JPS6147419A - 尿路感染症のための合成ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトまたは動物を、尿路感染症に対して免疫
する方法に関するものである。更に詳しくは、本発明は
、ヒトまたは動物に、担体と結合させた短いアミノ酸配
列を予防接種することに関するものである。これらの配
列は、病原体の線毛（ピリ）構造に係るタンパク質の一
部分に対応するものである。

技術背景 尿路感染症はアメリカ国内でかなり深刻な問題となって
いるが、この問題はさらに世界各国に広がってきている
。米国民のｔ′Ｊ１〜５％が再発性尿路感染症に罹゛患
している。これらの症例巾約０．１饅は腎孟腎炎を併発
している。上記の人数よりも実質上多数の人々が、たと
え、今回発性の感染症にかかつていなくとも、自身の有
する医学上の状況により％１回限りの腎孟腎炎の発症に
よっても重篤な合併症を引き起こしかねない様な危険に
さらされている。この様な危険な状態にある人々には、
糖尿病患者（米国内に約−千万人存在）、高齢者、腎不
全症患者、鎮痛剤を過剰に使用している人々、および免
疫系が抑制されている人々（例えば新生物に対する化学
療法で加療中の人々）等が含まれる。これらの人々は全
て１重篤な合併症。

恒久的な無能化、さらには尿路感染症による死、に至る
種々の危険にさらされている。

相当数の人々を尿路感染症から保護するのに有効なワク
チンを得ることができれば有益である。

このことは、現時点で、急性感染症に感染するこ令　　
　　　　とに伴う苦痛や衰弱を防止し得るだけでなく、
この感染症の治療を目的とする抗生物質の投与量を明確
に減少させることにもなる。その様な抗生物質使用の回
避により、抗生物質の過剰使用による感染性生物猾に対
する選択圧が減少し、耐性株の出現を遅延させることが
できる。

本発明で対象としているこの感染症は、一般に差し迫っ
た生命の危険を伴なわないと考えられており、従って、
殆んど、あるいは全く危険性を有していないワクチンを
用いる必要がある。その様なワクチンの活性成分として
これまでに入手し得た物質は□１弱毒化された病原性徴
生物、および不純物を含むタンパク質製剤であって、こ
れらは望ましくない免疫応答を引き起こし、ざらに／ま
たは不都合な副作用をもたらした。米国特許番号６０５
．２８７（１９８４年４月３０日出願）にはＨＵＢ４９
　　ピリン（下記参照）内の特定の配列を含有する化学
的に規定（明らかに）されたタンパク質からなるワクチ
ンであって、それ故に非感染性であり、かつ感染の第１
段階であると思われている尿路のコｏ＝−化（ｃｏｌｏ
ｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｆ与する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）
尿路病原体（つｐパトゲン）の機能質に対する特異抗体
を惹起する作用を有するワクチンが開示されている。本
発明はこの種ワクチンの仲間に、上記の様な利点を有す
る。入手可能な免疫原をさらに追加すると共に、非常に
短く１合成容易な配列からむ保護作用を′惹起させるこ
とのでき右方法を提供するものである。゛発明の開示 大部分の尿路病原体大腸菌が有する特殊な型の線毛から
導かれるペプチドのある部分とホモローガスな、新らし
いアミノ酸配列フ□ラグメントが。

ヒトにおける尿路感染症に対するワクチンの活性　　□
成分として用いる上で好ましい性質を有しそいることを
発見した。大、Ｓ菌の尿路病原泳株が有する’　にｙａ
　ｌ　−Ｇａ　Ｉ　’線毛は、その媛象となる感染症と
高度の関連性を示す。しかし、他の線毛サブタイプはこ
の様な関連性を示さない。すなわち、Ｇａ１−Ｇａｌ　
　線毛タンパク質のこれらの追加の抗原性領域は、尿路
感染症の病原体に対する技法の産生に櫨めて有効かつ特
異的であり、しかも、その性質が明らかでありサイズが
比較的小さいことから。

実用的な量を純粋な形で得ることができる。特に。

本発明の活性ペプチドを含んでいるＧａ１−Ｇａｄピリ
ン（ｐｉｌｉｎ）は、　Ｇａｌ−Ｇａｇ線毛のための遺
伝子のみを発現する形質転換組換え大腸菌である％ＨＵ
８４９（ハル（Ｈｕｌｌ）らにより調製された。インフ
エクション・アンド・イムニアイ（ＩｎｆｅｃｔＩｒｒ
ｔｎｕｎ）（１９８１）３１９３３゜〕ｉこ由来するも
のであ机 従って１本発明は、ヒトを尿路病原体による感染力）ら
予防するのに有効なワクチンであって、実質上、抗原的
に中性な担体と結合している、ＨＵ８４９ピリンのアミ
ノ酸５−１２またはアミノ酸６５−７５と★質的に同等
なアミノ酸配列を含有しているワクチンを提供するもの
である。このワクチンに含まれるアミノ酸配列は、ＨＩ
Ｊ８４９ビリンのアミノ酸５３−１６３と実質的に同等
な配列で挑っでもよく、この場合には担体を必要としな
い、また本発明は、精製されたこれらのアミノ酸配列を
提供するものでもある。更に本発明は。

