JPH06504676A - Ｃ末端から２番目にプロリン残基を有するペプチドのｃ−末端の修飾方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペプチドのＣ−末端修飾方法に関し、とくにＣ−末端プロリンアミドま たはＮ−置換アミドを有するペプチド、たとえばヒトもしくはサケカルシトニン またはそれらの類縁体の製造方法に関する。

生物学的に活性なペプチドは、その医薬的目的および農業での使用から、この種 の化合物を大規模に合成できることの重要性が増大している。この場合、３種類 の方法がある。すなわち、（ａ）化学的合成、（ｂ）酵素的合成。

および（Ｃ）遺伝子操作微生物による発酵である。方法（ａ）および（ｂ）また はそれらの組合わせは短いペプチドには好ましいが２組換えＤＮＡを扱う方法の 進歩を活用して、将来、長いペプチドが製造されるであろうことは益々明白であ る。しかしながら、これらの方法では、生物活性に重要なり一アミノ酸やＣ−末 端アミドまたはＮ−置換アミド基の導入のような多（の修飾は可能ではない。し たがって、以後の酵素的修飾がきわめて望ましいことになるが、このような反応 は限られた範囲で検討されているのみである。

Ｃ−末端グリシル残基のヒドロキシル化を触媒し、ついでこれを分解して末端か ら２番目のアミド化残基を残す酵素が記載されている（ＵＳ特許第４．７０８． ９３４号、ＥＰ３０８０６７Ａ号、　ＤＫ出願第４４８９／８８号）。補因子と してＣｕ”＋０２およびアスコルベートに依存するこのグリシンオキシダーゼ酵 素は、インビボにおけるペプチドアミドの形成に関与するものと考えられる。そ れは小規模でのペプチドのアミド化には利用されてきたが、その活性は低く。

大規模な製造への適用可能性はまだ疑問である。ラット髄様甲状腺癌のような天 然原料から単離された酵素はきわめて高価である。

上述のＥＰ　３０８０６７Ａ号には、Ｃ−末端Ｇｌｙを特異的に切断できる天然 起源の、類似の多数のα−アミド化酵素が記載されている。それらのアミド化活 性は、短いＤ−アミノ酸含有基質の変換に基づくもので、活性と生理的に関連す るし一基質中の基質との関係は明らかにはされなかったと述べられている。

出願ＷＯ９０１０８１９４号（Ｔａｎａｋａら）には、　Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅ ｖｉｓ　（カエル）の皮膚からのα−アミド化酵素が記載されている。Ｔａｎａ ｋａらは、この酵素を生合成的に製造したが、そのα−アミド化活性は同じくＣ −末端Ｇｌｙの存在が条件とされる。

アミド化はまた請求核試薬としてアミノ酸アミドまたはペプチドアミドを使用す るプロテアーゼ−触媒縮合反応によっても達成できる。縮合反応の収率は一般に 、生成物が反応混合物中で沈殿しなければ、存機溶媒を存在させても低く、長い ペプチドの場合には生成物は沈殿しないことが多い。さらに、前駆体ペプチドの このような媒体への溶解性はよくない。しかしながら、セリンまたはチオールプ ロテアーゼが触媒するペプチド転移反応は高収率で実施できるが、これには酵素 がＣ−末端に近いペプチド結合に特異性を示すことが前提条件になる。エンドペ プチダーゼは１通常、ペプチド鎖の他の部分も同様に切断するので、一般的に適 当でない。一方、セリンカルボキシペプチダーゼはＣ−末端ペプチド結合に厳密 な特異性を示し請求核試薬として水と競合するように反応媒体中に加えられたア ミノ酸アミドによるＣ−末端アミノ酸の交換を触媒できる。

セリンカルボキシペプチダーゼのこの性質はＣａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒの研究者グループによって認識され、　ＤＫ出願第１４４３ ／７９号に基づき、現在の権利者に譲渡された一部の多数の特許、たとえばＢＰ 特許第１７４８５号、ＵＳ特許第４．８０６．５３４号およびその親のＵＳ特許 第４、３３９．５３４号、ならびに国際出願Ｗ０８０１０２１５１号があり。

さらに多くの特許たとえば、　ＤＫ特許第１５５６１３号およびＪＰ特許第１． ４８９．４９４号となっている。これらの特許は、先行技術ではもっばらエンド ペプチダーゼが取扱われていたのに対し、酵素的ペプチド合成の触媒としてエキ ソペプチダーゼが適しているというその当時としては驚くべき所見に基づくもの であった。反応物（基質および核試薬成分）の性質、および反応条件、とくにｐ Ｈに依存して、セリンおよびチオールカルボキシペプチダーゼは。

鎖延長またはペプチド転移によって２ペプチド合成を触媒できる。好ましい酵素 は酵母からのカルボキシペプチダーゼＹ　（ＣＰＤ−Ｙ）である。

基礎となったまたその後の研究はさらに、多くの文献（引用文献１〜８）に記載 されている。これらは上述の特許とともに、すべて参考として本明細書に導入す る。

セリンまたはチオールカルボキシペプチダーゼの存在下におけるペプチド転移に よる酵素的ペプチド合成の一般的な原理は、ＵＳ特許第４．８０６．４７３号お よびその対応のＤＫ特許第１５５６１３号に開示されている。と（にペプチドア ミドの製造に関しては、これらの特許は一般的に、基質成分としてＮ−末端が任 意に保護されたペプチドＡ−Ｘ−ＯＨ（式中、ＡはＮ−末端保護アミノ酸残基ま たはＮ−末端が任意に保護されたペプチド残基であり、Ｘはアミノ酸である）を 核試薬（アミン）成分Ｈ−Ｂ−ＮＨ，（式中、ＢはＬ−アミノ酸残基である）と 、酵母。

動物、植物または微生物起源のＬ−特異的セリンまたはチオールカルボキシペプ チダーゼの存在下１分散水性溶液のｐＨは５〜１０．５で反応させることによる ペプチドアミドＡ−Ｂ−ＮＨ２（式中、ＡおよびＢは上に定義した通りである） の製造が開示され、請求されている。引用文献ｌにさらに説明されているように 、ペプチドアミドの形成を所望の場合の好ましいｐＨは中性付近である。

引用文献１〜５にはさらに実験が開示されているが。

これらは上述の初期の特許のパイオニア的特徴およびペプチドのＣ−末端修飾の 触媒としてのセリンカルボキシペプチダーゼの一般的な適用性を支持するもので ある。

とくに、引用文献３では、ペプチド中のＣ−末端アミノ酸残基の交換において、 様々な核試薬の反応性を比較し、アミノ酸ＨＢ　ＮＨ＊の上述の使用と同等な様 式で、アンモニアがアシル基転移反応に適用可能な核試薬であると結論している 。すなわち、　Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ　−ＯＨをＨ−ｃｌｙ−Ｎ　Ｈ２およびＮＨ ，と反応させて、それぞれ、カップリング収率１００％および７５％で、　Ｚ− Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２およびＺ−Ａｌａ　ＮＨ２の形成が生じた。これに対し 、　Ｈ−Ｇｌｙ　−ＯＭｅとの反応でもＺ　−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｙ　−ＯＭｅが ７５％の収率で生成する。

上記の一群の特許の公告以前がら既に９本技術分野の熟練者には、アンモニアが アミノ酸アミドやアミノ酸エステルとともに、ペプチドのＣ−末端修飾に適用可 能な核試薬であることは自明であった。

引用文献２には、α−アミノカルボン酸以外の一連の一級アミンの、アミノ酸エ ステルへのカルボキシペプチダーゼ触媒カップリングにおける核試薬としての使 用か記載されている。この核試薬にはアンモニア、ヒドラジンおよびこれらのＮ −アルキルまたは他の置換誘導体が包含されている。しかしながら、使用された 基質は特定のＮ−α保護アミノ酸エステルたとえばＢｚＡ　ｌａＯＭｅのみで、 ペプチド転移反応は試みられていない。

現在の権利者に譲渡された出願Ｗ０９１／１８９９８号には。

成長ホルモン放出因子のＧＲＦ（１−２９）Ｎ　Ｈ２の誘導体およびそれらの同 族体の、セリンカルボキシペプチダーゼ触媒ペプチド転移による製造方法か記載 されている。

この方法では２式 ％式％ ［式中、　ＧＲＦ’は、ネイティブなＧＲＦ（１〜２６）配列またはＧＲＦ（ｎ 〜２６）を包含するその類縁体であり、この場合ｎは１〜８であり、Ｘは少なく ともメチル基のサイズの側鎖を有する非荷電親水性アシルα−アミノカルボン酸 残基である］の基質成分を請求核試薬成分としてのＨ−Ａｒｇ−ＮＨ２と、酵母 、動物、植物または他の微生物起源のし一特異的セリンまたはチオールカルボキ シペプチダーゼ酵素の存在下に、ｐＨ６〜９の水性溶液または分散液中で反応さ せ、必要に応じて所望のＮ−末端［１〜（ｎ　−１）］フラグメントを化学的ま たは酵素的にカップリングさせる。

好ましいアミノ酸Ｘは、　Ａｌａ　、　Ｔｈｒ　、　Ｓｅｒ　、　Ａｓｎまたは Ｇｌｎである。

参考として本明細書に導入されたこの出願には、ペプチド転移の原理の一般的考 察および競合反応の記述かある。

以上の所見の本質を要約すると、　ＵＳ特許第４．８０６．４７３号および他の 一群の特許等に記載され請求されている。

適当なアミノ酸アミドを核試薬として使用し、セリンカルボキシペプチダーゼの 存在下でのペプチド転移によるペプチドへのＣ−末端アミド基の導入は、任意の ペプチドに実際に応用できるきわめて適切な方法である。

既に引用文献３にも示されているように、このようなアミド化においては、アン モニアは適当な核試薬であることが期待できる。

しかしながら、この方法は常に十分に選択的ではなく。

とくに長いペプチドが用いられる場合には、様々な副反応の生成物を除去するた めの精製操作を必要とし、この場合、副反応を抑える至適反応条件を確立するこ とは難しい。

上述の特許出願の出願後間もなく発表された原発明者による初期の文献には、Ｃ −末端（離脱基）アミノ酸および末端から２番目のアミノ酸の影響の解析が試み られている。すなわち、引用文献１には請求核試薬としてＬｅｃｒＮ　Ｈ２、離 脱基としてＧｌｙ　、　Ａｌａ　、　Ｓｅｔ　、　Ｖａｌ　。

しｅｕおよびＰｈｅを用いたＢｒｅｄｄａｍらは、得られた収率に基づき、離脱 基が最小のアミノ酸の一つすなわちｃｔｙ　。

ＡｌａまたはＳｅｔである場合にのみ反応が成功であったこと、および試験した 単純な基質については少なくとも２番目の残基（Ａｌａ　、　ＰｈｅおよびＧｌ ｙ　）との関係はないことを示唆している。

