JP2002136296A - 新規抗血栓症物質 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ｖＷＦと、血小板が含有するＧＰＩｂ−ＩＸ
複合体との結合を特異的に阻害することにより、抗血栓
症法の別の方法を提供する。 【解決手段】 以下の群から選択されるヘビ毒から得ら
れる血小板抗粘着ペプチドをコードする配列を含有す
る、ＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子組成物：アグキスト
ロドン、ビティス、ボスロプス、セラステス、クロタル
ス、シー、エキス・カリナツス・ソクレキー、エリステ
ィコフィス・マクマホニー、プソイドセラステス・ペル
シカス、シストルルス、トリメレスルス、およびバイペ
ラ。
複合体との結合を特異的に阻害することにより、抗血栓
症法の別の方法を提供する。 【解決手段】 以下の群から選択されるヘビ毒から得ら
れる血小板抗粘着ペプチドをコードする配列を含有す
る、ＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子組成物：アグキスト
ロドン、ビティス、ボスロプス、セラステス、クロタル
ス、シー、エキス・カリナツス・ソクレキー、エリステ
ィコフィス・マクマホニー、プソイドセラステス・ペル
シカス、シストルルス、トリメレスルス、およびバイペ
ラ。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は血小板粘着インヒビ
ターに関する。さらに詳しくは、本発明は、フォン・ビ
ルブラント因子（ｖＷＦ）が血小板糖タンパク質ＧＰＩ
ｂ−ＩＸ複合体と結合するのを阻害し、したがって血小
板−血管壁の粘着を防止するタンパク質およびペプチド
に関する。これらのペプチドのいくつかはヘビ毒中に存
在する。 【０００２】 【従来の技術】心臓血管系内の血栓症は、血管閉塞疾患
の主要な機序であると考えられ、西欧社会における高い
罹患率と死亡率の原因である。したがって、これらの多
くの疾患を治療するため、抗血栓物質が広く使用されて
いる（例えば、Ｓｔｅｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ，８０巻，１５０１〜１５１３頁，１９８９年参
照）。しかしいずれのグループの薬剤も、すべての個体
に対して完全に満足される薬剤ではなく、可能な治療剤
のレパートリーへの追加は常に歓迎される。 【０００３】血栓症発生の機序は複雑であるが、部分的
に理解されている。アテローム性動脈硬化症班の破裂に
よるか、または引き続く血管形成の間の該班の機械的除
去のなどの初期外傷のために、血小板−非血小板相互作
用によって血小板が損傷血管壁と粘着し、続いて血小板
が凝集（血小板−血小板相互作用）するともにフィブリ
ンの沈着が起こる。この現象の続発は、血漿タンパク質
と、特定の血小板表面糖タンパク質レセプターとの相互
作用によって制御される。血小板の粘着は、損傷に対す
る初期の反応であると考えられるから、粘着性血小板に
よって仲介される血栓症および／または再狭窄を予防も
しくは改善するために、阻害するのに特に望ましい標的
である。 【０００４】未刺激の循環血小板は数種の粘着性タンパ
ク質に対するレセプターを含有する。このタンパク質の
中で、ラミニンはＶＬＡ２およびＶＬＡ６と結合し、ま
たコラーゲンはＶＬＡ２、ＧＰＩＶなどと結合する。血
小板の内皮下層への初期の粘着は、血小板表面に存在す
るＧＰＩｂ−ＩＸ複合体の、特に動脈血管の閉塞部位に
見られる高い剪断速度の条件下で血管壁に固定化される
フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）に対する結合によ
って仲介されていると考えられる。この血小板ＧＰＩｂ
−ＩＸ複合体は、一般に休止血小板上で機能するが、通
常、血漿が含有するｖＷＦを捕捉しない。通常の環境下
では、動脈表面は血小板を粘着させる粘着性タンパク質
リガンド（ｖＷＦ）を提供しないので、血小板の粘着は
血管損傷の部位に捕捉されたｖＷＦに限定される。 【０００５】捕捉されたｖＷＦの存在によって血小板の
血管内皮への粘着が保持されると、血小板は活性化され
て血小板凝集体を形成し得、これに付随して、活性化さ
れたＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａレセプターによって、フィブ
リノーゲン（Ｆｇ）および血漿が含有するｖＷＦの結合
が起こる。したがって、ＧＰＩｂ−ＩＸに捕捉されたｖ
ＷＦの相互作用による未活性化血小板の粘着を特異的に
阻害する物質は、特に、狭窄によって高い剪断応力がも
たらされる血管内で血栓症が起こるのを阻害し得る。 【０００６】ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、ＧＰＩＸと非共
有結合的に複合したＩｂ表面メンブランのヘテロダイマ
ー（ＩｂαとＩｂβ）で構成され、約２５,０００コピ
ー／血小板表面の密度で存在している。この複合体の欠
除が、まれな先天的出血疾患であるベルナール・スリエ
症候群の原因であることが分かっており、この症候群
は、血小板表面に現れるＧＰＩｂ−ＩＸ複合体の欠除、
および動脈と血小板の粘着不全を特徴とする。フォン・
ビルブラント病の特徴であるフォン・ビルブラント因子
の欠損も、動脈と血小板の粘着不全をもたらすことが分
かっている。 【０００７】ＧＰＩｂ−ＩＸ／ｖＷＦの相互作用を妨害
できる物質が知られている。Ｋｉｒｂｙら，Ｔｈｒｏｍ
ｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，３４巻，７７０頁，１９
７５年には、エバンスブルー染料が、ｖＷＦとホルムア
ルデヒド固定血小板とのリストセチンによって誘発され
る結合をインビトロで阻害することが報告されている。
Ｇｅｒａｔｚら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉ
ｓ，３９巻，４１１頁，１９７８年では芳香族アミジノ
化合物類による同じ作用が証明されている。Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓら，Ｂｌｏｏｄ，７２巻，１８９８〜１９０３
頁，１９８８年には、リストセチンによって誘発される
血小板の凝集反応および血小板が豊富な血漿中での剪断
力によって誘発される血小板の凝集反応は、先に発表さ
れた他の化合物より１０倍低い濃度でトリフェニルメチ
ル化合物のアウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）により有
効に阻害されることを示した。またＡＴＡは、冠状動脈
血栓症のインビボでの有効なインヒビターであることが
立証されている（Ｓｔｒｏｎｙら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉ
ｏｎ，８０巻，ＩＩ−２３頁（Ａｂｓｔｒａｃｔ）１９
８９年；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０４１６６号）。 【０００８】また、ｖＷＦとＧＰＩｂ−ＩＸ複合体の結
合反応は、Ｒｕａｎら，ＢｒｉｔＪ Ｈａｅｍｏｔｏｌ
４９巻，１５１１頁，１９８１年とＣｏｌｌｅｒら，
Ｂｌｏｏｄ，６１巻，６９頁，１９８３年とに開示され
ているように、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体と免疫反応性のモ
ノクローナル抗体類によって阻害される。これらの抗体
は、ｖＷＦと血小板のリストセチン誘発結合反応を阻害
する。Ｂｅｃｋｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，７４巻，６９０〜
６９４頁，１９８９年には、これらの抗体もしくはその
免疫反応性フラグメントの１つは、モルモット中でのＧ
ＰＩｂの機能をインビボでブロックするが、ＡＤＰ、コ
ラーゲンもしくはトロンビンによって誘発される血小板
凝集反応に対しては全く効力を発揮しない。 【０００９】ヒトｖＷＦに対して免疫反応性のモノクロ
ーナル抗体は、高剪断速度下での血小板とコラーゲンの
粘着をブロックする（Ｆｒｅｓｓｉｎａｕｄら，Ｊ Ｌ
ａｂＣｌｉｎ Ｍｅｄ，１１２巻，５８〜６７頁，１９
８８年，およびＣａｄｒｏｙら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ，８０：Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ−２４，１９８９年）。ブ
タのフォン・ビルブラント因子に対するマウスのモノク
ローナル抗体は、内在の血小板の機能を発揮することな
く、正常なブタに抗血栓の状態を誘発する（Ｂｅｌｌｉ
ｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
（ＵＳＡ），８４巻，８１００〜８１０４頁，１９８７
年）。 【００１０】グリコカリシンの４５ｋｄのタンパク質分
解性フラグメント（ＧＰＩｂフラグメント）とその誘導
体は、ｖＷＦと血小板の結合反応を阻害するので、これ
らのペプチドは、ヨーロッパ特許出願公開第３１７２７
８号に示されているように抗血栓物質として使用し得
る。オーストラリア特許出願第ＡＵ８７／７３７１５号
に記載されているように、ｖＷＦのフラグメントも上記
の結合反応を阻害する。Ｖｉｎｃｅｎｔｅら，Ｊ Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ，２６５巻，２７４〜２８０頁，１９９
０年、には、リストセチンおよびボトロセチンで誘発さ
れるｖＷＦと血小板の結合反応をブロックする、ＧＰＩ
ｂ由来のペプチドが開示されている。 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】ｖＷＦと、血小板が含
有するＧＰＩｂ−ＩＸ複合体との結合を特異的に阻害す
ることにより、抗血栓症法の別の方法を提供すること。 【００１２】 【課題を解決するための手段】本発明は、抗血栓物質と
して有用な、内皮下層に対する血小板の粘着のペプチド
インヒビターに関する。このようなタンパク質のいくつ
かはヘビの毒中に存在することが見出され、本発明はこ
れらのタンパク質の精製法を提供するものである。さら
に所望のインヒビターを含有するこれらの毒の同定法も
示す。 【００１３】したがって、１つの局面では、本発明は、
ｖＷＦ／ＧＰＩｂ−ＩＸ相互作用のインヒビターである
抗血栓物質に関する。より特定すれば、これらのペプチ
ドは、ＧＰＩｂ−ＩＸに結合して、ｖＷＦが結合するの
をブロックすると考えられる。これらの抗血栓物質は、
血小板抗粘着物質と総称する。本明細書に記載されてい
るヘビ毒中に見出された血小板抗粘着物質は、各々１２
〜１４ｋｄの２つの異なるサブユニットがジスルフィド
結合されて構成される２４〜２８ｋｄのペプチドであ
る。ペプチド抗粘着物質の２つの各サブユニット間に
は、有意な配列の相同性が存在する。 【００１４】別の局面では、本発明は、本発明の血小板
抗粘着物質を提供する、ヘビ毒を含む生物体液の同定方
法に関する。 【００１５】さらに他の局面では、本発明は、本発明の
血小板抗粘着物質を用いて血栓症を予防もしくは改善す
る方法およびその抗粘着物質を含有する製薬組成物に関
する。 【００１６】本発明のペプチドは、ｖＷＦと、血小板が
含有するＧＰＩｂ−ＩＸ複合体との結合を特異的に阻害
することにより、抗血栓症法の別の方法を提供する。こ
れらのペプチドは抗血栓治療に有用な薬剤である。 【００１７】 【発明の実施の形態】本発明の血小板抗粘着物質は、抗
血栓物質としてのその挙動に関連する明白なインビトロ
での特性をもっている。本発明の抗粘着物質はすべて、
ＡＤＰ、コラーゲンおよびトロンビンによって誘発され
る血小板凝集反応を阻害できないので、これはＧＰＩＩ
ｂ−ＩＩＩａに結合するＦｇのインヒビターではなく、
その血小板凝集反応を阻害しない。しかし、本発明の抗
粘着物質は、Ａｌｌａｉｎ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｊ Ｌａｂ
Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，８５巻、３１８頁、１９７５年およ
びＲｅａｄ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｍｅ
ｄ，１０１巻、７４頁、１９８３年に記載されているよ
うな標準のアッセイでは未刺激の血小板の凝集反応を防
止する。また本発明の抗粘着物質は、Ｒｕｇｇｅｒｉ，
Ｃ．Ｍ．ら，ＪＣｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，７２巻、１−
１２頁、１９８３年のアッセイのような標準アッセイを
用いた場合、標識を付けたｖＷＦの洗浄血小板への結合
を阻害する。 【００１８】以下に述べるのは、本発明の血小板抗粘着
物質が明確な試験結果を示すアッセイである。 【００１９】１）血小板のリストセチンまたはボトロセ
チンによる凝集の阻害：このアッセイでは、Ｂｒｉｎｋ
ｈａｕｓ，Ａ．Ｍ．ら，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１
６９巻、１４９〜１４３頁、１９８９年に記載されてい
るようにして調製した、ホルムアルデヒドで固定し洗浄
した血小板を、Ｔｈｏｒｅｌｌ，Ｌ．ら、Ｔｈｒｏｂ
Ｒｅｓ，３５巻、４３１〜４５０頁、１９８４年に記載
されているのと同様にして調製した精製ｖＷＦと混合
し、次いで抗生物質のリストセチンまたはヘビ毒凝集素
のボトロセチンによって凝集反応を開始させる。血小板
に対する抗粘着活性を試験する物質の濃度を増大させた
ものを、凝集反応誘発物質を添加する前に、ｖＷＦの存
在下、固定血小板とともに１分間インキュベートする。
凝集反応は、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ（米国、ペンシルベニア州、ババータウン）が供給
しているような市販の血小板凝集計（ａｇｇｒｅｇｏｍ
ｅｔｅｒ）で測定され、ｖＷＦとＧＰＩｂ−ＩＸ複合体
の結合反応の尺度となる。（いくつかの試料は、固定血
小板アッセイの代わりに、血小板が豊富な血漿（ｐｌａ
ｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ，ＰＲＰ）中で試
験し得るが、前者の形態のアッセイは、高濃度の凝固酵
素を含有するヘビ毒のような粗原料については好ましく
ない）。 【００２０】２）標識ｖＷＦの血小板との結合の阻害 本発明の抗粘着物質は、放射性標識、ビオチンまたは他
の方法で標識をつけたｖＷＦの血小板に対する、リスト
セチンもしくはボトロセチンによって誘発される結合反
応もまた阻害する。血小板は洗浄された血小板として提
供され得、アッセイは、Ｒｕｇｇｅｒｉら，Ｊ Ｃｌｉ
ｎ Ｉｎｖｅｓ，７２巻，１〜１２頁，１９８３年（上
記文献）に記載されているのと同様にして、ＥＬＩＳＡ
プレートに結合させたグリコカリシンに対して、または
任意の適切な形態の血小板もしくはＧＰＩＸ−Ｉｂに対
して実施し得る。 【００２１】したがって一般に、本発明の抗粘着物質
は、リストセチンもしくはボトロセチンで誘発された血
小板凝集反応を阻害する性能を測定するアッセイと、リ
ストセチンもしくはボトロセチンで誘発されたｖＷＦが
血小板と結合するのを阻害する性能を測定するアッセイ
の両方で陽性である。しかし本発明の抗粘着物質は、フ
ィブリノーゲンがＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａレセプターと結
合するのを阻害しない。 【００２２】抗粘着物質の起源の同定 ヘビ毒のような生物体液は、本発明の血小板抗粘着物質
を含有するが、上記のような、固定し洗浄された血小板
によるリストセチン／ボトロセチン誘発凝集反応の阻害
アッセイ、またはｖＷＦの、血小板が含有するＧＰＩｂ
−ＩＸ複合体への結合の阻害を測定するアッセイを用い
て有効に同定される。 【００２３】活性のある候補物質は、単離・精製された
形態で血小板抗粘着物質を得るために精製工程に付され
る。サイズクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィーおよび逆相ＨＰＬＣのような各種のタンパク質
精製法を使用し得るが、代表的で有効な方法は次のとお
りである。 【００２４】凍結乾燥された形態の粗毒約１０〜１００
０ｍｇを希酢酸（０.５Ｍ）で再構成し、次にセファデ
ックスＧ−５０のようなサイジングカラムに入れ、次に
同じ溶媒中で溶離する。酢酸を除くために凍結乾燥した
後、先に述べたような、固定され洗浄された血小板と精
製ｖＷＦとのボトロセチンもしくはリストセチンで誘発
された凝集のアッセイを利用して、各画分を抗粘着活性
について検定する。 【００２５】サイジングカラムから同定された活性画分
を次に、そのヘビ毒中の抗粘着物質のイオン電荷によっ