上蒜己のワクチンをヒトに投与することにより゛、尿路
感染症からヒトを保護する方法を提供するものでもある
。

第１９ハＨＵ８４９　　（７）Ｇａｌ−ＧａＪ線毛タン
パク質のアミノ酸配列、並びに本発明に係る、感染から
保護するために用いられる配列の模式肉である。

Ａ、定義 本明細書中、ペプチド配列を特徴付ける際に用いるゞ実
質的に同等な′という語句は、その実質的に同等な配列
が引用している配列と同じ抗原性機能を有し、また免疫
機能を媒介することができる、ということを意味する。

一般に、実質的に同等なペプチドと引用配列のアミノ酸
配列とは同一であるが、得られたポリペプチドの効力に
、識別し得る程の影響を及ぼすことのない、少数の残基
の置換または修飾がなされたペプチドであってもよい、
ということは容易に理解されることである。

個々のアミノ酸残基を直接、またはその暗号配列を改変
することにより、配列に欠失、付７７０または修飾を施
す方法は当業者によく理解されている。

同等の作用を示すポリペプチド配列を形成する様になさ
れた修飾により、′″実質的に同等な′ペプチドが得ら
れる。

ゞペプチド′、′ポリペプチド′およびゞタンパク質′
という語句は相互変換的に用いられ、これらの語句は、
中性（非荷電）形または塩の形。

あるいは、グリコジル化、側鎖の酸化、またはりん酸化
等で修飾されている、または修飾されていない、様々な
長さのアミノ酸配列を指す。アミノ酸配列は酸性基と塩
基性基の両方を含有しており。

ペプチドが示す特定のイオン状態は、該ペプチドが溶液
状態にあるときにはその溶媒のｐＨにより、また該ペプ
チドが固体状態にあるときには、それが得られた媒質の
ｐＨに依存する。また、アミノ酸側鎖にグリコジル単位
、脂質またはホスフェートの様な無機イオン等の置換基
が付加することにより修飾されているタンパク質や、メ
ルカプト基の酸化の如く、鎖の化学的な変換に関連した
修飾が施されているタンパク質も上記の定義に含まれる
。この様に％′ペプチド′　またはそれと同等の語句は
、免疫原性を破壊しない上記の修飾に委ねられた適当な
アミノ酸配列を含むものとする。

ゝ実質上、抗原的に中性な担体′という語句は。

本発明のペプチドに結合することにより、このペプチド
に免疫原性を付与する様な物質であるが。

それ自身は宿主にとって有害な抗体、あるいは本発明の
ペプチドの抗原性機能を妨害する様な抗原性部位を有し
ている抗体を惹起することのない物質を指す。以下の例
では抗体供給源としてウサギを用いているが、ウシ血清
アルブミン（ＵＳＡ）を用いることもできる。しかしな
がら、ヒトに対して用いるためには、担体は、ヒトが日
常的に、そして非−病原的に出会う物質に対して、抗体
を惹起させることのないタンパク質に限定される。

例えば、淋菌自身の体細胞や破傷風トキソイドタンパク
質を用いることができる。他の担体の使用が除外される
訳ではないが、これらが血清学的に適合し得る担体とし
て最も便利な形であり、今日。

このクラスを代表する、最も使用し易いものである。

Ｂ０発明および好ましい態様についての一般的な説明 Ｂ、１　　線毛タンパク質の性質およびその感染との関
係 感染に関連した。菌力の基本的な有害因子は。

感染菌の標的組織への付着能力にある。この付着能力は
細菌表面の、タンパク質に富む糸状体（フィラメント）
構造と関連している。これらの糸状体は、適度な配列長
さの同一のサブユニット（ビリン）の凝集体である。尿
路病原性感染症と関係すると考えられている大腸菌は、
染色体にコードされている少くとも３つの型の線毛、即
ちゞ通常（コモン）　　’または’　ＭＳ　”　；　’
　Ｇａ１−Ｇａｌ　’；　　オよび′Ｘ′を有している
。これらは、その結合特異性に基いて分類されている。

通常型（またはタイプ■、マンノース結合、あるいはＭ
Ｓ）線毛はモルモットの赤血球および酵母細胞を凝集し
、　Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ　　ウｏ　ム：１４　
Ｆ（ｕｒｏｍｕｃｏｉｄ）と結合することができ、あら
ゆる胎盤性哺乳類の腎臓から分泌される。高度にマンノ
シル化された糖タンパクである。マンノースそのもの、
メチルマンノジッドおよび酵母マンナンの様に、マンノ
ースを含む糖類によって、その結合は阻害される。ＭＳ
線毛は、起源と無関係に、全人、陽菌株の８５％に見出
される。

Ｇａ１−ＧａＪ　＠毛はＤ　−７７／　−ス（’）存在
下で。

ヒト赤血球の凝集を媒介し、空の尿路−Ｆ皮細胞に結合
する。これらの菌株の大部分は、構造上、互に関連した
２つの中性なグリコスフィンゴリビッドであるグロポテ
トラオシ」し・セラミツドおよびトリへキソシル・セラ
ミツド〔これらは通常、ヒト赤血球オヨび尿路上皮（ｕ
ｒａｅｐｉ　ｃｈｅｌ　ｉａｌ　）細胞−ヒに存在して
いる〕と結合する。この様な線毛は、真性大腸菌の約３
０％に見出されているが、急性の小児での非−閉塞性腎
孟腎炎患者、あるいは健常な成人女性の尿路から単離さ
れる菌株中９０〜１００％に存在していることが分って
いる。二糖“　　　＠ａ−Ｇａｌ（１−４）、／９−Ｇ
ａ１（Ｇａｌ−６３，）１よ、これらの腺毛によって認
識され得る、最小の活性な受容体であることが示された
。

