JPH06502159A - 無細胞ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

無細胞ワクチン 本発明は、無細胞ポルデテラベルソンスワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅ ｒｔｕｓｓｉｓ）及び薬品におけるその使用に関する。 ボルデテラペルランスは、ヒト特に子供の重篤で衰弱を与える疾患の原因となり 、発展途上国では、大規模な免疫化計画によって、抑制されている。一般的には 、免疫化は、ボルデテラペルランスの細胞培養物由来の全細胞ワクチンを使用し て実施されており、前記疾患の予防に比較的可動であることか判明している。し かしながら、発熱、局所反応、持続的絶叫のような有害な反応に関する関心によ って、近年では、ワクチンの許容性か減少してδす、その連続的使用について議 論か行われている。 開発国における前記疾患の低発病率に関して、全細胞ワクチンの使用に関連する 利益／危険比はほとんど定義されていない。しかしながら、多くの臨床医は、有 害な反応の危険か、感染に対する免疫化の利点よりも重いと信している。その結 果、今日では多くの子供か、百日咳の流行の危険を高めながらも、免疫化を受け ていない。 事実、近年では、全細胞ワクチンの使用か減少するにつれて、百日咳の発病率及 びその結果の幼児の罹患率は増加している。従って、前記疾患に対する保護を与 えるために必要な成分を保持しながら、全細胞ワクチンの有害な効果の原因とな る成分を含まない改良型のワクチンを開発Ｔることに、かなりの研究努力か注が れている。 安全て効果的なワクチンの研究は、全細胞ワクチン中に含まれる細菌有機体の病 原性及び毒性の保護部分の作用の同定及びメカニズムに関する情報か不十分であ るので、妨げられている。従って、研究は、有機体の２０またはそれ以上の表面 抗原を単離して特性化すること並びに免疫反応を誘導するその効力に集束してい る（　ｒＪ、Ａｍ、Ｍｅｄ、ｓｏｃ、　Ｊ　、Ｉ　９８２．２４８　（１）、２ ２〜２３）。研究されている抗原の例は、百日咳毒素（ＰＴ）としても知られて いるリンパ球増加促進因子（ＬＰＦ）、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）　、リボ多 糖類（ＬＰＳ）、凝集原、皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）　、非耐熱性及び耐熱性毒素 、多形核白血球阻害因子、アデニル化ンクラーセ、外膜６９ｋＤａ　（Ｐ、６９ ）及びその他の表面成分を包含する。これらの抗原はいずれもそれ自体では、可 動なワクチンのの基礎とはなりえないと考えられる。 本発明者らは、６９ｋＤａ抗原とトキソイド化されたＬＰＦの組合せ物か、その 個々の成分の効果の総和よりも驚くほと強力であることを発見した。さらに、６ ９ｋＤａ抗原及びトキソイド化されたＬＰＦの相乗的組合せの使用は、全細胞ワ クチンによって得られるもの（シーブロート、■、及びノエフィールト、Ｆ、　 、ｒＪ、ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄ　Ｊ、１９８）、９．３５］− ３６５）と平行の用量−依存の線状応答を与える。従って、この相乗的組合せは 、百日咳の予防において使用される存効なワクチンの基礎を与える。 従って、本発明は、ポルデテラベルソンスの６９ｋＤａの抗原及びホルデテラベ ルソンスのトキソイド化されたＬＰＦの相乗的組合せ物を含むワクチンを提供す る。 ６９ｋＤａ抗原は、ソゲナルペプチド及びＣ末端フラグメントを除去することに よって生体内で処理される、プレカーサータンパク質、Ｐ９３のＮ末端フラグメ ントである。すてにホルデテラベルッンスの外膜タンパク質として特性化されて いる。特に、１２９６（ｗ　／ｗ　）ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測 定によると、６７〜７３　ｋＤａの相対分子重量を有しており、またアミノ酸分 析（ＥＰ−Ａ　Ｉ　６２６３９）による測定によると、実質的に１・１のプロリ ン対グルタミン酸比を有している。このアミノ酸配列は、クローン化されたＤＮ Ａ分析（チャールズら、ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　、ｌ　９８９．８６．．３５５ ４〜３５５８）から推定されているか、本発明における使用において、このアミ ノ酸配列は、得られた配列か少なくとも９００６、好ましくは９５０６において 相同であり、本質において実質的に類似の生物学的性質を存するように変更され てもよい。この６９ｋＤａ抗原は、例えば、ノホトニーら（１９８５）により記 載されたｒ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　５０　Ｊ　、１ ９９〜２０６及び欧州公開第０１６２６３９号に記載されているような従来の方 法により、ホルデテラベルツシスの培養物から単離されることができる。代替的 に、組換えＤＮＡ技術を使用して得ることもてきる。この点に関して、６９ｋＤ ａ抗原をコードするＤＮＡを、例えばマコフらによって記載された方法（ｒＢＩ ｏ　／Ｔｅｃｈｎａ１ｏｇｙＪ、８．１９９０．１０３０〜１０３３）によりク ローン化し、次いて、適当な宿主中で表現することかできる。例えばＥ、ｃｏｌ ｉのような細菌またはビチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　） のような酵母を宿主として使用することか特に好ましい。このようにして得られ た６９ｋＤａの抗原は不溶性であってもよく、従来の方法による変性剤としての 塩酸グアニジニウムの使用の後で再生されることを必要としてもよく、少なくと も、ヒト用ワクチンにおけるその使用に一致したレベルにまで精製されることか 好ましい。ＬＰＦは、毒性ポルデテラベルツシスの細胞外環境に放出される１０ ５ｋＤａのタンパク質である（タムラ、Ｍら、１９８２、ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙＪ　、２１．５５１６〜５５２２）、５のサブユニットをコードするオペ ロンの出配列は、解明されているにコシアら、ｌ９８６、ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ　１．　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　Ｊ　８３．４６３１〜４６３５．イ才ヒト及びケイス、１９８ ６、ｒｓｃｒｅｎｃｅ　Ｊ　、　２３２．１２５８〜１２６４）。 ＬＰＦは、例えばイマイズミらにより記載された方法（ｒ　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉ ｎ＋＋ｎｕｎ、　Ｊ　、１９８３．