JPH0636759B2 - 個々の症例における抗腫瘍処置の効果を予測する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、化学療法の前もしくはその過程の初期に１種
もしくはそれ以上の選択された抗腫瘍(antineoplastic)
剤の効果を予測する方法に関するものである。

［従来の技術］ 癌の治療方法は照射線療法、外科療法および化学療法を
包含する。化学療法が広範に使用されているが、指定さ
れる化学療法剤またはその組合せは必ずしも軽快を得る
のに成功を収めていない。極めてしばしば、指定された
化学療法の過程が開始されても癌の軽快を得るのに失敗
するだけである。化学療法は、医者がその処置を不成功
であると結論しかつ他の化学療法剤を断定しうる前に、
この化学療法を１週間または数ケ月にもわたって継続す
ることがある。無効な化学療法法の期間中に貴重な時間
が失われる。

患者からの腫瘍細胞に対する活性につき抗癌剤を選択し
うるインビトロ法として、腫瘍細胞のクロノジェニック
分析が提案されている。臨床的反応もしくは耐性を予測
する試験として、ハンバーガーおよびサルモンのヒト腫
瘍クロノジェニック分析［サイエンス、第197巻、第461
〜463頁(1977)］が提案されている［ジョーンズ等、ジ
ャーナル・クリニカル・オンコロジー、第３巻、第92〜
97頁(1985)］。この種の方法は細菌感染を有する患者に
おける抗生物質の選択性試験と同類であり、化学療法に
対する反応性を予測するものとして細胞の生存に基づい
ている。しかしながら、これらの方法は信頼性がない
［セルビー等、Ｎ．Engl.J.Med.、第308巻、第129〜134
頁(1983)］。

古典的研究において、プライスラー等［ジャーナル・セ
ルラー・バイオケミストリー、補遺11Ａ、アブストラク
トNO.Ｄ510、第237頁(1987)］は、白血病患者における
プロト−オンコゲンｃ−ｍｙｃおよびヒストンＨ３の発
現と化学療法に基づく軽快との間の相関関係を認めてい
る。他の古典的試験においては、急性骨髄細胞白血病患
者の骨髄細胞から分離されたｃ−ｍｙｃ ＲＮＡのレベ
ルが完全軽快した他の群の患者から分離された細胞にお
けるよりも高いことが観察された［プライスラー等、キ
ャンサー・リサーチ、第47巻、第874〜880頁(1987)］。
長期間にわたる化学療法の後の生長調節遺伝子発現にお
けるこの種の古典的な相関関係は、生長調節遺伝子発現
における薬剤特異性の変化に基因するのでなく、寧ろ腫
瘍細胞死滅および細胞ｍＲＮＡの全般的低下に基因す
る。

さらに、必要とされることは、化学療法を開始する前ま
たはその直後に個々の患者に対して特定化学療法剤もし
くは薬剤組合せがもたらしうる効果を決定して、最も有
効な化学療法を用いうるようにする方法であることは明
らかである。

［発明の要点］ 本発明によれば、腫瘍(neoplastic)疾患を有する動物、
人などの生物検体における抗腫瘍(antineoplastic)剤ま
たは抗腫瘍剤の組合せの効果を予測する方法が提供され
る。検体から得られた腫瘍細胞における少なくとも１種
の生長調節遺伝子の発現レベルが決定される。化学療法
は、検体に抗腫瘍剤を加えて開始される。生長調節遺伝
子の発現レベルは、抗腫瘍剤を加えた後かつ腫瘍細胞の
死滅開始前、すなわち好ましくは抗腫瘍剤を加えてから
約６〜約48時間後、特に好ましくは約24〜約48時間後に
検体から得られた腫瘍細胞につき決定される。抗腫瘍剤
を加える前後の生長調節遺伝子の発現レベルが比較され
る。遺伝子の発現レベルにおける有意の低下の存在もし
くは不存在が、抗腫瘍剤での継続療法により軽快をもた
らすかどうかを示す予測値となる。本発明は、抗白血病
療法における抗腫瘍剤の効果を予測するのに特に有用で
ある。

