JPH064768B2 - 新規蛍光染料 - Google Patents

新規蛍光染料

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JPH064768B2
JPH064768B2 JP2158538A JP15853890A JPH064768B2 JP H064768 B2 JPH064768 B2 JP H064768B2 JP 2158538 A JP2158538 A JP 2158538A JP 15853890 A JP15853890 A JP 15853890A JP H064768 B2 JPH064768 B2 JP H064768B2
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規は蛍光染料に関する。さらに詳細には，本
発明は核酸を優先的に染色する新規な蛍光染料に関す
る。
血液によって運ばれる寄生中感染は，世界の多くの地域
において大きな健康上の問題を引き起こしている。これ
らの地域の多くは，生物学的サンプル（血液やその成分
等）中に存在する寄生中を検出するのに利用できる機
器，及びこのような機器を使いこなすことのできる熟練
技能者が不足している。こうした問題に対処するため
に，正確で且つ簡単に読み取ることのできる結果を与え
るある特定の低コスト・低技能レベルの機器が開発され
ている。ある１つのこのような機器は，ある比重を有す
るほぼ円筒状の物体を収容した毛細管を含んでおり，血
液サンプルが遠心分離によって分離されるときに，該物
体が複数の血球層のうちの１つの血球層中に浮遊するよ
うになっている。該物体は，寄生中を保有している血球
が押し込まれる毛細管中に薄い環状スペースを形成する
よう選択される。次いで毛細管に対し，この環状区域内
に寄生中が存在するかどうかを，顕微鏡を使用して調べ
る。米国特許第4,190,328号明細書は，この方法を利用
した機器について開示している。本方法は，工業的には
QBCRシステム〔ベクトン・ディッキンソン・プライマリ
ー・ケア・ダイアグノスティクス（Becton Dickinson P
rimary Care Diagnostics）〕にて実用されている。
しかしながら，ある与えられた血球中における寄生中の
存在を明確に表わすのに，染料を加えなければ，このよ
うな寄生中を検出するのが難しい，というのが本方法の
欠点である。寄生中は，ある特定の宿主中において，い
くつかの異なる発育段階を経て成長する。各発育段階を
識別するのは難しい場合が多く，ある程度の熟練が必要
とされる。ある特定の段階が存在するかしないかによっ
て，感染の相対的程度又は相対的段階がわかる。
米国特許第4,190,328号明細書においては，寄生中の核
酸を染色する膜透過性染料としてアクリジンオレンジが
開示されている。しかしながら，アクリジンオレンジは
他の血球に対しても透過性があり，従って核化した白血
球をある程度染色する。このため，臨床医が感染段階の
識別に熟練していない場合，アクリジンオレンジのよう
な染料を使用すると，誤った陽性判断を下しやすい。
血液によって運ばれる寄生中を分析するための他の方法
がある。本方法は現場用には適用できないが，研究用に
は適用可能である。本方法は，フロー・サイトメーター
（flow cytometer）及びチアゾールオレンジのような膜
透過性の核酸染料を使用してなる。本方法については，
マーカー（Marker）らによる「サイトメトリー（Cytome
ter），8:568(1987)」に説明されている。
一般には本方法は，患者から全血サンプルを単離するこ
と，そして血球をチアゾールオレンジで染色することを
含む。次いで，染色した血球を，FACScanTM〔ベクトン
・ディッキンソン・イミュノサイトメトリー・システム
ズ（Becton Dickinson Immunocytometry Systems）〕等
のフロー・サイトメーターに通す。血球がフロー・サイ
トメーターを通過する際に，血球は検知区域を実質的に
１回に１つ通過するが，このとき励起波長の光（通常
は，アルゴンレーザーからの波長488nmの光）によって
各血球を調べる。各血球によって散乱された光及び各血
球か発する蛍光を光検出器のような検知手段によって検