４１Ｓ　１１３８〜＋１４３）のような、文 献記載の方法に従って、ボルデテラペルツシスの培養物から得ることができる。 これは、カラムクロマトグラフィーまたはその他の知られた精製方法を使用して 精製することかできる。これは、ホルムアルデヒド（ホルマリン）、グルタルア ルデヒド、過酸化水素（サトーら、ｒＬａｎｃｅｔＪ　、１９８４、（１）、１ ２２〜１２６）またはこれらの試薬のいずれかの組合せのような種々の異なる不 活ｒヒ剤を使用してトキソイド化されることかできる。 化学的無毒化に加えて、百日咳毒素は、遺伝子操作によって不活化されることか できる。ピザら（１９８９）ｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｊ　、２４６．４９７〜５００ は、酵素的に活性なＳｌサブユニット中の１または２のキーアミノ酸を置換する ことによって生成される百日咳毒素遺伝子の遺伝子的に操作された多数の対立遺 伝子について記載している。 ６９ｋＤａ抗原対トキソイド化されたＬＰＦの比は、例えば１・１０〜１０：Ｉ のような広い範囲内で変化することができるか、約Ｊ：Ｊか好ましく、とにかく ワクチン効能に相乗的効果をもたらすような比である。この比は重量比である。 本発明のワクチンは、任意的に、破傷風及びジフテリアのようなポルデテラベル ツシスまたはその他の細菌の抗原をさらに含むことかできる。 本発明のワクチンは通常、その相乗的組合せ物の患者への投与を可能にする薬学 的に許容され得る賦形剤と組合せられる。投与は通常、経口または好ましくは非 経口経路を経由して行われる。非経口経路の場合、賦形剤は一般的に液体であり 、相乗的組合せ物は一般的にその中に溶解または懸濁される。液体賦形剤の１の 例として、生理食塩水が挙げられる。 このワクチンは免疫反応を刺激する佐剤をも含むことかでき、それによって、こ の相乗的組合せ物の効能を高める。本発明における使用に好都合の佐剤は、例え ば、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムを包含する。 ワクチンは通常０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０、　０３〜２ｍｇ／ｍｌ 、最も好ましくは０．　３ｍｇ／ｍｌの範囲の最終濃度の抗原タンパク質を含有 することが好都合である。処方の後に、このワクチンを滅菌容器中に入れて、次 いで密閉し、低温度、例えば４°Ｃにおいて保存するかまたは凍結乾燥する。 本発明はまた、有効量の本発明のワクチンを患者に投与することを含む、ヒトの 百日咳に対する免疫を誘導する方法を提供する。 ヒトに百日咳に対する免疫を誘導するために、このワクチンのｌまたはそれ以上 の投与物が通常投与される。 各投与物は、０．１〜２［ＤＩ、好ましくは０．２〜１ｍｌ、最も好ましくは０ ．５ｍｌである。 以下、本発明を図面及び実施例を参照してさらに詳しく説明する。 図面の説明 図１ プラスミドｐＰＥＲｔａｃｌ、２．３．４．７及び８Ｉａ、ＤＮＡ及びアミノ酸 配列は、それぞれ５ＥＱＩＤ　Ｎｏ・１及び２である。ｐＭＬＵ６由来のＡｖａ ［−Ｃ１ａ　ｒ　Ｉ　４９１　ｂｐフラグメントを、ｐＰＥＲｔａｃｌ中にクロ ーニングすることによって生成されるプラスミドＰＥＲｔ　ａ　ｃ　２゜ｐＰＥ Ｒｔａｃ４由来のＳｐｈ［−５ａｃ　Ｉ　Ｉ　８５１　ｂｐフラグメントを、ｐ ＰＥＲｔａｃ２中にクローニングすることによって生成されるプラスミドｐＰＥ Ｒｔ　ａ　ｃ　３゜ｐＭＬＵ６由来のＡｖａ［−Ｄｒａｌ［［１８７５ｂｐフラ グメントを、ｐＰＥＲｔａＣＩ中にクローニングすることによって生成されるプ ラスミドｐＰＥＲｔａｃ４゜ Ｉｂ、オリゴヌクレオチド１〜４（それぞれＳＥＱ　ＩＤＮ０：３．５．６及び ８）を、ｐＴＥＴｔａｃ２のＡｐａｌ及びＢａｍＨ［部位の間にクローニングし て、中間プラスミドｐＰＥＲｔａＣＩを生成する。オリゴヌクレオチドＩ及び３ の上に示されたアミノ酸配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：４及び７である。 ｌｃ、　オリゴヌクレオチド５　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：９）は、ｐＰＥＲｔａ ｃ４のＢｓｔＸ［及びＢａｍＨＩの間にクローニングされて、ｐＰＥＲｔａｃ７ を生成する。 Ｉｄ、オリゴヌクレオチド６及び７　（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０及び＋２）を、ｐ ＰＥＲｔａｃ　７　ノＢｇｌ［及ヒＢａｍ８１部位の間にクローニングして、ｐ ＰＥＲｔａｃ８を生成する。オリゴヌクレオチド６の上に示されるアミノ酸は、 ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：ＩＩである。図２ ａ、オリゴヌクレオチド８．９及び１ｏは、それぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３ ．１６及び１４でり、ＲはＧまたはＡを示し、ＹはＣまたはＴを示す。オリゴヌ クレオチド９はオリゴ８及び１０にアニールされ、次いで、ｐＰＥＲｔａｃ８の Ｂｇｌ［！及びＥｃｏＲ［部位の間にクローニングされ、形質転換体が提供され 、それから表現プラスミドｐＰＥＲｔａｃ３６が単離された。オリゴヌクレオチ ド１０の上のアミノ酸配列は５ＥＱＩＤ　ＮＯ：＋５である。 ｂ、　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１７として示される生体内の修復後の上記オリゴヌ クレオチドの上部鎖てあり、ＲはＧまたはＡを示し、ＹはＣまたはＴを示す。 ｃ、　ｐＰＥＲｔａｃ８中に存在する（ｂ）中の変更。 ｄ、　ｐＰＥＲｔａｃ３６中に存在する（ｂ）中の変更。 図３ ｐＰＥＲｔａｃ３６の誘導された培養物の抽出物のＳＤＳポリアクリルアミドゲ ル。 図４ ベクターｐＰ　Ｉｃ　３−６０５にの構造物。ｐＡＯ８０４のＡｓｕ［［及びＥ ｃｏＲＩの間の合成オリゴヌクレオチド（上方の鎖−３ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，１８ ，下方の鎖−８ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）のクローニングによって生成されるプ ラスミドｐＰＩｃＩ。 ｐＰＩｃｌから生成されるプラスミドｐＰｆｃ２゜アダプターオリゴヌクレオチ ド（上方の鎖−３ＥＱＩＤＮＯ・２０、下方の鎖−３ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１） を使用して、Ｂａｕ［−５ｐｅｌ切断されたｐＰＩｃ２中に、ｐＰＥＲｔａｃ８ の１　、　８　ｋｂＥｃｏＲ［−Ｎｈｅｌフラグメントを挿入し、表現ベクター ｐＰＩｃ３−６０．５Ｋか生成される。 