引用文献３ては請求核試薬としてＧｌｙ−Ｎ　Ｈｘ　、基質としてＺ−Ａｌａ− Ｘ（ＸはＧｌｙ　、　Ａｌａ　、　Ｓｅｒ　、　Ａｒｇ　、　Ｐｒｏ　。

Ｌｙｓ　、　Ａｓｎ　、　Ｈｉｓ　、　Ｖａｌ　、　Ｍｅｔ　、　Ｐｈｅおよび Ａｓｐである）を使用したＢｒｅｄｄａｍらは、前の論述を請求核試薬としてＧ ＩＹ−Ｎ　Ｒ２を用いた場合には収率はＣ−末端（離脱基）アミノ酸の性質に強 く依存すると修正した。収率は１０〜１００％を変動し、最低の収率は疎水性の 酸（Ｖａｌ。

Ｍｅｔ　、　Ｐｈｅ　）が離脱基として働く場合の基質によって得られた。塩基 性アミノ酸（Ａｒｇ　、　ＬＹＳ　）での収率は親水性アミノ酸（Ａｌａ　、　 Ｓｅｔ　）の場合に匹敵し、　ＬｙｓはむしろＳｅｒよりも良かったことに注目 すべきである。

ペプチド基質の末端から２番目のアミノ酸残基については、離脱基として異なる ２番目のアミノ酸（Ａｌａ。

Ｖａｌ　、　Ｌｅｕ　、　Ｉｌｅ　、　ＰｈｅおよびＶａｌ　）を有する一連の Ｎ−保護ジペプチドを用いて検討された請求核試薬としてＧｌｙ−ＮＨｔを用い たときの＋　Ｉｌｅの場合の４５％からＰｈｅの場合の５％までのカップリング 収率の変動は、それが２番目のアミノ酸残基に依存することを明白に示したが。

明らかな傾向を見出すことはできなかった。

引用文献４には、　ＵＳ特許第４．６４５．７４０号およびその対応特許の基礎 となった一部の実験が論じられている。この場合は、ブタインスリンＩｎ５−Ｐ ｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａを、たとえばＴｈｒ−Ｎ　Ｈ＊と反応させ、Ｉｎ５−Ｐｒ ｏ−Ｔｈｒ−Ｎ　Ｈ２がＩｎ５−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｎ　Ｈｔよりも好収 率で形成されたことから。

Ｉｎ５−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＯＨはＩｎ５−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＯＨよりも 良い基質と結論された。この反応におけるＬｙｓはＡｌａよりも優れた離脱基で あったと推論されている。Ｉｎ５−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｎ　Ｈ２ の形成の形での有意なオリゴメリゼーションも生じた。

これらの結果は、さらに引用文献５で、ブタインスリンとともにモデルペプチド としてＢｚ−Ｌｙｓ−Ａ　ｌａ−○Ｈを使用して確認された。結論的な教示では 、ＣＰＤ−Ｙ　（この実験ではセリンカルボキシペプチダーゼが使用された）の 将来の使用に際しては２副生成物の形成される可能性に注意することが重要とさ れている。

インスリンのＣ−末端修飾におけるセリンカルボキシペプチダーゼの適用性につ いての上述の検討のほかに。

ＣＰＤ−Ｙを触媒として用いた。さらに長いペプチドのアミド化についての別の 実験が報告されている。すなわち、　ＥＰ−８２−１９７７９４号およびその対 応ＵＳ特許第４．７０９．０１４号（Ｔａｍａｏｋｉ　）では、ヒトカルシトニ ン−Ｌｅｕペプチドが。

触媒としてＣＰＤ−Ｙを使用し、他の点ではＢｒｅｄｄａｍらに引用文献３で用 いられたのと類似の条件で請求核試薬としてのアンモニアと反応させている。

ＴａｍａＯｋ　ｉは、Ｓ−スルホン化ヒトカルシトニンアミドを２４．７％の収 率で得ている。５７％の未反応物質が残存し。

１７．２％の非アミド化生成物が生じた。

Ｓ−スルホン化カルシトニンをグルタチオンで還元して成熟ヒトカルシトニンを 得ているが、収率は記載されていない。

そのより一般的な態様として、参考として導入されるＴａｍａｏｋｉの特許には 、Ｃ−末端Ｐｒｏ−Ｌｅｕ　、　Ｐｒｏ−１１ｅ　。

Ｐｒｏ−ＶａｌまたはＰｒｏ−Ｐｈｅをもつペプチド基質を水溶液中でアンモニ アの存在下にカルボキシペプチダーゼＹと反応させる。Ｃ−末端プロリンアミド を有するペプチドの製造方法が開示されている。

何らかの意味でのＴａｍａｏｋｉの論述の支持を意図するものではないが、彼は 、離脱基として親水性のＣ−末端アミノ酸が好ましいとするＢｒｅｄｄａｍらの 引用文献３における所見とは異なり、　Ｐｒｏが末端から２番目のアミノ酸であ る場合には、疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ　、　［ｌｅ　、　ＶａｌおよびＰｈｅ　 ）の使用がＧＩｙよりも好収率を与えると主張していることに言及しなければな らない。

しかしながら、基質としてＣｂｚ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘ　−ＯＨを用いたＴａｍ ａｏｋ　ｉの実施例におけるアミド化生成物の収率は。

ＸがＬｅｕ　、　Ｌｅｕ　、　Ｖａｔ　、　Ｐｈｅおよびｌｉｅの場合それぞれ わずか３５．１％、４３％、　１５．４％、１３．４％および２２．６％であっ た。残部は報告されている限りでは、未反応出発原料および非アミド化副生成物 Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ｐｒｏ　−ＯＨであった。

以上の記述をまとめると請求核試薬としてアミノ酸アミドを用いるカルボキシペ プチダーゼ触媒ペプチド転移に関するこれまでの文献では、引用文献３に述べら れているように、末端から２番目のアミノ酸残基の影響に明らかな傾向は示され ていない。離脱基の影響に関しても同様に、一定しない結果か認められている。

すなわち。

上述の引用文献では小さい親水性離脱基または大きくても陽性に荷電した基はＺ −Ａｌａ−Ｘモデルに対して最善の収率を与えたが、一方、　ＷＯ９１／１８９ ９８号ではＲ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｘ基質に対するペプチド転移については大きな 非荷電親水基が好ましかった。同様に請求核試薬としてアンモニアを用いた場合 、引用文献３では離脱基としてＡｌａを使用してＺ−Ａｌａ−Ｘに対して優れた 収率が指示されている。Ｒ−Ｐｒｏ　−Ｘ型のペプチドを用いて、　Ｔａｍａｏ ｋｉは、疎水性離脱基の特定の基すなわちＬｅｕ　、　Ｐｈｅ　、　ｌｉｅおよ びＶａｌがアンモニアとの反応に対して独特であると述べ。

この場合もっともな、しかしながら中等度の収率が得られているが、　Ｔａｍａ ｏｋｉのＪＰ優先権出願第７２７０５／１９８５号から明らかなように、離脱基 としてのＧｌｙまたはＡｌａの使用では反応生成物は形成されなかった。

本発明は、たとえばカルシトニンのモデルとしても有効な上述の種類のペプチド において、アミノ酸残基の異なる基がアンモニア、ヒドラジンまたはそれらの置 換誘導体とのカルボキシペプチダーゼ触媒反応の離脱基として作用できて、上述 のＴａｍａｏｋｉの特許に報告よりはるかに優れた速度および高収率が確実に得 られるという驚くべき所見に基づくものである。

したがって１本発明は、一般式 ％式％ （式中、Ｒは水素、ヒドロキシ＋ＣＩ〜Ｃ，アルキル。

ヒドロキシＣ１−、アルキル、Ｃｓ−５アラルキルから選ばれるか、またはＲは 基ＮＨＲＩであり、この場合Ｒ８は水素＋ＣＩ−＠アラルキル＋Ｃ５−５アラル キルまたは基Ｃｏ−Ｒ，でありｌ　Ｒ２はＮＨｔ　、Ｃ＋−ａアルキルおよれた ペプチドの製造方法に関する。

Ｃｌ−８アルキルは、直鎖状または分岐状のアルキル。

たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル。

ｎ−ブチル、イソブチル、　ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルを包含 する。

Ｃ＠−９アラルキルは、たとえばフェニル−Ｃ５−３アルキル、たとえばベンジ ル、フェニルエチルおよびフェニルプロピルを包含する。

アルキルおよびアラルキル基は１個または２個以上の不活性置換基たとえばハロ ゲン（Ｆ、Ｃ１，Ｂｒ、Ｉ）。

ヒドロキシまたはニトロで置換されていてもよい。

本発明の方法は、一般式 ％式％ （Ｘは非荷電または陽性に荷電され、少なくとも２個の炭素原子またさらにＮ、 ＯおよびＳから選ばれる少なくとも１個のへテロ原子からなる側鎖を存するアミ ノ酸である）で表される基質成分を請求核試薬成分ＮＨ，−Ｒ（式中、Ｒは上述 の意味を有する）と、酵母からのまたは動物、植物もしくは他の微生物起源のＬ −特異的セリンまたはチオールカルボキシペプチダーゼ酵素の存在下。

ｐＨ７，５〜ＩＯの水性溶液または分散液中において反応させ。

ついて所望により、Ｒが水素以外の反応生成物はペプチドアミドに変換すること を特徴とするものである。

記録のために、適用可能の核試薬中、Ｒ，＝Ｈはアンモニア、Ｒ＝ＮＨＲ，にお いてＲ＋＝Ｈはヒドラジン。

Ｒ＝　Ｎ　ＨＣＯＲ２、Ｒｚ　＝　Ｎ　Ｈｔはセミカルバジドであアミノ酸離脱 基Ｘの適用可能な基の親水性は広範囲に及び、疎水性のトリプトファンおよび千 ロジンから、メチオニンおよびその保護誘導体たとえばスルホンＮｅｔ（０）。

ヒスチジンおよびスレオニンを含め、　Ｈｏｐｐ　＆　Ｗｏｏｄｓのスケール（ 引用文献１３）を用いて親水性のグルタミン、アスパラギン、アルギニンおよび リジンまでである。それらは、Ｎ、０およびＳから選ばれる少なくとも１個のへ テロ原子を有し、非荷電または陽性に荷電された。大きな（少なくともＣ２）の 側鎖をもつという共通の構造的性質をもっている。