て、カルボキシメチル（ＣＭ）−セファシルまたはジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファシルのカラムに
吸着させ、次に、イオン強度を増大させながら用いる酢
酸アンモニウム緩衝液でカラムから溶離させる。カラム
から得た画分を再び凍結乾燥して上記の揮発性塩を除
き、次いで上記の血小板凝集アッセイを利用して検定す
る。（多くの粗ヘビ毒中に存在する凝固活性が活性面分
から除去されたとき、場合によっては、この段階で、血
小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）を固定・洗浄された血小板
の代わりに用い得る）。 【００２６】イオン交換ステップから得た活性画分は次
に、ＶｙｄａｃのようなＣ4ＲＰＬＣカラムの調製用逆
相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）を用い、アセト
ニトリル（２〜７０％アセトニトリル）および０.１％
ＴＦＡ／Ｈ2Ｏを含有するグラディエント液で溶離して
精製し得る。グラディエント液の濃度の勾配と流量は、
通常の方法を用いて最適化される。活性画分は、この場
合は血小板製剤としてＰＲＰを用い、前記の血小板凝集
アッセイによって決定される。得られた活性画分をプー
ルし、濃縮し、次いで分析用のＨＰＬＣもしくはＳＤＳ
−ＰＡＧＥを用いて均質性について試験する。 【００２７】上記のまたは他の精製法によって得ること
ができる本発明の抗粘着物質には、下記のヘビからなる
群から選ばれる毒から得られる物質が含まれる。すなわ
ちアグキストロドン・アクタス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏ
ｎ ａｃｔｕｓ）、アグキストロドン・ハリス・ブロモ
フィ（Ａｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｂｌｏｍｈ
ｏｆｆｉ）、アグキストロドン・コントルトリックス・
モカセン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒ
ｉｘ ｍｏｋａｓｅｎ）、ビティス・アリエタンス（Ｂ
ｉｔｉｓ ａｒｉｅｔａｎｓ）、ビティス・コーダリス
（Ｂｉｔｉｓｃａｕｄａｌｉｓ）、ビティス・ガボニカ
（Ｂｉｔｉｓ ｇａｂｏｎｉｃa）、ビティス・ジー・
リノセロス（Ｂｉｔｉｓ ｇ．ｒｈｉｎｏｃｅｒｏ
ｓ）、ボスロプス・アスパー（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｓ
ｐｅｒ）、ボスロプス・アルタナータ（Ｂｏｔｈｒｏｐ
ｓ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、ボスロプス・アトロックス
（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ）、ボスロプス・コチ
アラ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｃｏｔｉａｒａ）、ボスロプ
ス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｏｓ ｊａｒａｒａｃ
ａ）、ボスロプス・ニューイーディ（Ｂｏｔｈｒｏｐｏ
ｓ ｎｅｗｉｅｄｉ）、ボスロプス・メデューサ（Ｂｏ
ｔｈｒｏｐｏｓ ｍｅｄｕｓａ）、ボスロプス・シュレ
グリ（Ｂｏｔｈｒｏｐｏｓ ｓｃｈｌｅｇｌｉ）、セラ
ステス・セラステス（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔ
ｅｓ）、セラステス・バイペラ（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｖ
ｉｐｅｒａ）、クロタルス・アダマンチユース（Ｃｒｏ
ｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）、シ・アルトック
ス（Ｃ．ａｔｒａｘ．）、シー・バシリカス（Ｃ．ｂａ
ｓｉｌｉｃｕｓ）、シー・ジュリスス・トトナタカス
（Ｃ．ｄｕｒｉｓｓｕｓ ｔｏｔｏｎａｔａｃｕｓ）、
シー・エイチ・ホリダス（Ｃ．ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕ
ｓ）、シー・エム・モロスス（Ｃ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｕ
ｓ）、シー・ルバー（Ｃ．ｒｕｂｅｒ）、シー・スクタ
ラタス（Ｃ．ｓｃｕｔａｌａｔｕｓ）、シー・ブイ・セ
レバルス（Ｃ．ｖ．ｃｅｒｅｂｅｒｕｓ）、シー・ブイ
・ヘレリ（Ｃ．ｖ．ｈｅｌｌｅｒｉ）、シー・ブイ・ル
トスス（Ｃ．ｖ．ｔｕｔｏｓｕｓ）、シー・ブイ・オレ
ガヌス（Ｃ．ｖ．ｏｒｅｇａｎｕｓ）、エキス・カリナ
ツス・ソクレキー（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓ
ｓｏｃｈｕｒｅｃｋｉ）、エリステェコフィス・マクマ
ホニー（Ｅｒｉｓｔｉｃｏｐｈｉｓｍａｃｍａｈｏｎ
ｉ）、プソイドセラスシス・パーシクス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｃｅｒａｓｔｅｓ ｐｅｒｓｉｃｕｓ）、シストルール
ス・エム・バルボーリ（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ ｍ．ｂａ
ｒｂｏｕｒｉ）、シストルールス・シー・ターゲミナス
（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ Ｃ．ｔｅｒｇｅｍｉｎｕｓ）、
トリメレスルス・フラボビリディス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓ
ｕｒｕｓ ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｅｓ）、トリメレスル
ス・グラミニウス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａ
ｍｉｎｅｕｓ）、バイペラ・レベティナ（Ｖｉｐｅｒａ
ｌｅｂｅｔｉｎａ）、バイペラ・アモンディテス（Ｖ
ｉｐｅｒａ ａｍｍｏｎｄｙｔｅｓ）、バイペラ・パラ
スティナエ（Ｖｉｐｅｒａ ｐａｌａｓｔｉｎａｅ）、
およびバイペラ・アール・ルセリィ（Ｖｉｐｅｒａ
ｒ．ｒｕｓｓｅｌｌｉ）からなるヘビの群から選択され
る。 【００２８】本発明の精製血小板粘着インヒビターは、
次に標準法を用いて配列が決定される。全ペプチドは一
般に、未変性タンパク質中のシステイン残基の還元とア
ルキル化によって配列を決定され得、この処理によって
個々のサブユニットを分離し得る。個々のサブユニット
はタンパク質分解反応によって消化されてフラグメント
を生成しそのフラグメントはＲＰＬＣを用いて分離さ
れ、ついでそのタンパク質の配列が、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７３Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ｅｑｕｅｎａｔｏｒのような自動タンパク質シークエネ
ーターを用いて決定される。 【００２９】あるいはそのタンパク質の全配列は、ヘビ
の組織のクローン化ＤＮＡライブラリーから抗粘着物質
をコードするＤＮＡを検索することによって決定され得
る。このようなＤＮＡを得る各種の方法が知られるが、
抗粘着物質に対する部分的なアミノ酸配列に基づいて設
計されたオリゴヌクレオチドのプローブによってスクリ
ーニングする方法、または精製抗粘着物質に対して調製
された抗体を用いる発現スクリーニング法がある。 【００３０】組換え産生および他の合成産生 本発明の血小板抗粘着物質（ＰＡＡ）は、組換え法の使
用を含む各種の方法で産生することができる。 【００３１】未変性のＰＡＡまたはその変異体をコード
する遺伝子は、各種の組換え系を用いて操作して発現し
得る。適切な構造の発現系があれば、翻訳されたタンパ
ク質をプロセシングしない宿主系を使用し得る。例えば
その発現系は、任意の隣接配列を適切に修飾することに
より、所望のＮ末端のすぐ前にＡＴＧ開始コドンを配置
し、かつ所望のＣ末端の後に終止コドンを配置すること
によって構築される。次に所望のコーディング配列を、
所望どおりに、原核もしくは真核の宿主内で機能する制
御系に、作動可能な結合で連結される。現在、多数の制
御系が当該技術分野で公知である。 【００３２】ＰＡＡのプロセシングが所望の場合は、あ
る種の真核系が有利である。組換え宿主を選択するには
注意しなければならない。この選択がプロセシングの性
質を決定する。また、タンパク質分解酵素もしくはグリ
コシル化酵素により、切断またはグリコシル化され易い
と考えられる位置の置換アミノ酸をコードするために遺
伝子配列を改変することによって、プロセシングを中断
し得る。例えばアルギニンまたはリシンをトレオニン残
基で置換すれば、生成したペプチドは、それらの部位で
トリプシンによって切断されにくくなる。あるいは、発
現は、これらのペプチドのプロセシングを行うことがで
きる酵素の欠乏する宿主内で行われ得る。 【００３３】ＰＡＡをコードする遺伝子は、ＰＡＡをコ
ードするＤＮＡで構築されたプローブまたは抗ＰＡＡ抗
体が入手できれば得られるので、これらの遺伝子は、部
位特異的突然変異誘発法で１つ以上のアミノ酸に対する
コドンを置換することによって操作し得、ＰＡＡ活性を
保持するこれらのペプチドのアナログをコードする配列
を得ることができる。 【００３４】発現ベクターの構築と、適正なＤＮＡ配列
の組換え法による産生は、当該技術分野でそれ自体公知
の方法で行われ得る。 【００３５】発現は原核または真核系で行われ得る。原
核系は、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の各種の菌株で代
表される場合が最も多い。しかし他の微生物の菌株も使
用し得、例えば、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｌｓ）のような桿菌類、シュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の各種の種、または他
の細菌菌株がある。このような原核系では、宿主と適合
性の種由来の複製起点および制御配列を含むプラスミド
ベクターが用いられる。例えば、イー・コリは、一般
に、ｐＢＲ３２２すなわちイー・コリの種由来のプラス
ミドの誘導体、またはｐＵＣシリーズのベクターを用い
て形質転換される。通常用いられる原核制御配列は、本
明細書では、リボソーム結合部位の配列とともに任意に
オペレーターを有する転写開始のプロモーターを含有す
ると定義され、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）と
ラクトース（ｌａｃ）のプロモーター系のような通常用
いられるプロモーター系が含まれるが、原核生物と適合
性のトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびλ
由来ＰLプロモーター系を使用し得る。 【００３６】真核宿主に有効な発現系は、適切な真核遺
伝子由来のプロモーターを含有する。酵母に有効なある
種類のプロモーターは、例えば、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼの合成を行うプロモーターを含む、解糖酵素
合成を行うプロモーターを持っている。他のプロモータ
ーとしては、ＹＥp１３から得られるエノラーゼ遺伝子
またはＬｅｕ２遺伝子由来のプロモーターがある。 【００３７】適切な哺乳類のプロモーターとしては、メ
タロチオネインプロモーター、ＳＶ４０由来の初期もし
くは後期のプロモーター、またはポリオーマ、アデノウ
イルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウィルスもしくはトリ肉腫ウィ
ルスのような他のウィルスプロモーターがある。適切な
ウィルスおよび哺乳類のエンハンサーも使用し得る。植
物の細胞が発現系として用いられる場合は、ノパリン合
成のプロモーターが適切である。昆虫細胞もまた、バキ
ュロウイルスに基づいた発現系とともに宿主として使用
し得る。 【００３８】発現系は、標準の方法を用い、当該技術分
野で公知の標準の連結法および制限法を採用して、ＰＡ
Ａをコードする配列に前記の制御要素を作動可能に連結
することによって構築される。単離されたプラスミド、
ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、
切断され、仕立てられ、所望の形に再連結される。 【００３９】構築されたベクターで適切な宿主を形質転
換させる。使用される宿主細胞によって、その細胞に適
した標準の方法を用いて形質転換が実施される。形質転
換された細胞は、次に、ＰＡＡをコードする配列の発現
に有利な条件下で培養され、ついで組換え法で産生され
たタンパク質が培養物から回収される。 【００４０】組換え法による産生に加え、その推定配列
が直接ペプチド合成を実施できる程度に充分に短いペプ
チドを、標準の固相法を用いて調製し得る。 【００４１】したがって、本発明の適用範囲内の化合物
は、当該技術分野で公知の手段、例えば固相ペプチド合
成法によって化学的に合成し得る。この合成は、α−ア
ミノ保護アミノ酸を用いてペプチドのカルボキシ末端か
ら開始される。他の保護基が適切であっても、ｔ−ブチ
ルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基はすべてのアミノ
基に対して使用することができる。例えばＢｏｃ−Ｖａ
ｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｏ
ＨまたはＢｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ（すなわち選択されたＢ
ＮＰアナログのカルボキシ末端のアミノ酸）は、クロロ
メチル化ポリスチレン樹脂の支持体に対してエステル化
され得る。このポリスチレン樹脂の支持体は、架橋剤と
してのジビニルベンゼンが約０.５〜２％となる、スチ
レンとのコポリマーが好ましく、この架橋剤によって、
ポリスチレンポリマーはある種の有機溶媒に対して完全
に不溶性になる（Ｓｔｅｗａｙｔら，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈ
ａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９６
９年，米国、サンフランシスコのＷ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａ
ｎ Ｃｏ．、およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ Ａｍ
Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，８５巻、２１４９〜２１５４頁、１
９６３年参照）。またこれらのおよび他のペプチド合成
法は、米国特許第３,８６２,９２５号、同第３,８４２,
０６７号、同第３,９７２,８５９号および同第４,１０
５,６０２号に例示されている。 【００４２】この合成は、手動法を用い得るが、また
は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４
３０Ａもしくは４３１Ａペプチド合成器（米国、カリフ
ォルニア州、ホスターシティ）を、メーカー提供の指示
マニュアルに記載されている指示事項にしたがって用い
て自動的に行い得る。 【００４３】当然、自動合成法も配列の制御を行い得る
ので、上記のように遺伝子を改変することによって得ら
れるアミノ酸配列に対する上記の改変は、この合成法を
用いて得られる。さらに、置換アミノ酸は遺伝子によっ
てコードする必要はない。従って、Ｄ型アミノ酸もしく
はβアミノ酸が天然に存在しているアミノ酸の代わりに
用いられ得る。 【００４４】抗粘着剤に対する抗体の調製 本発明の血小板抗粘着剤はまた、本発明の化合物に対し
て免疫特異的な抗血清を得るため、免疫化プロトコルに
利用し得る。得られたＰＡＡ化合物は、次いで、マウ
ス、ウサギなどの適切な哺乳類の被検体に注射し得る。
適切なプロトコルは、血清中に抗体の産生を上昇させる
計画にしたがって、アジュバントの存在下、免疫原を繰
返し注射することを含む。免疫血清の力価は、当該技術
分野で現在標準になっている免疫検定法を用い、本発明
の化合物を抗原として用いることによって容易に測定す
ることができる。 【００４５】得られた抗血清は直接使用し得、またはモ
ノクローナル抗体が、免疫化動物の末梢血液リンパ球も
しくは膵臓を採集し、その抗体産生細胞を不死化し、次
いで標準の免疫検定法を用いて適切な抗体産生体を同定