図５ ベクターｐｐｒｃ３−６ｏ、５にのプラスミド地図かパートＡ中に示されている 。バートＢは、ｐＰＴＣ３−６０，５にの構造において使用されたＰ、６９遺伝 子のＤＮＡ配列の詳細を示す。使用されるＤＮＡフラグメントは、９３にプレカ ーサー遺伝子（チャールズら、１９８９、ｒＰＮＡＳ」　８６．３５５４〜３５ ５８）由来のＡｖａｌ　（ｎｔ、３１５）からＢｇｌｌｌ　（ｎｔ、１９７９　 ：ｌの領域を含む。 この領域は、ベクター１）　Ｐ　Ｅ　Ｒｔ　ａ　Ｃ８（マコフら、ｒＢｉｏ　／ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪ　、８　、　１９９０　、　１０３０〜　ｌ　０３３） に由来する示された配列か側部に存在する。ｐ６９遺伝子の側部に存在する配列 は、（左側）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２及び（右側）ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：２３ である。 図６ ＧＳ　１１５／ｐＰ　ＩＣ３−６０，５ＫＬイｕｔ’形質転換体のＤＮＡドツト プロットスクリーン。示されたフィルターは、５６の形質転換体、プラスの対照 （位置ＥＩＯ：＠のスクリーンにおいて同定された多重複製形質転換体「クロー ン２２」）及びマイナスの対照（Ｅｌｌ：ＧＳ　ｌ　１５）を有していた。スク リーン中のほとんどの形質転換体は、類似の弱いシグナルを与え、非常に小部分 か、多重複製の組込みを示す強いシグナルを与えた（Ａ３、Ａ４、Ｂａ：第３． ４及び１８と命名された）。 同様にしてさらに４つのフィルターをスクリーニングしたか、多重複製形質転換 体は見られなかった。 図７ ＨＩ５４ＤＮＡによりプローブされたｐｐｒｃ−６ｏ。 ５に形質転換体のサザンブロット抗原。トランクｌ−８１ｉＩＩＩ−切断された ｐＰ　ＩＣ−６０，５Ｋ　：　ｌ−ラック２−９５］１５ＤＮＡニドラツク３及 び８−単一−複製トランスプレースメント：トラノク４〜７−多重複製クローン 第３．４．１８及び２２゜ 図８ 誘導された草−一複製形質転換体（トラック５）及び多重複製形質転換体（トラ ック６〜９−それぞれクローン３．４．１８及び２２）に由来のタンパク質（３ ０ｇｇ）のウェスタンプロット。トラック１〜３は、全細胞タンパク質（０，３ ，０，６及び１．　５μｇ）の１．２及び５％に等しい量の純粋なボルデテラペ ルツソスＰ。 ６９を含み、トランク４はサイズマーカー（見えない）を含む。 図９ クローン２２の導入後の種々の時間に採取した発酵槽試料由来のウェスタンプロ ット（トラック１〜Ｉ２．それぞれ−１，、Ｏ１２，４，６，７５，２２，７５ ，２４゜７５．２７．７５．３０．２５．４９．２５．５７．２５．７１．２５ 時間）。トラックＩ３は、揺動フラスコ誘導由来のタンパク質の等しい充填量、 ５０ｍｇを含む。 トラック１４〜Ｉ８は、０．５．１．２．４及び８９６表現レベルに等しい純粋 なボルデテラペルツシスＰ、６９純枠なボルデテラベルツソスＰ、６９と比較し た可溶化されたＰ、６９調製物（トラック１〜３．２．５及び１０４ｍ）のクー マシーのブルー染色されたゲル。 実施例 実滝例に関する一般的な情報は下記の通りである：培地 ＹＰＤ、ｌｊｌ’：１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇグルコース。 ＹＮ白ＢＧ、ＩＡ　：　ｌ　３．４ｇ酵母窒素ベースｗ１０アミノ酸（ディフコ ）、０．４ｍｇビオチン、２０ｍｇグリセロール。 ＹＮＢＢＴＧＣａ　ｓ　：　ＹＮＢＢＧと同して１０ｇカザミノ酸を含む。 ＹＮＢＢＤ　：　ＹＮＢＢＧと同しであるか、２Ｏｎ＋１グリセロールの代りに ２０ｇグルコースを含む。ＹＮＢＢＭ：ＹＮＢＢＧと同じであるが、２０ｍ１グ リセロールの代りに５ｍｌメタノールを含む。ＹＮＢＢＤＣａｓ及びＹＮＢＢＭ Ｃａｓは、ｌｊ’当り１０ｇカザミノ酸を含む。 固形培地＝ｌｌ当り２０ｇの寒天か追加される。 実施例１：ポルデテラペルツシスの６９ｋＤａ抗原の生成Ｅ、ｃｏｌｉ中ての生 成 （ｉ）プラスミドの構成、中間プラスミドｐＰＥＲｔ　ａＣｌを、１ｍ１ｂに示 される４つのすりゴヌクレオチド（オリゴＩ〜４）を、ｐＴＥＴ　ｔ　ａ　ｃ　 ２　（７：７）ら、ｒＢｌｏ　／ＴＥｃｈｎｏｌｏｇｙＪ　、１９８９．７．１ ０４３〜１０４６）のＡｐａｒ及びＢａｍＨ１部位の間にクローニングすること によって構成した。プラスミドｐＰＥＲｔａｃ２．３．４．７及び８（図１ａ） は全て、種々のポルデテラペルツシスＰ９３コード配列フラグメントを、ｐＰＥ ＲｔａＣＩ中にクローニングすることによって構成された。ＰＯ２をコードする 配列を、下記の制限部位：Ａｖａ［（３１５）　、５ａｌｌ（１０６５）　、５ ｐｈｌ（＋２５０）　、Ｃ１ａ［（１８０６）　、Ｂｇｌ［（］　９７９）　、 ＢｓｔＸｌ　（２０５３）　、５ａｃｌ［（２１０１）　、Ｄｒａｌ［ｌ　（２ １９０）を使用して、ｐＭＵ６、ｐＢＰ　Ｉ　６０のサブクローン（チャールズ ら、ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ、１９８９．８６．３５５４〜３５５８）から得られ た。［カッコ内の数字は、ＰＯ２の文献に記載の配列中のヌクレオチド番号に対 応し、その一部、１８０４〜２２１７は、図１ａ中で再生される。］プラスミド ｐＰＥＲｔａｃ２は、ｐＭＬＵ６由来のＡｖａＩ−Ｃ１ａ［Ｉ　４９１　ｂｐフ ラグメントをｐＰＥＲｔａｃＩ中にクローニングすることによって生成され、プ ラスミドｐＰＥＲｔａｃ４は、Ａｖａｌ−Ｄｒａｌｆｌ　１８７５　ｂｐフラグ メントをクローニングすることによって生成された。 プラスミドｐＰＥＲｔａｃ３は、ｐＰＥＲｔａｃ４由来の５ｐｈｌ−５ａｃＴ１ ８５１　ｂｐフラグメントをｐＰＥＲｔａｃ２中にクローニングすることによっ て生成された。プラスミドｐＰＥＲｔａｃ７は、ｐＰＥＲｔａｃ４のＢＳｔｘｔ 及びＢａｍ８１部位の間に１本鎖のオリゴヌクレオチド（オリゴ−５、図１ｃ） をクローニングすることによって構成された。プラスミドｐＰＥＲｔａｃ８は、 図１ｄ中に示される１対のすりゴヌタレオチト（オリゴ６及び７）を、ｐ　Ｐ　 Ｅ　Ｒｔ　ａ　ｃ　７のＢｇｌｌ及びＢａｍＨ［部位の間にクローニングするこ とによって構成された。プラスミドｐＰＥＲｊａＣ２，３，４，７及び８及び高 表現の２つのシストロン誘導体（マコフ及びスマルウノド、１９９０）の表現生 成物の天然Ｐ、６９との移動度の比較は、Ｓｅｒ　６００におけるＰ、６９のＣ 末端と一致している（マコフら、１９９０、ｒＮｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　Ｊ　、Ｉ　８．１７１１−１−　７１８）。