JPH0638755B2 - ポリペプチドおよび蛋白質生成物、ならびにその製造方法および使用 - Google Patents

ポリペプチドおよび蛋白質生成物、ならびにその製造方法および使用

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JPH0638755B2 JP50233884A JP50233884A JPH0638755B2 JP H0638755 B2 JPH0638755 B2 JP H0638755B2 JP 50233884 A JP50233884 A JP 50233884A JP 50233884 A JP50233884 A JP 50233884A JP H0638755 B2 JPH0638755 B2 JP H0638755B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、クロラムフエニコールアセチルトランスフエ
ラーゼ（CAT）蛋白質の活性部分およびポリペプチドか
らなる融合蛋白質の製造方法、その融合蛋白質自体、そ
のポリペプチドの製造方法、その融合蛋白質をコードす
る遺伝子、その遺伝子を含むベクター、このベクターで
形質転換された宿主生物、ならびに抗体の産生方法に関
する。
遺伝子操作の組換えDNA技術によれば、宿主生物への外
来性遺伝子の挿入が可能である。そして、宿主生物の細
胞は外来性遺伝子がコードする蛋白質またはポリペプチ
ドを産生できるようになる。このような修飾もしくは形
質転換が行われた宿主生物によれば、工業的発酵技術を
用いたポリペプチドまたは蛋白質の大量生産が可能な、
再現性のある培養源が与えられる。
組換えDNA技術の適用によつて得られる生成物の多く
は、ヒトまたは動物ホルモンのようなポリペプチドであ
る。このポリペプチドが比較的小さい場合には、宿主生
物へのポリペプチドの蓄積は低濃度にしか至らないこと
が明らかにされている。このように蓄積の程度が低い
と、生成物の精製工程は長時間を要し、高価について、
経済性が著しく劣ることになる。生成物の蓄積が低い原
因の少なくとも一部は、宿主生物による外来性生成物の
分解的代謝回転によるものと考えられる。
外来性生成物の収率を増加させるためには、宿主生物に
蓄積することが知られている大きな蛋白質にポリペプチ
ド生成物が融合した融合生成物として外来性生成物を産
生させる方法がある。これは、選択された生物中に豊富
に産生することが知られた蛋白質をコードする遺伝子に
所望の生成物をコードする遺伝子を、読み取り枠を正し
く、介在停止コドンを含まないように連結することで達
成される。このような豊富に産生される蛋白質の例とし
ては、アントラニル酸シンテターゼ（Trp遺伝子生成
物）およびβ−ガラクトシダーゼ（lacZ遺伝子生成物）
がある。公告されたヨーロツパ特許出願ＥＰ−Ａ２−０
００１９３０号（Genentech Ino.）にはβ−ガラクトシ
ダーゼとソマスタチンからなる融合蛋白や、β−ガラク
トシダーゼとヒトインシュリンのＡまたはＢ鎖とからな
る融合蛋白が記載されている。このような融合蛋白は所
望のポリペプチドを得るために切断しなければならな
い。融合蛋白は、蛋白質中のメチオニン残基を選択的に
攻撃するシアノゲンブロマイドを用いて切断している。
偶然、所望の生成物がメチオニン残基を含んでいなかつ
たために、この切断操作で所望の生成物は影響されてい
ない。一般に、このような融合蛋白の回収および精製操
作は複雑で、高価につく。さらに、宿主生物による異種
ポリペプチドまたは蛋白質の産生は細胞代謝を疲労さ
せ、高レベルの産生は細胞系の安定性を低下させる。所
望のポリペプチドとの融合蛋白の形成に用いられた上述
の蛋白質は、通常のポリペプチド生成物に比較して大き
すぎる。したがつて、形質転換宿主生物によつて産生さ
れる融合蛋白中に占める所望のポリペプチドの割合はき
わめて小さく、製造過程の効率は低く、費用は高くな
る。
CATと原核蛋白質からなる融合蛋白は公知である。これ
らの融合蛋白は、細菌プラスミドでの欠失突然変異（Ii
daら：The EMBO Journal、１、No.６：７５５〜７５
９、１９８２）、自然クロラムフエニコール抵抗性復帰
細胞（Betz,J.L.ら：Gene、１５：１８７〜２００、１
９８１）、停止コドンの偶発的欠失（Goldfrab,D.S.
ら：Molecular Cloning and Gene Regulation in Bacil
li,Academic Press,Ganesan,A.T.ら：編、３１１〜３２
４、１９８２；Close,T.J.ら：Gene、２０：３０５〜３
１６、１９８２）によつて生じている。
本発明の目的は、宿主生物中に高レベルに産生可能な融
合蛋白の製造方法を提供するにある。本発明の目的はさ
らに、容易に単離、精製が可能で、容易に分裂して所望
のポリペプチドの生成が可能で、ポリペプチドに融合す
る蛋白質は比較的小さい蛋白である融合蛋白を提供する
にある。さらに、本発明の目的は、このような融合蛋白
をコードする遺伝子、このような遺伝子を含有するベク
ターおよびこのようなベクターで形質転換された宿主生
物を提供するにある。
本発明の第一の態様によれば、本発明は、クロラムフエ
ニコールアセチルトランスフエラーゼ（CAT）の活性部
分と真核ポリペプチドからなる融合蛋白の製造方法、す
なわち、その融合蛋白をコードする遺伝子を含有するベ
クターで形質転換した宿主生物を培養してその遺伝子を
発現させ、融合蛋白を単離する方法を提供する。
本発明の第二の態様によれば、本発明は、クロラムフエ
ニコールアセチルトランスフエラーゼ（CAT）蛋白質の
活性部分のカルボキシ末端に異種ポリペプチドが結合し
た融合蛋白の製造方法、すなわち、その融合蛋白をコー
ドする遺伝子を含有するベクターで形質転換した宿主生
物を培養してその遺伝子を発現させ、融合蛋白を単離す
る方法を提供する。
本明細書において用いられる「活性」の語は、融合蛋白
のCAT部分に、CAT基質に対する結合部位が存在すること
を示す。このCAT部分は、CAT基質に対しアセチルトラン
スフエラーゼとしての触媒活性をもつことが好ましい。
このCAT部分はCAT基質に可逆的に結合し、比較的緩和な
条件下に基質から除去できることが好ましい。このCAT
蛋白質の部分は全CAT蛋白質であつてもよく、その活性
部分でもまたその活性類縁体であつてもよい。
本明細書において用いられる「ポリペプチド」の語は、
２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合によつて直鎖状
に連結された化合物を意味する。この語には、一定の二
次構造（ポリペプチド鎖がたたまれる形態）を有する蛋
白質も、一定の二次構造を示さないポリペプチドも包含
される。しかしながら、ポリペプチドは鎖長の比較的短
いものであることが好ましい。
本明細書において用いられる「真核ポリペプチド」の語
は、真核生物中に天然に見出されるポリペプチドもしく
はその誘導前駆体、またはその類縁体を意味する。真核
生物は酵母のような単純な生物でも、また複雑な動物や
植物でもよい。
本発明の方法によつて産生された融合蛋白は、CAT基質
に対する触媒作用を検出または測定することにより、容
物に検出または定量が可能である。
本明細書において用いられる「異種」ポリペプチドの語
は、宿主生物に固有でないまたは通常は蓄積されないポ
リペプチドを意味する。
CATは豊富に産生され、容易に検知でき、比較的小さい
蛋白質である。したがつて、ポリペプチドとのCAT融合
蛋白の製造は、ポリペプチド製造経路としては有利であ
る。
上述の方法で製造されたCAT融合蛋白は、これまで天然
のCATの精製についてのみ知られたCAT基質親和性クロマ
トグラフイーによる精製（Zaidenzaig,Y.&Shaw,W.V.:FE
BS Lett.,６２、No.３：２６６〜２７１、１９７６）