アンモニアを核試薬として使用すると２本発明の方法は、カルシトニン型の様々 なペプチドホルモン、たとえばアミノ酸配列： Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−＾ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｂｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ− Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＴＦｒ−丁ｂｒ−Ｇｌｎ−＾５ｐ−Ｐｂｅ−＾５ｎ−Ｌｙ　５ −Ｐｈｅ−Ｈｉ　ｇ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｈｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｒ＋−Ｔｈｒ−Ａ　 １　ａ−１１ｅ−Ｇ　Ｉ凵| Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｎ　Ｈ２゜を有するヒトカルシトニンの製造 に適している。

２０倍も大きい効力を有するとくに興味のあるカルシトニンは、アミノ酸配列： Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａ　５ｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙ　ｓ−Ｖ　ａ　Ｉ− Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−ＬＦＳ　−Ｌｅ　ｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌ@ｎ− ｓ　ｔ。

Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ　５−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ −＾ｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ −Ｎ　Ｈ２゜３Ｑ　３２ 他の天然種たとえばウナギ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ。

ブタおよびマウスからのカルシトニンも２本発明の方法で製造できる。

これらのカルシトニンの構造は、ＵＳ特許第４．６５２．６２７号（Ｋｅｍｐｅ ら）に記載されている。これは参考として本明細書に導入する。Ｋｅｍｐｅは３ １位置がＤ−アミノ酸置換されたカルシトニンも開示している。これらも本発明 の方法て製造できる。

求核試薬としてヒドラジンを使用すれば、この方法は相当するヒドラジド、たと えばカルシトニンヒドラジドの製造に使用できる。これらを化学的方法たとえば アジド法でさらに変換することを所望の場合には１反応前に基質中のＮ−末端の および側鎖に存在することのあるアミノ基をまず、たとえばＢｏｃによって保護 する必要がある。保護されたアジドはついでアンモニアと反応させて保護ペプチ ドアミドを形成させ、これから保護基をそれ自体既知の方法で除去して所望のペ プチドアミドたとえばカルシトニンを形成させることができる。

Ｔａｍａｏｋｉ　らの陳述とは逆に、また請求核試薬として遊離塩基型での高濃 度のアンモニアを用い、とくに有機酸好ましくは酢酸またはギ酸の存在下に、よ りよい収率が得られること、しかしＮＨ，ＣＩの調整に塩基として水酸化リチウ ムを用いると同じ収率は得られないことが見出された。特定の理論に固執するも のではないが、大きな残基の立体効果が、ヘテロ原子に関してしばしば可能性が ある水素結合または塩もしくは電子効果とともに作動することが推測される。し かしながら、これらの相互作用の大きさ、影響または正確な性質はまだ明らかで はない。

最後に、ヒトカルシトニン前駆体においてＴａｍａｏｋｉにより好ましいとされ た基質を溶解状態に保持することは明らかに不可能であって、ペプチド転移の前 にジスルフィド橋を酸化し、ついで還元して所望のカルシトニンを得る必要があ った。本発明の好ましい実施態様における類縁の基質を用いると、多くの場合、 基質を溶液に保持することが可能であり、したがって、　Ｔａｍａｏｋｉの３工 程反応ではなく、塩酸グアニジニウムを添加することを条件に、直接一工程反応 を実施することが可能であった。

しかしながら、技術的理由により開裂鎖または溶解型中間体の使用が望ましい場 合には、これも１本発明の方法で可能である。

求核試薬としてエチルアミンまたはセミカルバジドを使用すると、Ｃ−末端プロ リンＮ−エチルアミドまたはプロリンセミカルバジドを、この方法で製造できる 。生物学的に興味のあるこれらの基を含有するペプチドの例としては、たとえば 、ノナペプチドの黄体ホルモン放出ホルモン類縁薬剤、　Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ”　（ＧＢ特許第１．４３４．６９４号参照）ならびにＣ−末端にＰｒｏ−ＮＥ ｔを有するＢｕｓｅｒｅｌｉｎ　（ＵＳ特許第４．２６３．２８２号参照）およ びＣ−末端Ｐｒｏ−３ＥＭをもツＧｏｓｅｒｅｌｉｎ　（ＵＳ特許第４．１００ ．２７４号参照）がある。

本発明の方法に適用可能なカルボキシペプチダーゼは。

Ｌ−特異的セリンまたはチオールカルボキシペプチダーゼである。このような酵 素は酵母かびから製造できるが。

また動物、植物もしくは他の微生物起源のものでもよい。

とくに好都合な酵素は酵母かびからのカルボキシペプチダーゼＹ　（ＣＰＤ−Ｙ ）である。この酵素は初期の特許に、　Ｊｏｈａｎｓｅｎらの文献（引用文献１ ０）を引用して記載されている。彼らは、ポリマー樹脂マトリックスにベンジル スクシニル基をカップリングさせてなるアフィニティー樹脂上でのアフィニティ ークロマトグラフィーによる。とくに存利な精製方法を開発したものである。セ リン酵素であるＣＰＤ−Ｙは大量に入手することが可能で。

比較的高い安定性を示す。さらに詳細は引用文献ｌに記載されている。

ネイティブなＣＰＤ−Ｙは特徴が十分に明らかにされたセリンカルボキシペプチ ダーゼである。この種の他のカルボキシペプチダーゼとの比較は引用文献７に示 されている。これらには酵母または遺伝的にもしくは化学的に修飾されたタイプ 以外の他の起源のものも包含された。

さらに他の酵母ＫＥＸＩからのＣＰＤ−Ｙ類縁セリンカルボキシペプチダーゼが 引用文献１４に記載され、引用文献１５にさらに性質か明らかにされている。酵 母カルボキシペプチダーゼの化学的および遺伝学的方法の組合わせによる修飾は 引用文献１６に記載されている。

ＣＰＤ−Ｙは、自己溶解後のパン酵母から（引用文献１０）または例１８におい て適用されたように遺伝的に操作された酵母細胞の培地から（引用文献１１）容 易に単離される。この酵素は、グリコジル化と分子量が異なるが。

ネイティブな型で同等に有用なことが証明されている。

この酵素はかなり安価で、したかつてこのに記載された操作は、はるかに稀少な グリシンオキシダーゼの使用に価値ある変法を提供するものと考えられる。

現時点において好ましい酵素であるＣＰＤ−Ｙに加えて９本発明の方法は、以下 の一覧表に掲げたような酵母以外の他の起源の他のカルボキシペプチダーゼでも 実施できる。

酵素　起源 かび カルボキシペプチダーゼ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ カルボキシペプチダーゼ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　５ａｉｔｏｉカルボキシペ プチダーゼ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ植物 カルボキシペプチダーゼＣオレンジの葉オレンジの皮 カルボキシペプチダーゼＣＮナラダイダイ／）ヤタファセオレイン　フレンチビ ーンの葉 カルボキシペプチダーゼＭ　発芽大麦 カルボキシペプチダーゼＷ　小麦ふすまカルボキシペプチダーゼ　発芽ワタ 多数の上記カルボキシペプチダーゼの間の密接な関係については、　Ｋｕｂｏｔ ａらによって考察され（引用文献１２）。

それはさらに引用文献７で追補されている。

上述のように２本発明の方法は、　ｐＨ７，５〜１０．０．好ましくはｐＨ８， ５〜９．５．とくに好ましくは９．０〜９，５で実施できる。したがって、酵素 は２反応時のアルカリ性培地中で十分な安定性をもつ必要がある。多くの場合き わめて狭い範囲内に有る好ましいｐＨ値は、使用された酵素および採用された基 質に依存する。ＣＰＤ−Ｙについては、大部分の基質の場合、好ましいｐＨは約 ９．５である。

ＮＨ□を含有する出発溶液のｐＨ調整に好ましい試剤は。

低分子のカルボン酸、好ましくは酢酸もしくはギ酸であり、また一部のアンモニ ウム塩たとえば硝酸アンモンを用いても良好な結果が得られた。

反応は水性反応培地中で行われる。所望により、考えられる有機ｐＨ調整剤以外 に、２５容量％まての有機溶媒を含有させることもできる。好ましい有機溶媒は 、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドであるが。

アルカノールたとえばメタノールおよびエタノール、グリコールたとえばエチレ ングリコールもしくはポリエチレングリコール、トリエチレングリコールジメチ ルエーテル、グリセロール、アルカン酸たとえば酢酸、テトラヒドロフラン、ジ オキサンならびにジメトキシエタンも使用できる。好ましくは、少量たとえば２ 〜１２％のみの有機溶媒が使用される。

反応培地の組成の選択は、とくに反応成分および反応生成物の溶解度ならびに酵 素の溶解度に依存する。これらは、尿素および／または界面活性剤の添加によっ て変動させることができる。例としては、陰イオン界面活性剤たとえばペンタン スルホン酸９両イオン性界面活性剤たとえばＣＨＡＰＳＯ，非イオン界面活性剤 たとえばＢｒ１ｊｉ　３５もしくはＴｗｅｅｎ　２０および陽イオン界面活性剤 たとえば塩酸グアニジニウムを挙げることができる。

酵素の安定化はまた。炭水化物たとえばマンニトール。

または蛋白質たとえばＢＳＡの添加によってもたらされる場合もある。

通常、この様々な添加物は２反応の経過および合成比にも影響する場合がある。

反応培地にはまた。酵素を不溶性にするが酵素活性のかなりの部分を維持する成 分、たとえばイオン交換樹脂を含有させることもできる。別法として、酵素は、 既知の方法で、たとえばマトリックスたとえば架橋デキストランもしくはアガロ ースまたはシリカ、ポリアミドまたはセルロースに結合させることにより、ある いはポリアクリルアミド、アルギネートまたは線維中に封入することにより、固 定化することもできる。さらに、酵素は化学的方法により修飾して、その安定性 または酵素的性質を改良することができる。

反応培地へのキレート剤たとえばＥＤＴＡの添加は。

多くの場合不必要である。

しかしながら、培地にはゲル化阻害剤たとえば塩酸グアニジニウムを含有させる のが好ましい。

反応混合物中の２つの反応物の濃度は、以下に説明するように、広範囲に変動さ せることができる。ペプチド基質の好ましい初期濃度は、０．１〜５．　Ｏｍ　 Ｍ　＋好ましくは０．２〜１．’ＯｍＭ、とくに約０．５ｍＭであり請求核試薬 がアンモニアの場合は、飽和溶液または液体の型で添加するのが好ましく、ａ度 は４．０〜１２．０ｍ　Ｍ　、好ましくは４．３〜９．７Ｍ、とくに５〜８Ｍで ある。これは、４．５Ｍの溶液のみを使用し、これが至適であると主張したＴａ ｍａｏｋ　ｉの場合とは対照的である。