出し，そして検出された全ての光信号に基づいて各血球
を識別する。
前記文献中に説明されているように，血小板の染色が起
こると，核化した血球（nucleated cells）（未発達の
赤血球と全段階の白血球）のバックグラウンド染色が起
こる。白血球の染色は血球分析に関して“ゲートで制御
する（gated out）”ことができるけれども，核化した
赤血球と血小板の染色は“ゲート制御”することができ
ず，従ってバックグラウンドの蛍光を与え，これが寄生
中搬送血球の識別・確認に影響を及ぼすことがある。
従って，上記したような方法を改良された仕方で実施す
るのに必要とされるものは，核化した赤血球・白血球及
び血小板を殆どもしくは全く染色することなく，血液に
よって運ばれる寄生中の核酸を優先的に染色するような
染料である。
本発明は，一般式 （式中，RはCH3とCH2COOHからなる群から選ばれ；X-は
ハロゲンインオのようなアニオン，PO4 3-，SO4 2-，I
O4 -，CIO4 -，NO3 -及びNO2 -等の無機イオン，並びに酢酸
イオン，グルコース−６−リン酸イオン，及びＤ−グル
クロン酸イオン等の有機イオンである）を有する核酸染
料を含んでなる。Rはそれぞれの位置において同じであ
る必要はない。
本染料は488nmにて励起可能（460nmにおいて励起は最
大）であり，核酸の存在下に470〜550nmの間（478nmに
て最大発光）で蛍光を発する。本染料は，RNA核酸とDNA
核酸の両方を選択的に染色する。
本発明は，核酸を優先的に染色する新規な蛍光染料を含
んでなる。本蛍光染料は488nmにて励起可能であり，478
nmにて最大発光を呈する。RNAが存在すると，染料の蛍
光は7,000倍にも増大する。本染料の量子収率は約0.4で
ある。
本染料は，第Ｉ表に記載の方法に従って合成した。時に
明記しない限り，本明細書にて使用している化合物は，
全てアルドリッチケミカル社から市販されているもので
ある。中間体２と３は，ネイマン（Neiman）らによる
「Israel J.Chem. 3:161(1965)」に記載の方法を若干
変えて合成した。中間体４は，ブルーカー（Brooker）
らによる「J.Am. Chem. Soc., 67:1889(1945)」に記載
の方法に従って合成した。
融点は，トーマス・フーバー（Thomas Hoover）毛管融
点装置により測定した。NMRスペクトルはIBM WP-200SY
を使用して求め，化学シフトはテトラメチルシランを内
部標準として求めた。逆相イオン対によるHPLC分析は，
以下に記載の条件にて，ブラウンリー（Brownlee）シア
ノ4.6×220mmカラムを使用して，フォトダイオードアレ
ー検出器（photo diode array detection）検出器（200
〜600nm）備えたウオーターズ（Waters）860 ２ポンプ
システムにより行った：50mMのトリエチルアンモニウム
アセテートを水と混合して得られる溶液（pH 6.5）中
に５分間初期保持し，次いで50mMのトリエチルアンモニ
ウムアセテートに対して，アセトニトリル中に１時間で
直線状勾配になるようにした。デューク大学の質量分析
装置により，高分解の質量スペクトルを得た。
３−メチル−６−（メチルチオ）プリン(2)の合成 3gの６−（メチルチオ）プリン(1)，3.7gのｐ−トルエ
ンスルホン酸メチル，及び6mlのジメチルホルムアミド
を丸底フラスコ中に仕込んだ。
本混合物が透明黄色の溶液となるまで，本混合物を油浴
中にて110℃で2.5時間加熱した。
冷却後，溶液に20mlの水を加え，次いでエーテルで抽出
（20ml×３）して未反応の出発原料を除去した。合わせ
てエーテル抽出液を20mlの水で逆抽出し，水相を20mlの
エーテルで洗浄し，そしてこの水相を最初の水溶液と合
わせた。次いで，KOHを加えることによって本溶液を塩
基性(pH13)にした。数分後，溶液から白色結晶固定が析
出・沈澱した。本固体を濾過し，水で洗浄し，そして風
乾した。この白色結晶は３−メチル−６−（メチルチ
オ）プリン(2)であることが確認された。
3,7−ジメチル−６−（メチルチオ）プリンｐ−トルエ
ンスルホネート(3)の合成 0.80gの３−メチル−６−（メチルチオ）プリン(2)と0.