が、驚くべきことに可能なことを発見した。これは、と
くにカルボキシ融合の場合、クロラムフエニコール結合
領域がCAT一次構造のカルボキシ末端近くに存在するこ
とから予期し得ないものであつた。融合蛋白は、CAT蛋
白質の活性部分が特異的に結合可能な基質を結合させた
固相を用い、親和性クロマトグラフイーによつて単離す
るのが好ましい。
このような基質親和性クロマトグラフイーは、酵素と基
質の間の選択的相互作用によるので、特異性がきわめて
高く、したがつて純度の高い生成物が得られるという利
点がある。
単離工程または精製工程では、CATの融合蛋白は固相に
不動化されたCAT基質と結合し、精製される。
CAT蛋白質の活性部分は、任意の原核蛋白質から誘導で
きる（Shaw,W.V.:CRC Crit.Rev.Biochem.,１４：１〜４
６、１９８３）。このようなCAT蛋白質の例としては、
腸内細菌CAT変異体（たとえばＩ、II、III型）およびブ
ドウ球菌変異体（たとえばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ型）があり、
本技術分野において公知である。これらの蛋白質は、全
蛋白質を使つてもよいし、またCAT基質への結合に必要
な活性部位が残つていれば、短縮した一部を使用するこ
ともできる。
CAT基質は、融合蛋白の部分を形成するCAT蛋白質の活性
部分に選択的に結合できるものであれば、任意のリガン
ドであつてよい。このガンドはクロラムフエニコール、
または「クロラムフエニコール塩基」のような類縁体
（Zaidenzaig,Y.& Shaw,W.V.参照）からなるものでよ
い。このリガンドは、アセチルCoAまたはCATによつて結
合されるこの化合物の類縁体からなるものでよい。さら
に、抗生物質フシド酸を認識しそれに結合するある種の
CAT変異体、たとえばＩ型CAT変異体、およびその類縁体
（Bennett,A.D.＆Shaw,W.V.：Biochem.J.，２１５：２
９〜３８、１９８３参照）、ならびにある種のトリフエ
ニルメタン染色（Proctor＆Rownd：J.Bactteriol.，１
５０：１３７５〜１３８２、１９８２）およびこのよう
な化合物は、CAT融合蛋白の親和性精製用リガンドとし
て使用できる。したがつて、不動化CAT基質は、任意の
適当なCAT結合リガンドまたはその適当な組合せからな
るものでよい。CAT基質は適当な不活性固相に、不可逆
的に、または化学的もしくは酵素的分解を受けやすい結
合（たとえばジスルフイド結合）を介して結合できる。
任意の適当なCAT基質親和性クロマトグラフイー操作がC
AT融合蛋白の精製に使用できる。融合蛋白を含有する形
質転換宿主細胞粗生成物を、たとえばカラムの形に不動
化したCAT基質に接触させて、融合蛋白を選択的に結合
させる。形質転換宿主細胞の他の粗生成物は洗浄操作に
よつて、結合した融合蛋白から分離される。たとえば、
結合した融合蛋白からなる固相を洗浄緩衝液で洗浄する
と、他の成分は溶出される。使用される洗浄緩衝液は融
合蛋白の結合が維持できる環境を与えるものが好まし
い。
洗浄後に、結合した融合蛋白を、通常は適当な溶出処
理、すなわち、融合蛋白を不動化基質から遊離させる溶
出緩衝液で固相を処することにより、回収できる。溶出
処理には１個または２個以上の要素、たとえばpH、イオ
ン強度、温度、その他の処理（たとえば有機溶媒もしく
は酸化還元試薬）が関与し、それによつて融合蛋白の結
合状態が変動して基質からの溶出が促進される。しかし
ながら、CAT基質の溶液による処理が溶出処理として好
ましい。溶出用の基質にはCAT基質として用いることが
できる任意のリガント、たとえばクロラムフエニコー
ル、アセチルーCoA、フシド酸、トリフエニルメタン染
料、およびこれらの類縁体を単独でまたは組合わせて使
用できる。とくに好ましい溶出緩衝液は、クロラムフエ
ニコール溶液からなるもので、たとえば0.6Ｍ食塩、５m
Mクロラムフエニコール含有溶液である。
好ましい宿主生物は細菌であり、培養基にはCAT蛋白質
によつて不活性化できるクロラムフエニコールまたはそ
の殺菌性類縁体が包含される。
CAT活性を有する融合蛋白の産生は、同時に蛋白の産生
と有用な選択マーカーを与える点で有利である。形質転
換された細菌は外来性遺伝子材料を含むベクターを拒絶
することが多い。本発明の方法で産生された融合蛋白自
体はクロラムフエニコールトランスフエラーゼ活性を有
する。したがつて、その産生は形質転換細菌にクロラム
フエニコールに対する抵抗性を付与する。したがつて、
形質転換細菌はクロラムフエニコール含有培養基中で生
育でき、この融合蛋白をコードする遺伝子を含むベクタ
ーを保持する細菌細胞の選択が起こる。さらに、組換え
DNAベクターは自然移動を起こし、選択マーカーが破壊
されやすい。CATの融合蛋白とポリペプチドにおける著
しい近接は、所望の生成物の遺伝子を有する形質転換細
胞のパーセンテージに影響するこのような移動の危険を
最小にする。
本発明の第三の態様によれば、本発明はクロラムフエニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）蛋白質の活
性部分と真核ポリペプチドからなる融合蛋白を提供する
ものである。融合蛋白は、本発明の第一の態様の方法に
よつて製造できる。
真核ポリペプチドはCAT蛋白質に、CAT蛋白質のアミノ末
端で融合しても、CAT蛋白質のカルボキシ末端で融合し
てもよい。たとえば、真核ポリペプチドをコードする遺
伝子を制限部位、たとえばＩ型CAT変異体遺伝子（Betz,
J.L.& Sadler,J.R.:Gene、１５：１８７〜２００、１９
８１）のCAT蛋白質コードDNA配列内に挿入する内部融合
によつて製造することができる。
しかしながら、ポリペプチドは、クロラムフエニコール
トランスフエラーゼ蛋白質のカルボキシ末端に結合させ
ることが好ましい。この種類の融合蛋白には多くの利点
がある。第一に、天然のCATプロモーターおよび／また
はそのリボソーム結合部位が単純でまたは他のプロモー
ターまたはリボソーム結合部位と組合わせて、融合蛋白
の発現に使用できることである。Ｎ未端融合では、真核
ペプチドのアミノ末端からメチオニン残基を除去する必
要を生じる。内部挿入では有核ポリペプチドの両端を切
断する必要が生じ、全体の過程をさらに複雑化する。
本発明の第四の態様によれば、本発明は、クロラムフエ
ニコールアセチルトランスフエラーゼ（CAT）蛋白質の
活性部分のカルボキシ末端に異種ポリペプチドが結合し
てなる融合蛋白を提供するものである。
真核もしくは異種ポリペプチドはCAT蛋白質に、選択的
化学もしくは酵素切断が可能な結合を介して結合してい
ることが好ましい。
本明細書において用いられる「選択的」切断の語は、真
核もしくは異種ポリペプチドに影響を与えないで実施で
きる切断を意味する。このような結合は、融合蛋白をコ
ーードするDNA配列中、ポリペプチドをコードするDNA配
列の末端にまたはその隣接部位に適当なDNA配列を挿入
し、DNAのレベルで設けるのが便利である。
２種の特別な結合がこの場合好ましい。第一の好ましい
結合はグルタミン酸アミノ酸残基ジラジカルである。真
核もしくは異種ポリペプチドとCAT蛋白質活性部分との
間へのグルタミン酸残基の挿入は、融合蛋白の切断によ
る真核もしくは異種ポリペプチドの遊離を可能にする。
融合蛋白は、Sorghumからの酸プロテアーゼ（EC３、
４、２３、１４−Grag,G.K.ら：Eur.J.Biochem.,１７、
No.４：１９７０）、ウニ孵化プロテアーゼ（EC３、
４、２４、１２−Lopez，C.W.ら：Biol.Bull.,１４７：
４８９、１９７４）または好ましくはブドウ球菌プロテ
アーゼ（EC３、４、２１、１９）を用いて、グルタミン
酸残基部位で切断できる。