することによって得ることができる。 【００４６】比較的小さなハプテン類である本発明のい
ずれの化合物も、通常用いられるキーホールリンペット
ヘモシアニン（ＫＬＨ）のような抗原として中性の担
体、または血清アルブミン担体に有利に連結される。担
体への連結は、当該技術分野で一般に公知の方法で行い
得る。連結はジシクロヘキシルカルボジイミド、または
他のカルボジイミド脱水剤のような縮合剤を用いて実施
し得る。この連結を行うのにリンカー化合物も使用し
得、同種の二官能性のリンカーおよび異種の二官能性の
リンカーは、米国、イリノイ州、ロックフォードのＰｉ
ｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手
できる。 【００４７】投与および効用 本発明の血小板粘着インヒビターは、血小板の粘着およ
び血栓の生成を防止し、かつ血管形成術のような侵襲性
方法を行った後の動脈の再狭窄を防止するのに治療上有
用である。このような治療法を行うのに適した症状に
は、限定はないが、アテローム性動脈硬化症および動脈
硬化症、急性心筋梗塞、慢性不安定狭心症、一過性脳虚
血発作、末梢血管の疾病、動脈血栓症、子かん前症、塞
栓症、ならびに血管形成術、頸動脈血管内膜切除術、血
管移植片の吻合術および心臓血管器具（例えば留置カテ
ーテルもしくはシャント“体外循環装置”）の長期間の
使用の後に起こる、再狭窄および／または血栓症が含ま
れる。これらの症候群は各種の狭窄性と閉塞性の血管障
害を示すが、これらの障害は、血小板の粘着で始まり、
次いで血小板が活性化され、血管壁の新生内膜層の血管
平滑筋が増殖して、再狭窄に至る原因である強力な成長
因子を含有する、血小板顆粒の内容物が放出され、続い
て損傷した動脈の管壁に血小板血栓が生成すると考えら
れる。 【００４８】本発明の血小板粘着インヒビターは、不安
定狭心症および動脈の塞栓症もしくは血栓症における動
脈血栓の形成の防止もしくは停止、ならびに心筋梗塞
（ＭＩ）およびＭＩが起こった後の壁在性血栓生成の治
療もしくは防止に使用し得る。本発明の血小板粘着イン
ヒビターは、血小板が粘着し、続いて動脈の再閉塞が起
こるのを阻害するために、ストレプトキナーゼまたはプ
ラスミノーゲン活性化因子のような血栓崩解剤とともに
投与し得る。 【００４９】さらに、これらの抗血栓剤は、器官の移植
が原因で起こる血栓症と再狭窄を抑制するのに使用し
得、そして血栓症によって仲介される器官の拒絶反応お
よび移植で誘発されるアテローム性動脈硬化症の防止に
使用し得る。 【００５０】血小板粘着インヒビターの投与量は、所望
の作用と治療計画によって広範囲に変化させ得る。一般
に投与量は約０.００１〜１０ｍｇ／Ｋｇ個体の体重で
ある。投与は、好ましくは、静脈投与のような非経口
で、毎日、１週間まで、または１、２ヶ月間もしくはそ
れ以上行うが、治療のスケジュールによって変化し得
る。血小板粘着インヒビターのペプチドフラグメントを
使用する場合は、鼻内、舌下などのような他の経路を利
用し得る。 【００５１】注射剤は次のような通常の形態で調製し得
る。すなわち液体の溶液または懸濁液、注射に先立ち溶
液または懸濁液にするのに適した個体の形態、またはエ
マルジョンである。適切な賦形剤は、例えば水、食塩
水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシ
チン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイ
ン塩酸塩などである。さらに、目的により、注射用医薬
組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤、ｐＨ
緩衝剤などを含有し得る。目的により、吸収促進製剤
（例えばリポソーム類）を利用し得る。 【００５２】以下に記載する実施例は例示を目的とする
ものであり、本発明を限定するものではない。 【００５３】 【実施例】（実施例１） 血小板抗粘着剤を含有するヘビ毒の同定 アッセイを行うために、精製ヒトｖＷＦを、Ｔｈｏｒｅ
ｌｌらの前記文献の方法を用いて、ヒト血漿の冷却沈降
物から調整し、ＢｒｉｎｋｈｏｕｓおよびＲｅａｄの前
記文献に記載されているのと同様にして、ホルムアルデ
ヒドで固定し洗浄した血小板を調製しアッセイした。リ
ストセチン（１.５ｍｇ／ｍｌ最終濃度）またはボトロ
セチン（１０μｇ／ｍｌ最終濃度）を用いて血小板凝集
反応を開始させた。 【００５４】Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ社（米国、ミズーリ州、セントルイス）またはＭ
ｉａｍｉ Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ Ｌａｂｓ社（米
国、ユタ州、ソルト・レーク市）から入手した７３種の
凍結乾燥したヘビの粗毒液の１０ｍｇ／ｍｌ蒸留水溶液
を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０およびＣｅｎｔｒｉｃｏ
ｎ−３０（ＹＭ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）のマイクロコンセ
ントレーター（Ａｍｉｃｏｎ社、米国、マサチューセッ
ツ州、ダンバーズ）を用いて調製用限外濾過に付した。
濾液（１０μｌと５０μｌの試料）および保持液（１０
μｌと５０μｌの試料）両方を、調製した固定・洗浄血
小板を精製ｖＷＦとともに使用する、血小板凝集アッセ
イに試験試料として使用した。阻害活性は、Ｃｅｎｔｒ
ｉｃｏｎ−１０および同−３０の限外濾過で得た保持液
試料にのみ見い出された。結果を表１に示す。 【００５５】 【表１】 抗粘着活性は、ＶｉｐｅｒｉｎａｅおよびＣｒｏｔａｌ
ｉｎａｅの全種ではなく一部の種にみられたが、試験し
たＥｌａｐｉｄａｅの全種にはみられなかった。 【００５６】実施例２ Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｈｏｒｒｉｄｕｓ ｈｏｒｒｉｄｕ
ｓ毒からの血小板抗粘着物質の精製 ０.５Ｍ酢酸７.０ｍｌ中、Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｈｏｒｒ
ｉｄｕｓ ｈｏｒｒｉｄｕｓ毒５００ｍｇ（Ｍｉａｍｉ
Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ Ｌａｂｓ，Ｌｏｔ ＃Ｃ
Ｈ１８ＳＺ）の溶液を、０.５Ｍ酢酸で平衡化したセフ
ァデックスＧ−５０（ｆｉｎｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
２.５×１００ｃｍ）のカラムにかけ、溶出した。カ
ラムは、流速２５ｍｌ／時で溶出し、５ｍｌ画分を採集
した。各画分の１０μｌを１０画分１グループとしてプ
ールし（即ち、画分１−１０、１１−２０、２１−３０
等）、分析のために凍結乾燥した。この凍結乾燥画分
は、蒸留水５００μｌ中に再懸濁し、そしてその適量を
とり、精製ｖＷＦで再構築された固定化洗浄血小板の、
リストセチンで誘発される血小板凝集の阻害活性を測定
した。このアッセイにより活性のある阻害画分（３１−
４０）をプールし、凍結乾燥することにより、白色非結
晶粉末９５ｍｇを得た。 【００５７】この物質を、５ｍｌの０.０１Ｍ ＮＨ4Ｏ
Ａｃ、ｐＨ４.５中に溶解し、そして０.０１Ｍ〜０.５
Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ６.５で平衡化したカルボキシメ
チルセファクリルカラム（２.２×１３ｃｍ）にかけ、
画分（１２ｍｌ）を採取した。このカラムは、ＵＶ吸収
により画分を同定するため、２５４ｎｍ／１.０ ＡＵ
ＦＳでモニターした（図１）。ＵＶ吸収画分は、画分毎
に凍結乾燥し（各２０μｌ）、蒸留水１ｍｌ中に再懸濁
し、そしてその血小板凝集を阻害する能力を測定した。
画分１３〜１７が阻害活性を示し、そして過剰のＮＨ4
ＯＡｃを除くため、各画分をＨ2Ｏを用いて３回凍結乾
燥した。 【００５８】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（非還元）によるピーク阻害画分の分析により、Ｍｒ＝
２３−２８ｋｄに泳動する２種の主要タンパクが認めら
れた。これらの画分（１００μｇ）を、逆相Ｃ4液体ク
ロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ５４，０.
４６×２５ｃｍ、流速１.０ｍｌ／分、３００Ａ、１５
％アセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）〜７０％アセトニトリルのグラジエント溶出３０
分）で分析すると、２つの主要なＵＶ（２１４ｎｍ）吸
収ピークが認められ（図２）、これを集め、そして乾燥
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるこれら２つのピークを再
分析すると、より速くＨＰＬＣ溶出するピークは、ＣＨ
Ｈ−Ａ（２４.９分）として、Ｍｒ＝２３ｋｄに泳動さ
れ、そしてより遅く溶出するピークは、ＣＨＨ−Ｂ（２
５.６分）として、Ｍｒ＝２５ｋｄに泳動された（図
３）。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ＣＨＨ−ＡおよびＣ
ＨＨ−Ｂは２つの別個のタンパク鎖Ｍｒ＝１２−１５ｋ
ｄに分解された。未変性のＣＨＨ−ＡおよびＣＨＨ−Ｂ
は、共に、洗浄系のボトロセチンおよびリストセチンで
誘発される血小板凝集を阻害し、そして血小板に富む血
漿中の凝集も同程度に阻害した。 【００５９】ＣＨＨ−ＡおよびＣＨＨ−Ｂのイオン変換
画分からの分取精製は、分析用分析と同じグラジエント
溶出条件を用いて、セミ分取Ｃ4（２１４ＴＰ５１０、
３.５ｍｌ／分）カラム上で行った。図４は、精製され
たＣＨＨ−Ｂの分析Ｃ4 ＨＰＬＣクロマトグラムを示
し、そして図５は、ＣＨＨ−Ａのクロマトグラムを示
す。（各図の３４分におけるピークは雑音（ａｒｔｉｆ
ａｃｔ））。 【００６０】精製タンパク質（ＣＨＨ−Ｂ）の一部を還
元し、そしてアルキル化した（６Ｍグアニジン・ＨＣ
ｌ，０.２５Ｍトリス−ＨＣｌ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，
２０ｍＭジチオストレイトール（ＤＴＴ）を含む、ｐＨ
７.５、８時間２５℃）。過剰のヨードアセトアミドを
この還元タンパク質に加え、室温で８時間置いた。還元
された、およびアルキル化された鎖は、それぞれ、Ｃ4
逆相ＨＰＬＣを用いて分離した。より速く溶出するサブ
ユニット（ＣＨＨ−Ｂ−β）およびより遅く溶出するサ
ブユニット（ＣＨＨ−Ｂ−α）は、それぞれ、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７３Ａタンパク質シー
クエンサーを用いて、Ｎ末端配列分析（エドマン分解）
を行った。 【００６１】ＣＨＨ−Ｂ−αについては、エドマン分解
を３７回繰り返すことにより、以下のＮ末端アミノ酸配
列が得られた。Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ
−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ。１２７個のアミノ酸からなるこの鎖の完全な
アミノ酸配列を図６に示す。 【００６２】ＣＨＨ−Ｂ−βについては、２７回のサイ
クルにより、以下のＮ末端アミノ酔配列を得た。Ａｓｐ
−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ。この鎖の完全なアミノ酸配列は図６
を示す。 【００６３】精製ペプチドＣＨＨ−Ｂは、Ｒｕｇｇｅｒ
ｉら（前述）の方法に従って、ｖＷＦ血小板結合アッセ
イで試験した。結果は、図７に示す。結合阻害は、用量
依存的であり、そして精製ＣＨＨ−Ｂ濃度が２００ｎＭ
未満で、ｖＷＦの洗浄血小板への結合を抑制する。 【００６４】実施例３ Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅｓ毒からの抗粘着物
質の精製 Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅｓ毒（Ｍｉａｍｉ
Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ Ｌａｂｓ，Ｌｏｔ ＃ＣＣ
１２ＳＺ）５００ｍｇの０.５Ｍ酢酸溶液５.０ｍｌを、
０.５Ｍの酢酸で平衡化したセファデックスＧ−５０
（ｆｉｎｅ）のカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２.５×
１００ｃｍ）にかけ、溶出した。このカラムは４０ｍｌ
／時の流速とし、８ｍｌ画分をポリプロピレンチューブ
に採集した。各画分２５μｌを、１０画分を１グループ
としてプールし（１−１０、１１−２０、２１−３０
等）、そして凍結乾燥した。凍結乾燥画分は、蒸留水１
００μｌ中に再懸濁し、そしてその一定量をとり、精製
ｖＷＦにより再構築された固定化洗浄血小板のリストセ
チンで誘発される血小板凝集の阻害活性をアッセイし
た。このアッセイにおける活性画分（画分２１−４０）
をプールし、そして凍結乾燥して１９８ｍｇの白色粉末
を得た。 【００６５】この物質を、１０ｍｌの０.０１Ｍ ＮＨ4
ＯＡｃ、ｐＨ４.５中に溶解し、そしてＣＭ−セファロ
ースカラム（２.２×１３ｃｍ）に流した。０.０１Ｍ〜
０.５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ、〜ｐＨ６.５のｐＨおよび塩の
グラジエントを行い、そして画分（１０ｍｌ）をポリプ
ロピレンチューブに採集した。カラム溶出液は、ＵＶ吸
収により画分を同定するために、２５４ｎｍ／１.０Ａ
ＵＦＳでモニターした。各画分からの２５μｌを、１０
画分のグループに再度プールし、そして凍結乾燥した。
この画分を、蒸留水１００μｌに再溶解し、そしてその
血小板凝集阻害活性をアッセイした。画分８１−１００
が阻害活性を示し、集めて、過剰のＮＨ 4ＯＡｃを除く
ために各画分をＨ2Ｏにより３回凍結乾燥した。 【００６６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）による阻害画
分の分析により、Ｍｒ＝２３−２８ｋｄで泳動する染色
されたバンドである１つの主要タンパク質を認めた。還
元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、未変性のタンパク質が２つの
別個のタンパク質鎖Ｍｒ＝１２−１５ｋｄに分解した。
分析用Ｃ4逆相液体クロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ２
１４ＴＰ５４、０.４６×２５ｃｍ、流速１.０ｍｌ／
分、３００Ａ）上での３０％アセトニトリル／０.１％
ＴＦＡから７０％アセトニトリルのグラジエント溶
出、３０分間、で、図８に示す１つの主要ＵＶ（２１４
ｎｍ）吸収ピークを認めた（２７および３１分のピーク
は雑音）。 【００６７】精製されたタンパク質（ＣＣ）の一部を還
元し、そして実施例１と同様に、ヨードアセトアミドで
アルキル化した。このカルボキシアミドメチル化鎖を、
逆相Ｖｙｄａｃ−フェニルカラムを用いて分離した。よ
り速く溶出するサブユニット（ＣＣ−β）およびより遅
く溶出するサブユニット（ＣＣ−α）は、それぞれ、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７３Ａ）タン
パク質シークエンサーを用いてＮ末端配列分析を行っ
た。 【００６８】ＣＣ−βについて、エドマン分解を２５サ
イクル行うことにより、以下のＮ末端アミノ酸配列を得
た：Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌ
ｕ。 【００６９】ＣＣ−αについて、２０サイクルにより、
以下のＮ末端アミノ酸配列を得た：Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ。 【００７０】実施例４ Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ ｐｅｒｓｉｃｕｓ毒か
らの抗粘着物質の精製 Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ ｐｅｒｓｉｃｕｓ毒
（Ｍｉａｍｉ Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ Ｌａｂｓ，
Ｌｏｔ ＃ＰＳ８ＳＺ）１０００ｍｇの０.５Ｍ酢酸溶
液７.０ｍｌを、セファデックスＧ−５０ｆのカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２.５×１００ｃｍ）にかけ、
実施例２および３に記載のように溶出しアッセイした。
活性な画分（画分３１−５０）をプールし凍結乾燥し
た。 【００７１】この物質約１６０ｍｇを、０.０１Ｍ〜０.