他の核試薬の多く、たとえばベンジルアミンでは。

はるかに低い濃度、すなわち、１．０〜４．０Ｍ、好ましくは２．０〜３．０Ｍ が使用される。

基質中のＮ〜末端もしくは存在することのある側鎖アミノ酸またはカルボキシ基 は請求核試薬との反応時に必ずしも保護する必要はない。しかしながら２反応生 成物たとえばヒドラジドが、その後の反応に使用される場合には、保護が必要で ある。同じ理由で、ヒドラジン中のアミノ基の一つを保護することが望ましい。

酵素活性も同様に変動できるが、ＣＰＤ−Ｙの場合には、濃度は５〜５０μｍ、 好ましくは５〜２０μｍである。

最も有利な活性は、基質績および濃度、求核試薬濃度。

反応時間２反応温度、　ｐＨ，ならびに有機溶媒および／または塩の存在に依存 する。

本発明によれば２反応温度は２０’Ｃ〜４０°Ｃである。適当な温度は、酵素の 活性および安定性を適宜考慮して２通常約３３°Ｃ〜３９°Ｃ１好ましくは約３ ７°Ｃである。

反応時間も同様に変動し、それは上述の反応パラメーター、とくに酵素濃度に大 いに依存する。本発明の方法圧力に関しては２反応は密閉容器中、１〜３バール 好ましくは１〜２バールで行われるのが好ましい。

アミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドの略号はＩＵＰＡＣ−１０８の生化学 命名法委員会の指針によった。アミノ酸はとくに指示のない限り、Ｌ−アミノ酸 である。

そのほか以下の略号を使用した。すなわちＨＯＡｃ。

酢酸；Ｂｚ、Ｎ−ベンゾイル；Ｂｏｃ、三級ブチルオキシカルボニル；ＤＭＦ、 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＧＲＦ、 成長ホルモン放出因子；ＨＰＬＣ，高速液体クロマトグラフィー；ＳＥＭ、セミ カルバジド；ＴＦＡ、）リフルオロ酢酸；ＴＧＭＥ、ｌ−リエチレングリコール ジメチルエーテル、ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；Ｚ、カルボベンゾキシ；ＣＨ ＡＰＳｏ、３−［（３−コラミドプロピル）］ジメチルアンモニ第１−２−ヒド ロキシ−１−プロパン−スルフォネートである。

本発明の方法を実施例で例示する前に、出発原料、測定方法等について一般的に 説明する。

例１〜１９における一般操作 反応は、４つの異なる群の試験基質について実施した。

Ｘはアミノ酸離脱基を意味する。

式：　Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘ　−ＯＨおよびＺ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ　−Ｘ　 −ＯＨのトリペプチドは、それぞれサケおよびヒトカルシトニンの短い基質モデ ルとして使用する。式：　Ｈ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＧＩｎ−Ｔｈ ｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−ＧＩ Ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘ　−ＯＨの基質は、Ｘによって延長された残基１６〜３ ２に相当する。サケカルシトニンの長い基質モデルとして使用し、以後、ＳＡＬ 　（１６−３２）　−Ｘと呼ぶ。これらの基質は９本分野の技術水準における慣 用の液相および同相法で、たとえば出願ＷＯ９１／１８９９８号の記載のように 、化学的合成により得られる。最後に、アミノ酸ｌ残基だけ延長されたヒトカル シトニンは、水性媒体中ＣＰＤ−Ｙ触媒を用い、相当するカルシトニンメチルエ ステルへの遊離アミノ酸の酵素的カップリング（以下の例１３参照）、または標 準的固相法ついで環化によるジスルフィド橋の形成によって得ることができる。

ＨＰＬＣ精製後、すべての短縮化基質は２反応のモニタリングに用いられたもの と同じシステムでのＨＰＬＣによって９５％以上の純度を示し、最長のペプチド を含む選ばれた標本についてはアミノ酸分析またはガス配列分析を実施して正し い同一性が証明された。Ｍｅｔ−スルホン基質は、相当するメチオニン基質をた とえば過酸化水素で処理して酸化して得られた。上述の方法と同様な合成法で、 相当するアミド生成物、副生物および加水分解副生物を、ＨＰＬＣの標準物質と して合成した。

反応のモニタリング、生成物の同定および生成物の収率の決定は逆相ＨＰ　Ｌ　 Ｃ（Ｗａｔｅｒｓ　６０００Ａポンプ、自動勾配コントローラー、　［ＪＫ６イ ンジエクター）により、Ｃ，。

Ｎ０ＶＡ　ＰＡＫカラム（Ｗａｔｅｒｓ、　ＲＣＭ　）上、５０ｍＭリン酸トリ エチルアンモニウム、　ｐＨ３，０または７．Ｏ，０〜８０％アセトニトリルを 含む適当な勾配の溶出系を用い、流速２ｍｌ／ｍｉｎで行った。溶出はＵＶ検出 器（Ｗａｔｅｒｓ　４８０）により。

２３０ｎｍ　、　２５４ｎｍおよび２７８ｎｍでモニタリングした。

生成物は、ＨＰＬＣ分析からの、推定される生成物ピークに相当する分画のアミ ノ酸分析および／または化学的に合成された標本化合物とのＨＰＬＣ比較によっ て確認した。いずれの場合も生成物が他の化合物と明瞭に分離できるＨＰＬＣシ ステムを使用した。場合により、いくつかのｐＨ値でＨＰＬＣを実施した。

反応培地の大半を形成させる濃アンモニア保存溶液を作成した。通常は、室温お よび約１バールの常圧で、基本的には次のいずれかの方法で作成した。すなわち 、濃厚もしくは水性酸溶液と混合した濃アンモニア水溶液から、またはアンモニ ア塩を水に溶解したのち固体アルカリ塩基と混合して作成した。室温に冷却した のち、または必要に応じて水で希釈したのち、関連の酸またはアルカリを用いて ｐＨを調整した。たとえば１０ｍ１の２５％アンモニア水を６．５ｍｌの氷酢酸 （ＨＯＡｃ）または３．７ｍｌの濃ギ酸と混合し、濃厚な酸でｐＨ９，２に調整 すると８ＭおよびＩＯＭのアンモニア／アンモニウム塩濃度の溶液が生成する。

同様に同じ９Ｈで４．５Ｍのアンモニア／アンモニウム塩溶液が、約２６．７ｇ のＮＨ４Ｃ１および８．１ｇのＮａＯＨを水１００ｍ１中に混合しても得られる 。アンモニア濃度は、他の溶媒１反応物または添加物の添加の結果としての低下 に対して、以後に補正される。

大部分の反応は密閉容器中で実施し、密閉は通常室温で行った。記録されたｐＨ はしたがって、この温度での測定値であり、初期の反応圧力は通常、測定されな い１バ一ル未満の上昇分だけ１バールよりも高く、１〜２バールであった。とく に指示のない限り、実験はすべて容量１ｍｌまたは場合によりＯ，，５ｍｌで、 　ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＢ５４２７サーモメーター中に挿入した安全キャップロッ ク付きのＥｐｐｅｎｄｏｒｆプラスチックマイクロ試験管中で実施した。

他のチューブ、すなわちガラス管でも同じ結果を示した。

典型的な短いモデルペプチド反応では、有機溶媒、水またはこれらの混合物中１ ０ｍ　Ｍ溶液を作成し、所望の塩または添加物たとえば塩化グアニジウムを含有 する。反応に適当なｐＨでの１０倍容量過剰２〜ｌＯモルアンモニア溶液中に注 いだ。ＣＰＤ−Ｙの場合には１反応はクエン酸上乾燥２０％ｗ／ｗＣＰＤ−Ｙの 適当量または同様のＣａ１ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｌｔｄ、Ａ／Ｓ　（Ｃｏｐｅｎｈａ ｇｅｎ）製の精製カルボキシペプチダーゼＹの３３３μＭＣＰＤ−Ｙ溶液を添加 することによって開始させた。組換え分泌ＣＰＤ−ＹはＪａｃｏｂＲ，Ｗｉｎｔ ｅｒ博士（Ｃａｒｓｂｅｒｇ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）によって恵与 され２例１８に記載のようにして精製された。反応の開始には、酵素を正確なモ ル濃度１適常は５〜３０μＭで適当容量添加した。反応混合物をついでサーモミ キサー中で、実験の継続中１通常は１〜５時間振盪した。この間に、　１０〜２ ０μＩのサンプルを一定間隔で採取し。

ＨＰＬＣ分析に供した。分析サンプル中へのＵＶ吸収基の採取洩れが起こらない ように、沈殿が生じて゛いないことを確認した。場合によっては、サンプルを採 取したのち、大量の有機溶媒を加えて反応を停止させるか、または濃厚な酸を添 加して反応を鎮静化した。

反応の時間経過中に、基質の消費、アミド生成物の生成、−次加水分解副生物の 生成、ならびに−次加水分解副生物またはアミド生成物中のプロリン残基の二次 的な加アミン分解によるアミド副生物の形成をモニタリングした。これらの４種 類の化合物、基質、アミド生成物。

−次加水分解副生物およびアミド副生物の相対的モル百分率を、それぞれ２５４ または２３０ｎｍにおいて得られたＨＰＬＣＵＶ吸収の積分によって得られる相 対面積カウントから、吸収の差に対する適当な補正係数を用いて計算した。これ らは実施例中にそれぞれ５ｕｂｓｔｒ、、　Ｙｉｅｌｄ　。

Ｈｙｄｒ、およびｏｔｈ、として示す。トリペプチドよりも長い基質の場合には 、後者の表現には、可能性のある二次加水分解および加アミン分解生成物が包含 されるように計算した。また、ヒトカルシトニンについては、長いペプチドにお ける既知の化学的副反応によって形成された副生成物、すなわち反応の経過中に 生成し、採用された系で同様に分離できるα、β−シフトアスパラギン酸または 酸化されたメチオニンも包含させて計算した。還元性添加物を加えて酸化反応を 阻止する試みは行わなかった。

例８による典型的反応の時間経過を図１に例示する。

アミド生成物の相対量自体、方法の成否に対する有効ナハラメーターである。反 応を至適化する助けとして。

さらに変数を導入し、計算した。すなわちＲＡＴＩＯを次の式： ％式％） で計算する。これは、基質からの生成物の形成における触媒効率であり、また未 反応基質を回収して新たな反応に戻す循環工程の導入の成否を示すものである。

この値のほかに、最終アンモニア濃度ＣＮＨ，を得るためにｐＨ調整剤ＰＨＡＤ Ｊによって調整されたアンモニア化合物５ＡＬＴも表に掲げる。他の添加剤はＡ ＤＤ、それらの濃度はＣＡＤＤとして表に示す。実験を行った温度はＴＥＭＰと して示す。

最後に、初期の基質は多くの場合、実施例中ではコアペプチドＰＥＰＴ　［ＤＩ Ｅと命名して掲げ、別個の離脱基はＬＨＡＶＩＮＧ　、初期基質濃度ハＣＰＥＰ ＴＩＤＥとしテ示ス。