また別法としては、リジン−アルギニンペプチドジラジ
カルを結合に用いることもできる。この部位での切断
は、マウスの下顎腺プロテアーゼまたは好ましくはクロ
ストリパイン（EC３、４、２２、８）を用いて切断でき
る。
このような結合の例としては、さらに４個のアミノ酸残
基からなる血液凝固因子Xa部位（Ileu-Glu-Gly-Arg+-
X）（EC３、４、２１、６）がある。
真核ポリペプチドは、ヒトまたは動物の免疫グロブリ
ン、アルブミン、酵素（たとえばキモシン）、酵素前駆
体（たとえばプロキモシン、プレプロキモシン）または
その誘導体もしくは類縁体）のような蛋白質であつても
よい。しかしながら、ポリペプチドは比較的小さいヒト
または動物ポリペプチドであることが好ましい。この種
のポリペプチドには、インシユリン、副腎皮質刺激ホル
モン（ACTH）、生長ホルモン、カルシトニンならびにそ
の前駆体および誘導体、たとえばカルシトニン−グリシ
ンが包含される。生成物は抗原性ペプチド、たとえば口
蹄疫ウイルス（FMVD）抗原性ポリペプチドであつてもよ
い。
しかしながら、好ましいポリペプチドはカルシトニンま
たはその誘導体である。もつとも好ましいポリペプチド
はカルシトニン−グリシンである。とくに好ましい融合
蛋白は、CAT蛋白質の活性部分、上述のような結合部お
よびカルシトニンまたはカルシトニン−グリシンからな
るものである。
本発明の第五の態様によれば、本発明は、クロラムフエ
ニコールアセチルトランスフエラーゼ（CAT）の活性部
分とポリペプチドからなる融合蛋白を、融合蛋白をコー
ドする遺伝子を含むベクターで形質転換された宿主生物
の培養基による遺伝子の発現によつて産生させる工程、
融合蛋白を切断する工程およびポリペプチドを単離する
工程によつてポリペプチドを製造する方法を提供する。
好ましくは、本発明の第三または第四の態様における融
合蛋白を本発明の第一または第二の態様における方法で
製造する工程、融合蛋白を切断する工程およびポリペプ
チドを単離する工程によつてポリペプチドを提供する方
法である。
好ましくは、融合蛋白を溶液中で切断後、この溶液のpH
をクロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ蛋
白質の活性部分が沈殿するようなレベルに調整し、ポリ
ペプチドを溶液中に残し、ポリペプチドを単離する方法
が採用できる。CAT蛋白質は酸溶液に不溶性なので、産
生されたポリペプチドが酸溶液に可溶性であれば、pHを
下げてCAT蛋白質を沈殿させて、不要のCAT蛋白質を所望
のポリペプチドから異成分分離する方法が有である。
融合蛋白がグルタミン酸残基結合でできている場合は、
融合蛋白の切断はブドー球菌プロテアーゼで実施する。
融合蛋白がジン−アルギニン結合でできている場合は、
切断はクロストリパインで行うのが好ましい。
切断工程を、親和性マトリツクス、たとえば融合蛋白の
精製に用いる親和性カラムに結合した融合蛋白に対して
実施することもできる。
天然のカルシトニンは、カルシトニン−グシンに酵素変
換を行い、ポリペプチドのカルボキシ末端に天然のアミ
ド化プロリンを産生させて製造できる。また、ポリペプ
チドがカルシトニンのアミノ酸配列をもつ場合（ただ
し、末端のプロリンはアミド化されていない）には、天
然カルシトニン（カルボキシ末端がアミド化されたプロ
リン）の類縁体がアミド化によつて製造できる。ただ
し、この場合、アミノ酸１５にアミド化を生じ、アスパ
ラギン酸はアスパラギンに変わつている。
本発明の第六の態様によれば、本発明は、本発明の第三
または第四の態様における融合蛋白をコードする遺伝子
を提供する。
本発明の第七の態様によれば、本発明は、本発明の第六
の態様における遺伝子を含有するベクターを提供する。
CAT融合蛋白をコードする組換えDNAを含有した表現ベク
ターを構築し、これらのベクターで宿主生物を形質転換
し、形質転換させた宿主細胞により融合蛋白を発現させ
る操作は、組換えDNA技術の分野でよく知られていると
ころに従つて実施できる。ベクターは形質転換宿主生物
中に、エピソームとしてまたは宿主染色体に組込まれて
保持されるプラスミドまたはウイルであつてよい。通
常、CAT蛋白質をコードするDNAの制限酵素切断、ついで
真核ポリペプチドをコードする異種遺伝子とのリゲーシ
ヨンによつて組換えDNAを調製する。異種遺伝子はCAT蛋
白質DNA配列の３′もしくは５′末端位置もしくは付近
に結合するか、またはそのDNA配列内に挿入される。異
種遺伝子はCAT蛋白質DNAの３′末端またはその付近に結
合させ、カルボキシ末端融合を生じさせるのが好まし
い。所望の組換えDNA配列の構築を容易にするため、CAT
蛋白質DNA配列に適当な制限酵素切断部位を導入する必
要がある。融合蛋白は強力な誘導プロモーターたとえば
trpプロモーターの下流にあることが好ましい。
本発明の第八の態様によれば、本発明は、本発明の第七
の態様におけるベクターで形質転換された宿主生物を提
供する。宿主生物は細菌宿主生物から選択されてもよい
し、また真核宿主生物たとえば酵母もしくは哺乳類細胞
から選択されてもよい。
本発明の第九の態様によれば、本発明は、本発明の第三
または第四の態様における融合蛋白で動物を免疫処置
し、ポリペプチドに対する抗体を産生させる方法を提供
する。
ある種のポリペプチド（とくに小さいポリペプチド）
が、抗体産生誘発のための免疫原として用いた場合、満
足すべき免疫応答を生じないことはよく知られている。
従前は、この種の小さなポリペプチドは大構造体たとえ
ばオボアルブミンに化学的に結合させて、免疫原に使用
してきた。本発明者らは、本発明の第三または第四の態
様における融合蛋白が抗体産生誘発のための免疫原とし
て作用することを発見した。かくして産生した抗体を免
疫処置動物から直接収穫するか、またはこの免疫応答を
モノクロナール抗体の形成に利用することができる。本
発明の本態様における方法は、それに対する抗体が必要
な抗原のエピトープを含むポリペプチドの場合、ワクチ
ンの製造に使用できる。
本発明の実施態様は、以下の実施例において、添付の図
面を参照しながら詳述する。図面は次のとおりである。
第１図は、天然CATをコードする遺伝子および上述のカ
ルボキシ末端融合蛋白をコードする遺伝子の５′末端ヌ
クレオチド配列である。
第２図は、上述のプラスミドの構築を模式的に示した図
である。
第３図は、上述のプラスミドの一部の生成物のSDSポリ
アクルアミドゲルを示す。ゲルのレーンは次のとおりで
ある。
レーン１ E.coliＨＢ１０１全細胞 レーン２ E.coliＨＢ１０１可溶性分画 レ−ン３ E.coliＨＢ１０１不溶性分画 レーン４ pBR３２８含有E.coliＣ６００からの基質
親和性精製天然CATI レーン５ プラスミドpAB７４含有E.coliＨＢ１０１
全細胞 レーン６ レーン５可溶性分画 レーン７ レーン５不溶性分画 レーン８ プラスミドpCT２０２４含有 E.coliＨＢ１０１全細胞 レーン９ レーン８可溶性分画 レーン10 レーン８不溶性分画 レーン11 レーン１０不溶性分画からの精製 CATI-lys-arg-hCT-glycine レーン12 プラスミドpCT２０２６含有 E.coliＨＢ１０１全細胞 レーン13 レーン１２可溶性分画 レーン14 レーン１２不溶性分画 レーン15 可溶性物質からの置換クロマトグラフイー
精製CATI-glu-hCT-glycine 第４図は、プラスミドpCT２０２４によつて表現された
融合蛋白を切断して製造したヒトカルシトニン−グリシ
ンについて行つたHPLCの結果を示す。
第５図は、ヒトカルシトニン−グリシンの空気酸化によ
る１，７ジスルフイド結合の生成をモニタリングする連
続HPLCの結果を示す。
第６図は、化学合成ヒトカルシトニン(A)と本発明の方
法で製造したヒトカルシトニン−グリシン(B)について
