ酢酸で平衡化したセファデックスＧ−５０（ｆｉｎｅ）のカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　２．５ｘ１００ｃ箇）にかけ、溶出した。このカラムは４０謹ｌ／時の流速とし、８１画分をポリプロピレンチューブに採集した。各面分２５μｌを、１０画分を１グループとしてプールしく　１−１０．１１−２０．２１−３０等）、そして凍結乾燥した。凍結乾燥画分は、蒸留水ｉｏ。

μｌ中に再懸濁し、そしてその一定量をとり、精製ｖＷＦにより再構築された固定化洗浄血小板のりストセチンで誘発される血小板凝集の阻害活性をアッセイした。このアッセイにおける活性画分（画分２ｌ−４０）をプールし、そして凍結乾燥して１９８■ｇの白色粉末を得た。

この物質を、１０謹ｌの０．ＯＩＭ　ＮＨａＯＡｃ、　ｐＨ４，５中に溶解し、そしてＣトセファロースカラム（２，２Ｘ　１３ｃｍ）に流した。０．ＯＩＭ〜０．５Ｍ　ＮＨａＯＡｃ、〜ｐＨ６，５のｐＨおよび塩のグラジェントを行い、そして画分（１０ｍｌ）をポリプロピレンチューブに採集した。カラム溶出液は、ＵＶ吸収により画分を同定するために、２５４ｎ冒／１、０ＡＵＦＳでモニターした。各面分からの２５μｌを、１０両分のグループに再度プールし、そして凍結乾燥した。この画分を、蒸留水１００μｍに再溶解し、そしてその血小板凝集阻害活性をアッセイした。画分８１−１００が阻害活性を示し、集めて、過剰のＮＨａＯＡｃを除くために各画分をＨ２Ｏにより３回凍結乾燥した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（非還元）による阻害画分の分析により、Ｍｒ＝２３−２８ｋｄで泳動する染色されたバンドである１つの主要タンパク質を認めた。還元５ＤＳ−ＰＡＧＥでは、未変性のタン／ｆり質が２つの別個のタンパク質鎖Ｍｒ・１２−１５ｋｄに分解した。分析用ｃ４逆相液体クロマトグラフィー　（Ｖｙｄａｃ２１４ＴＰ５４．０．４６Ｘ　２５ｃｍ、流速１．０謹ｌ／分、３００Ａ）上テ１７）　３０％７　セトニトリル１０．１％　ＴＦＡから７０％アセトニトリルのグラジェント溶出、３０分間、で、図８に示す１つの主要ＵＶ　（２１４ｎ■）吸収ピークを認めた（２７および３１分のピークは雑音）。

精Ｈされたタンパク質（ＣＣ）の一部を還元し、そして実施例１と同様に、ヨードアセトアミドでアルキル化した。このカルボキシアミドメチル化鎖を、逆相Ｖｙｄａｅ−フェニルカラムを用いて分離した。より速く溶出するサブユニット（ＣＣ−β）およびより遅く溶出するサブユニット（ＣＣ−α）は、それぞれ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７３Ａ）タンパク質シークエンサーを用いてＮ末端配列分析を行った。

ＣＣ−βについて、エドマン分解を２５サイクル行うことにより、以下のＮ末端アミノ酸配列を得た：　Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｈｉ　ｓ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙ　５ −Ｔｙｒ−Ｌｙ　５−Ｖａ　１−Ｐ　ｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｘａａ− Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−ＧｌｕｅＣＣ−αについて、　２０サイクルにより、以下のＮ末端アミノ酸配列を得た：　Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｅａ−Ｐｒｏ −Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ −Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＧＩ　ＬＩＯ爽胤舅まＰｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ　ｅｒｓｉｃｕｓ　かゝの　のＰｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ　ｅｒｓｉｃｕｓ毒（Ｍｌａｍｉ　Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ　Ｌａｂｓ。

Ｌｏｔ　＃ＰＳ８ＳＺ）　１０００ｍｇの０．５Ｍ酢酸溶液７．０ｍｌを、セファデックスＧ−５Ｏｆのカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　２．ＳＸ１００ｃｍ）にかけ、実施例２および３に記載のように溶出しアッセイした。活性な画分（画分３ｌ−５０）をプールし凍結乾燥した。

