JPH06504715A - 油が充填されたパウチラメラ脂質小胞の形成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 油が充填されたパウチラメラ脂質小胞の形成方法１１直皿立且ｊ この出願は１９８９年９月２１日付は出願の米国特許出願第４１０゜６５０号（ 発明の名称：リポソームクリーナー）の部分継続出願である。そして、この米国 特許出願は１９９０年３月２７日付は発行の米国特許第４．９１１．９２８号（ 発明の名称：パウチラメラ脂質小胞）の部分継続出願である。また、この出願は １９８９年１１月２９日付は出願の米国特許出願第４４３．５１６号（発明の名 称：パウチラメラ脂質小胞）の部分継続出願である。そして、この米国特許出願 は前記米国特許第４．９１１．９２８号の分割出願である。前記の特許出願及び 特許の全てをここで述べることによりそれらの開示を本明細書に含めるものとす る。

１豆至１１ 本発明は、非晶質中央キャビチーを油のような水不混和性物質により実質的に充 填してなるパウチラメラ脂質小胞の形成方法に関する。本発明は、別の方法では 組み入れることができなかった揮発性の及び（又は）熱に不安定な（熱分解する ）物質を小胞内に組み入れるのを可能にする　”常温充填（ｃｏｌｄ−１ｏａｄ ｉｎｇ）”法である。

米国特許第４．９１１．９２８号は、水不混和性物質を非晶質中央キャビチーに 実質的に充填してなるパウチラメラ脂質小胞な形成する”熱間充填（ｈｏｔ−１ ｏａｄｉｎｇ　）”法を記載しいる。この方法では、脂質（そして組み入れるべ きどんな油又は水不混和性の物質も）は、過剰の水性相に注入することができる ように高められた温度に加熱され、例えば液状又は流動性の形態にされる。この 脂質を水性相中に注入することにより小さい脂質ミセル（おそら（長球形であろ う）の形成が起こり、これは乱流又は剪断混合しながら冷却すると凝集する。凝 集したミセルは小胞へと融合し、そして多くの二重層外殻が中央の非晶質コアを 取り囲む。また、油又は水不混和性物質も存在する場合には、脂質ミセルとマイ クロエマルジョン油滴の両者が形成される。マイクロエマルジョン油滴は核とし て作用し、この回りにミセルが凝集し、脂質二重層により取り巻かれた小胞の油 充填非晶質中央キャビチーが形成される。好ましくは、油を安定化するために少 量の不関の界面活性剤も含有される。用語「不関の界面活性剤」とは、本明細書 で使用するときは、脂質小胞の形成に関わらないが包封すべき水不混和性物質を 乳かさせることができる界面活性剤を意味する。不関の界面活性剤には、大抵の ポリオキシエチレンソルビタンエーテル（ツイーン類）、ドデシル硫酸ナトリウ ム、Ｃ１オ〜Ｃ＋ｓ脂肪酸及びそれらの塩類、例えばオレイン酸ナトリウムが包 含される。不関の界面活性剤を使用しない場合には、壁形成用脂質の一部が油を 安定化するために供せられる。

熱間充填法は多数の水不混和性物質に有効であるが、この方法は、小胞形成温度 においてあまりにも揮発性であり又は熱に不安定である種々の重要な水不混和性 物質にとっては有用でない、これらの熱的に不安定な物質について熱間充填法を 試みると、水不混和性物質の大部分は揮発し、ごく一部を小胞中に組み入れるだ けである。

これらの揮発性物質には、ジエチルトルアミド（ＤＥＥＴ）のような殺虫剤、あ る種の香料及び芳香物質、香油並びにミネラルスピリッツのような多くのその他 の物質が包含される。芳香物質のあるものは混合物であるから、その混合物の一 部の放出は全体の性質を劇的に変化させるおそれがある。さらに、ある種の不揮 発性物質さえも、熱間充填法よりも本発明の常温充填法を使用すれば、小胞の非 晶質中央キャビチー内に容易に導入される。例えば、熱間充填法を使用してクリ ーニング剤であるｄ−リモネンを小胞内に比較的低濃度で組み入れることができ るが、常温充填法を使用すればもつと高い濃度を達成することができる。