例１ １００ｍｌのガラスフラスコ中で、　２５ｍｇのＺ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ −ＯＨを１．０５ｍ１のＤＭＦに溶解し、予め氷酢酸を用いてｐＨを９．２に調 整した８Ｍアンモニア／アンモニウム溶液５０ｍ１を加えた。ガラスフラスコを ３７°Ｃの恒温にした撹拌水浴中に置き、０．３ｍＭのカルボキシペプチダーゼ Ｙ溶液０．７８ｍ１を加えて反応を開始させ、フラスコをプラスチックのねじキ ャップで密栓し、水浴中に７５分間放置した。

この時点でのＨＰＬＣは、７６％のアミド化Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−Ｎ　Ｈ２ 生成物、２０％の加水分解副生物Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−ＯＨおよび４％の残 存基質を示した。　゛ 例２ Ｚ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ　−ＯＨのアミド化Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈプラス チック管に、　０．２３ｍｇのＺ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ＯＨを取り、４ ０μｍのＤＭＳＯに溶解し、予め氷酢酸を用いてｐＨを９．２に調整した８Ｍア ンモニア／アンモニウム溶液９４５μｌ、ついで９５ｍｇの塩化グアニジウムを 加えた。０．３ｍＭのカルボキシペプチダーゼＹ溶液１５μｌを加えて反応を開 始させ、キャップロックを閉じたのち、３７°Ｃの恒温にしたＥｐｐｅｎｄｏｒ ｐｈミキサー中で、実験時間中振盪した。１２９０分後、ＨＰＬＣは、８５％の アミド化生成物Ｚ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２、２％の加水分解副生物Ｚ−Ａｌａ −Ｐｒｏ　−ＯＨおよび１％のアミド副生物Ｚ−Ａｌａ−Ｎ　Ｈ２および１２％ の未反応基質を示した。

例３ Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ　−ＯＨのアミド化Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈプラス チック管に、　０．４６ｍｇのＺ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ＯＨを取り、２ ０μｌのＤＭＳＯに溶解し、予め濃ギ酸を用いてｐＨを９．２に調整した１０Ｍ アンモニア／アンモニウム溶液９６５μｌを加えた。０．３ｍＭのカルボキシペ プチダーゼＹ溶液１５μｌを加えて反応を開始させ、キャップロックを閉じたの ち、実験時間中、３７°Ｃの恒温にしたＥｐｐｅｎｄｏｒｐｈミキサー中で振盪 した。９０分後。

ＨＰＬＣは、８８％のアミド化生成物Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−Ｎ　Ｈ２。

１２％の加水分解副生物Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−ＯＨを示し、基質は残存しな かった。

例４ Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ　−ＯＨのアミド化Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈプラス チック管に、　０．４６ｍｇのＺ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ＯＨを取り、２ ０μｌのＤＭＳＯに溶解し、予め固体水酸化ナトリウムおよび塩化アンモニウム を用いてｐＨを９．２に調整した４、５Ｍアンモニア／アンモニウム溶液９６５ μｌを添加した。０．３ｍＭのカルボキシペプチダーゼＹ溶液１５μｍを加えて 反応を開始させ、キャップロックを閉じたのち、実験時間中、３７℃の恒温にし たＥｐｐｅｎｄｏｒｐｈミキサー中で振盪した。１４３分後、ＨＰＬＣは、７４ ％のアミド化生成物Ｚ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ２、１０％の加水分解副生物Ｚ　 −Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−ＯＨおよび１６％の残存基質を示した。

例５ Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（０）−０８のアミド化Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈプ ラスチック管に、　０．４６ｍｇのＺ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（０）−ＯＨ ［式中、（０）は側鎖スルホンを意味する］を取り、予め氷酢酸を用いてｐＨを ９．２に調整した８Ｍアンモニア／アンモニウム溶液９０５μｌ、ついで９５ｍ ｇの塩化グアニジウムを加えた。０．３ｍＭのカルボキシペプチダーゼＹ溶液１ ５μＩを加えて反応を開始させ、キャップロックを閉じたのち、実験時間中、３ ７°Ｃの恒温にしたＥｐｐｅｎｄｏｒｐｈミキサー中で振盪した。９０分後、　 、ＨＰ　Ｌ　Ｃは。

３３％のアミド化生成物Ｚ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨｚ　、８％の加水分解副生物 Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−ＯＨ，２％のアミド副生物Ｚ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　Ｎ　 Ｈ２およびおよび５７％の残存基質を示した。

例６ サケカルシトニン（１６−３２）　−Ｔｈｒ　−ＯＨのアミド化Ｅｐｐｅｎｄｏ ｒｐｈプラスチック管に、１．０ｍｇの一５ＡＬ（１６−３２）　−Ｔｈｒ　− ＯＨを取り、２０μｌのＤＭＳＯに溶解し、予め氷酢酸を使用してｐＨを９．２ に調整した８Ｍアンモニア／アンモニウム溶液４３５μｌを添加した。０．３ｍ ＭのカルボキシペプチダーゼＹ溶液４５μｌを加えて反応を開始させ、キャップ ロックを閉じたのち、実験時間中、３７°Ｃの恒温にしたＥｐｐｅｎｄＯｒｐｔ ｌミキサー中で振盪した。３００分後、ＨＰＬＣは、　５１％のアミド化生成物 Ｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−ＮＨ２，２４％の加水分解副生物Ｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　 −ＯＨ、１６％の他の副生物および９％の残存基質を示した。

上記式中、Ｒはサケカルシトニンの１６−３０配列を示す。

例７ サケカルシトニン（１６−３２）　−Ｔｙｒ　−ＯＨのアミド化Ｅｐｐｅｎｄｏ ｒｐｈプラスチック管に、　１．Ｏｍｇの５ＡＬ（１６−３２）　−Ｔｙｒ−Ｏ Ｈを取り、２０μｍのＤＭＳＯに溶解し、予め氷酢酸を使用してｐＨを９．２に 調整した８Ｍアンモニア／アンモニウム溶液４３５μＩを添加した。０．３ｍＭ のカルボキシペプチダーゼＹ溶液１５μｍを加えて反応を開始させ、キャップロ ックを閉じたのち、実験時間中、３７°Ｃの恒温にしたＥｐｐｅｎｄｏｒｐｈ　 ミキサー中で振盪した。１０５０分後、ＨＰＬＣは、４４％のアミド化生成物Ｒ −Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−ＮＨ！、１３％の加水分解副生物Ｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｏ Ｈ，３１％の他の副生物および１２％の残存基質を示した。

上記式中、Ｒはサケカルシトニンの１６−３０配列を示す。

例８ 各種サケカルシトニンフラグメントＳＡＬ　（１６−３２）−Ｘペプチドのアミ ド化によるＳＡＬ　（１６−３２）　−ＮＨｚの生成１ ＬＨＡＶＩ！ＩＣＣＰＥＰＴＩＤＥ　ＣＦＤ−Ｙ　時間　Ｔｉｅｌｄ　５ｕｂｓ ｔｒ、Ｈｙｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡＴＩＯ（Ｘ　（ｍＭ）（Ｍ　（％）（％）　（％ ）（％）（％）Ｍｅｔｂ）　０．５　２０　１２００　！３　２１　！　２０　 ４１Ｍｅｔｃ）　１０　２０　３００　５！　Ｉ　２４　１７　５６Ｔｈｒ　、 　１．０　３０　３００　５１　１　２５　１５　５６Ｔｙｒ　１．０　！０　 １δＯＳ６　１９　Ｎ　９　４４Ｔｒ　Ｏ，５１０１（１５０４４１２１４３１ ５０ａ）反応条件＝７．７Ｍアンモニア／アンモニウム、　ＰＨＡＤＪ：ＨＯＡ ｃ、　ｐ［Ｉ９．２．　＄７℃Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈミキサー中、４％ＤＭＳ　 Ｏｂ）ＤＭＳＯ添加せず、ＩＭ塩化グアニジウムＣ）反応の時間経過は図１に例 示 例９ 各種Ｚ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−Ｘペプチドのアミド化１）ＬＥ＾マＩＮＧ　溶媒 　ＣＰＤ−Ｙ　時間　Ｙｉｅｌｄ　５ｕｂｓｔｒ、Ｂｙｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡＴＩ Ｏ（Ｘ）　Ｍ）　％　％　（％　（％）（％）Ｍｅｔ　水　５　８０　７８　３ 　１９　０　８０Ｍｅｔ　（０）　水　５　１２０　３３　５７　９　２　７１ Ｍｅｔ（０）　４％ＤＭＳＯ５１１１０１６Ｉｌｌ　２　２　ｇｌＴｈｒ　＊４ ５　８５　５１１　２７　ｉｓ　Ｏ７９Ｔｂｒ　４″％ＤｋｌＳ０　１ｋ　！ｇ ｏ　８０　１６　２２　２　７１Ｔｈｒ　４％ＤＭＳＯ”　Ｉｓ　２５０　Ｓｏ 　８　２９　１　６５Ｔｒｐ　４％ＤＭＳＯ”　１’０　９５　７７　６　１７ 　０　８２Ａｒｇ　４％ＤＭＳＯ”　５　１４００　５７　４　３３　７　５９ Ａｒｇ　４駕ＤＭＳＯ”０）Ｓ　１３０　２６　１５　６０　０　３０Ｌｙｅ　 ４＄ＤＭＳＯ”　５　２５５　５６　３４　１０　０　１１５Ｌｙｓ　４％Ｄｉ ｌＳＯ”。）５　１’ｊＧ　４１　２６　３４　０　５５＾ａｎ　４％ＤＭＳＯ ”　１７　１５０　３５　８０　５　０　８８Ｇｌｕ”　４％ＤＭＳＯ”　１７ 　１３８０　０　９４　１　０　０１）反応条件：　１　ｍＭ　ＰＨＰＴＩＤＥ 、　７．７ＭＣｌ１１３（アンモニア／アンモニウム）。