５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃのＮＨ4ＯＡｃ緩衝液を用いたＣＭ−
セファロースカラム（２.２×１３ｃｍ）に吸着させ、
グラジエント溶離した。活性画分（各６ｍｌ、画分６４
−７２）が、固定化血小板アッセイで活性であることが
見いだされ、プールし、そして揮発性塩を除くために水
で数回凍結乾燥した。 【００７２】最終精製を、０.１％ＴＦＡ中の１５〜７
０％アセトニトリルの３０分間のグラジエントを用いた
セミ分取Ｃ4逆相液体クロマトグラフィーにより行っ
た。この物質の一部（３００μｇ）を還元し、そして実
施例２に記載の通り、カルボキシアミドメチル化した。
このカルボキシアミドメチル化した鎖を、前述のように
Ｃ4ＲＰＬＣで分離し、そして各鎖についてＮ末配列分
析を行った。 【００７３】より速く溶出するサブユニットＰＢ−β
は、エドマン分解を５０サイクル行い以下の配列を得
た：Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ
−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈ
ｅ。 【００７４】ＰＰ−α鎖は、３１サイクルで以下の配列
を得た：Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ。 【００７５】実施例５ Ｖｉｐｅｒａ ｒ． ｒｕｓｓｅｌｌｉ毒からの血小板
抗粘着物質の精製 実施例２−４の方法を用いて、Ｖｉｐｅｒａ ｒ．ｒｕ
ｓｓｅｌｌｉの毒１ｇを精製し、ＧＰＩｂインヒビター
を得た。精製したインヒビターの一部を、実施例２−４
に記載の通り、カルボキシアミドメチル化し、そしてそ
のサブユニットをＣ4ＲＰＬＣで分離した。 【００７６】より遅く溶出するサブユニットのＮ末端配
列を、２２サイクルのエドマン分解で、以下のアミノ酸
配列を得た。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ。 【００７７】実施例６ ボトロセチン／リストセチンで誘発される凝集の阻害 実施例２で調製したように、Ｃ． ｈｏｒｒｉｄｕｓ
ｈｏｒｒｉｄｕｓから精製されたタンパク質、および実
施例３で調製したように、Ｃ．ｃｅｒａｓｔｅｓから精
製されたタンパク質を、前述のように、ＰＲＰを用いた
ボトロセチン／リストセチンで誘発される凝集阻害アッ
セイを行った。その結果を図９に示す。再び、用量依存
的作用が示され、２−３μｇ／ｍｌの低濃度で阻害を示
す。
ターに関する。さらに詳しくは、本発明は、フォン・ビ
ルブラント因子（ｖＷＦ）が血小板糖タンパク質ＧＰＩ
ｂ−ＩＸ複合体と結合するのを阻害し、したがって血小
板−血管壁の粘着を防止するタンパク質およびペプチド
に関する。これらのペプチドのいくつかはヘビ毒中に存
在する。 【０００２】 【従来の技術】心臓血管系内の血栓症は、血管閉塞疾患
の主要な機序であると考えられ、西欧社会における高い
罹患率と死亡率の原因である。したがって、これらの多
くの疾患を治療するため、抗血栓物質が広く使用されて
いる（例えば、Ｓｔｅｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ，８０巻，１５０１〜１５１３頁，１９８９年参
照）。しかしいずれのグループの薬剤も、すべての個体
に対して完全に満足される薬剤ではなく、可能な治療剤
のレパートリーへの追加は常に歓迎される。 【０００３】血栓症発生の機序は複雑であるが、部分的
に理解されている。アテローム性動脈硬化症班の破裂に
よるか、または引き続く血管形成の間の該班の機械的除
去のなどの初期外傷のために、血小板−非血小板相互作
用によって血小板が損傷血管壁と粘着し、続いて血小板
が凝集（血小板−血小板相互作用）するともにフィブリ
ンの沈着が起こる。この現象の続発は、血漿タンパク質
と、特定の血小板表面糖タンパク質レセプターとの相互
作用によって制御される。血小板の粘着は、損傷に対す
る初期の反応であると考えられるから、粘着性血小板に
よって仲介される血栓症および／または再狭窄を予防も
しくは改善するために、阻害するのに特に望ましい標的
である。 【０００４】未刺激の循環血小板は数種の粘着性タンパ
ク質に対するレセプターを含有する。このタンパク質の
中で、ラミニンはＶＬＡ２およびＶＬＡ６と結合し、ま
たコラーゲンはＶＬＡ２、ＧＰＩＶなどと結合する。血
小板の内皮下層への初期の粘着は、血小板表面に存在す
るＧＰＩｂ−ＩＸ複合体の、特に動脈血管の閉塞部位に
見られる高い剪断速度の条件下で血管壁に固定化される
フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）に対する結合によ
って仲介されていると考えられる。この血小板ＧＰＩｂ
−ＩＸ複合体は、一般に休止血小板上で機能するが、通
常、血漿が含有するｖＷＦを捕捉しない。通常の環境下
では、動脈表面は血小板を粘着させる粘着性タンパク質
リガンド（ｖＷＦ）を提供しないので、血小板の粘着は
血管損傷の部位に捕捉されたｖＷＦに限定される。 【０００５】捕捉されたｖＷＦの存在によって血小板の
血管内皮への粘着が保持されると、血小板は活性化され
て血小板凝集体を形成し得、これに付随して、活性化さ
れたＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａレセプターによって、フィブ
リノーゲン（Ｆｇ）および血漿が含有するｖＷＦの結合
が起こる。したがって、ＧＰＩｂ−ＩＸに捕捉されたｖ
ＷＦの相互作用による未活性化血小板の粘着を特異的に
阻害する物質は、特に、狭窄によって高い剪断応力がも
たらされる血管内で血栓症が起こるのを阻害し得る。 【０００６】ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、ＧＰＩＸと非共
有結合的に複合したＩｂ表面メンブランのヘテロダイマ
ー（ＩｂαとＩｂβ）で構成され、約２５,０００コピ
ー／血小板表面の密度で存在している。この複合体の欠
除が、まれな先天的出血疾患であるベルナール・スリエ
症候群の原因であることが分かっており、この症候群
は、血小板表面に現れるＧＰＩｂ−ＩＸ複合体の欠除、
および動脈と血小板の粘着不全を特徴とする。フォン・
ビルブラント病の特徴であるフォン・ビルブラント因子
の欠損も、動脈と血小板の粘着不全をもたらすことが分
かっている。 【０００７】ＧＰＩｂ−ＩＸ／ｖＷＦの相互作用を妨害
できる物質が知られている。Ｋｉｒｂｙら，Ｔｈｒｏｍ
ｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，３４巻，７７０頁，１９
７５年には、エバンスブルー染料が、ｖＷＦとホルムア
ルデヒド固定血小板とのリストセチンによって誘発され
る結合をインビトロで阻害することが報告されている。
Ｇｅｒａｔｚら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉ
ｓ，３９巻，４１１頁，１９７８年では芳香族アミジノ
化合物類による同じ作用が証明されている。Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓら，Ｂｌｏｏｄ，７２巻，１８９８〜１９０３
頁，１９８８年には、リストセチンによって誘発される
血小板の凝集反応および血小板が豊富な血漿中での剪断
力によって誘発される血小板の凝集反応は、先に発表さ
れた他の化合物より１０倍低い濃度でトリフェニルメチ
ル化合物のアウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）により有
効に阻害されることを示した。またＡＴＡは、冠状動脈
血栓症のインビボでの有効なインヒビターであることが
立証されている（Ｓｔｒｏｎｙら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉ
ｏｎ，８０巻，ＩＩ−２３頁（Ａｂｓｔｒａｃｔ）１９
８９年；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０４１６６号）。 【０００８】また、ｖＷＦとＧＰＩｂ−ＩＸ複合体の結
合反応は、Ｒｕａｎら，ＢｒｉｔＪ Ｈａｅｍｏｔｏｌ
４９巻，１５１１頁，１９８１年とＣｏｌｌｅｒら，
Ｂｌｏｏｄ，６１巻，６９頁，１９８３年とに開示され
ているように、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体と免疫反応性のモ
ノクローナル抗体類によって阻害される。これらの抗体
は、ｖＷＦと血小板のリストセチン誘発結合反応を阻害
する。Ｂｅｃｋｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，７４巻，６９０〜
６９４頁，１９８９年には、これらの抗体もしくはその
免疫反応性フラグメントの１つは、モルモット中でのＧ
ＰＩｂの機能をインビボでブロックするが、ＡＤＰ、コ
ラーゲンもしくはトロンビンによって誘発される血小板
凝集反応に対しては全く効力を発揮しない。 【０００９】ヒトｖＷＦに対して免疫反応性のモノクロ
ーナル抗体は、高剪断速度下での血小板とコラーゲンの
粘着をブロックする（Ｆｒｅｓｓｉｎａｕｄら，Ｊ Ｌ
ａｂＣｌｉｎ Ｍｅｄ，１１２巻，５８〜６７頁，１９
８８年，およびＣａｄｒｏｙら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ，８０：Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ−２４，１９８９年）。ブ
タのフォン・ビルブラント因子に対するマウスのモノク
ローナル抗体は、内在の血小板の機能を発揮することな
く、正常なブタに抗血栓の状態を誘発する（Ｂｅｌｌｉ
ｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
（ＵＳＡ），８４巻，８１００〜８１０４頁，１９８７
年）。 【００１０】グリコカリシンの４５ｋｄのタンパク質分
解性フラグメント（ＧＰＩｂフラグメント）とその誘導
体は、ｖＷＦと血小板の結合反応を阻害するので、これ
らのペプチドは、ヨーロッパ特許出願公開第３１７２７
８号に示されているように抗血栓物質として使用し得
る。オーストラリア特許出願第ＡＵ８７／７３７１５号
に記載されているように、ｖＷＦのフラグメントも上記
の結合反応を阻害する。Ｖｉｎｃｅｎｔｅら，Ｊ Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ，２６５巻，２７４〜２８０頁，１９９
０年、には、リストセチンおよびボトロセチンで誘発さ
れるｖＷＦと血小板の結合反応をブロックする、ＧＰＩ
ｂ由来のペプチドが開示されている。 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】ｖＷＦと、血小板が含
有するＧＰＩｂ−ＩＸ複合体との結合を特異的に阻害す
ることにより、抗血栓症法の別の方法を提供すること。 【００１２】 【課題を解決するための手段】本発明は、抗血栓物質と
して有用な、内皮下層に対する血小板の粘着のペプチド
インヒビターに関する。このようなタンパク質のいくつ
かはヘビの毒中に存在することが見出され、本発明はこ
れらのタンパク質の精製法を提供するものである。さら
に所望のインヒビターを含有するこれらの毒の同定法も
示す。 【００１３】したがって、１つの局面では、本発明は、
ｖＷＦ／ＧＰＩｂ−ＩＸ相互作用のインヒビターである
抗血栓物質に関する。より特定すれば、これらのペプチ
ドは、ＧＰＩｂ−ＩＸに結合して、ｖＷＦが結合するの
をブロックすると考えられる。これらの抗血栓物質は、
血小板抗粘着物質と総称する。本明細書に記載されてい
るヘビ毒中に見出された血小板抗粘着物質は、各々１２
〜１４ｋｄの２つの異なるサブユニットがジスルフィド
結合されて構成される２４〜２８ｋｄのペプチドであ
る。ペプチド抗粘着物質の２つの各サブユニット間に
は、有意な配列の相同性が存在する。 【００１４】別の局面では、本発明は、本発明の血小板
抗粘着物質を提供する、ヘビ毒を含む生物体液の同定方
法に関する。 【００１５】さらに他の局面では、本発明は、本発明の
血小板抗粘着物質を用いて血栓症を予防もしくは改善す
る方法およびその抗粘着物質を含有する製薬組成物に関
する。 【００１６】本発明のペプチドは、ｖＷＦと、血小板が
含有するＧＰＩｂ−ＩＸ複合体との結合を特異的に阻害
することにより、抗血栓症法の別の方法を提供する。こ
れらのペプチドは抗血栓治療に有用な薬剤である。 【００１７】 【発明の実施の形態】本発明の血小板抗粘着物質は、抗
血栓物質としてのその挙動に関連する明白なインビトロ
での特性をもっている。本発明の抗粘着物質はすべて、
ＡＤＰ、コラーゲンおよびトロンビンによって誘発され
る血小板凝集反応を阻害できないので、これはＧＰＩＩ
ｂ−ＩＩＩａに結合するＦｇのインヒビターではなく、
その血小板凝集反応を阻害しない。しかし、本発明の抗
粘着物質は、Ａｌｌａｉｎ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｊ Ｌａｂ
Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，８５巻、３１８頁、１９７５年およ
びＲｅａｄ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｍｅ
ｄ，１０１巻、７４頁、１９８３年に記載されているよ
うな標準のアッセイでは未刺激の血小板の凝集反応を防
止する。また本発明の抗粘着物質は、Ｒｕｇｇｅｒｉ，
Ｃ．Ｍ．ら，ＪＣｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，７２巻、１−
１２頁、１９８３年のアッセイのような標準アッセイを
用いた場合、標識を付けたｖＷＦの洗浄血小板への結合
を阻害する。 【００１８】以下に述べるのは、本発明の血小板抗粘着
物質が明確な試験結果を示すアッセイである。 【００１９】１）血小板のリストセチンまたはボトロセ
チンによる凝集の阻害：このアッセイでは、Ｂｒｉｎｋ
ｈａｕｓ，Ａ．Ｍ．ら，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１
６９巻、１４９〜１４３頁、１９８９年に記載されてい
るようにして調製した、ホルムアルデヒドで固定し洗浄
した血小板を、Ｔｈｏｒｅｌｌ，Ｌ．ら、Ｔｈｒｏｂ