従って、本発明の目的の一つは、パウチラメラ脂質小胞非晶質中央キャビチーに 水不混和性物質を常温充填する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、揮発物をパウチラメラ脂質小胞内に組み入れる手段を提供 することである。

本発明のさらに他の目的は、リン脂質、イオン性及び非イオン性の脂質物質と共 に使用することができる油質の又は水不混和性の物質を脂質小胞に充填させる一 般化された手段を提供することである。

本発明のさらに他の目的及び特徴は、以下の説明及び図面から明らかとなろう。

１豆立ｌ刀 本発明は、パウチラメラ脂質小胞の非晶質中央キャビチーに水不混和性物質を常 温充填する方法に特に係る。

この方法は、熱間充填法を使用してパウチラメラ脂質小胞の中央キャビチーに有 意義な量で充填することができない揮発性物質にとって特に重要である。

本発明の方法は、実質的に水溶液で充填された非晶質中央キャビチーを有するパ ウチラメラ脂質小胞な形成させることから開始される。この小胞は任意の典型的 な方法により作成することができるが、米国特許第４．９１１゜９２８号に開示 された方法及び物質を参照されたい、概略すれば、これらの方法は、剪断混合技 術を使用して過剰の水性相中に流動性の脂質を小割合の油と共に又はそれなしで 注入することを必要とする。用語「剪断混合」とは、前記の米国特許第４．９１ １，９２８号に定義されているように、相の流速が１ｍｍのオリフィスを通して 約５〜５０　ｍ　／　ｓの相対流速に等しいことを意味する。得られた小胞は、 水溶液で充填され、場合により若干の油を含有した非晶質中央キャビチーを有す る。

実質的に水溶液で充填されたパウチラメラ脂質小胞な形成させた後、これらの小 胞は、中間混合条件下に、非晶質中央キャビチー中に組み入れるべき水不混和性 物質、例えば油、最も好ましくは揮発性の油と混合される。用語「中間混合条件 」とは、予備形成された小胞と水不混和性物質とを渦流又は注入のような穏やか な条件下で室温で又は室温付近で混合することを意味する。パウチラメラ脂質小 胞な最初に形成するのに使用した剪断と類似の剪断を生じさせる流れ条件を使用 することができたが、それは不必要であり、事実及生産的であろう。

この操作の後、脂質小胞の非晶質中央キャビチーに水不混和性物質が充填され、 水溶液が置き換えられる。水不混和性物質は、それに可溶性であるか又は分散さ れる物質のためのキャリアーとして作用し得る。次いで、例えば遠心分離により パウチラメラ脂質小胞がどんな過剰の油からも分離される。好ましくは、不関の 界面活性剤が水不混和性物質を安定化させる過程で使用される。不関の界面活性 剤は通常水溶性であり、外部水性相中に担持されるが、水不溶性の下関界面活性 剤も中間混合の前にパウチラメラ脂質小胞の非晶質中央又は壁内に組み入れるこ とができる。好ましい下関界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、０１８〜Ｃ ＋ｓ脂肪酸、ツイーン類（ポリオキシエチレンソルビタンエーテル）及びそれら の塩類並びにこれらの混合物より成る群から選択される。

本発明の好ましいパウチラメラ脂質小胞は、壁又は二重層形成用脂質としてポリ オキシエチレン脂肪酸エーテル、ポリオキシエチレングリセリンモノステアレー ト、ポリオキシエチレンステアリルアルコール及びジェタノールアミドのような 非イオン性物質を有するが、リン脂質、ベタインのようなその他の物質並びにそ の他のイオン性又は双生イオン性の物質も使用することができる。