得られたHPLC結果を比較したものである。
第７図は、ヒトカルシトニン標品（ｈ−ＣＴ）とヒトカ
ルシトニン−グリシン（ｈ−ＣＴ−gly）についての生
物活性（ラツトの血清カルシウム濃度の低下により測
定）を比較したものである。
外来性ポリペプチドまたは蛋白質をＩ型CAT蛋白質のカ
ルボキシ末端に融合させた融合蛋白を発現するように宿
主生物を形質転換できる融合蛋白ベクタープラスミドの
構築を決定した。以下に述べるCAT基質親和性クロマト
グラフイー精製操作においては、融合蛋白クロラムフエ
ニコールとの構造類縁体たとえばクロラムフエニコール
塩基を認識し、それと結合する必要がある。すなわち、
融合蛋白は、不動化基質を認識して結合するための正し
いコンホーメーシヨンがとれるため、天然CAT蛋白質の
必要部分をもつていなければならない。
Ｉ型酵素は、選択された宿主生物E.coli中に高レベル発
現されることが知られているので（Bennett,A.D.& Sha
w,W.V.：Biochem.J.,２１５：２９〜３８、１９８
３）、Ｉ型変異体のカルボキシ末端融合ならば、高レベ
ル発現に必要な構造遺伝子の５′末端を破壊することが
ないと期待し、選択した。しかも、このような融合蛋白
の利用によれば、アミノ末端融合の場合に問題になる外
来性ポリペプチドまたは蛋白質生成物のアミノ末端から
のホルミルメチオニン残基の除去の必要がない。
しかしながら、クロラムフエニコールアセチルトランス
フエラーゼＩ型（CATＩ）遺伝子は、このような融合の
構築を可能にする３′暗号領域における適当な制限部位
をもつていなかつた（第１図）（現在では、制限酵素Sc
a１が市販されるようになつたので事情が変化してい
る）。
したがつて、天然酵素の主要部分を暗号化し、CATＩ遺
伝子の所望領域に有用な制限部位をもつたCATＩ融合ベ
クタープラスミドの１種を構築することとした。
基質親和性クロマトグラフイーを適用可能なCATＩ融合
蛋白質は一般に好ましい。不動化親和性基質の認識は触
媒活性と密接に関係する。したがつて、最適の融合ベク
タープラスミドは、クロラムフエニコールをアセチル化
する蛋白質を暗号化するものと考えられる。クロラムフ
エニコールは抗生物質であるので、そしてアセチル化は
抗生物質を不活性化するので、実用上もつとも好ましい
融合ベクタープラスミドはE.coliにクロラムフエニコー
ル抵抗性を付与する能力をもつものということになる。
したがつて、CATＩ融合ベクタープラスミド群の選択操
作の基準として、クロラムフエニコール抵抗性を用いる
ことに決定した。しかしながら、この選択は、出発遺伝
子は完全であるがそれが暗号化する蛋白質はクロラムフ
エニコール抵抗性を欠いている場合に、都合よく使用で
きる。
この種の適当なプラスミドは以前、弱いクロラムフエニ
コール抵抗性を示すＲ１００−Ｒプラスミド変異体のDN
AのPst１消化、ついでプラスミドpBR３２２のPst１部位
への単一Pst１断片の連結によつて単離されている（Iid
aら：EMBO J.,１：７５５〜７５９、１９８２）。プラ
スミドpBR３２２：cm１０４は、欠失によつてカルボキ
シ末端の最後の７個のアミノ酸残基が除去されたCATI酵
素をコードしていた。この除去は自然のin vivo突然変
異によるもので、同時にＩＳ１の挿入を生じていた。し
かしながら、生成したDNA分子はCAT1構造遺伝子の末端
に停止コドンをもつておらず、したがつてリボゾームは
ＩＳ１DNAから転与されたRNAを、フレーム内（同じ読み
とり枠内）に停止コドンが現れるまで蛋白質に翻訳する
ことになる。生成したCAT1蛋白質は天然酵素よりもアミ
ノ酸残基１９個分長く、最後の２６個のアミノ酸残基は
ＩＳ１DNA配列によつて指示されている（第１図）。
この突然変異構造遺伝子は、所望の融合蛋白を創成する
ために有用である適当な制限部位もなく、しかがつて一
連のDNA操作を行つた。
例１ CATI融合ベクタープラスミド群の構築 A) 融合ベクタープラスミドの構築 DNA操作は、Maniatisら（Molecular Cloning,Cold Spri
ng Harbor,New York,１９８２）の記載に主として従
い、わずかに改変して実施した。構築したすべてのプラ
スミドのCATI遺伝子の３′末端のDNA配列は、CATImet-
プロキモシンの場合を除いて、本技術分野でよく知られ
た２つの方法、すなわちMaxam & GilbertまたはＭ１３
ジデオキシンDNA配列決定法のいずれかによつて決定し
た。
上に概述した変異体CATI遺伝子を含有するPst１制限断
片をプラスミドpBR３２２：Cm１０４から単りし、プラ
スミドpAT１５３の脱ン酸化Pst１部位に連結した。プラ
スミドpAT／Cm１０４ｂ（第２図）は、この配置でCATI
およびβ−ラクタマーゼ両プロモーターが同一方向に転
写するので選択された。このクローニング手段は唯一の
Tth１１１Ｉ制限部位をもつプラスミドをまず構築する
ことにあつた。この切断部位はCATＩ構造遺伝子の末端
に結合したIS1 DNAに由来し、延長した２６個のアミノ
酸残基の１９番目のアミノ酸コドン中に存在する（第１
図）。
プラスミドpAT／Cm１０４ｂはTth１１１Ｉで線状化し、
BAL３１エキソヌクレアーゼで消化した。一連の時間経
過後にサンプルを採取し、過剰のEDTAを用いて反応を停
止させた。このBAL３１消化で生成した非ブラント末端
は、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片を用いて完全に対
合させた。これらのプラスミドDNA分子を次にウシ腸ホ
スフアターゼを用いて脱リン酸化した。次にキナーゼ処
理したリンカー、配列 ５′-TCAGATCTGGAGCTCCAGATCTGA-３′ のＲ１４０を各時点でのプラスミドサンプルに連結し
た。連結後、プラスミドDNAをSstＩ制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、各プラスミドにただ１個のリンカーが存
在することを確認するための再連結を行つた。
これらのDNA分子のセツトで次にE.coli DH１を形質転換
し、融合ベクタープラスミドを２０μｇ／mlのクロラム
フエニコール含有Ｌ−アガール上での激しい生育に基づ
いて選択した。
小規模のプラスミド調製を実施した。１個のSst１制限
部位（リンカーDNA由来）を有し、EcoＲ１およびBglII
で同時に消化したとき比較的小さいDNA断片を生成する
多くのプラスミドを単離した。DNA配列分析により、プ
ラスミドpAB７、pAB８およびpAB９にはリンカーDNAが３
個の読み取り枠のそれぞれでCATI構造遺伝子の３′末端
に付着していたことが明らかにされた（第１図および第
２図）。
プラスミドpAB１９をBglIIで消化し、脱リン酸化した。
これに、リジン−アルギニン−カルシトニン−グリシン
を暗号化するSau3A1制限断片を連結した。この断片はRo
ger Craig（Nature.２９５：３４５〜３４７，１９８
２）によつて単離されたcDNAクローンから誘導し、trp
Ｅタンパク質リジン−アルギニン−カルシトニン−グリ
シン融合プラスミド（プラスミドpE2；WO８４／００３
８０）から単離した。プラスミドpAB１９はCATIとフレ
ームシフトを起こさないで融合するように正しい読みと
り枠でBglII部位を含むので選択された。連結混合物で
E.coli DH１を形質転換し、テトラサイクン抵抗性コロ
ニーを選択した。これらのコロニーから小規模プラスミ
ド調製を行い、CATI遺伝子中のEcoR１部位に関し正しい
配置でのカルシトニン遺伝子由来Sph１制限部位の存在
をスクリーニングした。
プラスミドpAB７４を単離し、ウエスターン法で、CATI
よりわずかに大きく、オボアルブミン抱合ヒトカルシト
ニン標品に対して産生したウサギ抗血清に対して免疫反