ＰＨＡＤＪ　：　ＨＯＡ　ｃ　、　ｐ［Ｉｓ、　２．　！７℃Ｅｐｐｅｎｄｏｒ ｐｈミキサー中、１Ｍ塩化グアニジウｂ）塩化グアニジウム添加せず ｅ）ｐＨ７，８ ｄ）比較例 例ＩＯ 各種溶媒およびアンモニア／アンモニウム混合物中でのＺ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍ ｅｔのアミド化１′溶媒　Ｃ１１Ｈ！　基土　時間　Ｙｌｅｌｄ　５ｕｂｓｔｒ 、！Ｉｙｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡＴＩＯシｔ＋サンｄ＞　７．７　ＫＨ３＋　１８０ 　７０　１４　１６　０　８２ＨＯ＾Ｃ ジｔ＋’？ンｂ）ｄ）４．３　Ｎｌｌ４ＣＩ＋１０２０　２１　’ｌＧ　−”− １００Ｎａ０１［ ジｔ＊ｆｙｅ）ｄ）４．０　ＮＨ４Ｃ＋＋　６０　６４　１４　２０　２　７５ ａＯＩＩ ＤＭＳＯ４，１Ｎｉｌ、ＩＣ＋＋１５０　７０　２１　！　０　１１１１１１ａ ｏ［ １）反応条件：　１　ｍＭ　ＰＥＰＴＩＤＨ，４％溶媒、５μＭＣＦＤ−！、　 ｐＨ９，２，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈミキサー中３７℃ ｂ）３．！μＭ　ＣＰＤ−Ｙ添加 ｃ）３．１８Ｍ　ＣＰＤ−Ｙ添加 ｄ）ジオキサンは過酸化物フリーの等級例ＩＩ ＤＭＳ　ＯＣＮＨ３ＣＰＤ−Ｙ　時間　Ｙｉｅｌｄ　５ｕｂｓｔｒ、Ｂｙｄｒ、 Ｏｔｈ、ＲＡＴＩＯ度（％）（Ｍ）（Ｍ（（％）　％）　（％）（％）（％）４ 　７．７　５　７５　７８　０　２２　０　７１１ａ　５　１２０　７７　ａ　 １４　０　８４１２　Ｓ、９　１０　１２００　７２　Ｈ９２８６１２６、！　 １０”　１２４２　６８　１４　Ｉｓ　２　８０ａ）反応条件：　５ＡＬＴ／Ｐ ＩＩＡＤＪ　：　ＩＴ！Ｉａ／［１ＯＡｃ、　ｐＨ９，２，［１ｐｐｅｎｄｏｒ ｐｂミ牛サ一中３７℃ｂ）０．５μＭペプチド ｅ）Ｌ　３μＭ　ＣＰＤ−ＹＦｆ！加 ｄ）ジオキサンは過酸化物フリーの等級例１２ ＣＩｌｌ３　５ＡＬＴ／ＰＨＡＤＪ　時間　Ｙｌｅｌｄ　５ｕｂｓｔｒ、［Ｉｙ ｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡＴＩＯＭ）　（）（％）　（％）　（％）　（％）　（％） ９．７　１１ＨｉＢ２ｓＯ４７０１２７３０３°　８δ８．２　ＮＨａ／ｌｌＣ ｌ　７０　８０　９　１１　０　０１．７　ＮＨ３／ＨＣＯＯ１１９０８８０１ ２０８８７，７ＮＨａ／［１ＯＡｃ’　ｆｉ９　７８　４　１８　０　ｌ１１７ ．７　Ｎ１１３／１ＩＯＡｃ　７５　７６　４　２０　０　７９７．７　ＮＨ３ ／ＨＯＡｅ　６１１　７９　３　１５　３　ｌ１１７．７　ＮＢ３／ＨＯＡｃ　 ４０　Ｈ８１１０ｐＨ４，３Ｎ１１９／［１ＯＡｃ　５３　８８　０　３２　０ 　６８４、３　ＮＨ４Ｃｌ／ＬＩＯ１１１１１１４３４１１９３１８４，１ｂ） 　ｌ１１１ａＣＩ／ｌ１ａＯ［ｌ　１２　８１　５　１４　０　８＆４、１　Ｎ ｉＩｎＣ１／ＮｉＯ［１１４３７４１６１００Ｉｌｌ６．３　ＮｉＩ　Ｎ［１４ ＣＩ　１４０　Ｔｏ　２０　１０　０　Ｕ哀）反応条件：１ｍＭペプチド、　ｐ Ｈ９，２，ｓμＭＣＰＤ−Ｙ、　２％Ｄ　Ｍ　Ｆ　、　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｂミ キサー中３７℃ ｂ）２０ａＭ　ＣＰＤ−Ｙ添加 例１３ キシルメチルエステル約２ｍｇを、　８９ｍｇのし一メチオニンおよび９５ｍｇ の塩化グアニジウムとともに、８５０μｌの水および４０μｍのＤＭＳＯに溶解 し、ｐＨ調整容器中３７°Ｃの恒温にして、ｐＨを８．８に２Ｍ水酸化ナトリウ ムを用いて調整した。反応はこの容器中で実施した。０．３ｍＭのＣＰＤ−Ｙ溶 液１５μｌを加えて反応を開始させた。反応は３０分以内に完結した。混合物の ｐＨを２．５に調整して、逆相Ｃ＋　ｓ　ＨＰ　Ｌ　Ｃカラムに適用した。これ から、生成物を０６１％ＴＦＡ／含水アセトニトリル勾配で溶出し、窒素下に乾 燥して、収量１．２ｍｇ　（６０％）を得た。

アミノ酸分析（比） Ａｓｐ＋Ａｌａ（５，１）、　Ｇｌｕ（１，９）、　５ｅｔ（０，９）、　Ｇｌ ｙ（４，０）、　Ｈｉｓ（０，６）、　ＩＴｈｒ（４，９）、　Ｐｒｏ（２，１ ）、　Ｔｙｒ（１，１）、　Ｖａｌ（０，９）、　Ｍｅｔ　（１，９）、　Ｃｙ ｓ（１，２）、　（ｌｅ（１，０）、　Ｌｅｕ（２，３）、　Ｐｈｅ（３，２） システィンの化学的分解と２個のメチオニン残基・の存在の確認を付記する。

例１４ 各種Ｚ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ　−Ｘペプチドのアミド化１′Ｌ！ＡＶＩＩＩＧ　溶 媒　ＣＰＤ−Ｙ　時間　マ１ａｉｄ　５ｕｂｓｔｒ、［Ｉｙｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡ ＴＩＯＸ　（Ｍ）（（％）（％　（％）　％　％Ｍａｔ　２篤ＤＭＦｂ）　２． ５　１１０　６７　３１　０　２　９フＭｅｔ　４％ＤＭＳＯＳ　ｚｓｓ　ａｚ 　ｔｉ　ｚ　ＯＨＧｌｎ　水　２０　１００　２４　４１　３’５　０　４１Ｇ ｌｎ　４駕ＤＩＩＩＳＯ２０１２００Ｓｏ　４＠　２３　０　５４旧＄　水　２ ０　１１４０　２５　２８　４８　３　３３１　Ｈｉｓ　４％ＤｉｌＳＯ２０１ ２００２０＠０　２０　０　５１Ｔｈｒ　４％ＤＭＳＯ°’　２５　１４４０　 １フ　フ＠　６　１　７１丁ｙｒ　４ＸＤＭＳＯＩＴ　１３２０　４５　１フ　 ３１１　０　５４Ｔｒｐ　４駕ＤＭＳＯＳｏ　１８０　６８　１１　１５　０　 ８２Ａｒｇ　４駕ＤＭＳＯ１７２１４１７ＩＩ！　ＯＯ１００Ｌｙｓ　４％ＤＭ ＳＯ１７０Ｓ　２８　？！　０　０　１００Ｇｌｙ”）ＺＮＤＭＦ−”’５０　 １４４０　０　１００　０　０　Ｄ−助二」用亘畢」ｌ−ユ肚−−Ｌ−用一一」 −−１−−り暑）反応条件：　１　ｍＭ　ＰＥＰＴＩＤＥ、　７４Ｍ　ＣＩｌ［ １，（アンモニア／アンモニウム）。

ＰＨＡＤＪ：　ＨＯＡｃ、　ｐＨ９，２，１Ｍ塩化グアニジウム、３フ’ＣＥｐ ｐｅｎｄｏｒｐｈミキサーｂ）塩化グアニジウム添加せず Ｃ）塩化グアニジウム添加せず、　４．３Ｍ　Ｃｌ１１１３．　ＰＩＡＤＪ／５ ＡＬＴ：！１ａｏｌＩ／１ＩＨ４ｃ１ｄ）２Ｓ’Ｃ ｅ）比較例 例１５ 各種ｐＨおよび濃度でのＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔのアミド化１ｐ［Ｉ　ＣＰ ＥＰ−ＣＰＩ［Ｉａ　時間　Ｔｌｅｌｄ　Ｓｕｂ寥ｔｒ、ｌ１ｙｄｒ、Ｏｔｈ、 ＲＡＴＩＯＴＩＤＥ（ｗＭ　（Ｍ）　（）　（％　（％）　％）　（％）　（％ ）９．５　０．５　ｇ、ｓ　ｉｔｇｏ　５５　！ｆ　ｇ　０　９１９．２　０． ５　７．７　１２！ＯＩｓ　１２　２　１　９７９．２　０．２　７．８　１１ ２０　Ｔｏ　２７　２　０　９７ａ）反応条件：　５ＡＬＴ／ＰＩＩＡＤＪ　： 　ＮＨ３／ＨＯＡｃ、Ｉ　Ｍ塩化グアニジウム、５ＨＭ　ＣＰＤ−Ｙ＋さらに１ １００分後にｔｏμＭ　を追加、　Ｒｐｐｅｎｄｏｒｐｈミ牛サー中３７℃ｂ） 最す１６μＭ　ＣＰＤ−Ｙ 例１Ｇ 各種溶媒および温度でのＺ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ　−ＯＨのアミド化１） 溶媒　温度　ＣＰＤ−Ｙ　時間　ＴＩｅＪｄ　５ｕｂｓｔｒ、Ｈｙｄｒ、Ｏｔｈ 、ＲＡＴＩＯ（”Ｃ（Ｍ）　（％　％）　％）　（％〉　（％）４ｚジｔ＋サン ”　３７　３３　１２６０　８２　２＆　１２　０　１１４４％ＤＭＳＯ３？　 ２０　１２００　１１８　０　３２　０　６Ｓ４ｇＤＮＳ０　２５　！０　１２ ６５　５７　０　４１１　０　５７１０％ｆす＊ａミール３　２０　１２６０　 ２２　０　０　７１１　２２１０％グリセｔ７−ル２５　２Ｇ　１２６０　４２ 　０　０　５８　４２１０ＸＴＧＭ８　３７　２０　１２００　１３　８７　０ 　０　１（ＩＱ１０％ＴＧＭＩＩ： 一一一一一旦−一般一二世−−刃一−］−−一虹一一り一県し１）反応条＃　： 　４．２Ｍ　ＣＮＨ３，５ＡＬＴ／ＰＨＡＤＪ　：　ＮＨａＣＪ／ＮａＯＨ，ｐ Ｈ９，２，ｌ　ｍＭ　ペプチドｂ）Ｏ，７ｍＭペプチド、過酸化物フリージオキ サン例１７ 各種アンモニア／アンモニウム混合物中でのＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔおよび Ｚ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔのアミド化１ベプｆＶ　ＣｎＨ２塩＋　９Ｈ時間　 １１ｅｌｄ　Ｓｕｂ＋＋ｔｒ、Ｈｙｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡＴＩＯ−Ｍａｔ−ＯＨＭ ）　ＰＨＡＤＪ　（）　％　（％　（％ン　（％）　（％）２−＾１ｔ−Ｐｒｏ ４．３　Ｎ［１２＋　９４　６７　５５　４　３９　２　５７Ｚ−Ａｌａ−Ｐｒ ｏ４．３　ＮＨａＣＩ＋９．２２２５　４１　４５　１４　０　７４ｏＨ ２−Ａｉｍ−Ｐｒｏ４．５　ｌｌｌ！３＋　９．！１２０　１７　０　Ｇ　Ｏ１ ０Ｇ”　ＮＲＪＯ３ ｒ−Ａｌｔ−Ｐｒｏ？、Ｉ　１１Ｈｚ＋　９．２　９２　４１　ＨＩＩ　Ｇ　７ ０い　Ｉｌ［Ｉａｌ１％ ２−＾ｌ５−Ｐｒｏ　９．０　ＨＨ２＋　９．２　４０　＠　９２　０　０　１ ００Ｎ！ＩＭＯ 麿）反応条件：１ｍＭペプチド、　５８Ｍ　ＣＰＤ−Ｙ、　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐ ｈミキサー中３７℃ｂ）１７ａＭＣＰＤ−Ｙ、４％ＤＭｓ。