本発明は、壁形成用脂質が液体である温度において安定な液体でない揮発性物質 又は熱に不安定な物質をカプセル化するのに特に好ましい。

本発明のさらに他の特徴は以下の記載から明らかとなろう。

の　ｔ　葺 図１８及びはｌｂは、熱間充填法で使用されるような、過剰の水性相に脂質相を 注入したときのミセルの形成を例示するものである。

図２８及び２ｂは、熱間充填法で使用されるような、過剰の水性相に脂質−水不 混和性物質相を注入したときのミセル及びマイクロエマルジョンの形成を例示す るものである。

図３は、本発明の常温充填法について示唆されるエンドサイト−シス機構の該略 図である。

日の・　な曇Ｂ 小胞の非晶質中央キャビチーに充填すべき物質が揮発・性の又は熱に不安定な水 不混和性物質である場合には本発明の常温充填法は熱間充填法よりも好ましい、 さらに、中央キャビチー内に組み入れるべき物質が揮発性であり得ないとしても 、本発明の方法を使用すればより高濃度の水不混和性物質を充填することができ る。

図１ａ及び１ｂは、油を存在させない熱間充填法における臨界的な工程、即ち、 過剰の水溶液中に脂質相を注入することによるミセル構造の形成を例示する。前 述したように、このミセルは凝集してパウチラメラ脂質小胞の二重層を形成する 。

図２８及び２ｂは、水不混和性物質を脂質に添加した場合の上記と同じ機構を示 す。ミセルとマイクロエマルジョン油滴の双方が形成する。これらのマイクロエ マルジョン油滴は核となり、その回りに脂質小胞の二重層が形成される。これら のマイクロエマルジョン油滴はこの熱間充填法には必要であるが、明らかかなよ うに、これらのマイクロエマルジョン油滴を形成しない揮発性物質は熱間充填法 に対して適当ではない。

図３は、本発明の常温充填法の最もありそうな機構を例示する０例えば図１に示 すような方法を使用して、実質的に水溶液で充填されたパウチラメラ脂質小胞が いったん形成されれば、それらは、好ましくは低濃度（約１．５％）の不問界面 活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムの存在下にカーゴ物質、例えば水不混和 性物質と結合する。水不混和性物質の液滴（不問界面活性剤により安定化された ）は、おそらくエンドサイト−シスに類似したプロセスにより小胞内に入って行 く。

常温充填法は芳香物質油、香油、ある種の脂質又は医薬のような揮発性の又は熱 的に不安定な物質にとって最も好ましいが、ミセルの形成及び（又は）融合を妨 害する水不混和性物質にとっても特に具合がよい、この後者・のグループの物質 には、ジエチルトルアミド、ｄ−リモネン、そして石油留分のようなある種の水 不混和性溶媒、キシレンのような芳香族溶媒がある。これらの物質は、熱間充填 法によっては脂質小胞内に多量でカプセル化できないものであるが、本発明の常 温充填法を使用すればパウチラメラ脂質小胞の非晶質中央キャビチー内に組み入 れることができる。

Ｋ轟ｌ 下記の実施例は本発明をさらに明確に説明する。

例」２ この例では、米国特許第４，９１１．９２８号に記載された方法を使用して、ポ リオキシエチレン（９）グリセリンモノステアレート、コレステリン及びツイー ン４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）の１．５％ 溶液から水性相を充填した小胞を形成した。概略すれば、この特許には、脂質に 可溶性の物質（使用するとすればどんな水不混和性物質も含めて）の全部を高め られた温度で流動性となるまで一緒にブレンドすることからなる方法が記載され ている０通常は、これには６０〜８０℃の温度が要求されるが、ある場合には９ ０℃はどに高い温度が使用される。水性相は水溶性物質（不問界面活性剤も含む 。ここではツイーン４０）の全部を含有し、これも加熱される０次いで、中剪断 装置により脂質相を過剰の水性相中に注入し、混合物を小胞の形態になるまで剪 断する。装置としては、例えば、米国特許第４、８９５．４５２号（この開示を 引用することにより本明細書に含める）に示された混合機を使用することができ るが、三方ストップコックにより接続された対の注射器が小胞な形成させるのに 十分な剪断を与えることができる。必要とされる剪断は、１ｍｍのオリフィスを 通して約５〜５０　ｍ　／　ｓの相対流速である。この方法の詳細は米国特許第 ４．９１１，９２８号に記載されている。