この物質的１６０ｍｇを、０．０１Ｍ〜０．５Ｍ　ＮＨｎＯＡｃのＮＨａＯＡｃ緩衝液を用いたＣＭ−セファロースカラム（２，２Ｘ　１３ｃ■）に吸着させ、グラジェント溶離した。活性画分（各６１１１画分６４−７２）が、固定化血小板アッセイで活性であることが見いだされ、プールし、そして揮発性塩を除くために水で数回凍結乾燥した。

最終精製を、０．１ＸＴＦＡ中の１５〜７０％アセトニトリルの８０分間のグラジェントを用いたセミ分取Ｃ４逆相液体クロマトグラフィーにより行った。この物質の一部（３００μｇ）を還元し、そして実施例２に記載の通り、カルボキシアミドメチル化した。

このカルボキシアミドメチル化した鎖を、前述のようにＣ４ＲＰＬＣで分離し、そして各鎖についてＮ未配列分析を行った。

より速く溶出するサブユニットＰＢ−βは、エドマン分解を５０サイクル行い以下の配列を得た：　Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ −Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−旧５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａ　１ −Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｙ　５−Ｔｈｒ−Ｔ　ｒｐ−Ｇ　１　ｕ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｙｓ−Ｐ　ｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ　 −Ｇ　Ｉ　普|Ｇ　Ｉ　ｎ −Ａｌ　ａ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｙ−Ｇｌ　ｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−５ｅｒ −＋　１　ｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ。

ＰＰ−ａ鎖は、３１サイクルで以下の配列を得たＨ　Ａｉｇ−１ｅｕ−Ａｓｎ− Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−３ｓｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ− Ｇｌｎ−Ｈｉ　５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙ　ｓ−Ａ　ｌ　ａ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　５ｐ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙ　５−３ｓ　ｒ−Ｔ　ｒｐ−Ａ　１ａ−Ａｓｐ−Ａ　５ｐ−Ｇ　１　ｕ|Ｌｙ　５ −Ｐｈｅ。

実】１１ｉＶｉ　ｅ　ａ　、ｕｓｓｅｌ　かゝの　ハ　の実施例２−４の方法を用いて、■ ｍＫ、　匡鉦吐■の毒１ｇを精ＩＷＬ、ＧＰＩＭンヒビターを得た。精製したインヒビターノ一部を、実施例２−４に記載の通り、カルボキシアミドメチル化し、そしてそのサブユニットをＣ４ＲＰＬＣで分離した。

より遅く溶出するサブユニットのＮ末端配列を、２２サイクルのエドマン分解で、以下のアミノ酸配列を得た。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒｏ −Ａｓ　ｎ−Ｇ　１ｙ−Ｔ　ｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈ　ｅ−Ｇ　１　ｙ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙ　５−Ｔｙ秩| Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕａ実施例２で調製したように、Ω、ＪＬＱｕ封ｕｓ」ｌ匡説ｕから精製されたタンパク質、および実施例３で調製したように、Ｑ。

■ｎ虹競から精製されたタンパク質を、前述のように、ＰＲＰを用いたボトロセチン／リストセチンで誘発される凝集阻害アッセイを行った。その結果を図９に示す。再び、用量依存的作用が示され、２−３μｇ／■ｌの低濃度で阻害を示す。

ｃＨＭ　ＧＰＬｂ　４−ｉｂビ゛ターのイｉ”Ｊ’＜１ｔｔＦ；ＬＦＩＧ、１ＦＩ６．２ＣＲＯＴＡＬＵＳ　？１．）（ＯＲＲＬＣ）υＳ　（ｊＰＬｂ　インヒビ′ターｃＮ）（−８’）　ｌげ椿ＲＰＬ＋。

ＦＩｏ、４ＦＩ６．５Ｃ，？ｌ？ｌ−β１ｚＪ−目梵４し艶七十反♂５１−ｖ苗詐夢漬ル希ＦＩθ、７ＣＥＲＡＳＴＥＳ　ＣしＲへＳτじＳ　ＣｖＰＬｂ　イソしビ゛ｑ一つｌゴルｆＶａｐしく：ｔＦ１ａ、８ｑ昨りイ、しビクー＋−Ｅ％　７にζＦ’Ａδピ穿ヒ９η引宝４ｕｇ　３ｕｇ　２ｕｇ　ｔｕｇ　γ１呻。