応を示す蛋白質の存在を確認した（データは示していな
い）。しかしながら、DNA配列決定分析では、IS１DNAお
よびカルシトニンcDNAに見出される共通の９個のヌクレ
オチド配列の存在により in vivo組換えが起こつて、リジン−アルギニン酵素切
断部位の欠失していることが明らかになつた（第１図お
よび第２図）。
プラスミドpAB７４から発現されるCATI融合蛋白質のレ
ベルを調べるための予備的実験を行つた。これらの実験
で中等度のレベルの合成が認められた（第３図）。しか
しながら、CATIプロモーターからの発現は構造的に調整
され、そのため細胞の生育に悪影響を与えることが予期
された。
したがつて、CATI融合蛋白のより高レベルの合成を達成
するため、また細胞世代時間を短く維持するため、３種
の融合ベクター遺伝子すべてを、強力な誘導トリプトフ
アン合成（trp）プロモーターの制御下に置くこととし
た。
プラスミドpAB７、pAB８およびpAB１９をそれぞれ制限
酵素SstＩで消化し、Ｓ１エキソゲナーゼとインキユベ
ートした。フエノール／クロロホルム抽出後、エタノー
ルで沈殿させ、これらのブラント末端プラスミド分子を
TaqＩで消化し、塩基対約７５０のDNA断片を単離した。
これらの断片は全CATI融合構造遺伝子と３個の読み取り
枠にBglII部位を含むが、CATIプロモーターは欠いてい
る（第２図）。
これらのCATI遺伝子はプラスミドpCT５４のtrpプロモー
ターの制御下に置かれた（Emtageら：Proc.Natl.Acad.S
cl.USA，８０：３６７１〜３６７５，１９８３）。この
プラスミドは、高レベル発現がこの配列の上流、trpプ
ロモーターの下流にクローニングされた遺伝子に制限さ
れるように転写ターミネーター配列をもつているという
利点がある。プラスミドpCT５４をEcoＲ１で消化し、
５′付着端はDNAポリメラーゼＩのKlenow断片を用いて
完全に対合させた。この分子の酵素Cla１による制限、
ついで脱リン酸化により、上に単離されたCATI融合ベク
ター遺伝子カートリツジを受けいれる分子が創成され
た。この分子に各CATI遺伝子カートツジの３倍モル過剰
でのリゲーシヨンを行い、ついでE.coliHB１０１を形質
転換すると、クロラムフエニコール抵抗性融合ベクター
プラスミドpCT２０１、pCT２０２およびpCT２０３が得
られた（第１図および第２図）（この３つの場合いずれ
も、操作によりpCT５４のEcoＲ１部位の再生成が起こ
る。） B) CATI−カルシトニン−グリシン融合蛋白質プラスミ
ドの構築 上に構築したプラスミドのひとつ、pCT２０２を、高レ
ベルでCAT−ヒトカルシトニン−グリシン融合蛋白の発
現を誘導する２個のプラスミドのベースとして以下に使
用した。
融合ベクタ−プラスミドpCT２０２は、このプラスミド
のCAT遺伝子が唯一のBglII部位を、BglII−PstＩ断片上
の上述のプラスミドpE２から単離されたリジン−アルギ
ニン−カルシトニング．グリシンの遺伝子への融合に際
し正しい読み取り枠でもつことから、選択された。この
断片とBglII−PstＩ消化pCT２０２のリゲーシヨンで、
クロラムフエニコール抵抗性を付与するプラスミドpCT
２０２４が得られた（第１図および第２図）。
この融合蛋白はE.coliにより大量に産生される（第３
図）。しかしながら、ウエスターン法での最初の結果は
（データは示していない）、このバクテリアがこの融合
蛋白をin vivoで部分処理することを示した。さらに実
験を重ねたところ、所望の融合蛋白は不溶性分画に見出
された。さらにこの不溶性物質の抽出時に（以下の例２
参照）、細菌性プロテアーゼが融合蛋白をin vitroでさ
らに広範に切断することがわかつた。蛋白分解切断部位
を欠くプラスミドpAB７４により合成された融合蛋白の
実験で、この蛋白質は可溶性でしかも蛋白分解酵素の作
用を受けないことが明らかにされた（第３図）。これ
は、不溶性と蛋白分解に対する感受性がいずれも、カル
シトニンポリペプチド残基自体によるものではないこと
を示している。この時点で、融合蛋白切断酵素としてブ
ドー球菌プロテアーゼの使用を検討することとした。ブ
ドー球菌プロテアーゼは酸性残基の次を切断するが、こ
の特異性は一定の緩衝条件下にグルタミン酸までに低下
させることができる。予備実験により、適当な条件では
このプロテアーゼは、化学的に合成したヒトカルシトニ
ン標品には、このポリペプチドがグルタミン酸残基を含
まないので、きわめて低い活性しか示さないことが明ら
かにされた（データは示していない）。さらに、リジン
−アルギニン切断部位をグルタミン酸残基に変換する
と、CATI−カルシトニン蛋白質のカルボキシ末端におけ
る電荷分布を天然CATIの場合に類似の分布に戻す可能性
が考えられた。可溶性を復元することが期待されたので
ある。
プラスミドpCT２０４０をNarＩで消化し、最大の断片を
単離し、リゲーシヨンにより再び環化した（第２図）。
プラスミドpCT２０２４Narを単離し、これをBglIIおよ
びSphＩ制限酵素で２重消化し、このプラスミドにはそ
れぞれ１個しか存在しない部位で切断した（第２図）。
生成したプラスミド分子を次に、過剰量の以下のオリゴ
ヌクレオチド Ｒ２３２ ５′-GATCTGAATGTGGCAA−３′ Ｒ２３３ ５′-CAAGTAGACAGGTTGCCACATTCA−３′ Ｒ２３４ ５′-CCTGTCTACTTGCATG−３′ とリゲートさせた。
この３種のオリゴヌクレオチドのうち、後二者のＲ２３
３およびＲ２３４のみが、リゲーシヨン反応に先立ち、
キナーゼ処理した。生成したプラスミド分子でE.coli
HB１０１細胞を形質転換し、所望の形質転換細胞はアン
ピシリン（１００μｇ／ml）含有培地上で生育させて選
択した。形質転換、選択に続いて、得られたアンピシリ
ン抵抗性コロニーから小規模プラスミド調製を行い、こ
れらのDNAサンプルを制限酵素Acc１で消化した。Acc１
部位を含むプラスミド、pCT２０２６が単離され、クロ
ラムフエニコール抵抗性をもつことが示された（第１図
および第２図）。プラスミドpCT２０２６は可溶性CATI
融合蛋白、CATI−グルタミン酸−カルシトニン−グリシ
ンの高レベルでの誘導発現を指示する。これはCATI−リ
ジン−アルギニン−カルシトニン−グリシンよりはるか
に蛋白分解を受けにくい（第３図）（この構築に際して
は、pAB７４のin vivo生成に関与する９ヌクレオチド反
復配列を適当なコドン選択に変更した。これは遺伝暗号
の冗長によつて可能であつた。この変更が以後のこのプ
ラスミドのin vivoでの再転位の可能性を低下させるも
のであることが期待された）。
例２ CAT−カルシトニン融合蛋白の調製および切断 例１に述べたように、CATI−Lys−Arg−ヒトカルシトニ
ン（hCT）−GlyおよびCATI−Glu−hCT−Glyのそれぞれ
の表現をコードするプラスミドpCT２０２４およびpCT２
０２６が構築された。これらのプラスミドでE.coliHB１
０１細胞を形質転換するとこの形質転換細胞によつて融
合蛋白が高レベルに表現された。これらの融合蛋白の回
収、切断、および以後のhCT−Gly生成物の精製に用いら
れた方法は次のとおりである。
1) CATI−Lys−Arg−hCT−Gly A) 不溶性CATI−Lys−Arg−hCT−Gly融合蛋白の調製 プラスミドpCT２０２４を含有するE.coliHB１０１細胞
を、２０μｇ／mlのクロラムフエニコールを含む無機塩
補充メジウム中、１０の発酵槽を用い、３７℃で、指
数増殖期の後期まで生育させた。細胞を遠心分離（1,00
0rpm×１０分）で収穫した。細胞（湿重量２２ｇ）を１
００mM NaClおよび１mMEDTA含有５０mM Tris-HCl緩衝液
（pH8.0）６０mlに再懸濁した。この懸濁液にPMSF溶液
（8.3mg／mlエタノール）0.2mlおよびリゾチーム21.4mg