Ｐ、６９の表現を高めるために（ Ｓｅｒ６００て終結）、混合されたオリゴヌクレオチドオリゴ−９をオリゴ８及 び１０（図２）にアニーリングし、ｐＰＥＲｔａｃ８のＢｇｌｒｆ及びＥｃｏＲ １部位（どちらもオリゴ１及び２に源を発する（図１ｂ））の間にクローニング した後に得られる多数の形質転換体から、プラスミドｐＰＥＲｔａｃ３６は単離 された。全てのオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、キナーゼ処理し、文献記 載の方法により配列を確認した（マコフら、ｒ　Ｂｉｏ　／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ」、１９８９．７．１０４３〜＋０４６）。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＭ２９４　（ メセルソンら、ｒＮａｔｕｒｅＪ　、１９６８．２１７．１１１０〜１１１４） を全体を通して使用した。 （ｉｉ）表現されたタンパク質の誘導及び分析二表現プラスミド、ｐＰＥＲｔａ ｃ３６は、Ｉａｃｌ遺伝子の機能性複製を含み、従って、イソプロピル−β−Ｄ −チ才ガラクトビラノンド（Ｉ　ＰＴＧ）により誘導されることができる。ｐＰ ＥＲｔａｃ３６を含むＥ、ｃｏｌｉＭＭ　２９４の培養物をＬブロス中で一晩生 長させ（マニアチスら、ｒＭ。 １ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　：　Ａ　（実験マニュアル、１９８２、 コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−）、７５μｇ／ｍ１ｌＰＴＧを含む新 鮮な培地中で１７５に希釈した。 細胞を、素速く通気しながら４時間さらに生長させ、遠心分離（１０，０００ｘ ｇ、１０分）により採取した。 ６９ｋＤａ抗原は、精製された抗原に対するラビット中に生したポリクローナル 抗血清を使用してウェスタンプロットにより検出された。表現のレベルをジョイ スーレブルクロモスキャン３（マコフら、ｒ？＃ｕｃ１．Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　Ｊ　。 １９８９．１７．１０１９１〜１０２０２）を使用して、５ＤＳ−ポリアクリル アミドゲルのデンシトメーターの走査により定量した。これによって、ｐＰＥＲ ｔａｃ３６は３６４０±４．８％と決定された（マコフら、ｒＢｉｏ　／Ｔｅｃ ｈｎｏ［ｏｇｙＪ　、Ｉ　９９０．８、ＩＯ３０〜１０３３）。（ｉ　ｉ　ｉ） 再生及び精製・遠心分離後に、細胞ペレットを、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ５ｐＨ ７，５，５０ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液中に再懸濁し、フレンチプレッシャーセ ル（１５，０００１ｂｉロー２）を２回通すことによって溶解した。溶解物のペ レット画分を１％トリトンＸ−１００を含む緩衝液（Ａ）（５０ｍＭトリス−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ８゜０．１００ｍＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ）中で洗浄した。不溶 性物質（はとんとか封入体として不溶性６９ｋＤａ抗原を含む）を遠心分離によ り回収し、６Ｍ塩塩酸グアジノニウムＧｕＨＣＩ）を含む緩衝液（Ａ）中に再懸 濁することによって可溶化した。タンパク質溶液を６Ｂ／ｍｌに調整し、希釈す ることによって、ＧｕＨＣＩ濃度をＩ　Ｍに減少させた。６９ｋＤａ抗原溶液を 、透析バッグ中に入れ、緩衝液（Ａ）に対して３回の変更により４°Ｃて２４時 間透析してタンパク質を再生した。（マーストン、　ｒＢｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、」 、＋　９８６．２４０５．１−１２を参照。）透析により表われた不溶性物質を １０，００ＱＸｇで１０分間遠心分離することにより除去した。 図３は、可溶化操作中における、ｐＰＥＲｔａｃ３６の誘導された培養物の抽出 物の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＩＯ９６）を示す。レーンＩ、全細胞抽 出物；レーン２、第１上清画分：レーン３、第１ベレツト画分：レーン４、トリ トンＸ−１００洗浄上清画分：レーン５、ＧｕＨＣＩ中の可溶化及び透析による その除去後の全画分；レーン６、透析後の上清画分：レーン７、透析後のペレッ ト画分。サイズマーカーはｋＤａで示される。 可溶性６９ｋＤａ抗原調製物をさらに、Ｑ−セファロース上でのイオン−交換ク ロマトグラフィーによって精製した。試料を５０ｍｇ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ８， ０におけるカラム上に充填し、洗浄し、抗原を０−０．４ＭＮａＣ１勾配により 溶離した。この精製された物質は、カブトガニアメーバ細胞溶解物アッセイによ り、タンパク質１μｇ当り０．１工ンドトキシン単位未満を存していた。ビチア バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　）の生成（ｉ）表現ベクターの 構造、寄託番号第４０２７０号を与えられて１９９０年３月３０日に英国スコツ トランド、Ａ３９８ＤＧ、アバディーン、エイビーロート、１３５、Ｐ、０．ホ ックス３１のナショナルコレクンヨンオブインダストリアルアジトマリンバクテ リアリミテッドに寄託され、ｐＡｏ　８０４　（Ｋ、ストリークリシュナら、ｒ ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ、ｌ　９８９．２８．４１１７〜４１２５）に由来 するベクターｐＰＩＣ３−６０，５Ｋを、ピチアパストリス中の６９ｋＤａ抗原 の細胞内表現のために使用した。このベクターは、ＡＯＸＩ遺伝子に由来のプラ スミドを使用して表現を駆動し、宿主染色体ＡＯＸＩ遺伝子座中に組込むことか できる。６９ｋＤａ抗原をコードする遺伝子の挿入を促進するために、図４中に 示される合成オリゴヌクレオチドをｐＡｏ　８０４のＡｓｕｌｒ及びＥｃｏＲＩ の間にクローンして、ｐｐｒｃ＋を与えた。次いて、ＥｃｏＲ１部位を欠くプラ スミドの誘導体、ｐｐ　ＩＣ２を構成した。これは、ＥｃｏＲＩによる消化の後 に、突出１本鎖の末端にＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントを充填し 、プラント末端と連結することによって行われた。６９ｋＤａ抗原をコードする 遺伝子のほとんどを含むプラスミドｐＰＥＲｔａｃ８由来の１　、　８　ｋｂＥ ｃｏＲ［−Ｎｈｅ　Ｉフラグメント（図５参照）か、図４に示されるアダプター オリゴヌクレオチドを使用して、Ｂａｍｆ（ｌ−５ｐｅ　Ｉ切断され１こｐＰＩ Ｃ２中に挿入され、ｐＰｒｃ３−６０．５Ｋを与えた。