Ｘ型の線毛タンパク質は上記のいずれのグループにも属
さない残余タンパク質であるが、それらの受容体の性質
は未だ知られていない。

多くの大腸菌株が前記の全ての型の線毛を含有している
。例えば、ヒト腎孟腎炎患者から単離された大腸菌Ｊ９
６株は、線毛をコードしている。

２つの明瞭な染色体遺伝子を含有している。これら遺伝
子の配列は、制限消化および単離により、決定された。

１方の遺伝子はＭＳ線毛を、他の遺伝子はＧａ　ｌ　−
Ｇａ　Ｉ線毛をコードしている。これらのフラグメント
を用いて、ハル（Ｈｕｌ　ｌ　）らはＭＳ線毛のみを発
現する形質転換組換え細胞（ＳＨ４８）および、　Ｇａ
１−Ｇａｌ線毛のみを発現する形質転換組換え細胞（Ｈ
Ｕ８４９）を調製した（インフエクションーアンド・イ
ムニテイ（１９８１）３３：９３３）、１２Ｌ下の実施
例では、これらの株を線毛タンパク質の供給源として用
いる。しかしながら。

同様の方法を用いて他の適当な組換え株を調製し。

線毛の供給源として使用することもでき；また。

実際、所望の線毛を生産するならば、非−組換え野生型
株や突然変異株をも使用することができる。

米国特許番号第６０５２８７号（前出）、には、典型的
な尿路病原体に伴なったＨＯ２４９線毛タンパク質の精
製および配列決定に関する記載があり、第１図に示す結
果が開示されている。このピリンは、１６３アミノ酸を
含有している。本発明から分る様に、このピリンには少
なく表も３つの。

これまで知られていなかった抗原決定領域が含まれてい
る。これらの領域の内２つは小さく、免疫原性を獲得す
るためには、担体タンパク質と結合させる必要がある：
これらの領域は、１”ｌＵ３４９ピリンのアミノ酸５−
１２および６５−７５と実質的に同等な配列である。第
３の領域はアミノ酸５３−１６３のＣＮＢｒ　　開裂フ
ラグメントに相当し。

単独で免疫原性を示す。

前記のフラグメントを表す配列は、その大きさによって
、精製タンパク質の消化物から単離するのが最も好都合
であるが、組換え法または化学合成性により製造するこ
ともできる。本明細書中で参照のために示している配列
は問題の領域と略対応させる様に意図されているが、免
疫原性が保持される限り、余分のアミノ酸を含むが、１
′たはアミノ酸を欠如しているものであってもよい。゛
これらのペプチド配列（短かい２つの配列の場゛合は。

担体と結合させて）を、その個々のものを活性成分とし
、あるいは他の免疫原性物質と併用して用い、ワクチン
を調製する。本発明のワクチンに応答して形成された抗
体は、それ以後、尿路感染症を引き起こす大腸菌による
感染から対象を保護する。

Ｂ、３　　ポリペプ゛チド活性成分の調製本発明ワクチ
ンの活性成分である所望のポリペブチ゛ドは、その失き
さにより、以下の３つの基本的な製造方法の内のどれか
を用いることによって最も都合良く調製することができ
る。

所望の配列が短かい場合（例えば大腸菌ｒｒＴｊ８′４
９ピリンの５−１２または６５−７５位を構成するアミ
ノ酸配列に相当する配列、即ち、配列中にアミノ酸を８
および１１個しか含有していないポリペプチドの適合）
には、現在、当業Ｗで標準的な方法に従い、化学合成す
るのが適当である。

その様な方法の総説は、例えは、マーボリン、Ａ。

（Ｍａｒｇｏｌ　ｉｎ　、　Ａ、）　　らｌこまって与
えられている〔アニュアル・レビュース・オブやバイオ
ケミ（Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｊ３ｊｏｃｈｅｍ　）（１９７０）３９　：
　８４１）。

これらの方法の大多数は、Ｃ末端アミノ酸を固体支持体
に結合させておき、隣接するアミノ酸（自己縮合を避け
るために予めアミノ基が保護されたもの）を順次反応さ
せることからなる。最初のカップリング（結合）の後、
このＮＨ２床護基を除き、次の位置のアミノ酸とのカッ
プリングを繰り返し行う。この方法により％相当な長さ
の鎖を有するポリペプチドを合成することができる。唯
一の必要条件は、合成すべき所望のポリペプチドのアミ
ノ酸配列が既知であることである。