を加えた。２５分後に４％（ｗ／ｖ）デオキシコレート
溶液２mlを加え、得られた粘稠な懸濁液をさらに１０分
間放置した。0.6mgのDNase１を加え、この懸濁液を室温
にさらに３０分まで、粘度が著しく低下するまで放置し
た。この段階が完了したのち、懸濁液を遠心分離し（1
1,000rpm×５分）、上澄液は捨てた。不溶性のCAT-Lys-
Arg-hCT-Gly生成物からなるペレットを冷、緩衝化Trito
n×１００溶液（５０mM Tris-HCl、pH8.0；１０mM ED
TA；0.5％v/v Triton×１００；１００mM NaCl）９倍
容で洗浄し、遠心分離して（11,000rpm×５分）回収し
た。この洗浄操作についで２回くり返した。ペレットを
集め、上述したと同じpH8.0Tris-HCl懸濁緩衝液２０ml
に再懸濁した。融合蛋白の純度をSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（第３図）によつて調べ、残つた懸濁液
を１mlずつの分画にして−２０℃で保存した。
B) CATI−Lys−Arg−hCT−Glyの切断 上述の１ml分画５個、計４４mgの融合蛋白を解凍し遠心
分離した（15,000ｇ×１分、Eppendorf管）。遠心分離
で得られたペレットを0.14Ｍ２−メルカプトエタノール
含有、0.1Ｍ Tris−HCl緩衝7.5Ｍ尿素溶液（pH8.0）２
mlに再懸濁し、生成した融合蛋白溶液をついで３７℃に
おいて５〜１０分間インキユベートした。蒸留水1.5ml
を加えたのち、DTT活性化／PMSF処理クロストリパイン
（Sigma製品番号C0888）１mgを含む溶液を加えて消化を
開始した。３７℃で１０〜１５分間消化したのちトリフ
ルオロ酢酸（1.3ml、２０％v/v）を加えて反応を停止さ
せた。酸性溶液を氷上に１０〜２０分間放置したのち、
遠心分離（15,000ｇ×１５分、Eppendorf管）して生成
した白色の蛋白の沈殿を除去した。クロストリパイン処
理により融合蛋白は切断され、酸性上澄液にはhCT−Gly
が溶けている。
C) hCT−Glyの精製 上述のようにして調製した酸性上澄液2.5mlの分画２個
を、半製造逆相HPLCカラム（Synchropak RP-P，２５cm
×1.0cm）上にロードし、水中３０〜４０％アセトニト
リル：0.1％v/vTFA勾配を用いて、２０分で（２ml／
分、２２５nmで検出）溶出した。抗ヒトカルシトニン標
品抗血清による放射免疫定量法で、保持時間17.01およ
び18.83の２個の免疫反応性ピークが得られた（第４
図）。これらのピークを集め、凍結乾燥した。得られた
白色固体を２mM EDTA含有５０mM Tris−HCl（pH8.5）
２mlに溶解し、得られた溶液を室温に３０分間放置して
空気酸化させた。この間に、hCT−Glyの1,7ジスルフイ
ド結合の生成が、類似の逆相分析HPLCカラム（水中１０
〜５０％アセトニトリル：0.1％v/vTFA勾配、１２分
間、1.6ml／分、２２５nmで検出）によつてモニターさ
れた。空気酸化０、５および３０分後のHPLCの結果を第
５図に示す。主ピークの矢印を付したピークへのシフト
は１，７ジスルフイド結合の生成を示している。ジスル
フイド結合の生成が完結したと判定されたとき（３０
分）、残つた分画（1.75ml）すべてを上述のHPLC半製造
分離に付した。精製された組換えhCT−Glyのピークを凍
結乾燥し、分析HPLCに付して、その結果を化学合成hCT
標品の場合と比較した（第６図）。融合蛋白４４mgから
の純組換えhCT−Glyの収量は約1.1〜2.0mgで、切断工程
の収率は理論量の１９〜３５％に相当する。精製組換え
hCT−Glyの予想アミノ酸配列はFast Atom Bombardmen
t（FAB）質量スペクトル分析によつて確認された。
2) CATI−Glu−hCT−Gly A) 可溶性CATI−Glu−hCT−Gly融合蛋白の調製 例１に記載したように、組換えCATI−Glu−hCT−Gly融
合蛋白はE.coliHB１０１／pCT２０２６細胞によつて可
溶性蛋白質として産生され、したがつてCAT基質親和性
クロマトグラフイーを融合蛋白の回収および初期の精製
に使用した。CAT基質親和性クロマトグラフイーに用い
た方法および操作は天然のCATI酵素の精製に関し、Benn
ettおよびShawによつて概説されている方法（Biochem.
J.,２１５：２９〜３８，１９８３）とほぼ同じであ
る。
プラスミドpCT２０２６を含むE.coliHB１０１細胞は、
クロラムフエニコール２０μｇ／mlを含む無機塩補充メ
ジウム２００mlをとつた１のバツフルフラスコ５個で
指数増殖期の後期まで３７℃で生育させた。細胞（湿重
量２ｇ）を遠心分離（10,000rpm×１０分）してペレツ
ト化し、ペレツト化した細胞を１０nm EDTA含有５０mM
Tris−HCl（pH7.8）２０ml中に再懸濁し、ついで機械
的せん断により、細胞抽出液を得た。Bennett＆ Shaw
によつて報告されている６０℃への加熱工程は省略し
た。細胞抽出液を遠心分離（20,000rpm×２０分）し、
上清を0.1mM２−メルカプトエタノール含有上記緩衝液
で希釈した。これを基質親和性カラム（床容量５０ml）
上にロードし、ついで同一緩衝液で２８０nmの吸収が0.
02単位以下になるまで洗浄した。次にカラムを0.6Ｍ N
aCl含有上記緩衝液１０カラム容量で洗浄して、非特異
的に結合したE.coli蛋白質を除去した。ついでCATI−Gl
u−hCT−Gly融合蛋白をカラムから0.6ＭNAClおよび５mM
クロラムフエニコール含有上記緩衝液で溶出した。
クロラムフエニコールは２８０nm領域に吸収をもつの
で、この波長の吸収を融合蛋白溶出のモニタリングに使
用することはできなかつた。その代わりに、溶出分画の
クロラムフエニコールアセチル化活性の測定によつて溶
出をモニタリングした。融合蛋白はSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によつて、均一であり予想されたサイ
ズ、すなわち天然のCATI蛋白質よりも約3.5kd大きいと
判定された（第３図）。得られた融合蛋白の収量はクロ
ラムフエニコールアセチル化活化の定量により得られた
値と等しかつた。次に抗ヒトカルシトニン標品抗血清を
用いた放射免疫定量法により、融合蛋白がヒトカルシト
ニン（hCT）を含むことを確認した。
B) CATI−Glu−hCT−Glyの切断およびhCT−Glyの精製 この融合蛋白はhCT−Glyポリペプチド配列の直前にグル
タミン酸残基を有し、したがつて、融合蛋白の切断には
ブドー球菌プロテアーゼを用い、hCT−Glyポリペプチド
を遊離させた。切断には以下の操作を用いた。
上述のようにして得られたクロラムフエニコールアセチ
ル化活性を有するカラム溶出分画を、0.1Ｍ DTTおよび
２mM EDTA含有５０mM NH4HCO3緩衝液（pH7.55）中に
透析した。次に融合蛋白をブドー球菌プロテアーゼ（Si
gma，製品番号ｐ８４００）と、酵素：基質(w/v比１：
１００で混合し、３７℃で４時間インキユベートした。
インキユベーシヨン完結後、hCT−Glyポリペプチドを、
CATI−Lys−Arg−hCT−Gly融合蛋白から誘導されたhCT
−Glyの精製について上述したとほぼ同じ操作により、
分析的規模で精製した。両融合蛋白から得られたhCT−G
lyポリペプチドは、各種の基準でも区別できなかつた。
3) hCT−Glyのヒトカルシトニン標品への変換両融合蛋
白源からのhCT−GlyポリペプチドのＣ末端アミノ酸をつ
いで処理し、ヒトカルシトニン標品の末端、すなわちプ
ロリンアミドを生成する。
4) CAT−カルシトニン産生種の安定性 pCT２０２４／E.coli HB１０１およびpCT２０２６／E.