これらのオリゴヌクレオ チドは、イニノエーター、へＴＧフトンを含む遺伝子の５′末端をコートする。 （１１）形質転換、クレングらによるｒＢｉｏ／’Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ 　９８７．５．４７９〜４８５に記載のスフ７０ブラスト方法を使用して、ピチ 了パストリス株ＧＳＩ＋５　（ｈｉｓ　４”）を、ｐＰＩｃ３　６０．５Ｋｉ： より形質転換した。形質転換体をヒスチジンを欠く最小培地上で再生し、それに より旧Ｓ゛コロニーか選択された。形質転換ＤＮＡは、Ｂｇｌｌｌ−消化された ｐＰＩＣ３−６０，５ＫＩＯまたは２０μｇであった。この消化物は、２つのＤ ＮＡフラグメントを含み、その１つ（７，２ｋｂ）は一方の端部にＡＯＸ　Ｉ配 列を有し、それにより、それは標的とされてそこで組込まれ、染色体ＡＯＸＩを 置換（トランスプレース）する。 生成されるＨｉｓ＋形質転換体は、主に非分裂ＡＯＸＩを含むことか判明してお り、トランスプレースメント（ａｏｘｌ）は、その池のスクリーニング方法を使 用して単離されることかできる。トランスプレースメントは、メタノール上での 生長か遅いことで同定されることかできる（Ｍｕｔ　”表現型に対するＭｕｔ　 ｓ）。この形質転換体は、再生プレートから直接採り出して最小メタノールプレ ー）（ＹＮＢＢｆｖｆ寒天）上での成育を試験することかできる。代替的に、再 生上部寒天を取上げて、水中で均質化して、この酵母細胞を、プレートに最小グ ルコースプレート（ＹＮＢＢＤ寒天）上でプレート当り約３００コロニーとなる ようにプレート上にのせることかできる。 次いて、Ｍｕｔ　ｓコロニーを、最小メタノールプレート上てシブ１１力培養す ることによって同定される。一般的に、Ｍｕｔ″の比率は、全形質転換体のＩＯ 〜２００６であることつ１判明している。ときおりＭｕｔ　”形質転換体はＭｕ ｔ　’として計測され、これらはベクターの多重複製を含むことを証明すること もてきる。（ｉｉｉ）スクリーニング　多数の形質転換体を迅速にスクリーニン グするために、これらを９６−空間滅菌微滴定プレート（ＮＵＮＣＬＯＮ）中の 個々のウェル中で成長させた。各ウェル中のＹＰＤブロス２００μｍにＭｕｔ　 ’形質転換体を植菌し振動を与えずにこのプレートを３０°Ｃて２日間インキュ ベートし、成長か定常期に達していることを確認した。 各微滴定プレート上に、ＧＳＩ］５（負の対照）を含むウェル及び知られたｐＰ Ｉｃ３−６０．５に組込み体（正の対照）を含むウェルか含まれていた。多重チ ャネルビペ７・ト器具（ティターチック）を使用して、各微培養物の試料５０μ ｍを、ノユライヒャー及びシュエルの「マニホールドｊ上のニトロセルロースフ ィルター上に、真空下で転移した。このフィルターを空気乾燥し、方向付のため にマークし、次いて下記の方法により処理して細胞を溶解した：　（ｉ　）５０ ｍＭＥＤＴＡ、２．５９６２−メルカプトエタノール、ｐＨ９，０により室温で １５分間、（ｉｉ）水中１ａ＋ｇ／ｍ１発酵溶解物（１００Ｔ）により３７°Ｃ て４時間、（ｉ　ｉ　ｉ）０．１？ｖｆＮａｃＩ、１．５ＭＮａＣ，ｌ中て室温 て５分間及び（ｉｖ）２ＸＳＳＣ中で室温で５分を２回。各処理は、３ＭＭ紙２ ノートを前記容器で浸漬し、ニトロセルロースフィルターを上部上に置くことに よって行った。これらの処理の後、このフィルターを８０°Ｃて１時間焼いた。 このフィルターを、ランダム開始された標識（ファイノハーグら、　ｒ、Ａｎａ ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｖ　、Ｉ　９８９、＋３２．６）　〜１３）を使用して、高特 異的活性に放射能標識された６９ｋＤａ抗原特異的ＤＮＡを用いて、サザンハイ ブリット形成により調べた。予備ハイブリット形成、ハイブリット形成、洗浄及 び放射能写真撮影は標準方法を使用して行った。 図６は、ソノようなｐＰＩｃ３−６０．５Ｋ（７）２００より多いＭｕｔ“形質 転換体のスクリーンの結果を示す。 全ての形質転換体は、プローブと反応し、はとんとか類似の弱いシグナルを与え た（単−一複製形質転換体）。 しかしなから、非常に小さい比率のものは、例Ａ３及び４のより強いシグナルを 与えた。これらの多重複製形質転換体をさらに試験した。示されるフィルター中 の正の対照は、多重複製としてすてに同定された形質転換体である。 ドツトプロットにより同定された２つの選択された単一複製トランスプレースメ ント及び４つの多重複製形質転換体由来のＤＮＡを、さらにサザンプロットによ り分析した。ツヤ−マン、Ｆ、ら（ｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＹｅａｓｔＧｅｎ ｅｔｉｃｓ　Ｊ　、Ｉ　９８３、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ−） によって、ＤＮＡをビチア細胞の培養物５０ｍ１から製造した。Ｂｇｌ［＋消化 物を０．６９６アガロースゲル中で分離し、サザンブロットによりニトロセルロ ースに転移し、放射能標識された旧５４ＤＮＡとハイブリット形成した（図７） 。Ｂｇｌ［［切断されたベクター、ｐＰＩＣ３−６０，５Ｋに関して、表現カセ ットに対応する７、２）［ｂバントか観察され、それにより、非形質転換された 株Ｇ５１１５か、染色体２．　７ｋｂＨＩＳ４フラグメントを与えた（トラック ２）。単一の形質転換体がこれらのハントを与え（トラック３及び８）、一方、 多重複製形質転換体の２つか増加した強度の７．２ｋｂハントを存し、表現カセ ットの多重挿入を示唆している（トラック４及び５）。その他の２つの多重複製 形質転換体は、７．２ｋｂハンドを全く示さず、Ｂｇｌ［［部位を欠く多重結合 の高い分子量のバンドを示した。 （ｉｖ）タンパク質分析　選択された形質転換体を３０°Ｃて２日間ＹＮＢＢＧ Ｃａｓ中で培養して、定常期に達した。これらの出発培養物を、新鮮なＹＮＢＢ ＧＣａｓ５ｍｌ中の０．２５のＯＤ　、、、に希釈し６時間成長させた。 これらの培養物を誘導するために、細胞を遠心分離によって収集し、滅菌水中で １度洗浄し、ＹＮＢＢＧＣａｓ中に再懸濁した。誘導は３０℃で２日間行った。 　細胞を低速遠心分離により採取し、水中で１度洗浄し、その０．５ｍｌを水冷 破壊緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，０，１０６トリトンＸ− １００，４ｍＭ　７　二二ルメチルスルホニルフル才リド）中に懸濁した。酸洗 浄されたガラスピーズ（０，４５ｍｍ）を添加し、激しく渦巻き状に回転して破 壊した。抽出物のタンパク質濃度を、バイオラッドのタンパク質７ソセイ（バイ オランド、製造者の支持に従って）を使用して測定し、この物質を一２０°Ｃて 保存した。 タンパク質を、７．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（レムリＵ、に、　、 　ｒＮａｔｕｒｅＪ　、Ｉ　９７０．