Ｒｅｓ，３５巻、４３１〜４５０頁、１９８４年に記載
されているのと同様にして調製した精製ｖＷＦと混合
し、次いで抗生物質のリストセチンまたはヘビ毒凝集素
のボトロセチンによって凝集反応を開始させる。血小板
に対する抗粘着活性を試験する物質の濃度を増大させた
ものを、凝集反応誘発物質を添加する前に、ｖＷＦの存
在下、固定血小板とともに１分間インキュベートする。
凝集反応は、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ（米国、ペンシルベニア州、ババータウン）が供給
しているような市販の血小板凝集計（ａｇｇｒｅｇｏｍ
ｅｔｅｒ）で測定され、ｖＷＦとＧＰＩｂ−ＩＸ複合体
の結合反応の尺度となる。（いくつかの試料は、固定血
小板アッセイの代わりに、血小板が豊富な血漿（ｐｌａ
ｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ，ＰＲＰ）中で試
験し得るが、前者の形態のアッセイは、高濃度の凝固酵
素を含有するヘビ毒のような粗原料については好ましく
ない）。 【００２０】２）標識ｖＷＦの血小板との結合の阻害 本発明の抗粘着物質は、放射性標識、ビオチンまたは他
の方法で標識をつけたｖＷＦの血小板に対する、リスト
セチンもしくはボトロセチンによって誘発される結合反
応もまた阻害する。血小板は洗浄された血小板として提
供され得、アッセイは、Ｒｕｇｇｅｒｉら，Ｊ Ｃｌｉ
ｎ Ｉｎｖｅｓ，７２巻，１〜１２頁，１９８３年（上
記文献）に記載されているのと同様にして、ＥＬＩＳＡ
プレートに結合させたグリコカリシンに対して、または
任意の適切な形態の血小板もしくはＧＰＩＸ−Ｉｂに対
して実施し得る。 【００２１】したがって一般に、本発明の抗粘着物質
は、リストセチンもしくはボトロセチンで誘発された血
小板凝集反応を阻害する性能を測定するアッセイと、リ
ストセチンもしくはボトロセチンで誘発されたｖＷＦが
血小板と結合するのを阻害する性能を測定するアッセイ
の両方で陽性である。しかし本発明の抗粘着物質は、フ
ィブリノーゲンがＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａレセプターと結
合するのを阻害しない。 【００２２】抗粘着物質の起源の同定 ヘビ毒のような生物体液は、本発明の血小板抗粘着物質
を含有するが、上記のような、固定し洗浄された血小板
によるリストセチン／ボトロセチン誘発凝集反応の阻害
アッセイ、またはｖＷＦの、血小板が含有するＧＰＩｂ
−ＩＸ複合体への結合の阻害を測定するアッセイを用い
て有効に同定される。 【００２３】活性のある候補物質は、単離・精製された
形態で血小板抗粘着物質を得るために精製工程に付され
る。サイズクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィーおよび逆相ＨＰＬＣのような各種のタンパク質
精製法を使用し得るが、代表的で有効な方法は次のとお
りである。 【００２４】凍結乾燥された形態の粗毒約１０〜１００
０ｍｇを希酢酸（０.５Ｍ）で再構成し、次にセファデ
ックスＧ−５０のようなサイジングカラムに入れ、次に
同じ溶媒中で溶離する。酢酸を除くために凍結乾燥した
後、先に述べたような、固定され洗浄された血小板と精
製ｖＷＦとのボトロセチンもしくはリストセチンで誘発
された凝集のアッセイを利用して、各画分を抗粘着活性
について検定する。 【００２５】サイジングカラムから同定された活性画分
を次に、そのヘビ毒中の抗粘着物質のイオン電荷によっ
て、カルボキシメチル（ＣＭ）−セファシルまたはジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファシルのカラムに
吸着させ、次に、イオン強度を増大させながら用いる酢
酸アンモニウム緩衝液でカラムから溶離させる。カラム
から得た画分を再び凍結乾燥して上記の揮発性塩を除
き、次いで上記の血小板凝集アッセイを利用して検定す
る。（多くの粗ヘビ毒中に存在する凝固活性が活性面分
から除去されたとき、場合によっては、この段階で、血
小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）を固定・洗浄された血小板
の代わりに用い得る）。 【００２６】イオン交換ステップから得た活性画分は次
に、ＶｙｄａｃのようなＣ4ＲＰＬＣカラムの調製用逆
相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）を用い、アセト
ニトリル（２〜７０％アセトニトリル）および０.１％
ＴＦＡ／Ｈ2Ｏを含有するグラディエント液で溶離して
精製し得る。グラディエント液の濃度の勾配と流量は、
通常の方法を用いて最適化される。活性画分は、この場
合は血小板製剤としてＰＲＰを用い、前記の血小板凝集
アッセイによって決定される。得られた活性画分をプー
ルし、濃縮し、次いで分析用のＨＰＬＣもしくはＳＤＳ
−ＰＡＧＥを用いて均質性について試験する。 【００２７】上記のまたは他の精製法によって得ること
ができる本発明の抗粘着物質には、下記のヘビからなる
群から選ばれる毒から得られる物質が含まれる。すなわ
ちアグキストロドン・アクタス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏ
ｎ ａｃｔｕｓ）、アグキストロドン・ハリス・ブロモ
フィ（Ａｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｂｌｏｍｈ
ｏｆｆｉ）、アグキストロドン・コントルトリックス・
モカセン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒ
ｉｘ ｍｏｋａｓｅｎ）、ビティス・アリエタンス（Ｂ
ｉｔｉｓ ａｒｉｅｔａｎｓ）、ビティス・コーダリス
（Ｂｉｔｉｓｃａｕｄａｌｉｓ）、ビティス・ガボニカ
（Ｂｉｔｉｓ ｇａｂｏｎｉｃa）、ビティス・ジー・
リノセロス（Ｂｉｔｉｓ ｇ．ｒｈｉｎｏｃｅｒｏ
ｓ）、ボスロプス・アスパー（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｓ
ｐｅｒ）、ボスロプス・アルタナータ（Ｂｏｔｈｒｏｐ
ｓ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、ボスロプス・アトロックス
（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ）、ボスロプス・コチ
アラ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｃｏｔｉａｒａ）、ボスロプ
ス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｏｓ ｊａｒａｒａｃ
ａ）、ボスロプス・ニューイーディ（Ｂｏｔｈｒｏｐｏ
ｓ ｎｅｗｉｅｄｉ）、ボスロプス・メデューサ（Ｂｏ
ｔｈｒｏｐｏｓ ｍｅｄｕｓａ）、ボスロプス・シュレ
グリ（Ｂｏｔｈｒｏｐｏｓ ｓｃｈｌｅｇｌｉ）、セラ
ステス・セラステス（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔ
ｅｓ）、セラステス・バイペラ（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｖ
ｉｐｅｒａ）、クロタルス・アダマンチユース（Ｃｒｏ
ｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）、シ・アルトック
ス（Ｃ．ａｔｒａｘ．）、シー・バシリカス（Ｃ．ｂａ
ｓｉｌｉｃｕｓ）、シー・ジュリスス・トトナタカス
（Ｃ．ｄｕｒｉｓｓｕｓ ｔｏｔｏｎａｔａｃｕｓ）、
シー・エイチ・ホリダス（Ｃ．ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕ
ｓ）、シー・エム・モロスス（Ｃ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｕ
ｓ）、シー・ルバー（Ｃ．ｒｕｂｅｒ）、シー・スクタ
ラタス（Ｃ．ｓｃｕｔａｌａｔｕｓ）、シー・ブイ・セ
レバルス（Ｃ．ｖ．ｃｅｒｅｂｅｒｕｓ）、シー・ブイ
・ヘレリ（Ｃ．ｖ．ｈｅｌｌｅｒｉ）、シー・ブイ・ル
トスス（Ｃ．ｖ．ｔｕｔｏｓｕｓ）、シー・ブイ・オレ
ガヌス（Ｃ．ｖ．ｏｒｅｇａｎｕｓ）、エキス・カリナ
ツス・ソクレキー（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓ
ｓｏｃｈｕｒｅｃｋｉ）、エリステェコフィス・マクマ
ホニー（Ｅｒｉｓｔｉｃｏｐｈｉｓｍａｃｍａｈｏｎ
ｉ）、プソイドセラスシス・パーシクス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｃｅｒａｓｔｅｓ ｐｅｒｓｉｃｕｓ）、シストルール
ス・エム・バルボーリ（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ ｍ．ｂａ
ｒｂｏｕｒｉ）、シストルールス・シー・ターゲミナス
（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ Ｃ．ｔｅｒｇｅｍｉｎｕｓ）、
トリメレスルス・フラボビリディス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓ
ｕｒｕｓ ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｅｓ）、トリメレスル
ス・グラミニウス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａ
ｍｉｎｅｕｓ）、バイペラ・レベティナ（Ｖｉｐｅｒａ
ｌｅｂｅｔｉｎａ）、バイペラ・アモンディテス（Ｖ
ｉｐｅｒａ ａｍｍｏｎｄｙｔｅｓ）、バイペラ・パラ
スティナエ（Ｖｉｐｅｒａ ｐａｌａｓｔｉｎａｅ）、
およびバイペラ・アール・ルセリィ（Ｖｉｐｅｒａ
ｒ．ｒｕｓｓｅｌｌｉ）からなるヘビの群から選択され
る。 【００２８】本発明の精製血小板粘着インヒビターは、
次に標準法を用いて配列が決定される。全ペプチドは一
般に、未変性タンパク質中のシステイン残基の還元とア
ルキル化によって配列を決定され得、この処理によって
個々のサブユニットを分離し得る。個々のサブユニット
はタンパク質分解反応によって消化されてフラグメント
を生成しそのフラグメントはＲＰＬＣを用いて分離さ
れ、ついでそのタンパク質の配列が、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７３Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ｅｑｕｅｎａｔｏｒのような自動タンパク質シークエネ
ーターを用いて決定される。 【００２９】あるいはそのタンパク質の全配列は、ヘビ
の組織のクローン化ＤＮＡライブラリーから抗粘着物質
をコードするＤＮＡを検索することによって決定され得
る。このようなＤＮＡを得る各種の方法が知られるが、
抗粘着物質に対する部分的なアミノ酸配列に基づいて設
計されたオリゴヌクレオチドのプローブによってスクリ
ーニングする方法、または精製抗粘着物質に対して調製
された抗体を用いる発現スクリーニング法がある。 【００３０】組換え産生および他の合成産生 本発明の血小板抗粘着物質（ＰＡＡ）は、組換え法の使
用を含む各種の方法で産生することができる。 【００３１】未変性のＰＡＡまたはその変異体をコード
する遺伝子は、各種の組換え系を用いて操作して発現し
得る。適切な構造の発現系があれば、翻訳されたタンパ
ク質をプロセシングしない宿主系を使用し得る。例えば
その発現系は、任意の隣接配列を適切に修飾することに
より、所望のＮ末端のすぐ前にＡＴＧ開始コドンを配置
し、かつ所望のＣ末端の後に終止コドンを配置すること
によって構築される。次に所望のコーディング配列を、
所望どおりに、原核もしくは真核の宿主内で機能する制
御系に、作動可能な結合で連結される。現在、多数の制
御系が当該技術分野で公知である。 【００３２】ＰＡＡのプロセシングが所望の場合は、あ
る種の真核系が有利である。組換え宿主を選択するには
注意しなければならない。この選択がプロセシングの性
質を決定する。また、タンパク質分解酵素もしくはグリ
コシル化酵素により、切断またはグリコシル化され易い
と考えられる位置の置換アミノ酸をコードするために遺
伝子配列を改変することによって、プロセシングを中断
し得る。例えばアルギニンまたはリシンをトレオニン残
基で置換すれば、生成したペプチドは、それらの部位で
トリプシンによって切断されにくくなる。あるいは、発
現は、これらのペプチドのプロセシングを行うことがで
きる酵素の欠乏する宿主内で行われ得る。 【００３３】ＰＡＡをコードする遺伝子は、ＰＡＡをコ
ードするＤＮＡで構築されたプローブまたは抗ＰＡＡ抗
体が入手できれば得られるので、これらの遺伝子は、部
位特異的突然変異誘発法で１つ以上のアミノ酸に対する
コドンを置換することによって操作し得、ＰＡＡ活性を
保持するこれらのペプチドのアナログをコードする配列
を得ることができる。 【００３４】発現ベクターの構築と、適正なＤＮＡ配列
の組換え法による産生は、当該技術分野でそれ自体公知
の方法で行われ得る。 【００３５】発現は原核または真核系で行われ得る。原
核系は、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の各種の菌株で代
表される場合が最も多い。しかし他の微生物の菌株も使
用し得、例えば、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｌｓ）のような桿菌類、シュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の各種の種、または他
の細菌菌株がある。このような原核系では、宿主と適合
性の種由来の複製起点および制御配列を含むプラスミド
ベクターが用いられる。例えば、イー・コリは、一般
に、ｐＢＲ３２２すなわちイー・コリの種由来のプラス
ミドの誘導体、またはｐＵＣシリーズのベクターを用い
て形質転換される。通常用いられる原核制御配列は、本
明細書では、リボソーム結合部位の配列とともに任意に
オペレーターを有する転写開始のプロモーターを含有す
ると定義され、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）と