coli HB１０１株を１０の発酵槽中、クロラムフエニ
コール（２０mg／）を補充した最小培地中、長期間に
わたつて（約８０世代）生育させた。発酵の誘導段階を
通じて、表現レベルは高く維持され、両プラスミドとも
分離に対して完全に安定であつた。さらに、プラスミド
pCT２０２６は分子再転位に対しても完全に安定であつ
た（データは示していない）。
5) ヒトカルシトニン−グリシンポリペプチドの生物活
性 上述のようにして、CATI−Lys−Arg−hCT−Gly融合蛋白
から調製したカルシトニン−グリシンの生物活性をヒト
カルシトニン標品と、５０ｇのラツトを用いてMac Int
yreらの報告した静脈内注射プロトコール（Handbuch de
r innern Medizin IV／１Ａ、Knochenら編、Springer
Verlag,Berlin,６２３〜６３４，１９８０）に従い比較
した。結果は第７図に示すとおりで、ヒトカルシトニン
−グリシンはヒトカルシトニン標品の約0.1％のカルシ
ウム低下活性を５０ｇのラツトで示した。しかしなが
ら、この低下作用の持続は長い。
例３ CAT−カルシトニン−グリシン融合蛋白の免疫原として
の使用 カルシトニンは比較的小さなポリペプチド（３２アミノ
酸残基）で、したがつてそれ自身を抗体誘発の免疫原と
して使用しても満足できる結果は得られない。したがつ
て、より大きなCAT−カルシトニン−グリシン融合蛋白
を、カルシトニンに対する抗体誘発のための免疫原とし
て使用してみた。例１に述べたようにして、pAB７４／
E.coli HB１０１細胞によつて産生されたCAT−ヒトカ
ルシトニン−グリシン融合蛋白を免疫原として用いた。
この融合蛋白はCATIとヒトカルシトニン−グリシンアミ
ノ酸配列間の切断部位を欠いている。さらに、それは正
しいＣ末端プロリンアミド残基をもつていない。
抗体の誘発にはCBA／Balbc Ｆ１マウスを用いた。マウ
スに基質親和性精製CAT−カルシトニン−グリシン融合
蛋白（プラスミドpAB７４をもつE.coli HB１０１の細
胞から得た）１０μｇを、約３週間の間隔で３回連続投
与して免疫処置した。第２および第３の免疫処置から約
１４日後に、マウスから血清を採取し、ヒトカルシトニ
ンに対する抗体の存在を放射免疫法で調べた。第２の免
疫処置後の血清は陰性であつたが、第３の免疫処置後の
血清にはかなりの量のヒトカルシトニンに対する抗体が
検出された。
比較のために、プラスミドpBR３２８を含有するE.coli
Ｃ ６００の細胞から得られた天然CATI（上述のBenn
ett ＆ Shaw参照）１０μｇによつてもマウスを免疫
処置した。また、オボアルブミン担体蛋白質にグルター
ルアルデヒドで架橋した合成ヒトカルシトニン標品から
なる慣用のカルシトニン免疫原１０μｇでもマウスを免
疫処置した。得られた結果を下表に示す。CATI−hCT−G
ly融合蛋白は、強力な免疫原性を示すプロリンアミドエ
ピトープを欠いているにもかかわらず慣用のhCTオボア
ルブミン免疫原の場合とほぼ同等の抗体応答を示してい
る。
その他のCAT融合蛋白、たとえばCAT−ACTHも同様に抗原
を誘発できるものと判断できる。抗体誘発のこの手法
は、現在用いられている合成ペプチドによる方法より
も、大量の免疫原（たとえばワクチン用の）をはるかに
安価に製造する方法を提供するものである。
例４ Asn15ヒトカルシトニン製造用のCATI−カルシトニン融
合蛋白の構築 カルシトニン類縁体Asn15ヒトカルシトニンは、ヒトカ
ルシトニン類縁体カルシトニン（１〜３１）＋プロリン
（すなわちヒトカルシトニン標品の場合のように、カル
ボキシ末端はプロリンアミドでなくプロリンである）を
化学的にアミド化して製造できる。
融合蛋白CATI−リジン−アルギニン−カルシトニンおよ
びCATI−グルタミン酸−カルシトニン表現のためのプラ
スミドDNA構築体は、CATI−リジン−アルギニン−カル
シトニン−グリシンおよびCATI−グルタミン酸−カルシ
トニン−グリシンをコードするプラスミドDNA構築体と
同様にして調製された。プラスミドD13（国際特許出願
第WO８４／００３８０号）をBgl IIおよびPst１で消化
し、リジン−アルギニン−カルシトニンポリペプチドを
コードする断片をBglIIおよびPst１消化プラスミドpCT
２０２１に連結させた。これにより、クロラムフエニコ
ール抵抗体プラスミドpCT２０２３が得られた（第１
図）。ヒトカルシトニン（１〜３１）プロリンポリペプ
チドは、E.coliHB１０１／pCT２０２４から精製された
ヒトカルシトニン−グリシンポリペプチドと同様にし
て、融合蛋白から精製できるものと期待される。しかし
ながら、好ましい態様における宿主菌株はE.coliHB１０
１ではなく、アンバーサプレツサー突然変異を欠くE.co
li菌株であると思われる。それは、この構築体に使用さ
れた停止コドンはいわゆるアンバー停止コドン(TAG)だ
からである。アンバーサプレツサー変異をもつ菌株はこ
の停止コドンをアミノ酸コドンと誤読し、そのため異常
な延長された融合蛋白を産生することがある。CATI−グ
ルタミン酸−カルシトニン融合蛋白をコードするプラス
ミドpCT２０２５（第１図）は、pCT２０２４からpCT２
０２６を単離した場合をまつたく同様の一連の操作によ
つてpCT２０２３から単離された。このプラスミドはE.c
oliにクロラムフエニコール抵抗性を付与し、上に概略
を述べた理由によりアンバーサプレツサー変異を欠くE.
coli宿主菌株中で表現させることが好ましい。
例１に述べたクロラムフエニコール抵抗性融合ベクター
プラスミドpCT２０１、pCT２０２およびpCT２０３につ
いて、ヒトカルシトニンおよびヒトカルシトニン−グリ
シンのほかの外来性ポリペプチドおよび蛋白質の表現に
使用できるかどうかを調べた。以下の例は実施された特
定の実験について述べたものであるが、本発明の融合ベ
クタープラスミドが、一般に外来性ポリペプチドおよび
蛋白質の表現に広く適用できることを示すものである。
例５ CATI−Metプロキモシン融合蛋白の製造 Met−プロキモシン遺伝子はEmtageらの報告（PNAS，８
０：３６７１〜３６７５，June，１９８３）にあるプラ
スミドpCT６７から得られた。Met−プロキモシン遺伝子
はpCT６７からBclＩ断片上に単され、この断片はBglII
切断脱リン酸化プラスミドpCT２０２とリゲートした。
E.coliHB１０１細胞をこのリゲーシヨン混合物で形質転
換し、形質転換体はアンピリシン（１００μｇ／ml）含
有Ｌ−アガール上で生育させて選択した。挿入DNA断片
が正しい方向性をもつたプラスミドpCT２０２６７を小
規模製造プラスミドのEcoＲ１消化で単離した。E.coliH
B１０１／pCT２０２６７菌株をクロラムフエニコール２
０μｇ／ml含有Ｌ−肉汁生育培地で培養した。SDSポリ
アクルアミドゲル電気泳動でCATI−met−プロキモシン
融合蛋白として期待されたサイズをもつと判断された不
溶性蛋白質が高レベルに表現された。E.coliHB１０１／
pCT２０２６７からの細胞抽出物はウサギ抗キモシン抗
血清に免疫応答を示した。
この不溶性蛋白質を可溶化し酸処理すると、ウシキモシ
ン標品が生成した。たとえば、この不溶性蛋白質は濃尿
素溶液中で可溶化し、ついで酸処理してウシキモシン標
品を得ることができる。
例６ CATI−ACTH融合蛋白の製造 E.coliに至適化されたコドンを有し、適当なベクターに
連結したとき、ACTH中のアミノ酸残基−１〜＋１４から
なるポリペプチドをコードする合成遺伝子を調製した。
６種の合成オリゾヌクレオチドが得られた。
Ｒ２４２ ５′GAACACTTCCGTTGGGGTA３′ Ｒ２４３ ５′GATCTTACTCTATG３′ Ｒ２４４ ５′AACCTGTTGGTTGATCAGA３′ Ｒ２４５ ５′GAAGTGTTCCATAGAGAA３′ Ｒ２４６ ５′CAACAGGTTTACCCCAACG３′ Ｒ２４７ ５′AGCTTCTGATCAAC３′ オリゴヌクレオチドＲ２４２、Ｒ２４４、Ｒ２４５、Ｒ
２４６およびＲ２４７をリン酸化し、Ｒ２４３に加え、
すべてを過剰のBglII／HindIII切断プラスミドpCT２０
２と混合した。リゲーシヨン後に生じたプラスミド混合
物でE.coliHB１０１細胞を形質転換し、E.coliHB１０１
／pCAT−ACTH形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ml
含有メジウム上で生育させて選択した。E.coliHB１０１
／pCATACTH細胞を２０μｇ／mlのクロラムフエニコール
含有無機塩補充メジウム中で指数増殖期の後期まで生育
すると、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて
予想のサイズをもつと判断された部分可溶性の融合蛋白
が高レベルに表現された。
精製CAT−ACTH融合蛋白を回収し、イオン交換クロマト
グラフイーで精製した。CAT−hCT−Gly融合蛋白の場合
と同様、CAT−ACTH融合蛋白はACTHに対する抗体を誘発
するための免疫原として使用するのに適している。
同様にCAT−口蹄疫ウイルス（FMDV）抗原性ペプチド融
合蛋白の表現、また上述のLys−Argおよびグルタミン酸
切断部位以外の切断部位たとえば血液凝固因子Xa部位を
含有するCAT−カルシトニン融合蛋白の表現のための融
合蛋白ベクターが構築された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ローウエ，ピーター アンソニー イギリス国アールジー６ ２ビーエヌ バ ークシヤー，リーデイング，メルローズ アベニユー ９ (72)発明者 ヘンツシエル，クリストフアー クライブ ガブリエル イギリス国ダブリユ９ １エイユー ロン ドン，クリフトン ガーデンズ 48

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】クロラムフェニコールアセチルトランスフ
    ェラーゼ(CAT)基質に結合し得るCAT蛋白質の一部とポリ
    ペプチドからなる融合蛋白をコードする遺伝子を含有す
    るベクターで形質転換した細菌宿主を培養してその遺伝
    子を発現させることにより融合蛋白を製造する工程、そ
    の融合蛋白を切断する工程およびポリペプチドを単離す
    る工程からなるポリペプチドの製造方法。
  2. 【請求項２】ポリペプチドが真核ポリペプチドである請
    求の範囲第１項の方法。
  3. 【請求項３】真核ポリペプチドがクロラムフェニコール
    アセチルトランスフェラーゼ(CAT)蛋白質の一部のカル
    ボキシ末端に結合している請求の範囲第２項の方法。
  4. 【請求項４】ポリペプチドがクロラムフェニコールアセ
    チルトランスフェラーゼ(CAT)蛋白質の一部のカルボキ
    シ末端に結合した外来性ポリペプチドである請求の範囲
    第１項の方法。
  5. 【請求項５】融合蛋白は、CAT蛋白質の一部が特異的に
    結合できる基質を結合させた固相を用い、親和性クロマ
    トグラフィーで単離する請求の範囲第１項〜第４項のい
    ずれか一つの方法。
  6. 【請求項６】培養基はクロラムフェニコールまたはその
    殺菌性類縁体を含有する請求の範囲第１項〜第５項のい
    ずれか一つの方法。
  7. 【請求項７】ポリペプチドはCAT蛋白質の一部と、選択
    的な化学的または酸素的切断が可能な結合部を介して結
    合している請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一つの
    方法。
  8. 【請求項８】結合部はグルタミン酸アミノ酸残基のジラ
    ジカルである請求の範囲第７項の方法。
  9. 【請求項９】結合部はジン−アルギニンペプチドのジラ
    ジカルである請求の範囲第７項の方法。