２２７・６８０〜７８５）中の電気泳動に より分離した。このタンパク質をクーマン−２のブリリアントブルーＲによるゲ ル染色により可視化した。代替的に、このタンパク質をニトロセルロースフィル ターへ転移し、６９ｋＤａ抗原特異的モノクローナル抗体ＢＢＯ５（モンタラズ ら、ｒ　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　Ｊ　、１９８５．４７．７４４〜 ７５１）と反応させ；ブダペスト条約の合意に従って、１９９０年２月１日に受 託番号第９００２０１０３号で、ヨーロビアンコレクションオブアニマルセルカ ルチャーズにおける英国ウィルトシャイアー、サリスベリー、ポートンダウンの ＰＨＬＳパブリックヘルスラボラトリ−サービスセンターフォーアブライドマイ クロバイオロジーアンドリサーチに寄託し、次いてヤギ抗マウスＩｇＧによって 、ホースラディツシュペルオキシダーゼに接合し、Ｈ２Ｏ２及び４−クロロナフ トール（バイオラッド）で展開した。このようにして、表現された６９ｋＤａ抗 原を特異的に検出することができた。 図８は、４つの選択された多重複製形質転換体（クローン第３．４、ｊ８及び２ ２号）及び】の典型的単一複製形質転換体の誘導された抽出物のウェスタンプロ ットを示す。標準濃度の純粋な６９ｋＤａ抗原と比較することによって、単一複 製トランスプレースメントは、全細胞タンパク質（ｔ、　ｃ、　ｐ、　）の０． 　１−０．　５％において６９ｋＤａ抗原を表現し、クローン第２２号は約２％ において、クローン第４号は約５％において表現することを推定することかでき る。これらのレベルは、最適下限の誘導条件である。発酵槽誘導において、５倍 の改良が】０％ｔ、Ｃ，ｐ、に対してクローン２２において見られた。しかしな がら、Ｍｕｔ　”であることが判明したクローン４は、発酵槽中て６％ｔ、ｃ、 ｐ、で残存していた。 低表現形質転換体において、６９ｋＤａ抗原は非常に可溶性で、一方、高表現に おいて、それは主に（９０％）不溶性である。この物質は容易に単離されること ができるので、不溶性の両分から復元されて精製されることが好ましい。 （Ｖ）発酵：高細胞密度のピチアパストリス培養物による６９ｋＤａ抗原の生成 を、ｐｌ、溶解された０２、撹拌速度、温度及び空気流のモニター及び制御装置 を備えた２Ｌのブラウン発酵槽中てクローン２２を使用して実施した。ＹＮＢＢ ＧｌＯｍｌの一晩の培養物を使用して、５×基礎塩（リン酸、４２　ｍｌ／　Ｌ 　；硫酸カルシウム２　）＋２０．１．８ｇ／Ｌ；硫酸カリウム２８．６ｇ／Ｌ ＋硫酸マグネシウム７Ｈ２０，２３，４ｇ／Ｌ；水酸化カリウム、６．５ｇ／Ｌ ）ＩＬとＰＴＭ、塩（硫酸第２鋼５Ｈ２０，６ｇ／Ｌ、ヨー化カリウム、０．０ ８ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウムＨ２０，３ｇ／Ｌ：モリブデン酸ナトリウム、０． ２ｇ／Ｌ＋硫酸第１鉄７Ｈ２０，６５ｈ／Ｌ　；ビオチン、０．２ｇ／Ｌ：硫酸 ５ｍｌ／Ｌ）４ｍｌ及び５％（ｖ／Ｖ）グリセロールを３０°Ｃにおいて含む発 酵槽に植菌した。溶解された酸素を、通気及び撹拌により２０％より高く維持し 、ｐｌを５０％（Ｖ／Ｖ）水酸化アンモニウムを添加することによりｐＨ５，０ に維持した。グリセロールが排出されるまで成長を続けた（２４〜３０時間）。 制限されたグリセロール流（５０９６ｗ　／　ｖグリセロール及び１２　ｍｌ／ 　Ｌ　Ｐ　Ｔ　Ｍ　ｒ塩を含む）を１２ｍ１／時間で、１７〜２１時間開始した 。この期間の後、グリセロール流をメタノール流（Ｉ　Ｏ０９６メタノール及び １２ｍ１／ＬＰＴＭ、塩）にｌ　ｍｌ／時間で２時間置換することにより培養物 を誘導した。次いて、メタノール流速を、６時間かけて６　ｍｌ／時間まで徐々 に増加させ、発酵を、このような条件を使用してさらに４０時間続けた。この時 にメタノール流速を２ｍ１７時間にまで減少した。 次いで、誘導の後の種々の時間において試料を発酵槽から採取し、上記に記載の ようにして６９ｋＤａ抗原表現を分析した。ウェスタンプロット分析の結果を図 ９に示すか、約１００６の細胞タンパク質の６９ｋＤａ抗原のレベルが達成され たことを示唆している。 （ｖ　ｉ）変性：　ＯＤｇｏｏ　２００における細胞３０ｍ１を含む、誘導開始 ２８時間及び３２時間後の発酵槽試料をプロセシングのために集めた。細胞を低 速遠心分離により採取し、水中で１度洗浄し、次いで１９６トリトンＸ−１００ を含む緩衝液Ａ（５０ｍｌｈリスｐＨ８，０，０，１ＭＮａＣｌ、１ｍ１ＥＤＴ Ａ）により３０ｍＩとした。次いてこの細胞を０．４５ｍｍのガラスピーズを存 するビードビータ−（バイオスペックプロダクツ、パードルスピル、０、に、’ ）中で１０回の１分間パルスで破壊した。細胞溶解物を、１５，０００で３０分 間遠心分離することにより清澄化した（ソーベル、ＲＣ−５Ｂ、５Ｓ−３４回転 装ｆｉり。ペレットを緩衝液水中に懸濁することにより洗浄し、再遠心分離した 。不溶性タンパク質のベレットを　、緩衝液Ａ（６ｍｌ）及び７．０Ｍ塩化グア ニジニウム７．０Ｍ中に再懸濁し、５０ｍＭトリスｐＨ８，０、Ｉｎ＋ＭＥＤＴ Ａを可溶化タンパク質に添加した。この溶液を、さらに７〜ｆ塩化グアニジニウ ムにより希釈して］ｌ０ｍ１とし、緩衝液Ａ５Ｌに対して４°Ｃで大量に透析し た。次いて、透析バッグ中の物質を　遠心分離により清澄化した（４０分、１０ ，０００ｒｐｍＳＲＣ−５８，５Ｓ−３４回転装置）。可溶化された６９ｋＤａ 抗原を含む最終上清を固形セファデックスＧ−１００に対する透析によって濃縮 した。この手順の各段階に由来する両分の相当量を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、次いて ウェスタンプロットにより分析した。得られた結果により、６９ｋＤａ抗原の約 ５０％か特定の実験において可溶化されたか、その全ては透析の後に可溶性のま までいることか示される。クーマシー染色されたゲルは、最終物質の純度か高い （６０〜７００６　：図１０）ことを示した。 実施例２　トモノイド化されたＬＰＦの調製及び不活化ホルデテラペルツノスの 培養物は、ヘプタキス−（２，６−０−ジメチル）−β−シクロデキストリン（ ＭｅＢＣＤ）を補給された修正されたステイナー−ショルテ培地において、フラ スコまたは発酵槽内て生長することかできる（イマイズミら、ｒ［ｎｆｅｃｔ、 ｌｎｍｕｎ、　Ｊ、１９８３．４１：ｌｌ３８〜！１４３）。ＬＰＦは、ヒドロ キシアパタイトアガロース（サトら、ｒｓｅｍｉｎａｒｓｉｎ　Ｉｎｆｅｃｔｉ ｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ、ｌ　９８２、ｖｏｌ　［ＶＪ　３８０〜５、ニューヨ ーク州スリームーストラットンインコーポレイテッド）上のカラムまたはパンチ 吸着により、培養上清から精製されることができる。このヒドロキシアパタイト は、最初に０．