ラクトース（ｌａｃ）のプロモーター系のような通常用
いられるプロモーター系が含まれるが、原核生物と適合
性のトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびλ
由来ＰLプロモーター系を使用し得る。 【００３６】真核宿主に有効な発現系は、適切な真核遺
伝子由来のプロモーターを含有する。酵母に有効なある
種類のプロモーターは、例えば、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼの合成を行うプロモーターを含む、解糖酵素
合成を行うプロモーターを持っている。他のプロモータ
ーとしては、ＹＥp１３から得られるエノラーゼ遺伝子
またはＬｅｕ２遺伝子由来のプロモーターがある。 【００３７】適切な哺乳類のプロモーターとしては、メ
タロチオネインプロモーター、ＳＶ４０由来の初期もし
くは後期のプロモーター、またはポリオーマ、アデノウ
イルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウィルスもしくはトリ肉腫ウィ
ルスのような他のウィルスプロモーターがある。適切な
ウィルスおよび哺乳類のエンハンサーも使用し得る。植
物の細胞が発現系として用いられる場合は、ノパリン合
成のプロモーターが適切である。昆虫細胞もまた、バキ
ュロウイルスに基づいた発現系とともに宿主として使用
し得る。 【００３８】発現系は、標準の方法を用い、当該技術分
野で公知の標準の連結法および制限法を採用して、ＰＡ
Ａをコードする配列に前記の制御要素を作動可能に連結
することによって構築される。単離されたプラスミド、
ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、
切断され、仕立てられ、所望の形に再連結される。 【００３９】構築されたベクターで適切な宿主を形質転
換させる。使用される宿主細胞によって、その細胞に適
した標準の方法を用いて形質転換が実施される。形質転
換された細胞は、次に、ＰＡＡをコードする配列の発現
に有利な条件下で培養され、ついで組換え法で産生され
たタンパク質が培養物から回収される。 【００４０】組換え法による産生に加え、その推定配列
が直接ペプチド合成を実施できる程度に充分に短いペプ
チドを、標準の固相法を用いて調製し得る。 【００４１】したがって、本発明の適用範囲内の化合物
は、当該技術分野で公知の手段、例えば固相ペプチド合
成法によって化学的に合成し得る。この合成は、α−ア
ミノ保護アミノ酸を用いてペプチドのカルボキシ末端か
ら開始される。他の保護基が適切であっても、ｔ−ブチ
ルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基はすべてのアミノ
基に対して使用することができる。例えばＢｏｃ−Ｖａ
ｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｏ
ＨまたはＢｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ（すなわち選択されたＢ
ＮＰアナログのカルボキシ末端のアミノ酸）は、クロロ
メチル化ポリスチレン樹脂の支持体に対してエステル化
され得る。このポリスチレン樹脂の支持体は、架橋剤と
してのジビニルベンゼンが約０.５〜２％となる、スチ
レンとのコポリマーが好ましく、この架橋剤によって、
ポリスチレンポリマーはある種の有機溶媒に対して完全
に不溶性になる（Ｓｔｅｗａｙｔら，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈ
ａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９６
９年，米国、サンフランシスコのＷ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａ
ｎ Ｃｏ．、およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ Ａｍ
Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，８５巻、２１４９〜２１５４頁、１
９６３年参照）。またこれらのおよび他のペプチド合成
法は、米国特許第３,８６２,９２５号、同第３,８４２,
０６７号、同第３,９７２,８５９号および同第４,１０
５,６０２号に例示されている。 【００４２】この合成は、手動法を用い得るが、また
は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４
３０Ａもしくは４３１Ａペプチド合成器（米国、カリフ
ォルニア州、ホスターシティ）を、メーカー提供の指示
マニュアルに記載されている指示事項にしたがって用い
て自動的に行い得る。 【００４３】当然、自動合成法も配列の制御を行い得る
ので、上記のように遺伝子を改変することによって得ら
れるアミノ酸配列に対する上記の改変は、この合成法を
用いて得られる。さらに、置換アミノ酸は遺伝子によっ
てコードする必要はない。従って、Ｄ型アミノ酸もしく
はβアミノ酸が天然に存在しているアミノ酸の代わりに
用いられ得る。 【００４４】抗粘着剤に対する抗体の調製 本発明の血小板抗粘着剤はまた、本発明の化合物に対し
て免疫特異的な抗血清を得るため、免疫化プロトコルに
利用し得る。得られたＰＡＡ化合物は、次いで、マウ
ス、ウサギなどの適切な哺乳類の被検体に注射し得る。
適切なプロトコルは、血清中に抗体の産生を上昇させる
計画にしたがって、アジュバントの存在下、免疫原を繰
返し注射することを含む。免疫血清の力価は、当該技術
分野で現在標準になっている免疫検定法を用い、本発明
の化合物を抗原として用いることによって容易に測定す
ることができる。 【００４５】得られた抗血清は直接使用し得、またはモ
ノクローナル抗体が、免疫化動物の末梢血液リンパ球も
しくは膵臓を採集し、その抗体産生細胞を不死化し、次
いで標準の免疫検定法を用いて適切な抗体産生体を同定
することによって得ることができる。 【００４６】比較的小さなハプテン類である本発明のい
ずれの化合物も、通常用いられるキーホールリンペット
ヘモシアニン（ＫＬＨ）のような抗原として中性の担
体、または血清アルブミン担体に有利に連結される。担
体への連結は、当該技術分野で一般に公知の方法で行い
得る。連結はジシクロヘキシルカルボジイミド、または
他のカルボジイミド脱水剤のような縮合剤を用いて実施
し得る。この連結を行うのにリンカー化合物も使用し
得、同種の二官能性のリンカーおよび異種の二官能性の
リンカーは、米国、イリノイ州、ロックフォードのＰｉ
ｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手
できる。 【００４７】投与および効用 本発明の血小板粘着インヒビターは、血小板の粘着およ
び血栓の生成を防止し、かつ血管形成術のような侵襲性
方法を行った後の動脈の再狭窄を防止するのに治療上有
用である。このような治療法を行うのに適した症状に
は、限定はないが、アテローム性動脈硬化症および動脈
硬化症、急性心筋梗塞、慢性不安定狭心症、一過性脳虚
血発作、末梢血管の疾病、動脈血栓症、子かん前症、塞
栓症、ならびに血管形成術、頸動脈血管内膜切除術、血
管移植片の吻合術および心臓血管器具（例えば留置カテ
ーテルもしくはシャント“体外循環装置”）の長期間の
使用の後に起こる、再狭窄および／または血栓症が含ま
れる。これらの症候群は各種の狭窄性と閉塞性の血管障
害を示すが、これらの障害は、血小板の粘着で始まり、
次いで血小板が活性化され、血管壁の新生内膜層の血管
平滑筋が増殖して、再狭窄に至る原因である強力な成長
因子を含有する、血小板顆粒の内容物が放出され、続い
て損傷した動脈の管壁に血小板血栓が生成すると考えら
れる。 【００４８】本発明の血小板粘着インヒビターは、不安
定狭心症および動脈の塞栓症もしくは血栓症における動
脈血栓の形成の防止もしくは停止、ならびに心筋梗塞
（ＭＩ）およびＭＩが起こった後の壁在性血栓生成の治
療もしくは防止に使用し得る。本発明の血小板粘着イン
ヒビターは、血小板が粘着し、続いて動脈の再閉塞が起
こるのを阻害するために、ストレプトキナーゼまたはプ
ラスミノーゲン活性化因子のような血栓崩解剤とともに
投与し得る。 【００４９】さらに、これらの抗血栓剤は、器官の移植
が原因で起こる血栓症と再狭窄を抑制するのに使用し
得、そして血栓症によって仲介される器官の拒絶反応お
よび移植で誘発されるアテローム性動脈硬化症の防止に
使用し得る。 【００５０】血小板粘着インヒビターの投与量は、所望
の作用と治療計画によって広範囲に変化させ得る。一般
に投与量は約０.００１〜１０ｍｇ／Ｋｇ個体の体重で
ある。投与は、好ましくは、静脈投与のような非経口
で、毎日、１週間まで、または１、２ヶ月間もしくはそ
れ以上行うが、治療のスケジュールによって変化し得
る。血小板粘着インヒビターのペプチドフラグメントを
使用する場合は、鼻内、舌下などのような他の経路を利
用し得る。 【００５１】注射剤は次のような通常の形態で調製し得
る。すなわち液体の溶液または懸濁液、注射に先立ち溶
液または懸濁液にするのに適した個体の形態、またはエ
マルジョンである。適切な賦形剤は、例えば水、食塩
水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシ
チン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイ
ン塩酸塩などである。さらに、目的により、注射用医薬
組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤、ｐＨ
緩衝剤などを含有し得る。目的により、吸収促進製剤
（例えばリポソーム類）を利用し得る。 【００５２】以下に記載する実施例は例示を目的とする
ものであり、本発明を限定するものではない。 【００５３】 【実施例】（実施例１） 血小板抗粘着剤を含有するヘビ毒の同定 アッセイを行うために、精製ヒトｖＷＦを、Ｔｈｏｒｅ
ｌｌらの前記文献の方法を用いて、ヒト血漿の冷却沈降
物から調整し、ＢｒｉｎｋｈｏｕｓおよびＲｅａｄの前
記文献に記載されているのと同様にして、ホルムアルデ
ヒドで固定し洗浄した血小板を調製しアッセイした。リ
ストセチン（１.５ｍｇ／ｍｌ最終濃度）またはボトロ
セチン（１０μｇ／ｍｌ最終濃度）を用いて血小板凝集
反応を開始させた。 【００５４】Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ社（米国、ミズーリ州、セントルイス）またはＭ
ｉａｍｉ Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ Ｌａｂｓ社（米
国、ユタ州、ソルト・レーク市）から入手した７３種の
凍結乾燥したヘビの粗毒液の１０ｍｇ／ｍｌ蒸留水溶液
を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０およびＣｅｎｔｒｉｃｏ
ｎ−３０（ＹＭ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）のマイクロコンセ
ントレーター（Ａｍｉｃｏｎ社、米国、マサチューセッ
ツ州、ダンバーズ）を用いて調製用限外濾過に付した。
濾液（１０μｌと５０μｌの試料）および保持液（１０
μｌと５０μｌの試料）両方を、調製した固定・洗浄血
小板を精製ｖＷＦとともに使用する、血小板凝集アッセ
イに試験試料として使用した。阻害活性は、Ｃｅｎｔｒ
ｉｃｏｎ−１０および同−３０の限外濾過で得た保持液
試料にのみ見い出された。結果を表１に示す。 【００５５】 【表１】 抗粘着活性は、ＶｉｐｅｒｉｎａｅおよびＣｒｏｔａｌ
ｉｎａｅの全種ではなく一部の種にみられたが、試験し
たＥｌａｐｉｄａｅの全種にはみられなかった。 【００５６】実施例２ Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｈｏｒｒｉｄｕｓ ｈｏｒｒｉｄｕ
ｓ毒からの血小板抗粘着物質の精製 ０.５Ｍ酢酸７.０ｍｌ中、Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｈｏｒｒ
ｉｄｕｓ ｈｏｒｒｉｄｕｓ毒５００ｍｇ（Ｍｉａｍｉ
Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ Ｌａｂｓ，Ｌｏｔ ＃Ｃ
Ｈ１８ＳＺ）の溶液を、０.５Ｍ酢酸で平衡化したセフ
ァデックスＧ−５０（ｆｉｎｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
２.５×１００ｃｍ）のカラムにかけ、溶出した。カ
ラムは、流速２５ｍｌ／時で溶出し、５ｍｌ画分を採集
した。各画分の１０μｌを１０画分１グループとしてプ
ールし（即ち、画分１−１０、１１−２０、２１−３０
等）、分析のために凍結乾燥した。この凍結乾燥画分
は、蒸留水５００μｌ中に再懸濁し、そしてその適量を
とり、精製ｖＷＦで再構築された固定化洗浄血小板の、
リストセチンで誘発される血小板凝集の阻害活性を測定
した。このアッセイにより活性のある阻害画分（３１−
４０）をプールし、凍結乾燥することにより、白色非結
晶粉末９５ｍｇを得た。 【００５７】この物質を、５ｍｌの０.０１Ｍ ＮＨ4Ｏ
Ａｃ、ｐＨ４.５中に溶解し、そして０.０１Ｍ〜０.５
Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ６.５で平衡化したカルボキシメ
チルセファクリルカラム（２.２×１３ｃｍ）にかけ、
画分（１２ｍｌ）を採取した。このカラムは、ＵＶ吸収
により画分を同定するため、２５４ｎｍ／１.０ ＡＵ
ＦＳでモニターした（図１）。ＵＶ吸収画分は、画分毎
に凍結乾燥し（各２０μｌ）、蒸留水１ｍｌ中に再懸濁
し、そしてその血小板凝集を阻害する能力を測定した。
画分１３〜１７が阻害活性を示し、そして過剰のＮＨ4
ＯＡｃを除くため、各画分をＨ2Ｏを用いて３回凍結乾
燥した。 【００５８】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（非還元）によるピーク阻害画分の分析により、Ｍｒ＝
２３−２８ｋｄに泳動する２種の主要タンパクが認めら
れた。これらの画分（１００μｇ）を、逆相Ｃ4液体ク
ロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ５４，０.