ｃ）３０℃ 例１８ 酵母からの各種型ｂ）ｅｌでの触媒による。酢酸でｐＨ９，２ペプチド　ＣＰＤ 　酵素　時間　Ｙｉｅｌｄ　５ｕｂｓｔｒ、！Ｉｙｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡＴＩＯ− Ｍａｔ　（Ｍ）　（盟）　（分）　（％）　（％）　（％）　（％　（％Ｚ−Ｔ ｈｒ−Ｐｒｏｄ）　２　Ｍｇ”　１００　７６　１　１９　４　フ７Ｚ−Ｔｈｒ −Ｐｒｏ”　２　ＳＲ”　６５　７３　４　２０　３　７６２−＾ｌ５−Ｐｒｏ ”　＄　１１Ｅｂ）　７５　９９　１　０ｆｌ　Ｇ”１００Ｚ−Ａｌａ−Ｐｒｏ −’　Ｉ　ＳＲ”　８０　９９　１　０ｆ′Ｇ”　１００暑）反応条件：１ｍＭ ペプチド、　５ＡＬＴ：　ＮＨ３，ＰＨＡＤＪ：　ＨＯＡｃｂ）ＭＥ−Ｊｏｈｍ ｎｓｅｎ、Ｊ、Ｔ、、Ｂｒａｄｄｉｓ、１．　＆　０ｔｔａｓａ＋＋、Ｍ、（１ ９８５）　Ｃｉｒｌｓｂｅｒｇ　ＲａｓAＣｏｍ５ｕ＋＋。

４１、　ｐ、１−１４に従って製造および精製したネイティブ抽出ＣＰＤ−Ｙｃ ）Ｓｉ１＝ｌＩＩｅｌｓｅｎ、Ｔ、Ｃ，、ｌｌｏｌｍｂｅｒｇ、Ｓ、　＆　Ｐｅ ｔａｒｓｏｎ、Ｊ、Ｇ、　（１９９Ｇ）＾ｐｐ１．組ｅｒ盾ｂ撃盾P．　Ｂｌ。

ｔｅｃｈｎｏｌ、　３３．　ｐ、＄０７−３１２に従って発現させて製造し、　 ｂ）によって精製した分泌組換えＣＰ　Ｄ−Ｙ ｄ）２％ＤＭＦ　Ｃ１１ｌ１３：４．３Ｍｅ）４％ＤＭＦ　ＣＮ［１３ニア、５ Ｍｆ）痕跡 例１９ 界面活性剤　時間　Ｔｌｅｌｄ　５ａｂｓｔｒ、Ｈｙｄｒ、ｏｔＮ、ＲＡＴＩＯ （％　％　％　（％）　（％） Ｏ，Ｓ％トラウロイルザルコシン　４１１　３１　２Ｉ　４１　０　ＧＯ，Ｓ％ ｔ９！／ンｘｓ、ホｙ酸３００　７　８０　１３　０　３４Ｏ，Ｓ％Ｂｒ１ｊ１ ３５　ＺＧｏ　４　ｇ４　１２　０　２７０．５％Ｔｗｅｅｎ２Ｇ　ＺＧｏ　１ １　Ｎ　４９　０　２７１）反応条件：　８．ＯＭ　ＣＮＨ２，ＰＨＡＤＪ　： 　ＨＯＡ　ｃ、　ｐＦｉ９．２．１　ｍＭ　Ｚ−Ａｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ。

４％Ｄ　Ｍ　Ｓ　０　、１７℃Ｍ　ＣＰＤ−Ｙ、　！１ｐｐｅｎｄｏｒｐｈミキ サー中３７℃ペプチド例２０ 界面活性剤　時間　Ｙｔｅｌｄ　５ｕｂｓｔｒ、Ｈｙｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡＴＩＯ （％　％　％　％）　％） ５％ＣＩＩＡＰＳＯ３５６０４０００１００５％ペンタンスルホン　１２００　 ８９　１　１０　０　ｇ！耐反応条件：　８．ＯＭ　ＣＮＨｚ、　ＰＨＡＤＪ　 ：　ＨＯＡ　ｃ　、　ｐｆ１９．２．１　ｍＭ　Ｚ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ。

４％ＤＭＳ０，１フｕＭ　ＣＰＤ−Ｙ、　Ｅｐｐａｎｄｏｒｐｈミキサー中３７ ℃ペプチド例２１ 酢酸でｐＨ調整されたアンモニア／アンモニウム混合物にさらに各種添加物を含 有させた場合のＺ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ＯＨのＣＰＤ−Ｙ触媒アミド化 １） ＣＡＤＤ　添加物　時間　Ｙｆａｌｄ　５ｕｂｓｔｒ、Ｂｙｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡ ＴＩＯ（）　％）（％）　（％）　％　％ ０、ｉｖ二）　−ｋ　２４１１　！７　５８　Ｓ　Ｏｌｌ５２．０　尿素　１４ ４　Ｉｔ　９２　０　０　ｔｏ。

１）反応条件：　８．０Ｍ　ＣＮ［１３，ＰＢＡＤＪ　：　８０　Ａ　ｃ　、　 ｐ［Ｉ９．２．１　ｍＭＺ−Ａｌｉ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ。

４％ＤＭＳ０．　５ｐＭ　ＣＰＤ−Ｙ、　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｂミキサー中３７ ℃ペプチド例２２ ｐＨ範囲８．５〜９．０の各種酢酸／アンモニア／アンモニウム混合物中、構造 Ｚ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ　−Ｘ　−ＯＨの各種ペプチドのＣＰＤ−Ｙ触媒アミド化 １） ＬＥＡＶＩＩＩＧ　ｐＨＣＩｌ［ｌａ　時間　Ｙｉｅｌｄ　Ｓｕｂｇｔｒ、Ｍｙ ｄｒ、Ｏｔｈ、ＲＡＴＩＯＸ　（分）　（％）　（％）　％）　（％）　（Ｋ） Ａｒｇ　８．８　７．５　ｆｆ！０　３６　５！　１２　０　７５＾ｒｚ　９． ０　？、７　３６０　３１　４５　２４　０　５７Ｔｈｒ　Ｃ５７，０６０２７ ３２４１０４ＣＩＴｈｒ　８．８　１．５　２０５　４２　３６　２３　０　６ ５Ｔｈｒ　９．０　７．７　３２５　４５　２０　３６　０　５６Ｔｒｐ　Ｃ５ ７，０８５２９６６５０！ＩＴｒｐ　１１．８　７．５　１５５　５！　４　４ ２　０　５６丁ｙｒ　ｓ、ｓ　フ、５　４００　４６　１１　４！　０　５１τ ｒ　９．０　７．７　！５０　４＄　１３　４４　０　４９１）反応条件：　１ 　ｍＭ　Ｚ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘ、Ｉ　Ｍ塩１１り７ニシン、　４　％ＤＭ　Ｓ 　０゜１７μｌＭ　ＣＰＤ−Ｙ、　［！ｐｐｅｎｄｏｒｐｈミキサー中３７℃ペ プチド例２３ メチオニン酸で延長した環状ヒトカルシトニン１−３２の１．１ｍｇをガラスチ ューブ中、２０μｌのＤＭＳＯに直接溶解し、予め氷酢酸でｐＨを９．２に調整 した２５％（Ｗ／Ｗ）アンモニア溶液０．４７ｍ１を添加すると澄明な溶液が得 られた。

ついでこれに４７ｍｇの塩化グアニジニウムを溶解した。混合物をＥｐｐｅｎｄ Ｏｒｐｈサーモミキサー中で３７℃の恒温にしたのち、０．３ｍＭのＣＰＤ−Ｙ を加えてＣＰＤ−Ｙ濃度を約０．３μＭとして反応を開始させた。密閉反応容器 を３７℃で約０．５時間振盪した。ＨＰＬＣによれば、この溶液は４２％のヒト カルシトニンアミドならびに２１％の加水分解副生物のカルシトニン遊離酸を含 み、残部は未反応基質およびわずかな分解生成物であった。

例２４ スレオニン酸で延長した環状ヒトカルシトニン１−３２の１、９ｍｇを試験管中 、４０μｌのＤＭＳＯに直接溶解し、予め氷酢酸でｐＨを９．２に調整した２５ ％（Ｗ／Ｗ）アンモニア溶液０．９２ｍ１．および９６ｍｇの塩化グアニジニウ ムを添加した。ついで、混合物をεｐｐｅｎｄｏｒｐｈサーモミキサー中で３７ °Ｃの恒温にしたのち、０．３ｍＭのＣＰＤ−Ｙを加えてＣＰＤ−Ｙ濃度を約８ μＭとして反応を開始させた。密閉反応容器を３７°Ｃで４０分間振盪すると、 基質の約１／３が変換され、いくつかのｐＨ値でのＨＰＬＣによりこの溶液は１ ６％のヒトカルシトニンアミドならびに痕跡の加水分解副生物のカルシトニン遊 離酸を含有し、残部は６７％の未反応基質およびわずかな分解生成物であった。

例２５ 少量のカルシトニン酸を含む、チロシン酸で延長した環状ヒトカルシトニン１− ３２の１．８ｍｇを試験管中、４０μｌのＤＭＳＯに直接溶解し、予め氷酢酸で ｐＨを９．２に調整し、　９６ｍｇの塩化グアニジニウムを含む２５％（Ｗ／Ｗ ）アンモニア溶液０．９４ｍ１をこの溶液に添加した。混合物をＥｐｐｅｎｄｏ ｒｐｈサーモミキサー中で３７°Ｃの恒温にしたのち。