下記の表１は、小胞を形成するのに使用した処方をリストする。

Ｐ　ＯＥ　（９）グリセリンモノステアレート　２０．３ｇコレステリン　３． ５ｇ ツイーン４０（１，５％水溶液）　７５ｍ１次いで、予備形成された小胞を一方 の注射器に入れ、カーゴとして作用すべき水不混和性物質の過剰量を第二の注射 器に入れることによて、予備形成された小胞を過剰の水不溶性物質と混合した。

まず、注射器を三方ストップコックにより接続する。周囲温度で一方の注射器か ら他方の注射器に約４０〜５０行程動かすことにより両温液を混合した。生じた 溶液を次いで３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによりカプセル化され ていない水不混和性物質を脂質小胞から分離した。下記の表２は、各種の異なっ た水不混和性物質についての水不混和性物質取り込み量をリストする。全ての値 は小胞１ミリリツトル当たりの水不混和性物質のミリリットル数で表す。

鉱油　１．０ｍｌ／ｍｌ ブチルセロソルブ　０．１１ｍ１／ｍｌミネラルスピリッツ　０．１８　ｍ　ｌ 　／　ｍ　１安息香酸イソデシル　１．０　ｍ　ｌ　／　ｍ　１りん酸トリクレ ジル　１．Ｏｍｌ／ｍｌ明らかなように、本発明の常温充填法を使用すれば多数 の種々の物質を高濃度で組み入れることができる。

し この例では、上記と異なる壁形成用物質のポリオキシエチレン（２）ステアリル アルコールとやはり異なる不問界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） を使用して小胞を形成した。小胞を予備形成するのに使用した量を下記の表３に 示す。

Ｐ　ＯＥ　（２）ステアリルアルコール　５．９ｇコレステリン　２．１ｇ ＳＤＳ　１．５％水溶液　４１．５ｍ１例１に記載した態様と同じ態様で小胞を 形成した０次いで、前記したのと同じ注射器系を使用して小胞な過剰の鉱油（ド ラケオール＃１９）と混合し、油が充填された小胞を遠心分離により分離した。

小胞中への鉱油の取り込み量は小胞ｌミリリットル当たり０．７ミリリツトルよ りも高かった。

匠ユ この例では、リン脂質のレシチンを使用して小胞を形成した。レシチンは大豆油 に溶解し、透明溶液が形成されるまで加熱し、次いで例１に記載した操作を使用 して過剰の水と混合してパウチラメラ脂質小胞を形成した。

下記の表４は、小胞な形成するのに使用した種々の成分の量を示す。小胞は水性 中央部に若干の油を含有した。

ム レシチン（９８％、エマルプルＮ−ＰＬルーカス・メイヤー社製）　６．４ｇ 大豆油　６．４　ｍ　ｌ 水　２６．０　ｍ　ｌ 前記した注射器系を使用して、予備形成されたリン脂質パウチラメラ脂質小胞を 過剰の追加大豆油と混合し、３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。第二処理 工程における大豆油の取り込み量は小胞１ミリリツトル当たり約１ミリリツトル の大豆油であった。同じ操作を使用して大豆油中のコレステリンオレエートの３ ３％溶液を小胞中に組み入れた。取り込み量は小胞ｌミリリットル当たり少なく とも０．６７ミリリツトルであった。

匠Ａ この例では、既に少量の油を含有していた非イオン性脂質小胞の非晶質中央に追 加の油を組み入れた。使用した操作は、鉱油を初期小胞な形成するのに使用した 加熱された脂質溶液に混入させたことを除いて、例１について説明したものと同 じであった。下記の表５に小胞を予備形成するのに使用した成分を示す。