本発明の他の特徴によれば、腫瘍細胞を抗腫瘍剤と共に
インビトロで培養する。したがって、検体から得られた
腫瘍細胞における少なくとも１種の生長調節遺伝子の発
現レベルを決定する。次いで、細胞を抗腫瘍剤と共にイ
ンビトロで培養する。生長調節遺伝子の発現レベルを再
び腫瘍細胞死滅の開始前に決定し、かつ細胞を抗腫瘍剤
と共に培養する前に発現レベルと比較する。好ましく
は、少なくとも１種の非細胞サイクル依存性遺伝子の発
現レベルをも生長調節遺伝子の発現と同時に決定する。
非細胞サイクル依存性遺伝子の発現が常に存在すること
は、抗腫瘍剤に基づく生長調節遺伝子の発現にて観察さ
れる全ての低下が生長調節遺伝子に対し特異性でありか
つ細胞ｍＲＮＡもしくは細胞質減少の全般的阻止の結果
でないことを示す。

遺伝子発現は、便利には特異性ＲＮＡを検出するのに有
効な各種の核ハイブリッド化技術によって決定すること
ができる。この種の方法は当業者に周知されている。

今回、腫瘍疾患を処置する際に特定の抗腫瘍剤（すなわ
ち抗癌剤）による処置過程が成功するかどうかを、薬剤
を最初に与えた後できるだけ早い検体の腫瘍細胞におけ
る或る種の遺伝子の発現レベルの変化を決定することに
より、各検体につき予測しうることが突き止められた。
さらに、抗腫瘍剤を１回与えた後の腫瘍細胞における生
長調節遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）
レベルの低下は完全軽快を示唆する一方、これらｍＲＮ
Ａの低下が存在しないことは特定の療法に対する反応に
おいて検体の最終的軽快を達成しえないことを示唆する
ことも突き止められた。事実、生長調節遺伝子の発現レ
ベルにおける検出可能な変化は、化学療法の過程を開始
してから数時間以内に生ずることが判明した。同時に、
非細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルは常に一定と
なる。

本発明の試験法は、生長調節遺伝子が正常組織と対比し
て過度に（すなわち高度に）発現されることが知られた
全ゆる悪性腫瘍にて抗腫瘍化学療法の成功を予測するの
に特に有用である。限定はしないが、例としては肺の小
細胞癌；肺、胸部、結腸もしくは前立腺の腺癌；睾丸お
よび卵巣の癌；並びに或る種の肉腫、たとえば骨の骨肉
腫が包含される。さらに、本発明は小児癌、神経芽細胞
腫およびウィルムス腫瘍における化学療法の効果を予測
する際に使用することもできる。

白血病は、白血球の成熟が細胞発生の初期段階で停止す
る腫瘍疾患である。この疾患は、骨髄における白血病芽
細胞の個数増加、および正常な成長造血細胞生成におけ
る種々な程度の欠損を特徴とする。この状態は急性また
は慢性のいずれかである。さらに白血病は、典型的には
リンパ球性（すなわち正常なリンパ球に共通の性質を有
する細胞により特性化される）または骨髄球性（もしく
は骨髄性、すなわち正常な顆粒球細胞の幾つかの特徴を
有する細胞により特性化される）のいずれかとして分類
される。急性リンパ球白血病（「ＡＬＬ」）はリンパ様
組織に発生し、通常の最初の徴候は骨髄におけるその存
在である。急性骨髄球白血病（「ＡＭＬ」）は、骨髄造
血幹細胞またはその後代から発生する。「急性骨髄球白
血病」という用語は、白血病すなわち骨髄芽球白血病、
前骨髄白血病および骨髄単球白血病の幾つかの亜型を包
含する。さらに、赤血球もしくは巨核球の性質を有する
白血病も骨髄性白血病と考えられる。

慢性の骨髄性白血病（すなわち慢性顆粒球白血病）は血
液、骨髄、脾臓、肝臓、およびしばしばその他の組織に
おける未成熟顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）
の異常な増殖を特徴とする。慢性骨髄白血病患者の大部
分は急性型の疾患から区別しえないパターンへの移行に
発展する。この変化は「ブラスト・クライシス」として
知られている。本発明は、ＡＬＬおよびその公知の亜
型、ＡＭＬおよびその公知の亜型、並びにブラスト・ク
ライシスにおける慢性骨髄白血病の処置における特定薬
剤の効果を予測するのに特に有用である。