０．３ｍＭのＣＰＤ−Ｙを加えてＣＰＤ−Ｙ濃度を約２０μＭとして反応を開始 させた。密閉反応容器を３７°Ｃで約０．５時間振盪すると、基質の約３７％の 基質が変換され。

ＨＰＬＣにより、この２６％がヒトカルシトニンアミドに変換されたことが明ら かにされた。すなわち総数率は約ｌＯ％であった。同時にそれよりわずかに多い 加水分解副生物のカルシトニン遊離酸を示し、残部は６３％の未反応基質および わずかな分解生成物であった。

例２６ アミン　−Ｒ濃度　時間　Ｙｌｅｌｄ　５ｕｂｓｔｒ、　１ｌｙｄｒ、Ｏｔｈ、 ＲＡＴＩＯ（Ｍ） ：ＬｆｋｌミンーＣＩ１２Ｃ［１３２，０１２０１８３１Ｉ２　Ｑ　２４２−エ タｔ−ｋＴミ７　−Ｃｌ！２Ｃ［１２０ｉ１３．０　９０　５９　Ｉｓ　２＠　 ０　６９ヒドラジン　−ＮＨ２２，０７５８０’　Ｓ　Ｉｓ　Ｏ８４セミカルバ ジド−ＮＨＣＯＮ［Ｉ２　２．０　７１　６９　２４　８　０　９０ヘンシルア ミ７−Ｃ［Ｉ２Ｃ１！ＩＩＳ　Ｏ，１Ｉ４　５４　３５　８　０　８３ｍ）反応 条件：　１　ｍＭ　Ｚ−Ｔｂｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ＯＨ，Ｉ　Ｍ塩酸グアニジン 、５ｇＭＣＰＤ−Ｙ、　４％ＤＭＳＯ，ｐＨ９，２，酢酸で調整ｒ　Ｅｐｐａｎ ｄｏｒｐｈミキサー中３７℃ｂ）塩酸塩として使用、　ｐＨは１ｌｉｏＩＩで調 整ｅ）１００８Ｍ　ＣＰＤ−Ｙ、　ｐｍは塩酸で調整、恒ｐａカップ中で反応１ 　、Ｂｒｅｄｄａｍ、に、、Ｗｉｄｍｅｒ、Ｆ、＆　Ｊｏｈａｎｓｅｎ、Ｊ、Ｔ 。

（１９８０）　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、４５．　２３７− ２４７２、Ｗｉｄｍｅｒ、Ｆ、、Ｂｒｅｄｄａｍ、に、＆　Ｊｏｈａｎｓｅｎ、 Ｊ、Ｔ。

（１９８１）Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、４６．９７−１０６ ３　、Ｂｒｅｄｄａｍ、に、、Ｗｉｄｍｅｒ、Ｆ、＆　Ｊｏｈａｎｓｅｎ、Ｊ、 Ｔ。

（１９８１）　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、４６．　１２１− １２８４．８ｒｅｄｄａｍ、に、、Ｗｉｄｍｅｒ、Ｆ、＆　Ｊｏｈａｎｓｅｎ、 Ｊ、Ｔ。

（１９８１）Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、４６，３６１−３７ ２５　、　８ｒｅｄｄａｍ、Ｋ、、Ｊｏｈａｎｓｅｎ、Ｊ、Ｔ、＆　０ｔｔｅｎ ｓｅｎ、Ｍ。

（１９８４）　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｎ＋ｍｕｎ、４９．　４５７ −４６２６．８ｒｅｄｄａｍ、に、（１９８５）Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、５０，３７、Ｂｒｅｄｄａｍ、Ｋ、（１９８６）　Ｃａｒｌｓｂ ｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、５１．８８　、Ｂｒｅｄｄａｍ、Ｋ、（１９８ ８）　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、５３，３９、　８ｒｅｄｄ ａｍ、Ｋ、＆　０ｔｔｅｎｓｅｎ、Ｍ、（１９８４）　ＣａｒｌｓｂｅｒｇＲｅ ｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、４９．　４７３−４８１１０、Ｊｏｈａｎｓｅｎ、Ｊ、Ｔ、 、Ｂｒｅｄｄａｍ、に、＆　０ｔｔｅｎｓｅｎ、Ｍ。

（１９７６）Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、４１．１−１４１１ 、Ｎ１ｅｌｓｅｎ、Ｔ、Ｌ、、Ｈｏｌｍｂｅｒｇ、Ｓ、＆　Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、 Ｊ。

Ｇ、Ｌ、Ａｐｐｌｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、（１９９０）、３ ３．　３０７−１２、Ｋｕｂｏｔａら、Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｃ Ｎ　（１９７３）、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、７４．Ｎｏ、４．　７５０−７７０１３、Ｈｏｐｐ　＆　Ｗｏ ｏｄｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

７８、　９．３８２４−３８２８　（１９８１）１４、　Ｄｍｏｃｈｏｕｓｋａ 、Ａ、ら、（１９８７）、Ｃｅ１ｌ、５０．　５７３−５８４１５、Ｃｏｏｐｅ ｒ、Ａ、＆　Ｂｕｓｓｅｙ、Ｈ，、（１９８９）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　 Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、９．　２７０６−２７１４１６、Ｂｅｃｈ 、Ｌ、Ｍ、＆　Ｂｒｅｄｄａｍ、Ｋ、、（１９８８）、ＣａｒｌｓｂｅｒｇＲｅ ｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、５３．３８１−３９３−　−≦１〜％ 国際調査報告 １ｐｌｅｍｍｗｓｌ　Ａｌｔｌｉ＋＋＋ｉｗ　Ｎ＋＋　ρＣＴ／ＤＫ　９２１０ ００６４国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ （７２）発明者　ウィドマー、フレッドオーストラリア国２１１２　ニュー　サ ウスウェールズ、ライド、アンザック　アベニュー　３５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式 ペプチド−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｒ （式中，Ｒは水素，ヒドロキシ，Ｃ１−６アルキル，ヒドロキシＣ１−６アルキ ルおよびＣ６−９アラルキルから選ばれるか，またはＲは基ＮＨＲ１であり，こ の場合Ｒ１は水素，Ｃ１−６アルキル，Ｃ６−９アラルキルまたは基ＣＯ−Ｒ２ であり，Ｒ２はＮＨ２，Ｃ１−６アルキルおよびＣ６−９アラルキルから選ばれ る）のＣ−末端修飾ペプチドの製造方法において，一般式 ペプチド−Ｐｒｏ−Ｘ （Ｘは非荷電または陽性に荷電され，少なくとも２個の炭素原子またさらにＮ， ＯおよびＳから選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子からなる側鎖を有するアミ ノ酸である）で表される基質成分を，求核試薬成分ＮＨ２−Ｒ（式中，Ｒは上述 の意味を有する）と，酵母からのまたは動物，植物もしくは他の微生物起源のＬ −特異的セリンまたはチオールカルボキシペプチダーゼ酵素の存在下，ｐＨ７． ５〜１０の水性溶液または分散液中において反応させ，ついで所望により，Ｒが 水素以外の反応生成物をペプチドアミドに変換することを特徴と方法 ２．求核試薬としてのヒドラジンＮＨ２−ＮＨ２を，Ｎ−末端および存在する場 合には側鎖アミノ基が保護された基質と反応させて保護ペプチドヒドラジドを形 成佐瀬，保護ヒドラジドをアジドに変換し，保護アジドをアンモニアと反応させ て保護ペプチドアミドに変換し，保護基を除去することを特徴とする「請求項１ 」に記載の方法 ３．カルシトニンを製造するにあたり，基質成分としてカルシトニン−Ｘ（式中 ，Ｘは上述の意味を有する）を使用することを特徴とする「請求項２」に記載の 方法４．ＸはＭｅｔ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ，Ｍｅｔ（０），Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ ，Ａｒｇ，ＬｙｓおよびＴｒから選択される「請求項１〜３」のいずれかに記載 の方法 ５．求核試薬はアンモニア，エチルアミン，ヒドラジンおよびセミカルバジドか ら選ばれる「請求項１〜４」のいずれかに記載の方法 ６．用いられるカルボキシペプチダーゼは酵母からのカルボキシペプチダーゼで ある「請求項１〜５」のいずれかに記載の方法 ７．用いられる酵素はカルボキシペプチダーゼＹである「請求項６」に記載の方 法 ８．複数個のベンジルスクシニル基がカップリングしたポリマー樹脂マトリック スからなるアフィニティー樹脂上アフィニティークロマトグラフィーによって精 製されたカルボキシペプチダーゼＹを使用する「請求項７」に記載の方法 ９．固定化カルボキシペプチダーゼ酵素を使用する「請求項１〜８」のいずれか に記載の方法１０．０〜２５％の有機溶媒を含有する水性反応溶液を使用する「 請求項１〜９」のいずれかに記載の方法１１．有機溶媒はジメチルスルホキシド ，ジメチルホルムアミド，アルカノール類，アルカン酸，ジオキサン，テトラヒ ドロフラン，ジメトキシエタン，グリセロール，エチレングリコールおよびポリ エチレングリコールからなる群より選ばれる「請求項１０」に記載の方法１２． アンモニアは反応培地中に濃厚溶液または液体型として添加する「請求項１また は４」に記載の方法１３．反応培地中のアンモニアの濃度は４．０〜１２．０Ｍ ，好ましくは５〜８Ｍである「請求項１または４」に記載の方法 １４．ｐＨ調整剤は，低分子有機酸，好ましくは酢酸またはギ酸から選択して使 用される「請求項１〜１３」のいずれかに記載の方法 １５．反応培地にはゲル化阻止剤，好ましくは塩酸グアニジウムを加える「請求 項１〜１４」のいずれかに記載の方法 １６．反応は密閉容器中，１〜３バールの圧力，好ましくは１〜２バールの圧力 で行われる「請求項１〜１５」のいずれかに記載の方法 １７．酵素的に，組換えＤＮＡ法により，化学合成により，またはこれらの組合 わせで製造されたペプチド−Ｐｒｏ−Ｘを使用する「請求項１」に記載の方法１ ８．式 ペプチド′−Ｐｒｏ−Ｘ′ （式中，ペプチド′はヒト，サケまたはウナギカルシトニンのネイティプな１− ３１アミノ酸配列であり，Ｘ′はＭｅｔ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒまた はＴｈｒである）で示されるカルシトニン関連ペプチド １９．ヒトカルシトニン−（１−３２）−Ｘ′′−ＯＨ（式中，Ｘ′′はＭｅｔ ，ＴｙｒまたはＴｈｒである）