ＦＩＧ、　９Ａ　”Ｈ階ｂ　゛インヒ１ダ−国際調査報告ＩＩＩＩ針Ｎ醋幹−＾阿ｋｕａａＩＩ開Ｈ・にゴル噂−１〜謁１−＋１ｖ＋絆Ｎ鴎開−〜−輌ｖａ−Ｎｏペゴ〜鳴−１〜制■−

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の群から選択されるヘビ毒から得られる、精製された、および単離された形態の、血小板抗ペプチド：アグリストロドン・アクタス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ａｃｔｕｓ）、アグリストロドン・ハリスブロモフィ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｈａｌｙｓ　ｂｌｏｍｈｏｆｆｉ）、アグリストロドン・コントルトリックス・モカセン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　ｍｏｋａｓｅｎ）、ビティス・アリエタンス（Ｂｉｔｉｓ　ａｒｉｅｔａｎｓ）、ビティス・コーダリス（Ｂｉｔｉｓ　ｃａｕｄａｌｉｓ）、ビティスガボニカ（Ｂｉｔｉｓ　ｇａｂｏｎｉｃａ）、ビティス・ジー・リノセロス（Ｂｉｔｉｓ　ｇ．ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ）、ボスロプス・アスパー（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ａｓｐｅｒ）、ボスロプス・アルターナタ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ａｌｔｅｒｎａｔａ）、ボスロプス・アトロックス（Ｂｏｔｈｒｏｐｓａｔｒｏｘ）、ボスロプス・コチアラ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ｃｏｔｉａｒａ）、ボスロプス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ｉａｒａｒａｃａ）、ボスロプス・ニューイーデイ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ｎｅｗｉｅｄｉ）、ボスロプス・メデユーサ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ｍｅｄｕｓａ）、ポスロプス・シュレグリ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ｓｃｈｌｅｇｌｉ）、セラステス・セラステス（Ｃｅｒａｓｔｅｓ　ｃｅｒａｓｔｅｓ）、セラステス・バイペラ（Ｃｅｒａｓｔｅｓ　ｖｉｐｅｒａ）、クロタルス・アダマンチユース（Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｄｍａｎｔｅｕｓ）、シー・アトロックス（Ｃ．ａｔｒｏｘ）、シー・パソリカス（Ｃ．ｂａｓｉｌｉｃｕｓ）、シー・ジュリサス・トトナ夕方ス（Ｃ．ｄｕｒｉｓｓｕｓ　ｔｏｔｏｎａｔａｃｕｓ）、シー・エイチ・ホリダス（Ｃ．ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）、シー・エム・モロサス（Ｃ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｕｓ）、ソー・ルーバ（Ｃ．ｒｕｂｅｒ）、シー・スクタラタス（Ｃ．ｓｃｕｔａｌａｔｕｓ）、シー・ブイ・セレパルス（Ｃ．ｖ．ｃｅｒｅｂｅｒｕｓ）、シー・ブイ・ヘレリ（Ｃ．ｖ．ｈｅｌｌｅｒｉ）、シー・ブイ・ルトスス（Ｃ．ｖ．ｌｕｔｏｓｕｓ）、シー・ブイ・オレガヌス（Ｃ．ｖ．ｏｒｅｇａｎｕｓ）、エキス・カリナツス・ソクレキー（Ｅｃｈｉｓ　ｃａｒｉｎａｔｕｓ　ｓｏｃｈｕｒｅｃｋｉ）、エリステイコフィス・マクマホニー（Ｅｒｉｓｔｉｃｏｐｈｉｓ　ｍａｃｍａｈｏｎｉ）、プソイドセラステス・ベルンカス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓｐｅｒｓｉｃｕｓ）、シストルルス・エム・バルボーリ（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ　ｍｂａｒｂｏｕｒｉ）、シストルルス・シー・ターゲミナス（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ　ｃ．