０１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ８，０により平衡化される。次いで、 培養上清をカラムに与えて、その？！１０．Ｏｉ１リン酸塩緩衝液ｐＨ６，０に より洗浄されることができる。ＬＰＦの溶離は、ＮａＣｌ０．５ｍを含む０．ｉ ｆリン酸塩緩衝液ｐＨ７，０を使用して行われる。ＬＰＦは、さらに、例えばハ プトグロビン−セファロース４Ｂカラム（イマイズミら、「［口ｆｅｃｔ　＆Ｉ ｍｍｕ旧、１９８３．４１．１１３８〜１１４３）上で精製されることかできる 。　ＬＰＦの精製された調製物の不活化または「トキソイド化Ｊは、ホルムアル デヒド、グルタルアルデヒド、過酸化水素若しくはホルマリン（サトら、　ｒＬ ａｎｃｅｔＪ　、ｌ　９８４、（１）、１２２〜１２６）またはこれらの試薬の いずれかの組合せのような種々の異なる不活化剤を使用して実施することかでき る。 実施例３：ケントリック試験における生物学的効能この試験は、１４〜１６ｇの 異系交配されたＮＩＨ−Ｓマウス（ＯＬＡＣ、カテゴリー３、Ｂ、　ｂｒｏｎｃ ｈｉｓｅｐｔ　ｉｃａを含むほとんどの病原を持たない）を使用して、百日咳ワ クチンについてのＷ、　Ｈ，Ｏ，の要件に従って行った。 ０．５ｍｌ容量の抗原を、混合物として腹膜内に接種し、上部希釈及び３つの３ 倍連続希釈を含んでいた。２週間後に、マウスに、推奨された攻繋株１８−３２ ３　（〜４００ＬＤｓ。）を使用して、大脳内に攻軍した。平衡線プロビット分 析のプログラムを使用して、ブリティッシュ百日咳参照ワクチン６６　／　８４ 　（ｒＪ、　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄ　Ｊ　、Ｉ　９８１．９． ３５１〜３６５）に関して相対的効能を算出した。この結果を表１．２及び３中 に示す。これらのデータの例は、ワクチンとして単独に使用される場合の６９ｋ Ｄａ抗原またはトキソイド化されたＬＰＦの限定された保護を示す。対照的に、 ６９ｋＤａ抗原及びトキソイド化されたＬＰＦの組合せは、全細胞参照ワクチン に非常に類似したレベルの保護を生じさせる驚くべき相乗効果を示す。 表土 番号　名熊μ般朋　生存 投与晴　雄　雌　全体 １　６９ｋＤａ　（Ｅ、ｃｏＬＬ）　希釈なし　１／９　０／９　１／ｌ１１８ ０μｇ　１／４　０／９　２／９　２／１ｌ１１／３２　０／９　０／９　’０ ／１８２　参照ワクチン　希釈なし　７／９　６／９　１３／１８１／４　１ａ ／９　ｋ１９　８／１８ １／１６　３／９　２／９　５／ｌ１１３　攻撃　希釈なし　Ｏ／９　０／９　 ０／１８１／２５０　１／９　１／９　２／Ｌ８１／１２５０　２／９　１ａ／ ９　６／１８λ１ 番シナ　名−祢微び説明　生ケ 投’ｊ！：ｉ　雄　雌　全体 １１−−１−　ソイドｕｇ　ＬＰＦ　希ｙｌ、Ｈし　３／９　７／９　１０／１ ８１／１６　０／９　０／９　Ｑ／Ｌ８ ２トキソイド５μｇ　ＩＪ’Ｆ希釈なし　９／９　８／９　１７／１８１／４　 ３／９　５／９　ｇ／１８ ６９ｋｆｌａ　（Ｅ、ｃｏＬＬ）　１／１６　Ｌｉ２　０／９　Ｌ／１８２０ｐ ｇ　１／６４　０／９　０／９　０／１８３　参照ワクチン　希釈なし　６／９ 　９／９　１５／１８１／１６　０／９　１／９　１／ｌｉｌ＋１／６／ａ　Ｏ ／９　１／９　１／１８４　攻撃　希釈なし　Ｏ１５０１５０／１０濤ユ 番号　名称−及Ｕ−紀４　患在 役′テ植　雄　雌　全体 １トキソイド２０μｇ　ＬＰＦ　希釈なし　４／９　４／９　８／１８Ｌ／４１ ／９　２／８　３／１７ ２トキソイド２０μｇ　ＬＰＦ　希釈なし　８／９　７／９　１５／１８６９ｋ Ｊ）ａ　２０μｇ（Ｐｉｃｈｉａ）　１／１６　０／９　３／９　３／１８３　 参照「ワクチン　希釈なし　７／９　８／９　１５／１８４　攻撃　希釈なし　 ０１５　０１５　０／１０配列表 ｔｌｌＳＩ：、ＱＩＩ）　ＮＯｌニｌｌ！ｌｌする情報：（ｉｉ）ｉα１の１ｉ ＩＩ類：ＤＮＡ （ｘ　ｉ　）　ｋＪ’？＞記ｄ：ｓＥＱ　ＩＩ）ＮＯ：Ｉ：（２）　ＳＩ’：Ｑ Ｉ　ｌ）　Ｎｏ　：　２１．−Ｍ４ル情？ｖ：（ｉｉ）配列のＩ４を司：ペプチ ド （Ｘｌ）内ピタ１０）社不：５ｌ−ＱＩｔ）ＮＯ：２：（対）　配列の記述＝９ ηＩＤ？す：２；ＬＦ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏに、ａ　Ｐｒｏ　聯Ｐｒｏ　Ａ ｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇ］、ｙ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｎ　Ｐｒ。 Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ａｌａ　Ｆ’ｒｏ　Ｊｕａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　ＰｒB Ａｈａ　Ｇｌｙ　Ａｒｑ　ＧＬｕシｍ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓ ｎにＬａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　’Ｉｈｒ　ＧｌｙＳａｒ　第Ａｒｑ　Ｌｍ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ−Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ 　Ｇｌｙ　ＡｌａＴｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｒ　Ａ ｒｑ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　ム担Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　Ａｌａ　Ｇｌｙｌｏｏ　 １０５　１１０ （’）　Ｓｌ：Ｑ　ＩＩ）　ＮＯ：３１．Ｊｔｌ−る情報：（ｉｉ）ｆｌｌクリ Ｍｊ二Ｉ）ＮＡ （ｘｉ）＾ｆｆ１ｌ１７）記述：ＳＥＱ　Ｉｔ）　ＮＯ：３：（７１８，二ＣＪ 　ＩＩ）　ＮＯニアに関４るｔｌ’１ｔｌｌ：（ｉｉ）１％列の挿幣：ベゾチド （ｘｉ）配列の記４：ｓ１：、Ｑ　Ｉｔ）ＮＯニア：Ｐｒｏ　Ｇｕｙ　Ｔｙｒ　 Ａｔｇ　ＬＩｌ？