本発明のポリペプチドは線毛中の、より長い配列の一部
、あるいは細菌の線毛タンパク質として生産されるもの
であるため、発酵培養から定量的に得ろことができる。

本発明のポリペプチドは。

線毛タンパク質を精製した後１種々の方法を用いて所望
のフラグメントを生成させ、この所望のフラグメントを
精製することにより、調製し得る。

配列が長くなる程、この方法がより実用的になる。

線毛タンパク質の精製、加水分解およびフラグメントの
精製は常法通りに行われるが、この方法は。

タンパク質のＣＮＲｒ　　消化産物であるアミノ酸５３
−１６３に相当するフラグメント（ＣＮＢｒ−ＩＴと命
名）の調！痩に７噸する。

また、所望のペプチドの合成法として組換えＤＮＡ法が
ある。本発明に係る３つの配列は全てこの方法を用いて
調製することができる。所望のペプチドまたはタンパク
質のＤＮＡ暗号配列を受容体菌株の形質転換に適した発
現ベクターにライゲーし、それによって遺伝子を発現さ
せ、目的のタンパク質を生産させる。上記のＤＮＡ暗号
配列は短かく、当業者既知の方法で充分１合成すること
ができる。あるいは、ｃＤＮＡ　　ｉたはゲノム消化を
利用してもよい。アミノ酸配列が既知であるため、　Ｇ
ａ　Ｊ　−Ｇａ　Ｊ　　線毛タンパク質−産生株からの
ｍ　ＲＮ　Ａ　を用いて調製され７’（ｃＤＮＡ　　ラ
イブラリィをプローブするのに適した一本鎖ＤＮＡプロ
ーブを組立てることができる。別法として、ＧａＪ−’
　　　　Ｇａｌ　　線毛タンパク質生産性大腸菌から得
た染色体を制限酵素消化してゲノムライブラリィを調製
し、これをｃＤＮＡ　　のプローブに用いたと同様の方
法でプローブすることもでき、あるいは、このフラグメ
ントを直接発現ベクターに挿入し、これを用いて受容株
を形質転換し、成功した形質転換体を、Ｇａ１−Ｇａｌ
受容体と結合するタンパク質の産生に関してスクリーン
することもできる。この方法はＴ（Ｕ８４９　　株の調
製に際してハル（Ｔ−１ｕｌｌ）ら（前出）が実際に用
いた方法である。

この暗号配列は、それがゲノムまたはｃＤＮＡライブラ
リィから導かれたか、あるいは、化学的手法を用いてオ
リゴヌクレオチド合成されたか、のいずれにせよ、所望
の暗号配列の挿入に好都合な制限部位を含有しているプ
ラスミド内において、細菌宿主と適合し得る７０モ一タ
ー配列のコントロール下に置かれる。その様なプラスミ
ドの代表例として、メツシング、　、■、（Ｍ’ｅｓｓ
　ｉｎｇ　、Ｊｏ、ミネソタ大学）から入手し得るＰＵ
（：８およびｐＵｃ１３（例、えばメツシングら、ヌク
レイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ
１ｄｓ　、Ｒｅｓ　）（１９８１）９　：　３０９参照
〕、またはニューイングランド・バイオラボラトリイズ
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ　ａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　）から入
手し得るｐＢＲ３２２を挙げることができる。適当なプ
ロモーターには１例えばβ−ラクタマーゼ（ペニシリナ
ーゼ）およびラクトース（Ｉａｃ）プＩ）　モーター系
〔チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
　）（１９７７）１９８ｉ１０５６〕　およびトリプト
ファン（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゲッタ／Ｌ／　、　
ｒ）　、　（：Ｇｏｃｄｄｅｌ　　、　Ｉ）　、）ら。

ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（１９３０）８：４
０５７）が含まれろ。得られた発現ベクターは、コーエ
、／　、　Ｓ、Ｎ、（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、）らの塩化
カルシウム法〔プロシーデイングスーオブ・ザ・ナショ
ナル・γカデミイ・オブサイエンスイズ（Ｐｒｏｃ　　
Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ　）　（ＵＳＡ）（１
９７２）６９：２１１０）に従って適当な細菌性宿主に
導入（トランスフオーム）することができる。成功した
形質転換体は、普通にＧａ１−Ｇａｌ線毛を生産する組
換えまたは天然菌株中に見出されるよりも高レベルに所
望のポリペプチドフラグメントを生産する。別法として
、これらのペプチドを、適当なコントロール配列、ベク
ターおよび形質転換を用い、非−細菌性組換え宿主中で
生産させてもよい。

Ｒ，４リンカ−類 アミノ酸５−１２および６５−７５で示さレルペプチド
配列は免疫原性を現わすには短かすぎると思われるので
、免疫原性を付与するために、担体物質と結合させる。

当業者にとって既知の、その様な結合の生成法は全て採
用し得る。

様々な方法で結合を得ることができる。例えば。

１つの機能的な基の末端でジスルフィド結合を生警　　
　　　　成させ、他方でペプチド結合を形成させる様な
数多く、の外来性の三機能性試薬が知られており、これ
らを広範囲に利用することができる。それらの内、最も
一般的な試薬はＮ−サクシドイミジル−３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピリオネート（ＳＰＤＰ）である。こ
の物質は自身と１つのタンパク質内のシスティン残基と
の間にジスルフィド結合を形成し、リジンのアミノ基、
あるいは他のものに含まれる遊離アミノ基との間にアミ
ド結合を形成スる。その様なジスルフィド／アミド結合
形成性試薬は種々知られている〔イムノロジカル・レビ
ューズ（Ｉｍｍｕｎ、　Ｒｅｖ、）（１９８２）６２＋
ｉｓｓ＠照〕。他の二機能性カップリング剤はジスルフ
ィド結合ですく、チオエーテルを形成する。

この様なチオエーテル形成性試薬の多数が市販されてお
り、それらには６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ
酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル
）シクロヘキサン−１−カルボン酸等の反応性のエステ
ルが含まれる。これらのカルボキシル基は、サクシンイ
ミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン
酸、ナトリウム塩と混合することにより、活性化される
。本発明方法において特に好ましいカップリング剤はサ
クシンイミジル　４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シク
ロヘキサン−１−カルホキシレー）（ＳＭＣＣ）〔ピア
ス・カンパニイ（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｏｍｐａｎｙ）　
。