ｔｅｒｇｅｍｉｎｕｓ）、トリメレスルス・フラボビリディス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）、トリメレスルス・グラミニウス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｇｒａｍｉｎｅｕｓ）、バイベラ・レベティナ（Ｖｉｐｅｒａ　ｌｅｂｅｔｉｎａ）、バイペラ・アモンディテス（Ｖｉｐｅｒａ　ａｍｍｏｎｄｙｔｅｓ）、バイペラ・パラスティナエ（Ｖｉｐｅｒａ　ｐａｌａｓｔｉｎａｅ）、およびバイペラ・アール・ルセリィ（Ｖｉｐｅｒａ　ｒ．ｒｕｓｓｅｌｌｉ）２．前記ヘビ毒が、セラステス・セラステス（Ｃｅｒａｓｔｅｓ　ｃｅｒａｓｔｅｓ）、シー・エイチ・ホリダス（Ｃ．ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）、バイペラ・アール・ルセリィ（Ｖｉｐｅｒａ　ｒ．ｒｕｓｓｅｌｌｉ）、またはプソイドセラステス・ベルソカス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ　ｐｅｒｓｉｃｕｓ）である、請求項１に記載の抗粘着剤。３．前記抗粘着物質が、ヘテロダイマーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ−末端を有する、請求項１に記載の抗粘着物質：【配列があります】４．前記抗粘着物質が、ヘテロダイマーであり、該ヘテロタイマーのひとつのメンバーが、約１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ−末端を有する、請求項１に記載の抗粘着物質：【配列があります】５．前記抗粘着物質が、ヘテロダイマーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ−末端を有する、請求項１に記載の抗粘着物質：【配列があります】６．前記抗粘着物質が、ヘテロダイマーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ−末端を有する、請求項１に記載の抗粘着物質：【配列があります】７．前記抗粘着物質が、ヘテロダイマーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ−末端を有する、請求項１に記載の抗粘着物質：【配列があります】８．前記抗粘着物質が、ヘテロダイマーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ−末端を有する、請求項１に記載の抗粘着物質：【配列があります】９．前記抗粘着物質が、ヘテロダイマーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ−末端を有する、請求項１に記載の抗粘着物質：【配列があります】１０．請求項１に記載の前記血小板抗粘着物質を、血栓形成を防止する有効量で、薬学的に受容可能な賦形剤との混合物中に含有する、製薬組成物。１１．動物被検体において血小板粘着および血栓形成を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする被検体に、請求項１に記載の前記血小板抗粘着物質またはその製薬組成物の有効量を投与する工程を包含する方法。１２．虚血症に伴う血小板を有する被検体を治療する方法であって、そのような治療を必要とする被検体に、請求項１に記載の前記血小板抗粘着物質またはその製薬組成物の有効量を投与する工程を包含する方法。１３．動物被検体において血管形成術に続く再狭窄を防止する方法であって、そのような治療を必要とする被検体に、請求項１に記載の前記血小板抗粘着物質またはその製薬組成物の有効量を投与する工程を包含する方法。１４．血液の体外循環の間の血小板損失を防止する方法であって、被検体から引き抜かれたときに、血液と請求項１に記載の前記血小板抗粘着物質またはその製薬組成物を接触させる工程を包含する方法。１５．請求項１に記載の前記血小板抗粘着物質をコードする配列を含有する、ＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子の組成物。１６．血小板抗粘着ペプチドを産生し得る発現システムであって、該ペプチドは請求項１に記載の群から選択されるヘビ毒から得られ、適切な宿主に形質転換されるとき、および該宿主が発現に好適な条件で培養されるとき、該発現システムは、該宿主に適合する制御配列に作動可能に連結された該血小板抗粘着性ペプチドをコードするＤＮＡを包含する、発現システム。１７．請求項１６に記載の発現システムで形質転換された組換え宿主。１８．血小板抗粘着（ＰＡＡ）ペプチドを産生する方法であって、請求項１７に記載の前記宿主細胞を、該ＰＡＡペプチドをコードするＤＮＡの発現に好適な条件下で培養する工程；および該ＰＡＡペプチドを細胞培養から回収する工程を包含する方法。１９．請求項１に記載の前記血小板抗粘着物質に免疫反応性の抗体。