95gのｐ−トルエンスルホン酸メチルを丸底フラスコ中
に仕込んだ。本混合物を油浴中100℃で短時間加熱し
た。この均質溶液を冷却し，アセトンとエーテルで洗浄
した。洗浄後，反応混合物から非晶質の白色固体が生成
した。有機洗浄液を合わせたところ，白色結晶固定が生
成した。この結晶質固体(3)を上記非晶質体と合わせ，
精製することなくPUR-1の合成に使用した。
ヨウ化2,3−ジメチルベンゾチアゾリウム(4)の合成 金属製攪拌棒と還流冷却器を備えた丸底フラスコ中に，
4.8gのヨウ化メチルと5gの２−メチルベンゾチアゾール
を仕込んだ。本混合物を油浴中80℃で16時間加熱した。
ピンク色を帯びた白色固体(4)を冷却し，破砕し，アセ
トンを洗浄し，そして濾過した。
PUR-1の合成 電磁攪拌棒と還流冷却器を備えた丸底フラスコ中に，1.
28gのヨウ化2,3−ジメチルベンゾチアゾリウム(4)，約
1.50g(4.4mM)の粗製3,7−ジメチル−６−（メチルチ
オ）プリニウム・ｐ−トルエンスルホネート(3)，20ml
のメタノール，及び0.5mlのトリエチルアミンを仕込ん
だ。本混合物を約45分間還流すると，黄色固体を含有し
た赤色溶液が得られた。本混合を冷却し，濾過し，そし
てメタノールとエーテルで洗浄しすると，黄橙色の固体
が得られ，本物質は という構造式を有する３−メチル−２−〔3,7−ジメチ
ル−６−プリニリデン）−メチル〕−ベンゾチアゾリウ
ム(PUR-1)であることが確認された。
PUR-1は本発明の染料の好ましい実施態様であり，次の
ような特性を有する：mp＝340〜345℃；nmr(CD3OD) δ
3.97(s,3H)，3.99(s,3H)，4.27(s,3H)，6.56(s,1H)，7.
39(t,1H)，7.57(d,1H)，7.80(d,1H)，8.04(d,1H)，8.54
(s,1H)，及び8.85(s,1H)；HPLC（該成分に対する保持時
間30分），UVmax＝488nm；C16H16N05S01I01（M+）に対
する高分解FAB-MS計算値−310.1126，実測値−310.113
6。
ヨウ化2,3−ジメチルベンゾチアゾリウムの代わりに2,3
−ジメチルベンゾチアゾリウムｐ−トルエンスルホネー
トを使用することによって，PUR-1のｐ−トルエンスル
ホン酸を合成することができる。200MHzのNMR分光法に
よれば，PUR-1のｐ−トルエンスルホン酸塩は，次のよ
うな特性を有する：(CD3OD) δ8.66(s,1H)；8.31(s,1
H)；7.9-7.2(m,8H)；6.55(s,1H)；4.28(s,3H)；4.03(s,
3H)；3.98(s,3H)；2.30(s,3H)。
他の塩形態物は，ヨウ化物の形からアニオン交換法によ
って作製することができる。以下に簡単に説明する。ブ
ラウンリー・アクアポアー・アニオン（Brownlee Aquap
ore Anion）10×250mmカラムを通して，2.0ml/min．に
て溶離剤をポンプ送りした。約100mlの水でカラムをフ
ラッシュし，そして交換すべきアニオンのナトリウム塩
の1.0M溶液10mlで平衡状態にした。200mlの水を使用し
て，カラムから過剰の緩衝液をフラッシュした。染料の
ヨウ化物塩をカラムに注入し，水とアセトニトリルとの
1:1溶液で溶離した。
このような方法を使用して，PUR-1の塩をいくつか作製
した（第II表）。
本方法によって形成されるPUR-1のPO4 3-形態物及びSO4
2-形態物は，PUR-1のヨウ化形態物より溶解性が高いこ
とがわかった。従って，分析のために血液又は他の血液
成分が加えられる毛細管を被覆する場合には，ヨウ化形
態物よりこれらの形態物を使用するのが望ましい。
さらに，PUR-1のヨウ化形態物の溶解性は，窒素に結合
しているメチル基のいずれか又は全てをCH2COOHに置き
換えることによって改良される。このことは，化合物３
の合成においてｐ−トルエンスルホン酸メチルの代わり
にブロモ酢酸を使用することによって達成することがで
きる。
第１図においては，PUR-1のｐ−トルエンスルホン酸塩
をメタノール中に溶解して1mM溶液を調製した。本溶液
を，リン酸塩により緩衝された塩類（“PBS”）の溶液
にて２×10-5の濃度に，又は1mg/mlの濃度のRNA（トル
ライースト，シグマケミカル社）を含有したPBSの溶液
にて２×10-5Mの濃度に希釈した。RNAが存在しない場合