ロックフォード、イリノイスから入手〕である。

上記の化合物リストは決して排他的なものでなく。

これら化合物を修飾したもの訃用い得ることは明、らか
である。ペプチド中に好都合にシスティンが含まれてい
ない場合には、このペプチドの調製時にいずれかの末端
にシスティン残基を付加する。

担体と結合させる必要があるのは短かいペプチドのみで
あるから、化学合成を行う際にこれらの残基を都合良く
含有させることができる。

活性成分としてペプチド配列を含有するワクチン製剤は
当該技術分野でよく知られている。通常。

その様なワクチン類は溶液または懸濁液の如き注射用の
剤形に製剤化されているが、注射に際して溶液または懸
濁液を調製するのに適した固形状に製剤化されていても
よい。製剤は乳剤であってもよい。活性な免疫原成分を
、薬学的に許容し得ると共に該活性成分と適合し得る賦
形剤と混合することが多い。適当な賦形剤の例として、
水、食塩水、デキストロース、グリセリンまたはエタノ
ール、あるいはこれらの混合物を挙げることができる。

更に、所望により、ワクチンには湿潤剤または乳化剤、
ｐＨＪｉｌ衝剤等の補助物質、あるいは該ワクチンの効
果を高めるためのアジュバント類を少量含有させてもよ
い。このワクチンは注射２例えば皮下または筋肉内注射
により、非経口的に投与することが好ましい。その他の
投与方法に適した剤形には、坐薬並びに、時には経口用
製剤が含まれる。坐薬は、例えばポリアルカレンゲリコ
ール類やトリグリセライド類の如き通常の結合剤および
担体を含有している。その様な坐薬は、活性成分を０，
５〜１０俤、好ましくは１〜２％の割合で含む混合物か
ら製造される。経口用製剤は、通常使用される賦形剤１
例えば製薬等級のマンニトール、乳糖、でんぷん、ステ
アリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロ
ースおよび炭酸マグネシウム等を含有する。これらの組
成物は液剤、懸濁剤１錠剤、九剤、カプセル剤、徐放性
製剤または粉剤等の剤形であり、活性成分を１０〜９５
％、好ましくは２５〜７０ダ含有している。

薬学的に許容し得る塩、当業者には理解されることだが
１本発明のタンパク質は溶媒またはそれが析出した溶媒
のｐＨによって、中性、または塩の間に形成される）１
例えば、塩酸またはりん酸等する。遊離のカルボン酸と
の塩は１例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、
カルシ１クムマタは水酸化鉄の如き無機塩基、あるいは
イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルア
ミノエタノール、ヒスチジンまたはプロカイン等の有機
塩基から導かれる。

本発明のワクチンは投与剤形に適した方法により、その
治療上有効かつ免疫原的に有効な置を投与される。投与
量は処置対象、対象者の免疫系の抗体産生能力、並びに
必要とされる保護の度合により、左右される。活性成分
の正確な投与要求量は医師の判断に委ねられており、各
人に特有の値となる。しかしながら、皮下または筋肉内
注入のしｔめの適当な用衛域は、１人当りの活性成分歌
が５０〜５００μｇ程度の範囲内であろう。種々の適当
な、初回投与と促進投与（ブースター・ショット）の投
与計画をたて得るが、初回投与から１〜２週間の間隔を
あけて次の注射または他の方法での投与を行うのが一般
的である。

Ｃ０実施例 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実
施例は制限的なものではない。

実質上、プリン）　ン、　Ｃ，（Ｒｒｉｎｔｏｎ、　Ｃ
，）らの方法〔トランス・エヌ・ワイ・アカド・サイ（
Ｔｒａｎｓ　　ＮＹ　　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　）　　（１
９６５）２７：１００３）に従い％ＴＳＡ上で、３７℃
において１８時間増殖させた生物から、ＨＵ８４９　　
由来の線毛を精製した。簡単に述べると、細胞を水冷下
、０．００５Ｍトリス・バッフγ−（Ｔ−バッファー、
ｐＴ−１ｓ、　３　）ニ収獲した。ツルバール・オムニ
ミキｔ　−（５ｏｒｖａ　ＩＱ、ｎｒ＋１ｍ１ｘｅｒ　
）中で細菌表面から線毛を刈り取り（４０００ｒｐｍ　
　３０分、４℃）、脱線上生物と崩壊物とを遠心して除
去した。０．５Ｍ）ＩＪス・バラｙ　７−オヨヒ０．１
５　ＭＮａＣ（！　（ＰＨ７，０）中でＭｇＣｌ２を０
．１Ｍになる様に加えることにより（ＴＳＭバッファー
）、線毛を沈殿させた。次いで。

遠心して凝集している腺毛フラグメントを集め、得られ
たペレットをＴ−バッファーに溶がし、不溶性不純物を
遠心して除いた。

線毛をＴＳＭバッファーに再懸濁し、遠心して可溶性不
純物を除去した。ＴＳＭバッファーおよびＴバッファー
の各々による沈殿化、可溶化の工程を６回繰返して行っ
た後、得られたピリン製品を二回蒸留脱イオン水に対し
て広範囲に透析した。

得られたタンパク質の純度を電気顕微鏡、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ、アミノ末端配列決定、および汚染物質であるリポ
多糖類（Ｌ　Ｐ　Ｓ　）レベルの評価に基いて確認した
。

電顕用標本は、フオームバー（Ｆｏｒｍｖａｒ　）　　
およびカーボンで被覆した銅製グリッド上で、２％（Ｗ
／ｖ）の酢酸ウラニルを用いて負染色することにより、
調製した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥはレムリ（Ｌａ　ｅｍｍｌ　ｉ　）ノ
ア法〔ネイチャー（１９７０）２２７：６８０〕に従っ
た。