４６×２５ｃｍ、流速１.０ｍｌ／分、３００Ａ、１５
％アセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）〜７０％アセトニトリルのグラジエント溶出３０
分）で分析すると、２つの主要なＵＶ（２１４ｎｍ）吸
収ピークが認められ（図２）、これを集め、そして乾燥
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるこれら２つのピークを再
分析すると、より速くＨＰＬＣ溶出するピークは、ＣＨ
Ｈ−Ａ（２４.９分）として、Ｍｒ＝２３ｋｄに泳動さ
れ、そしてより遅く溶出するピークは、ＣＨＨ−Ｂ（２
５.６分）として、Ｍｒ＝２５ｋｄに泳動された（図
３）。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ＣＨＨ−ＡおよびＣ
ＨＨ−Ｂは２つの別個のタンパク鎖Ｍｒ＝１２−１５ｋ
ｄに分解された。未変性のＣＨＨ−ＡおよびＣＨＨ−Ｂ
は、共に、洗浄系のボトロセチンおよびリストセチンで
誘発される血小板凝集を阻害し、そして血小板に富む血
漿中の凝集も同程度に阻害した。 【００５９】ＣＨＨ−ＡおよびＣＨＨ−Ｂのイオン変換
画分からの分取精製は、分析用分析と同じグラジエント
溶出条件を用いて、セミ分取Ｃ4（２１４ＴＰ５１０、
３.５ｍｌ／分）カラム上で行った。図４は、精製され
たＣＨＨ−Ｂの分析Ｃ4 ＨＰＬＣクロマトグラムを示
し、そして図５は、ＣＨＨ−Ａのクロマトグラムを示
す。（各図の３４分におけるピークは雑音（ａｒｔｉｆ
ａｃｔ））。 【００６０】精製タンパク質（ＣＨＨ−Ｂ）の一部を還
元し、そしてアルキル化した（６Ｍグアニジン・ＨＣ
ｌ，０.２５Ｍトリス−ＨＣｌ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，
２０ｍＭジチオストレイトール（ＤＴＴ）を含む、ｐＨ
７.５、８時間２５℃）。過剰のヨードアセトアミドを
この還元タンパク質に加え、室温で８時間置いた。還元
された、およびアルキル化された鎖は、それぞれ、Ｃ4
逆相ＨＰＬＣを用いて分離した。より速く溶出するサブ
ユニット（ＣＨＨ−Ｂ−β）およびより遅く溶出するサ
ブユニット（ＣＨＨ−Ｂ−α）は、それぞれ、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７３Ａタンパク質シー
クエンサーを用いて、Ｎ末端配列分析（エドマン分解）
を行った。 【００６１】ＣＨＨ−Ｂ−αについては、エドマン分解
を３７回繰り返すことにより、以下のＮ末端アミノ酸配
列が得られた。Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ
−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ。１２７個のアミノ酸からなるこの鎖の完全な
アミノ酸配列を図６に示す。 【００６２】ＣＨＨ−Ｂ−βについては、２７回のサイ
クルにより、以下のＮ末端アミノ酔配列を得た。Ａｓｐ
−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ。この鎖の完全なアミノ酸配列は図６
を示す。 【００６３】精製ペプチドＣＨＨ−Ｂは、Ｒｕｇｇｅｒ
ｉら（前述）の方法に従って、ｖＷＦ血小板結合アッセ
イで試験した。結果は、図７に示す。結合阻害は、用量
依存的であり、そして精製ＣＨＨ−Ｂ濃度が２００ｎＭ
未満で、ｖＷＦの洗浄血小板への結合を抑制する。 【００６４】実施例３ Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅｓ毒からの抗粘着物
質の精製 Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅｓ毒（Ｍｉａｍｉ
Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ Ｌａｂｓ，Ｌｏｔ ＃ＣＣ
１２ＳＺ）５００ｍｇの０.５Ｍ酢酸溶液５.０ｍｌを、
０.５Ｍの酢酸で平衡化したセファデックスＧ−５０
（ｆｉｎｅ）のカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２.５×
１００ｃｍ）にかけ、溶出した。このカラムは４０ｍｌ
／時の流速とし、８ｍｌ画分をポリプロピレンチューブ
に採集した。各画分２５μｌを、１０画分を１グループ
としてプールし（１−１０、１１−２０、２１−３０
等）、そして凍結乾燥した。凍結乾燥画分は、蒸留水１
００μｌ中に再懸濁し、そしてその一定量をとり、精製
ｖＷＦにより再構築された固定化洗浄血小板のリストセ
チンで誘発される血小板凝集の阻害活性をアッセイし
た。このアッセイにおける活性画分（画分２１−４０）
をプールし、そして凍結乾燥して１９８ｍｇの白色粉末
を得た。 【００６５】この物質を、１０ｍｌの０.０１Ｍ ＮＨ4
ＯＡｃ、ｐＨ４.５中に溶解し、そしてＣＭ−セファロ
ースカラム（２.２×１３ｃｍ）に流した。０.０１Ｍ〜
０.５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ、〜ｐＨ６.５のｐＨおよび塩の
グラジエントを行い、そして画分（１０ｍｌ）をポリプ
ロピレンチューブに採集した。カラム溶出液は、ＵＶ吸
収により画分を同定するために、２５４ｎｍ／１.０Ａ
ＵＦＳでモニターした。各画分からの２５μｌを、１０
画分のグループに再度プールし、そして凍結乾燥した。
この画分を、蒸留水１００μｌに再溶解し、そしてその
血小板凝集阻害活性をアッセイした。画分８１−１００
が阻害活性を示し、集めて、過剰のＮＨ 4ＯＡｃを除く
ために各画分をＨ2Ｏにより３回凍結乾燥した。 【００６６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）による阻害画
分の分析により、Ｍｒ＝２３−２８ｋｄで泳動する染色
されたバンドである１つの主要タンパク質を認めた。還
元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、未変性のタンパク質が２つの
別個のタンパク質鎖Ｍｒ＝１２−１５ｋｄに分解した。
分析用Ｃ4逆相液体クロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ２
１４ＴＰ５４、０.４６×２５ｃｍ、流速１.０ｍｌ／
分、３００Ａ）上での３０％アセトニトリル／０.１％
ＴＦＡから７０％アセトニトリルのグラジエント溶
出、３０分間、で、図８に示す１つの主要ＵＶ（２１４
ｎｍ）吸収ピークを認めた（２７および３１分のピーク
は雑音）。 【００６７】精製されたタンパク質（ＣＣ）の一部を還
元し、そして実施例１と同様に、ヨードアセトアミドで
アルキル化した。このカルボキシアミドメチル化鎖を、
逆相Ｖｙｄａｃ−フェニルカラムを用いて分離した。よ
り速く溶出するサブユニット（ＣＣ−β）およびより遅
く溶出するサブユニット（ＣＣ−α）は、それぞれ、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７３Ａ）タン
パク質シークエンサーを用いてＮ末端配列分析を行っ
た。 【００６８】ＣＣ−βについて、エドマン分解を２５サ
イクル行うことにより、以下のＮ末端アミノ酸配列を得
た：Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌ
ｕ。 【００６９】ＣＣ−αについて、２０サイクルにより、
以下のＮ末端アミノ酸配列を得た：Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ。 【００７０】実施例４ Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ ｐｅｒｓｉｃｕｓ毒か
らの抗粘着物質の精製 Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ ｐｅｒｓｉｃｕｓ毒
（Ｍｉａｍｉ Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ Ｌａｂｓ，
Ｌｏｔ ＃ＰＳ８ＳＺ）１０００ｍｇの０.５Ｍ酢酸溶
液７.０ｍｌを、セファデックスＧ−５０ｆのカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２.５×１００ｃｍ）にかけ、
実施例２および３に記載のように溶出しアッセイした。
活性な画分（画分３１−５０）をプールし凍結乾燥し
た。 【００７１】この物質約１６０ｍｇを、０.０１Ｍ〜０.
５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃのＮＨ4ＯＡｃ緩衝液を用いたＣＭ−
セファロースカラム（２.２×１３ｃｍ）に吸着させ、
グラジエント溶離した。活性画分（各６ｍｌ、画分６４
−７２）が、固定化血小板アッセイで活性であることが
見いだされ、プールし、そして揮発性塩を除くために水
で数回凍結乾燥した。 【００７２】最終精製を、０.１％ＴＦＡ中の１５〜７
０％アセトニトリルの３０分間のグラジエントを用いた
セミ分取Ｃ4逆相液体クロマトグラフィーにより行っ
た。この物質の一部（３００μｇ）を還元し、そして実
施例２に記載の通り、カルボキシアミドメチル化した。
このカルボキシアミドメチル化した鎖を、前述のように
Ｃ4ＲＰＬＣで分離し、そして各鎖についてＮ末配列分
析を行った。 【００７３】より速く溶出するサブユニットＰＢ−β
は、エドマン分解を５０サイクル行い以下の配列を得
た：Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ
−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈ
ｅ。 【００７４】ＰＰ−α鎖は、３１サイクルで以下の配列
を得た：Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ。 【００７５】実施例５ Ｖｉｐｅｒａ ｒ． ｒｕｓｓｅｌｌｉ毒からの血小板
抗粘着物質の精製 実施例２−４の方法を用いて、Ｖｉｐｅｒａ ｒ．ｒｕ
ｓｓｅｌｌｉの毒１ｇを精製し、ＧＰＩｂインヒビター
を得た。精製したインヒビターの一部を、実施例２−４
に記載の通り、カルボキシアミドメチル化し、そしてそ
のサブユニットをＣ4ＲＰＬＣで分離した。 【００７６】より遅く溶出するサブユニットのＮ末端配
列を、２２サイクルのエドマン分解で、以下のアミノ酸
配列を得た。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ。 【００７７】実施例６ ボトロセチン／リストセチンで誘発される凝集の阻害 実施例２で調製したように、Ｃ． ｈｏｒｒｉｄｕｓ
ｈｏｒｒｉｄｕｓから精製されたタンパク質、および実
施例３で調製したように、Ｃ．ｃｅｒａｓｔｅｓから精
製されたタンパク質を、前述のように、ＰＲＰを用いた
ボトロセチン／リストセチンで誘発される凝集阻害アッ
セイを行った。その結果を図９に示す。再び、用量依存
的作用が示され、２−３μｇ／ｍｌの低濃度で阻害を示
す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＮＨ4ＯＡｃグラディエント溶離液を
用いＣＭセファロースで精製されるＣＨＨ ＧＰＩｂイ
ンヒビターを２５４ｎｍの波長光の吸光度でモニターし
ているクロマトグラムを示す。 【図２】図２は、被検ＣＨＨ ＧＰＩｂインヒビターの
ＲＰＬＣ（Ｃ4、アセトニトリル／ＴＦＡグラディエン
ト溶離液）によるイオン交換精製法由来で、２１４ｎｍ
波長光でモニターされている活性画分を示す。 【図３】図３は、図２に示す活性画分について実施した
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。 【図４】図４は、Ｃ4カラムで精製されたＣＨＨ−Ｂの
ＲＰＬＣクロマトグラムを示す。 【図５】図５は、Ｃ4カラムで精製されたＣＨＨ−Ａの
ＲＰＬＣクロマトグラムを示す。 【図６Ａ】図６Ａは、シー・エイチ・ホリダス（Ｃ．
ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）のＧＰＩｂインヒビターのα鎖
のアミノ酸配列を示す。 【図６Ｂ】図６Ｂは、シー・エイチ・ホリダス（Ｃ．
ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）のＧＰＩｂインヒビターのβ鎖
のアミノ酸配列を示す。 【図７】図７は、ボトロセチンによって誘発される、
125Ｉ−フォン・ビルブラント因子の固定洗浄血小板へ
の結合の、ＣＨＨ−Ｂ ＧＰＩｂインヒビターによる用
量依存性阻害を示す。 【図８】図８は、セラステス・セラステス（Ｃｅｒａｓ
ｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅｓ）由来のＶＣＣＧＰＩｂイン
ヒビターのＣ4カラムによる精製のＲＰＬＣクロマトグ
ラムを示す。 【図９】図９は、ＰＲＰ中でのリストセチン誘発血小板
凝集反応の、精製クロタラス・エイチ・ホリダス（Ｃｒ
ｏｔａｌｕｓ ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）抗粘着物質によ
る用量依存性阻害（上方のグラフ）と、セラス・テス・
セラステス抗粘着物質による凝集反応の用量依存性阻害
とを示す。
用いＣＭセファロースで精製されるＣＨＨ ＧＰＩｂイ
ンヒビターを２５４ｎｍの波長光の吸光度でモニターし
ているクロマトグラムを示す。 【図２】図２は、被検ＣＨＨ ＧＰＩｂインヒビターの
ＲＰＬＣ（Ｃ4、アセトニトリル／ＴＦＡグラディエン
ト溶離液）によるイオン交換精製法由来で、２１４ｎｍ
波長光でモニターされている活性画分を示す。 【図３】図３は、図２に示す活性画分について実施した
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。 【図４】図４は、Ｃ4カラムで精製されたＣＨＨ−Ｂの
ＲＰＬＣクロマトグラムを示す。 【図５】図５は、Ｃ4カラムで精製されたＣＨＨ−Ａの
ＲＰＬＣクロマトグラムを示す。 【図６Ａ】図６Ａは、シー・エイチ・ホリダス（Ｃ．
ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）のＧＰＩｂインヒビターのα鎖
のアミノ酸配列を示す。 【図６Ｂ】図６Ｂは、シー・エイチ・ホリダス（Ｃ．
ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）のＧＰＩｂインヒビターのβ鎖
のアミノ酸配列を示す。 【図７】図７は、ボトロセチンによって誘発される、
125Ｉ−フォン・ビルブラント因子の固定洗浄血小板へ
の結合の、ＣＨＨ−Ｂ ＧＰＩｂインヒビターによる用
量依存性阻害を示す。 【図８】図８は、セラステス・セラステス（Ｃｅｒａｓ
ｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅｓ）由来のＶＣＣＧＰＩｂイン
ヒビターのＣ4カラムによる精製のＲＰＬＣクロマトグ
ラムを示す。 【図９】図９は、ＰＲＰ中でのリストセチン誘発血小板
凝集反応の、精製クロタラス・エイチ・ホリダス（Ｃｒ
ｏｔａｌｕｓ ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）抗粘着物質によ
る用量依存性阻害（上方のグラフ）と、セラス・テス・
セラステス抗粘着物質による凝集反応の用量依存性阻害
とを示す。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
//(Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA38 CA02 DA06 EA04
GA11
4B064 AG30 CA10 CA19 CC24 DA01
4B065 AA26X AA90X AA90Y AB01
BA02 CA24 CA44
4C084 AA02 BA19 BA23 CA43 ZA45
ZA54
4C087 AA02 AA03 AA05 BB32 NA20
ZA45 ZA54
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 以下の群から選択されるヘビ毒から得ら
れる血小板抗粘着ペプチドをコードする配列を含有す
る、ＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子組成物：アグキスト
ロドン・アクタス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ａｃｔｕ
ｓ）、アグキストロドン・ハリス・ブロモフィ（Ａｇｋ
ｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｂｌｏｍｈｏｆｆ
ｉ）、アグリストロドン・コントルトリックス・モカセ
ン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ
ｍｏｋａｓｅｎ）、ビティス・アリエタンス（Ｂｉｔｉ
ｓ ａｒｉｅｔａｎｓ）、ビティス・コーダリス（Ｂｉ
ｔｉｓｃａｕｄａｌｉｓ）、ビティス・ガボニカ（Ｂｉ
ｔｉｓ ｇａｂｏｎｉｃａ）、ビティス・ジー・リノセ
ロス（Ｂｉｔｉｓ ｇ．ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ）、ボス
ロプス・アスパー（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｓｐｅｒ）、
ボスロプス・アルターナタ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｌｔ
ｅｒｎａｔａ）、ボスロプス・アトロックス（Ｂｏｔｈ
ｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ）、ボスロプス・コチアラ（Ｂｏ
ｔｈｒｏｐｓｃｏｔｉａｒａ）、ボスロプス・ジャララ
カ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ）、ボスロプ
ス・ニューイーディ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｎｅｗｉｅｄ
ｉ）、ボスロプス・メデューサ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｍ
ｅｄｕｓａ）、ボスロプス・シュレグリ（Ｂｏｔｈｒｏ
ｐｓ ｓｃｈｌｅｇｌｉ）、セラステス・セラステス
（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅｓ）、セラステス
・バイペラ（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｖｉｐｅｒａ）、クロ
タルス・アダマンチュース（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄｍ
ａｎｔｅｕｓ）、シー・アトロックス（Ｃ．ａｔｒｏ
ｘ）、シー・バシリカス（Ｃ．ｂａｓｉｌｉｃｕｓ）、
シー・ジュリサス・トトナタカス（Ｃ．ｄｕｒｉｓｓｕ
ｓ ｔｏｔｏｎａｔａｃｕｓ）、シー・エイチ・ホリダ
ス（Ｃ．ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）、シー・エム・モロサ
ス（Ｃ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｕｓ）、シー・ルーバ（Ｃ．
ｒｕｂｅｒ）、シー・スクタラタス（Ｃ．ｓｃｕｔａｌ
ａｔｕｓ）、シー・ブイ・セレバルス（Ｃ．ｖ．ｃｅｒ
ｅｂｅｒｕｓ）、シー・ブイ・ヘレリ（Ｃ．ｖ．ｈｅｌ
ｌｅｒｉ）、シー・ブイ・ルトスス（Ｃ．ｖ．ｌｕｔｏ