ｕ　Ａｌａ　ｊｕａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｎ　Ｔｒｐ　５ｅｒ−Ｖａｌｌ　５　１０　１５ Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＩＦ　Ａｌａ　Ｐｒｃ＋　Ｆ’ｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ 　Ｐｒｏ　Ａｌａ（８）　Ｓｌ：、Ｑ　ＩＩ、ｌ　ＮＯ：８にｌ１ｔｌｔ’Ｉｔ ■報：（爾）配列の挿司：１）ＮＡ （ｘ　ｉ）　／ｋｆｆ’ｊメツ′Ｍ山杢：　５ＩＥＱ　ｌ　ｌ）　Ｎｏ　二８　 ：（９１５ＥＣ）　ＩＩ）　ＮＯ：９１こ１１１１１１−６ｆｌ’１％ｆ：（ｉ 　ｉ）配列の欅司：ｌ）ＮＡ （ｘｉ）配列の記述：５ＩＥＱ　Ｉｔ）ＮＯ：９：αχ工八へ’ｍ工Ｔ＾Ｃ− （１０）ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　ｌ０１３１−’清Ｒｆ：（ｉ　ｉ）醇勅挿旬： Ｉ）ＮＡ （ｘｉ）静則〆：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１０　：（１１ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ（］ ：　ＩＩ　Ｉｌ：ｊｔｌｔ６ｆＩ？？ｖ：（ｉｉ）配列の挿司：ペプチド （ｘｉ）＾ｌρμリルム杢二ＳＥＱ　ＩＩ、ｌ　ＮＯ：ＩＩ：Ａｌａ　Ａｌａ　 Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｍ　Ａｌａ　Ｓ ａｒ　Ｔｈｒ　１ｍ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒｌ　５　１０　１５ （１２）　ＳｌζＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２に関する情報：（爾）醪ゆ鴫：１）ＮＡ （ｘ　ｉ）配ｆり記−：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ２：π迫■Ｄ込ａ１ｕπｍ詰α スαスＯヱエαＬＭαπＩ’ｌＸ藁に＾ユαスπ！石Ｍテ習Ｕざ　ωＴへα刀ス にびＣんν了０ごひＧ 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【Ｃ７５ （１９Ｓｌ＞Ｃ）　Ｈ）　ＮＯ：１９１ユＩＩＨる情報。 （爾）酊勅闘：　ＤＮＡ （ｘｉ）配！１の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＋９：＋２Ｏ５ＩＥＱ　ＩＩ）　 ＮＯ：２０に【刺−る情報：（爾）配列の哨：Ｉ）ＮＡ （ｘｌ）配列の記ｉ＝＋ｓ＋シ（Ｊ　ＩＩ）　ＮＯ：２０：Ｇ咽て℃んν（ＣＮ バχ込Ｃ■疋込ＡＣＡＡＣＣＡＡＴＣＣｕてＣバフｖＧＡＯ工℃ｒ］υ函ＧＡＣ ＡＡＣＡＯ１２１−６０（２１）ＳＩうＱ　ＩＩ）　ＮＯ：２１に慣１１−る情 報：（ｉｉ）配列の祠：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１：σロＴχτＭ℃バＲＯコ１ｊ ＴＱ万Ｔ￥ｎびＧａＣ丁■テχ℃ａＣ丁ロυ■λＮ汀ワエＴフＡ　６０（２２） 　ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯ：２２に閏４る情報：（爾）配列の喚：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２：ｆｉ！（、Ａ！　２Ｂ （２３）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３に七Ｈ゛る情報：（旨）＾アｍｆｅ！ｉ　 ：　Ｉ）Ｎ　Ａ（ｘｉ）Ａ’ＪＩｋｎｙ５ピ！：Ｓｌ＞（Ｊ目）ＮＯ：２３：α ΣＭαに■Ｃ口τ品ＣＡＣπｇ石ひ４℃０丁にａ端ｑλゴロワ田ａスα制ｎ品　 ６０πＩＭのχＭンフ」ボッ１ズＨυαコゴχＺ　９０第÷図 第Ｓ図 ５“ＲＩ　Ｌ　８ｇｌ　１−１９７９シａｈｈｎｃ＾ｃＡｎｃｈａｃＧｒｒｃｒ ａＡでで７マダシ５−−−ｏ６９　−一−゛で５＝で挙に】３＝で９二＾ａｃｒ ａ丁ｒ＾＾ｃ＊ｃ＝| −ＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＣＴＴＧＣ＾＾ＱＴＡＣ丁ＣＴＧＴＧＧＴＡＣＧＣ ＴＧ＾＾ＴＣＴ＾＾ＴＣｉＣＡＴＴＡＴＣＴＴＡＡＧＧＡＴbＣεＳココシ２Ｓ Ｎｈ＠１ 第６図 第７図 １　ｗ　ｇ　６＠　ｍ　ｗ　ｍ　ｗｅｔ７ｋｂ　ｊ ゛　１ ７２３ｆ＋５６　り　８ 第９図 第７０図 手続補正書（睦） １−事件の表示 無細胞ワクチン メデバ　ホールディンゲス　ベスローテン　フェンノートシャ・ノブ４、代理人 ５、補正命令の日付　二ニー ６、補正により増力口する請求項の数 ７−補正の対象 明細富、請求の範囲及び要約書間訳文 国際調査報告 ｌｌ１一時一−＾、１ｌＩｉｌＩＬＫゴ／Ｇｅｌ　９１１０１６６９１．１．ｆ １ｍ１ｍｍＡｒｍｌｃｓ＋１ｍ１ｌａ、ＰＣＴ／ＧＯ９１１０１６６９国際調査 報告 ：＋ｗ＝’：ｖ′：、’ｃａｔＩＮＳ’ｍ“＋６１＋ｗ？：；；；、二；＝？＃ １Ｍｌ０フ：ｃ＊７ｏｐフａｅ二＝；°゛゛“ｅｌｍｊｌｍ撃香g−：Ｉ°１７ Ｔｏｆ７ｉ”””ｈｍ−Ｔｈ＋１９％＠＠Ｐｓ呻−噌ｍｌｋｍＩｓｋｍ＋ｅｙｍ ｕｍｌｙ＋ｌｖｍｅｅＨ醗ｃ替１書＋ｑｗｋｋｋａｒｅ−智■１醗Ｙ嘗−ｋｖｔ Ｍｎ秩|Ｑ１ｍｍｌ＊ｋｙ１＾−一一一一 フロントベージの続き （７２）発明者　フェアーウェザ−、ネイル　フレイザーイギリス国ピーアール ３３ビーニス　ケント、ベツケンハム、ラングリイ　コート（番地なし）　ザ　 ウェルカム　ファウシアーンヨン　リミテッド　気付

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ボルデテラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の６ ９ｋＤａ抗原とボルデテラペルツシスのトキソイド化されたリンパ球促進因子と の相乗的組合せ物を含むワクチン。
2. ２．６９ｋＤａ抗原が、組換えＤＮＡ技術を使用して得られた請求項１に記載の ワクチン
3. ３．リンパ球促進因子が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過酸化水素 またはそれらの組合せから選択される不活化剤を使用してトキソイド化された請 求項１または２に記載のワクチン。
4. ４．６９ｋＤａ抗原とトキソイド化されたリンパ球促進因子の重量比が、約１： １である請求項１〜３のいずかに記載のワクチン。
5. ５．さらに、非経口投与に適した薬学的に許容され得る液体賦形剤を含む請求項 １〜４のいずれかに記載のワクチン。
6. ６．抗原タンパク質の濃度が、０．０３〜２ｍｇ／ｍｌである請求項５に記載の ワクチン。
7. ７．さらに、佐剤を含む請求項１〜６のいずれかに記載のワクチン。
8. ８．さらに、ボルデテラペルツシスのその他の抗原またはジフテリア若しくは破 傷風の抗原を含む請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
9. ９．ボルデテラペルツシスの６９ｋＤａ抗原とボルデテラペルツシスのトキソイ ド化されたリンパ球促進因子とを、その相乗的組合せを与えるような量で混合す ることを含む請求項１に記載のワクチンの製造方法。
10. １０．有効量の請求項１〜８のいずれかに記載のワクチンを投与することを含む ヒトの患者に百日咳の免疫を誘導する方法。