タンパク質を検出するために、クーマシイー（ＣＯ（２
）ｃｃｉｅ　）ブリリアント・ブルーＲ２５０［シグマ
（Ｓｉｇｍａ）ケミカルＣＯ６，セントルイス、ＭＯ］
または銀〔モリツセイ、　Ｊ　、　（Ｍｏｒｒｉｓｓｅ
ｙ、　Ｊ、）。

アナリテイカル・バイオケミストリイ（ＡｎａｌＢｉｏ
ｃｈｅｍ　）（１９８２）１１７　３０７’：Ｊ　　を
用いてゲルを染色し；また、不純物ＬＰＳを検出するた
めに過沃素酸で酸化した後、銀で染色（−た〔ツアイ、
　Ｇ９Ｍ、（Ｔｓａｉ　、　Ｇ　、　Ｍ　、）ら、アナ
リテイカル・バイオケミストリイ（１９８２）１１９　
：１１５）。

ＬＰＳはまた。ワラデカ−、Ｖ　、　（Ｗａｒａｖｄｅ
ｋａｒ。

■、）らの方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリイ（１９５９）２３４：１９４５）に従い、
５００〜１０００μｇの試料中の２−ケト−３−デオキ
シ−〇−マンノーオクタネート含阻を、試料の５４８ｎ
ｍにおける光学密度と、ウエストファル、　０．（Ｗｅ
ｓｔｐｈａｌ、　Ｏ，）ら９フエノール抽出法〔メン・
カルボヒト・ケミ（ＭｅｔｈＣａｒｂｏｈｙｄ　　Ｃｈ
ｅｍ　）　（１９６５）５　：８０”にＣ従って大腸菌
ＨＢ　１０１株およびＪ９６株から調製１７たＬＰＳで
作成した標準曲線とを比較して求めることによっても評
価することができる。

Ｎ−末端配列決定は、ベックマン８９０Ｃ液ｆ目配列決
定装置（Ｒｅｃｋｍａｎ　　８９　Ｑ　Ｃ目ｑｕｉｄｐ
ｈａｓｅ　　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ　）［、−＜ツタ？？
／インストルメ：ｉ”ｙ　（Ｂｅｃｋｍａｎ　　Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ　）パロｅアルド。

ＣＡ）により、Ｏ，１Ｍり７　Ｆ　ｏ　−ル（Ｑｕａｄ
ｒｏｌ　　）プログラムを使用した自動エドマン（Ｅｄ
ｍａｎ）分解法に従って行った。各アミノ酸のフェニル
チオヒダントイン（ＰＴＩ−１）％導体を逆相高速液体
クロマトグラフィーで同定し、気−液クロマトグラフ警
　　　　４−１′／　’１　ｆｃ　Ｄｉ　＠　Ｊ＠　ｌ
　Ｃ−７”ｆｙ７に一１ｃＪ。

す、確認した。

精製した線毛タンパク質製品はＲＮＡおよびｒ）ＮＡの
両者を含まず、５ＤＳ−ＡＧＥ　　に基き９７−９９％
ホモジーニアスであることが分った。これらの製品は電
顕により、非−系状体構造の殆どないホモローガスな糸
状体で構成されていることが示ぎれた。ＬＰＳ含有看は
、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−マンノーオクトネー）
（ＫＤＯ）アッセイによる測定によれば０．１％より少
く、銀染色の際のゲル上のＬＰＳ相当部位の染色欠如に
基く評価では０，０１％より少なかった。

精製線毛タンパク質を常法に従ってＣＮ　Ｂ　ｒ処理に
付し、得られたフラグメントをＣ−１８逆相ＨＰ　Ｌ　
Ｃカラムにかけ、０−ＳＯ％アセトニトリル線状グラデ
ィエンドを用いた０、１％トリフルオロ酢酸バッファー
で溶離することにより、精製した。更に、ピリジン／酢
酸バッファー（ｐＨ６，４）中で高電圧沖紙電気泳動に
かけ、タンパク質含有画分を精製した〇 前記の方法に従って得られたアミノ酸５３−１６３に対
応するＣＮＢｒフラグメントの抗原決定基としての作用
を、　　）　−ヒン、　Ｈ（Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｈ、）ら
〔プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンスイズ（ＵＳＡ）（１９７９）７
６：４３５０〕またはスワン゛イン、Ｊ、（Ｓｗａｎｓ
ｏｎ、　Ｊ　、　）　　ら〔インフエクションｅアンド
・イムニディ（１９８２）３８：６．６８）の方法に従
い、ＨＵ８４９ピリン　に対すｔウサギ抗血清を使用し
てウェスタン・ブｐット法により、Ｎ認した。