ｓｕｓ）、シー・ブイ・オレガヌス（Ｃ．ｖ．ｏｒｅｇ
ａｎｕｓ）、エキス・カリナツス・ソクレキー（Ｅｃｈ
ｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓ ｓｏｃｈｕｒｅｃｋｉ）、
エリスティコフィス・マクマホニー（Ｅｒｉｓｔｉｃｏ
ｐｈｉｓ ｍａｃｍａｈｏｎｉ）、プソイドセラステス
・ペルシカス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ ｐｅｒ
ｓｉｃｕｓ）、シストルルス・エム・バルボーリ（Ｓｉ
ｓｔｒｕｒｕｓ ｍ．ｂａｒｂｏｕｒｉ）、シストルル
ス・シー・ターゲミナス（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ ｃ．ｔ
ｅｒｇｅｍｉｎｕｓ）、トリメレスルス・フラボビリデ
ィス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｆｌａｖｏｖｉｒｉ
ｄｉｓ）、トリメレスルス・グラミニウス（Ｔｒｉｍｅ
ｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａｍｉｎｅｕｓ）、バイペラ・レ
ベティナ（Ｖｉｐｅｒａ ｌｅｂｅｔｉｎａ）、バイペ
ラ・アモンディテス（Ｖｉｐｅｒａ ａｍｍｏｎｄｙｔ
ｅｓ）、バイペラ・パラスティナエ（Ｖｉｐｅｒａ ｐ
ａｌａｓｔｉｎａｅ）、およびバイペラ・アール・ルセ
リィ（Ｖｉｐｅｒａ ｒ．ｒｕｓｓｅｌｌｉ）。 【請求項２】 血小板抗粘着ペプチドを産生し得る発現
システムであって、該ペプチドは請求項１に記載の群か
ら選択されるヘビ毒から得られ、適切な宿主に形質転換
されるとき、および該宿主が発現に好適な条件で培養さ
れるとき、該発現システムは、該宿主に適合する制御配
列に作動可能に連結された該血小板抗粘着性ペプチドを
コードするＤＮＡを包含する、発現システム。 【請求項３】 請求項２に記載の発現システムで形質転
換された組換え宿主。 【請求項４】 血小板抗粘着（ＰＡＡ）ペプチドを産生
する方法であって、請求項３に記載の前記宿主細胞を、
該ＰＡＡペプチドをコードするＤＮＡの発現に好適な条
件下で培養する工程；および該ＰＡＡペプチドを細胞培
養から回収する工程を包含する方法。 【請求項５】 ヘビ毒血小板抗粘着ペプチドをコードす
る配列を含むＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子組成物であ
って、ｖＷＦのＧＰＩｂ−ＩＸレセプターへの結合は阻
害するが、フィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａレ
セプターへの結合は阻害せず、該ペプチドが、以下の群
から選択されるヘビ毒から得られる、ＤＮＡ分子組成
物：アグキストロドン・アクタス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄ
ｏｎ ａｃｔｕｓ）、アグキストロドン・ハリス・ブロ
モフィ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｈａｌｙｓ ｂｌｏｍ
ｈｏｆｆｉ）、アグリストロドン・コントルトリックス
・モカセン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔ
ｒｉｘ ｍｏｋａｓｅｎ）、ビティス・アリエタンス
（Ｂｉｔｉｓ ａｒｉｅｔａｎｓ）、ビティス・コーダ
リス（Ｂｉｔｉｓ ｃａｕｄａｌｉｓ）、ビティス・ガ
ボニカ（Ｂｉｔｉｓｇａｂｏｎｉｃａ）、ビティス・ジ
ー・リノセロス（Ｂｉｔｉｓ ｇ．ｒｈｉｎｏｃｅｒｏ
ｓ）、ボスロプス・アスパー（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｓ
ｐｅｒ）、ボスロプス・アルターナタ（Ｂｏｔｈｒｏｐ
ｓ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、ボスロプス・アトロックス
（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ）、ボスロプス・コチ
アラ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｃｏｔｉａｒａ）、ボスロプ
ス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃ
ａ）、ボスロプス・ニューイーディ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ
ｎｅｗｉｅｄｉ）、ボスロプス・メデューサ（Ｂｏｔｈ
ｒｏｐｓ ｍｅｄｕｓａ）、ボスロプス・シュレグリ
（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｓｃｈｌｅｇｌｉ）、セラステス
・セラステス（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅ
ｓ）、セラステス・バイペラ（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｖｉ
ｐｅｒａ）、クロタルス・アダマンチュース（Ｃｒｏｔ
ａｌｕｓ ａｄｍａｎｔｅｕｓ）、シー・アトロックス
（Ｃ．ａｔｒｏｘ）、シー・バシリカス（Ｃ．ｂａｓｉ
ｌｉｃｕｓ）、シー・ジュリサス・トトナタカス（Ｃ．
ｄｕｒｉｓｓｕｓ ｔｏｔｏｎａｔａｃｕｓ）、シー・
エイチ・ホリダス（Ｃ．ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）、シー
・エム・モロサス（Ｃ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｕｓ）、シー
・ルーバ（Ｃ．ｒｕｂｅｒ）、シー・スクタラタス
（Ｃ．ｓｃｕｔａｌａｔｕｓ）、シー・ブイ・セレバル
ス（Ｃ．ｖ．ｃｅｒｅｂｅｒｕｓ）、シー・ブイ・ヘレ
リ（Ｃ．ｖ．ｈｅｌｌｅｒｉ）、シー・ブイ・ルトスス
（Ｃ．ｖ．ｌｕｔｏｓｕｓ）、シー・ブイ・オレガヌス
（Ｃ．ｖ．ｏｒｅｇａｎｕｓ）、エキス・カリナツス・
ソクレキー（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓｓｏｃｈ
ｕｒｅｃｋｉ）、エリスティコフィス・マクマホニー
（Ｅｒｉｓｔｉｃｏｐｈｉｓ ｍａｃｍａｈｏｎｉ）、
プソイドセラステス・ペルシカス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒ
ａｓｔｅｓ ｐｅｒｓｉｃｕｓ）、シストルルス・エム
・バルボーリ（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ ｍ．ｂａｒｂｏｕ
ｒｉ）、シストルルス・シー・ターゲミナス（Ｓｉｓｔ
ｒｕｒｕｓ ｃ．ｔｅｒｇｅｍｉｎｕｓ）、トリメレス
ルス・フラボビリディス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ
ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）、トリメレスルス・グラミ
ニウス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａｍｉｎｅｕ
ｓ）、バイペラ・レベティナ（Ｖｉｐｅｒａ ｌｅｂｅ
ｔｉｎａ）、バイペラ・アモンディテス（Ｖｉｐｅｒａ
ａｍｍｏｎｄｙｔｅｓ）、バイペラ・パラスティナエ
（Ｖｉｐｅｒａ ｐａｌａｓｔｉｎａｅ）、およびバイ
ペラ・アール・ルセリィ（Ｖｉｐｅｒａ ｒ．ｒｕｓｓ
ｅｌｌｉ）。 【請求項６】 血小板抗粘着ペプチドを産生し得る発現
システムであって、該ペプチドが、ｖＷＦのＧＰＩｂ−
ＩＸレセプターへの結合は阻害するが、フィブリノーゲ
ンのＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａレセプターへの結合は阻害せ
ず、適切な発現宿主細胞と適合する制御配列に作動可能
に連結された請求項５に記載のＤＮＡを含む、発現シス
テム。 【請求項７】 請求項６に記載の発現システムで形質転
換された組換え宿主細胞。 【請求項８】 血小板抗粘着（ＰＡＡ）ペプチドを産生
する方法であって、請求項７に記載の宿主細胞を、該Ｐ
ＡＡペプチドをコードするＤＮＡの発現に好適な条件下
で培養する工程を包含する、方法。 【請求項９】 以下のＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子
組成物：ｖＷＦのＧＰＩｂ−ＩＸレセプターへの結合は
阻害するが、フィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ
レセプターへの結合は阻害せず、以下の群から選択され
るヘビ毒から得られるヘビ毒血小板抗粘着ペプチドの血
小板粘着物質をコードするＤＮＡ配列；アグキストロド
ン・アクタス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ａｃｔｕ
ｓ）、アグキストロドン・ハリス・ブロモフィ（Ａｇｋ
ｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｂｌｏｍｈｏｆｆ
ｉ）、アグリストロドン・コントルトリックス・モカセ
ン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ
ｍｏｋａｓｅｎ）、ビティス・アリエタンス（Ｂｉｔｉ
ｓ ａｒｉｅｔａｎｓ）、ビティス・コーダリス（Ｂｉ
ｔｉｓ ｃａｕｄａｌｉｓ）、ビティス・ガボニカ（Ｂ
ｉｔｉｓ ｇａｂｏｎｉｃａ）、ビティス・ジー・リノ
セロス（Ｂｉｔｉｓ ｇ．ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ）、ボ
スロプス・アスパー（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｓｐｅ
ｒ）、ボスロプス・アルターナタ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ
ａｌｔｅｒｎａｔａ）、ボスロプス・アトロックス（Ｂ
ｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ）、ボスロプス・コチアラ
（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｃｏｔｉａｒａ）、ボスロプス・
ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ）、
ボスロプス・ニューイーディ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｎｅ
ｗｉｅｄｉ）、ボスロプス・メデューサ（Ｂｏｔｈｒｏ
ｐｓ ｍｅｄｕｓａ）、ボスロプス・シュレグリ（Ｂｏ
ｔｈｒｏｐｓ ｓｃｈｌｅｇｌｉ）、セラステス・セラ
ステス（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅｓ）、セラ
ステス・バイペラ（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｖｉｐｅｒ
ａ）、クロタルス・アダマンチュース（Ｃｒｏｔａｌｕ
ｓ ａｄｍａｎｔｅｕｓ）、シー・アトロックス（Ｃ．
ａｔｒｏｘ）、シー・バシリカス（Ｃ．ｂａｓｉｌｉｃ
ｕｓ）、シー・ジュリサス・トトナタカス（Ｃ．ｄｕｒ
ｉｓｓｕｓ ｔｏｔｏｎａｔａｃｕｓ）、シー・エイチ
・ホリダス（Ｃ．ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）、シー・エム
・モロサス（Ｃ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｕｓ）、シー・ルー
バ（Ｃ．ｒｕｂｅｒ）、シー・スクタラタス（Ｃ．ｓｃ
ｕｔａｌａｔｕｓ）、シー・ブイ・セレバルス（Ｃ．
ｖ．ｃｅｒｅｂｅｒｕｓ）、シー・ブイ・ヘレリ（Ｃ．
ｖ．ｈｅｌｌｅｒｉ）、シー・ブイ・ルトスス（Ｃ．
ｖ．ｌｕｔｏｓｕｓ）、シー・ブイ・オレガヌス（Ｃ．
ｖ．ｏｒｅｇａｎｕｓ）、エキス・カリナツス・ソクレ
キー（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓ ｓｏｃｈｕｒ
ｅｃｋｉ）、エリスティコフィス・マクマホニー（Ｅｒ
ｉｓｔｉｃｏｐｈｉｓ ｍａｃｍａｈｏｎｉ）、プソイ
ドセラステス・ペルシカス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔ
ｅｓ ｐｅｒｓｉｃｕｓ）、シストルルス・エム・バル
ボーリ（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ ｍ．ｂａｒｂｏｕｒ
ｉ）、シストルルス・シー・ターゲミナス（Ｓｉｓｔｒ
ｕｒｕｓ ｃ．ｔｅｒｇｅｍｉｎｕｓ）、トリメレスル
ス・フラボビリディス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｆ
ｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）、トリメレスルス・グラミニ
ウス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａｍｉｎｅｕ
ｓ）、バイペラ・レベティナ（Ｖｉｐｅｒａ ｌｅｂｅ
ｔｉｎａ）、バイペラ・アモンディテス（Ｖｉｐｅｒａ
ａｍｍｏｎｄｙｔｅｓ）、バイペラ・パラスティナエ
（Ｖｉｐｅｒａ ｐａｌａｓｔｉｎａｅ）、およびバイ
ペラ・アール・ルセリィ（Ｖｉｐｅｒａ ｒ．ｒｕｓｓ
ｅｌｌｉ）；ここで該ＤＮＡ配列は、デノボ合成プロセ
スの産物として；該粘着物質の部分アミノ酸配列を基に
設計されたオリゴヌクレオチドプローブを用いてクロー
ン化されたヘビ組織ＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グし、成功した候補クローンを得、そして該スクリーニ
ングから成功した候補クローンを回収するプロセスの産
物として；または精製された抗粘着物質に対して調製さ
れた抗体を用いる発現スクリーニングのプロセスから得
られる、ＤＮＡ分子組成物。 【請求項１１】 前記ヘビ毒が、セラステス・セラステ
ス（Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｃｅｒａｓｔｅｓ）、シー・エ
イチ・ホリダス（Ｃ．ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｓ）、バイペ
ラ・アール・ルセリィ（Ｖｉｐｅｒａ ｒ．ｒｕｓｓｅ
ｌｌｉ）、またはプソイドセラステス・ペルシカス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ ｐｅｒｓｉｃｕｓ）であ
る、請求項１０に記載のＤＮＡ。 【請求項１２】 前記血小板抗粘着物質がヘテロダイマ
ーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約
１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ末端配列を有
する、請求項１０に記載のＤＮＡ：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号１の１位から３
７位）。 【請求項１３】 前記血小板抗粘着物質がヘテロダイ
マーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、
約１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ末端配列を
有する、請求項１０に記載のＤＮＡ：Ａｓｐ−Ｃｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ
−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ｐｈｅ（配列番号２の１位から２９位）。 【請求項１４】 前記血小板抗粘着物質がヘテロダイマ
ーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約
１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ末端配列を有
する、請求項１０に記載のＤＮＡ：Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｃ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａ
ａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ
−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号３）。 【請求項１５】 前記血小板抗粘着物質がヘテロダイマ
ーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約
１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ末端配列を有
する、請求項１０に記載のＤＮＡ：Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（配列番号
４）。 【請求項１６】 前記血小板抗粘着物質がヘテロダイマ
ーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約
１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ末端配列を有
する、請求項１０に記載のＤＮＡ：Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌ
ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ（配列番号５）。 【請求項１７】 前記血小板抗粘着物質がヘテロダイマ
ーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約
１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ末端配列を有
する、請求項１０に記載のＤＮＡ：Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａ
ｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ（配列
番号６）。 【請求項１８】 前記血小板抗粘着物質がヘテロダイマ
ーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約
１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ末端配列を有
する、請求項１０に記載のＤＮＡ：Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓ
ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕ（配列番号７）。 【請求項１９】 前記血小板抗粘着物質がヘテロダイマ
ーであり、該ヘテロダイマーのひとつのメンバーが、約
１４ｋｄの分子量を有し、そして以下のＮ末端配列を有
する、請求項５に記載のＤＮＡ：Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ（配列番号７）。
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