  10. 【請求項１０】融合蛋白を溶液中で切断後、溶液のpHを
    CAT蛋白質の一部を沈殿させる値に調整して、ポリペプ
    チドを溶液中に残し、ポリペプチドを単離する請求の範
    囲第１項〜第９項のいずれか一つの方法。
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8412517D0 (en) * 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
EP0196056B1 (en) * 1985-03-28 1991-05-22 Chiron Corporation Improved expression using fused genes providing for protein product
US5342921A (en) * 1985-03-28 1994-08-30 Chiron Corporation Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
EP0206769B2 (en) 1985-06-20 1999-11-10 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. A process for the production of alpha-human atrial natriuretic polypeptide
EP0241546A4 (en) * 1985-10-11 1988-11-02 Genetics Inst METHOD FOR PRODUCING HETEROLOGICAL PROTEINS.
ES2043610T3 (es) * 1986-01-31 1994-01-01 Sagami Chem Res Procedimiento para la produccion de un polipeptido hibrido del tipo activador de plasminogeno.
SE8601940D0 (sv) * 1986-04-25 1986-04-25 Kabigen Ab Preparation of fused proteins, antibodies and processes therefor
US4859609A (en) * 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
US5013653A (en) * 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5215896A (en) * 1987-03-20 1993-06-01 Creative Biomolecules, Inc. Leader sequences for the production of recombinant proteins
FR2615528B1 (fr) * 1987-05-18 1991-05-24 Pasteur Institut Procede de production d'un polypeptide ayant des proprietes choisies determinees, dans un organisme-hote transforme par un adn recombinant contenant des sequences nucleiques codant pour ce polypeptide et pour une proteine affine d'ose
DE3731875A1 (de) * 1987-09-18 1989-03-30 Schering Ag Gentechnische herstellung von neukombinierten plasmiden fuer die produktion von humanem adrenocorticotropen horman (acth) und davon abgeleiteten derivaten durch enzymatische spaltung primaer synthetisierter fusionsproteine
JP2653820B2 (ja) * 1988-03-14 1997-09-17 壽之 松尾 アミド化酵素及びその製造方法
WO1990001540A1 (en) * 1988-08-11 1990-02-22 California Biotechnology Inc. Method for stabilizing heterologous protein expression and vectors for use therein
WO1990002187A1 (en) * 1988-08-30 1990-03-08 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Recombinant fusion proteins for altering hormone secretion
JP2852431B2 (ja) * 1988-12-07 1999-02-03 財団法人阪大微生物病研究会 レトロウイルスのプロテアーゼ、逆転写酵素及びエンドヌクレアーゼ、並びにこれ等の酵素の製法
WO1990012877A1 (en) * 1989-04-19 1990-11-01 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
AU6642390A (en) * 1989-10-27 1991-05-31 Arch Development Corporation Methods and compositions for promoting immunopotentiation
AU649640B2 (en) * 1990-05-28 1994-06-02 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University, The A method of preparing a plasmid, the plasmid and expression products thereof
US5595887A (en) * 1990-07-16 1997-01-21 Bionebraska, Inc. Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment
US6316004B1 (en) * 1993-06-22 2001-11-13 T. Tikhonenko Chimeric somatostatin containing protein and encoding DNA, plasmids of expression, method for preparing chimeric protein, strain-producers, immunogenic composition, method for increasing the productivity of farm animals
AU4415796A (en) * 1994-12-07 1996-06-26 Bionebraska, Inc. Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs
US5962270A (en) * 1996-02-06 1999-10-05 Bionebraska, Inc. Recombinant preparation of calcitonin fragments and use thereof in the preparation of calcitonin and related analogs
ATE323765T1 (de) * 1998-07-10 2006-05-15 Scios Inc Verfahren zur herstellung eines peptids mit einem pi grösser als 8 oder kleiner als 5
US20030190740A1 (en) * 1998-10-13 2003-10-09 The University Of Georgia Research Foundation, Inc Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use
CA2346122C (en) 1998-10-13 2013-01-22 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis and use
US6461834B1 (en) 1998-11-06 2002-10-08 Bionebraska, Inc. Clostripain catalyzed amidation of peptides
DK1035133T3 (da) 1999-02-17 2005-05-02 Pfizer Prod Inc Fusionsproteiner, der omfatter bærere, som kan inducere et dobbelt immunrespons
CA2485703A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Fred W. Wagner Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides
US7714111B2 (en) * 2006-09-08 2010-05-11 Wyeth Llc Arginine derivative wash in protein purification using affinity chromatography
SG194368A1 (en) 2007-05-04 2013-11-29 Technophage Investigacao E Desenvolvimento Em Biotecnologia Sa Engineered rabbit antibody variable domains and uses thereof
CA3163776A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Foundation Medicine, Inc. Human papilloma virus as predictor of cancer prognosis
US10227384B2 (en) 2013-04-12 2019-03-12 Yale University Modified proteins and methods of use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
CA1200773A (en) * 1980-02-29 1986-02-18 William J. Rutter Expression linkers
JPS58501121A (ja) * 1981-07-15 1983-07-14 セルテク　リミテツド ヒト　カルシトニン前駆体ポリ蛋白質構造遺伝子

Also Published As

Publication number Publication date
GB8314362D0 (en) 1983-06-29
US5093241A (en) 1992-03-03
DE3477810D1 (en) 1989-05-24
EP0131363B1 (en) 1989-04-19
ATE42339T1 (de) 1989-05-15
WO1984004756A1 (en) 1984-12-06
EP0131363A1 (en) 1985-01-16
JPS60501391A (ja) 1985-08-29
CA1306207C (en) 1992-08-11

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