Ｐ　ＯＥ　（９）グリセリンモノステアレート　２０．３ｇコレステリン　３． ５ｇ 鉱油（ドラケオール＃１９）　２５．０ｍ１ＳＤＳ　１．５％水溶液　７５．０ 　ｍ　ｌ小胞を形成した後、注射器法を使用して、それらを追加の鉱油と混合し 、３．５０Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離して小胞を油から分離した。追加の鉱油 の取り込み量は小胞１ミリリツトル当たり約０．７ミリリツトルの鉱油であった 。

この例では、負に帯電した小胞へのＤＥＥＴ　（ジエチルトルアミド）の取り込 みを試験した。熱間充填法を使用するとＤＥＥＴは小胞の形成を妨害するので、 熱間充填法ではＤＥＥＴを不十分な量でしか小胞内に組み入れることができない ０例１に記載したような方法と同じ方法を使用し、下記の表６に示した物質を使 用して、負に帯電した小胞を形成した。

艮」。

Ｐ　ＯＥ　（９）グリセリンモノステアレート　１１．２ｇコレステリン　１． ９ｇ オレイン酸　０．２ｇ ツイーン４０　０．９ｍｌ 水　４２．０ｍ１ 次いで、予備形成された負に帯電された小胞な過剰のＤＥＥＴと混合し、３５０ ０ｒｐｍで３０分間遠心分離した。小胞中へのＤＥＥＴの取り込み量は小胞１ミ リリツトル当たり約０．４ミリリツトルのＤＥＥＴであった。

各種の香油、芳香物質及びハンドクリーナーのｄ−リモネンを使用して類似の結 果を得た。さらに、注射器を４０〜５０行程動作させ、小胞と水不混和性物質と を混合させることの代わりに単に物質の全部を試験管に入れ、渦形ミキサー、撹 拌機又はホモジナイザーによりブレンドすることだけを行い、これにより水不混 和性物質をカプセル化させた。

当業者にはその他の方法も認識できようが、これらも本発明の範囲内である。

国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．非晶質中央キャビテー内に水性物質を有するパウチラメラ脂質小胞を予備形 成し、 該予備形成されたパウチラメラ脂質小胞を該中央キャビテー内に組み入れるべき 水不混和性物質と中間混合条件下に混合し、 該パウチラメラ脂質小胞を該中央キャビテー内に組み入れられなかった該水不混 和性物質から分離し、これにより該パウチラメラ脂質小胞の非晶質中央キャビテ ーを該水不混和性物質で実質的に充填させることからなる実質的に油が充填され た非晶質中央キャビテーを有するパウチラメラ脂質小胞を形成する方法。
2. ２．小胞を形成させるのに使用する脂質に加えて不関界面活性剤を使用する請求 の範囲１記載の方法。
3. ３．不関界面活性剤が水溶性である請求の範囲２記載の方法。
4. ４．不関界面活性剤が水溶性でない請求の範囲２記載の方法。
5. ５．水溶性の不関界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンエーテル、ドデシ ル硫酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１■脂肪酸及びそれらの塩類並びにこれらの混合 物より成る群から選択される請求の範囲３記載の方法。
6. ６．非晶質中央キャビテー内に組み入れるべき水不混和性物質がパウチラメラ脂 質小胞を予備形成するのに使用する温度において揮発性又は熱に不安定である請 求の範囲１記載の方法。
7. ７．水不混和性物質がジエチルトルアミド、香油、芳香物質油、ｄ−リモネン、 水不混和性溶媒及びそれらの混合物より成る群から選択される請求の範囲６記載 の方法。
8. ８．パウチラメラ脂質小胞が一次二重層形成用物質として非イオン性脂質を有す る請求の範囲１記載の方法。
9. ９．パウチラメラ脂質小胞が一次二重層形成用物質としてリン脂質を有する請求 の範囲１記載の方法。
10. １０．予備形成されたパウチラメラ脂質小胞が非晶質中央キャビテー内に水性物 質の他に油を含有する請求の範囲１記載の方法。