０・２ｙμｊ二」」」すμ８ヨヒゴしト髪ｌ覧、配列：
　Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｙ−
Ｌｙ、５−Ｖａｌ−Ｔｈｒで示されるペプチドをや市販
のベックマン・モデル９９０Ｂペプチ）−合成装置（Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ　　Ｓｙｎ、ｔｈｅ−ｇｉｚｅｒ　）によ
り、市販の了ミイ酸ポリスチレン樹脂と、以下の側鎖保
護基を有するｔ　−Ｂｏｃ　　保護アミノ酸〔ペニンス
ラ・ラボラトリイズ（ＰｅｎｎｉｎｓｕｌａＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　）ベルモント、カリフォルニア〕を用
イテ合成した：保護基；　Ａｓｐ　、　Ｇｌ　ｕ、　Ｔ
ｈｒおよヒＳｅｒニハＯ−ベンジルエステルｉＡｒｇお
よヒＨｉｓにはトシル；ＣｙｓにはＰ−メトキシベンジ
ルＨＬｙｓには０−クロロベンジルオキシカルボニル；
そしてＴｙｒ　　には２，６−ジクロルベンジルの各基
。樹脂と結合したアミノ酸に対し、２．５モル過剰、量
のＥ　７　ＢＯＣアミノ酸とジシクロへキシルカーポジ
イミド（ＤＣＣ）を用いてカップリングさせた。Ａｓｎ
およびＧｌｎの場合には、２．５モル過剰量のアミノ酸
、ＤＣＣ，、およびＮ−ヒドロキシトリアゾールを用い
た。樹脂のニンヒドリン反応で測定したところ、全ての
カップリング反応が９９外以上の完成率を示した。アニ
ソール、ジメチルスルフィド。

およびインドールの存在下、無水ＨＦで処理することに
より、ペプチドを脱保護すると同時に樹脂から離した。

エーテル抽出してペプチドを様々な有機副産物から分離
し、５％酢酸で抽出して樹脂から単離した後、凍結乾燥
した。この粗生成物の純度ｆＣ−１８逆相カラム〔メル
ク（Ｍｅｒｃｋ）　。

ダルムスタット、ドイツ〕によるＨＰＬＣ，およびアミ
ノ酸分析に基いて測定した。その結果、該ペプチドの純
度は９０饅以−りであると断定された。

同様にして、以下に示すペプチドを調製した：Ｐ　ｒ　
ｏ−Ｇｌ　ｎ−Ｃ，Ｉ　ｙ−Ｇｌ　ｎ−ＧＪ　ｙ−Ｌｙ
　ｓ　−Ｖａ　Ｉ　−Ｔｈ　ｒ−Ｃｙ　ｓ　。

Ａｌ　ａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌ　ｙ−Ａｌ　ａ　−Ｌｙ　ｓ　−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｙおよびＡ　Ｉ　ａ−Ｐｈ　ｅ−Ｌｙ　ｓ−にｌ　ｙ−
Ｇｌ　ｙ−Ａｓ　ｎ−Ｇ１　ｙ　−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌｙ　
ｓ　−Ｌｙ　５−Ｇｌ　ｙ　−Ｃｙ　ｓ　０Ｃ，ａ　　
ｊｆｉ体タンパク質との結合０．２　　で得たＣ−末端
にＣｙｓを有するペプチドをフンタケ、　Ｓ　（Ｙｏｓ
ｈｉｔａｋｅ　、Ｓ、）らの記載〔ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリ（（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｌｌｅｍ、）　（１９７９）１０１　：３９５）
　　に従い、サクシンイミジル　４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭ
ＣＣ）（ピアース、ロックフォード。

イリノイス）を用いてウシ血清アルブミンと結合させた
。簡単に述べると、Ｂ５Ａｌ０〜をりん酸緩衝化食塩水
（Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ｐｒ（７，４）　２ｍｌに溶かし。

これを、ジメチルホルムアミド０．５　ｘｌ中のＳＭ（
１：Ｃ５〜と混合した。室温で１時間経過した後、０．
１Ｍホスフェート（ｐＨ６，０）中でＧ−２５によりゲ
ル沖過し、コンジュゲート（結合、ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
　）産物と未反応のＳＭＣＣとを分離した。

配列：　Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１
　ｙ−Ｌｙ　ｓ　−Ｖａ　Ｉ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓで示され
るペプチドを０．１　Ｍホウ酸塩（ＰＨ９，１）に溶か
し、　ＮａＢＨ４（０，１”　ス）　ツタ液０．１ｄ）
で還元した。５分後にホウ酸塩溶液のｐＨをＩＭＨ（：
Ｊｌ！　　で１に下げて過剰量のＮ　ａ　ＲＨ４を除き
。

次いでＩＭＮａＯＨにより、ｐＨを６に上げ、リンカー
−ＢＳＡ　　フンシュゲート産物と一緒にした口さらに
ＩＶｊ間室温でインキュベートした後、ペプチド−リン
カー−ＢＳＡコンジュゲート産物ｋｏ、１ＭＮＨ４）（
Ｃｏ３中でＧ−２５カラムにかけ、脱塩処理した。コン
ジュゲーシヨンの程度を、ペプチドと反応する前後のＢ
ＳＡのアミノ酸＆Ｆｉ　成の比Ｍに基いて定渚した。こ
のコンジュゲート産物は、ＢＳＡ１分）当り、約１５−
２５のペプチドが結合したものであった。