の最大吸光度は448nm（ε＝6.3×104M-1cm-1）であり，
RNAが存在する場合の最大吸光度は459nm（ε＝6.0×104
M-1cm-1であった。
第２図においては，PUR-1をPBS中に溶解して100μMの濃
度の溶液を調製した。3mlのキュベットに2.97mlのPBSと
30mlのPUR-1溶液を加えた。本溶液の蛍光発光を460nmの
励起波長を使用して測定した。RNAが存在しない場合
は，いかなる蛍光も観察されなかった。別のキュベット
に2.97mlのPBS，RNA溶液（1mg/ml，0.30ml），及び30μ
ｌのPUR-1溶液を加えた。上述したように蛍光発光を測
定した。478nmの最大吸光度にブロードな発光曲線が得
られ，量子収率は約0.4であった。
本明細書に記載の全ての文献及び特許出願は，本発明が
関する当業界の通常の技術レベルを示している。それぞ
れの文献又は特許出願が特定的に及び個別的に参照の形
で引用されているとしても，全ての文献及び特許出願を
それと同じ程度に参照の形でここに引用する。
特許請求の範囲に規定されている本発明の精神と範囲を
逸脱することなく本発明に対して多くの変形が可能であ
ることは，当技術者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は，PUR-1のヨウ化物塩の溶液に対し，RNAが存在
する場合としない場合について，波長(nm)に関して吸光
度をプロットしたものである。第２図は，PUR-1のｐ−
トルエンスルホン酸塩の溶液に対し，RNAが存在する場
合としない場合について，波長に関して蛍光をプロット
したものである。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式 （式中、ＲはCH3とCH2COOHからなる群から選ばれ、X-は
    アニオンであり、そしてｎは整数である）で表される化
    合物。
  2. 【請求項２】前記アニオンがハロゲンイオンである、請
    求項１記載の化合物。
  3. 【請求項３】前記アニオンがPO4 3-，SO4 2-，IO4 -，CIO4
    -，NO3 -およびNO2 -からなる群から選ばれる、請求項１
    記載の化合物。
  4. 【請求項４】前記アニオンが酢酸イオン、グルコース−
    ６−リン酸イオン、およびＤ−グルクロン酸イオンから
    なる群から選ばれる、請求項１記載の化合物。
  5. 【請求項５】X-がI-であり、ＲがCH3である、請求項２
    記載の化合物。
  6. 【請求項６】ＲがCH3であり、X-がPO4 3-またはSO4 2-で
    ある、請求項３記載の化合物。
  7. 【請求項７】生物学的サンプルを請求項１記載の化合物
    と接触させることを含む、前記サンプル中の核酸を染色
    する方法。
  8. 【請求項８】前記サンプルが血液またはその成分であ
    る、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】式 で表される化合物。
JP2158538A 1989-07-28 1990-06-16 新規蛍光染料 Expired - Lifetime JPH064768B2 (ja)

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US386904 1995-02-07

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KR (1) KR930008197B1 (ja)
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AT (1) ATE101182T1 (ja)
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CA (1) CA2015325C (ja)
DE (1) DE69006417T2 (ja)
DK (1) DK0410806T3 (ja)
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HU (1) HUT58738A (ja)
IE (1) IE66053B1 (ja)
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