同様にして、０．２　　で得た他のＣ−末端Ｃｙｓ含有
ペプチドとＵＳＡとをコンジュゲートさせた。

Ｃ，４腎孟腎炎のためのＢａ１ｂ／Ｃモデルおよび免疫
化分析 一般に、尿路感染症は腎孟腎炎で代表される。

この疾患の発病過程は、細菌が尿路に侵入し、粘膜に付
着してコロニー化し、終には宿主を感染さく３１） 仕ることからなる。

ヒト対象でのこの疾患のパラメーターを調べる上で有用
な　Ｂａ１ｂ／Ｃマウスにおける該疾、但の確立された
〔米国特許第６０５．２８７号（前出）〕。

尿道カテーテルを介して大腸菌Ｊ９６の１０８　コロニ
ー形成単位（ＣＦＵ）を投与することにより。

チャレンジ試験を行なった。感染の進行（またはその欠
如）を、以下のグ■くにして尿中並びに腎臓内増殖を調
べることにより、監視したＳチャレンジの２日後、長時
間エーテル麻酔によってマウスを殺し、尿および腎臓組
織における細菌増殖を調べた。尿の分析は、膀胱周囲を
マツサージして尿を押し出し、滅菌した１０μｅのルー
プ（白金耳）を用いて０．５　Ｃ４のトリブチカーゼ・
ソイ・アガー（ＴＳＡ）または抗生物質を補充したＴＳ
Ａ平板に接種することにより１行った。平板を３７℃で
１８−２４時間インキユベートシ。

観察し得る増殖を等吸付けて読み取った。ＴＳＡ平板上
で増殖した微生物がダラム陰性優性であり、スライド凝
集アッセイにおいてウサギ抗Ｊ−９６０血清（ＰＢＳ中
で１８１０００に希釈）を凝集すれば、この大腸菌７９
６であると観察された増殖は、被投与株と同一であるこ
とが証明されたことになる。

無菌的方法で腎臓を摘出し、骨盤中央を通って矢状に切
開し、切開面をＴＳＡまたは抗生物質添加ＴＳＡ上に画
線接種した。その他の分析手法は前述した尿標本に関す
る方法と同様である。

Ｃ１５本発明のペプチドによる保護 被検ワクチンには、６．３　で調製した。実質上抗原的
に中性な担体とコンジュゲートさせた。アミノ酸５−１
２または６５−７５に対応するペプチド、あるいはＣ８
１記載の、精製ＨＵ８４９ピリンかう得たＣＮＢｒ［フ
ラグメントを含有させた。

対照ワクチンはＨＵ８４９＠毛、および、担体に結合さ
せた他の合成ペプチドを用いて調製した。バッファ一対
照も用いた。

ワクチンは、　Ｐ　ＲＳ　（ｐＨ７，４）　１ゴ中の１
活性成分′であるタンパク質５０μｇを使用し、完全フ
ロイント・アジュバント１ゴで乳化することにより、調
製した。得られた２Ｗｌのワクチンを重複皮下注入、お
よび筋肉内注入法で投与した。

２週間後、Ｃ０４で述べた１１ｎ＜、動物に尿道カテー
テルを介して１０８ＣＦＵの大腸菌１９６（１００μｌ
）を投与し、チャレンジさせた。２日後に瀉血して抗体
力価測定用の血清を採取し、腎臓を摘出して前述の如く
中央部分を通して矢状に切開しＪ９６コロニー化を詳細
に評価した。

結果を次の表■に示す。この表には、Ｊ９６コロニー化
陽性、または侵入の陽性を示したマウス数の全動物中の
割合が示されている。

表■　大腸菌性腎孟腎炎予防における１種々の免疫原を
用いたワクチン接種試験 Ｊ９６　　コルニー化 仝　　　　　　″“′ファ一対照　　　　　８／８　　
　４．８　　８／８　　３．３ＨＵ８４９線毛　　　　
　３／１９　　０．３　１／１９　　０．ＩＣＮＢｒ１
ｌ（６３−１５３）　　　０／７　　０．Ｏ’・０／７
　　０．０アミノ酸１３１−１４３ｔｌｔ１０３−１１
６に相当する対照配列をワクチン接種し、Ｊ９６感染に
対するチャレンジにおいてマウスを保護しようとする試
みは、全ての試験基準で失敗に終った。

担体と結合させた５−１２および６５−７５　　ペプチ
ド、並びにＣＮＢｒ−■フラグメントから調製したワク
チンは有効であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＵ８４９ピリンタンパク質の一次構造を示す
模式図である。 特許出願人　ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オヴ
・ザ・レランド・スタン Ｐｒ、ｏ　ＣｆＢ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　
ＬｙＢ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＡｓｐＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ
　Ｌｙｓ　ＰＣ＜Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａ
ｌａ　Ｐ、ｈｅ　Ｌｙｓ　、Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　
Ｇｌ：ｂ ’ｒｈｒ　’ｒｙｒ　Ｇｉｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳類における尿路感染症予防のためのワクチンで
   あつて、実質上、抗原的に中性な担体と結合している、
   配列：Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
   ｓ−Ｖａｌ−ＴｈｒまたはＡｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ
   ｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｙと実質的に同等なアミノ酸配列を持つている
   ペプチドの保護有効量を含有しているワクチン。 ２、ペプチドが、いずれか１方の末端に更にＣｙｓ残基
   を有するものである第１項に記載のワクチン。 ３、哺乳類における尿路感染症予防のためのワクチンで
   あつて、ＨＵ８４９ピリンのアミノ酸６３−１５３と実
   質的に同等なアミノ酸配列を有するペプチドの保護有効
   量を含有しているワクチン。 ４、哺乳類における尿路感染症予防のためのワクチンで
   あつて、ＨＵ８４９ピリンのＣＮＢｒIIフラグメントと
   実質的に同等なアミノ酸配列を有するペプチドの保護有
   効量を含有しているワクチン。 ５、配列：Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−
   Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＴｈｒまたはＡｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
   −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
   Ｌｙｓ−Ｇｌｙで示され、いずれか１方の末端にＣｙｓ
   を有することもある、実質上純粋なペプチド。