本発明の具体例によれば、或る種の腫瘍疾患を有するが
未だ化学療法を受けてない検体から腫瘍細胞の試料を採
取する。この試料採取は、化学療法の開始前に行なわれ
る。白血病検体を試験するため骨髄細胞は腫瘍細胞の原
料となるが、静脈穿刺により容易に入手しうるため末梢
血液白血球を利用するのが好適である。腫瘍細胞におけ
る１種もしくはそれ以上の生長調節遺伝子の発現レベ
ル、すなわち問題とする遺伝子のｍＲＮＡ転写の相対数
は、たとえば目標ｍＲＮＡ転写に特異的なＲＮＡもしく
はＤＮＡプローブを用いる各種の核酸ハイブリッド化技
術のいずれかにより決定される。

「生長調節遺伝子」という用語は、発現が細胞サイクル
の進行およびその後の細胞増殖に関連する遺伝子を意味
する。この種の遺伝子は、非分裂性（すなわち休止）細
胞では発現されず或いは低レベルで発現される。生長調
節遺伝子は、G₀細胞が生長因子により刺戟された際に優
先的に発現することができる。生長調節遺伝子の同定
は、一般にｃＤＮＡの分別スクリーニングによって行な
われる。生長調節遺伝子を検出するためのｃＤＮＡ保存
物のスクリーニング法は当業者に周知されている。ｃＤ
ＮＡ保存物中に示される遺伝子の約0.5〜1.0％が生長調
節性であると思われる。

従来、多くの生長調節遺伝子が確認されている。この種
の遺伝子は全て、その発現が細胞サイクルの進行および
その後の増殖に関連する点において同様な性質を有す
る。しかしながら、たとえばｃ−ｍｙｃ遺伝子のような
或る種の生長調節遺伝子は細胞サイクル全体にわたり活
性である。他のものは、細胞サイクルの特定期間におい
て最も活性である。たとえば、ヒストンＨ３遺伝子は、
細胞サイクルのＳ期の際に最も高度に発現される。さら
に、幾つかの生長調節機能もしくは生産物が相互作用し
て、それまで正常であった細胞の形質転換もしくは腫瘍
性の表現型を誘発すると思われる。たとえば、生長調節
遺伝子ｐ５３および活性化ｃ−ｒａｓは、それまで正常
であった主胎芽細胞を形質転換するよう相互作用するこ
とができる。

最もよく研究された生長調節遺伝子としてはｃ−ｍｙｃ
［ケリー等、セル、第35巻、第603〜610頁(1983)］；各
種のヒストン遺伝子［プランブ等、ヌクレイック・アシ
ッド・リサーチ、第11巻、第2391〜2410頁(1983)］；ｃ
−ｒａｓ［キャンピシ等、セル、第36巻、第241〜247頁
(1984)］；ｃ−ｆｏｓ［グリーンベルク等、ネイチャー
（ロンドン）、第311巻、第433〜438頁(1984)およびコ
ッホラン等、サイエンス、第226巻、第1080〜1082頁(19
84)］；ｐ５３［ライヒ等、ネイチャー（ロンドン）、
第308巻、第199〜201頁(1984)］；ｃ−ｍｙｂ［トレリ
等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第５巻、第
2874〜2877頁(1985)］；チミジンキナーゼ［リュー等、
ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第260
巻、第3269〜3275頁(1985)］；カルモジュリン［シャホ
レアス等、セル、第36巻、第73〜81頁(1984)］；および
オルニチン・デカルボキシラーゼ［カハナ等、プロシー
ディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳ
Ａ、第80巻、第3645〜3649頁(1983)］がある。他の生長
調節遺伝子は２Ａ９もしくはカルサイクリン［カラブレ
ッタ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第261巻、第12628〜12632頁(1986)］；４Ｆ１もしくは
ビメンチン［フェラリ等、モレキュラ・セルラー・バイ
オロジー、第６巻、第3614〜3620頁(1986)］；並びにＡ
ＴＰ／ＡＤＰトランスロカーゼをコードする２Ｆ１［バ
ッチーニ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第262巻、第4355〜4359頁(1987)］を包含する。各
種のプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻止剤のための遺
伝子も生長調節遺伝子として確認されている［デンハル
ト等、バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ、第
865巻、第83〜125頁(1986)；エドワーズ等、モレキュラ
・セルラー・バイオロジー、第５巻、第3280〜3288頁(1
985)］。プロラクチン−生長ホルモン族の一員をコード
する生長調節遺伝子も、リンツァー等により確認されて
いる［プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス、第81巻、第4255〜4259頁(1984)］。

本発明を実施するには、ｃ−ｍｙｃおよびヒストンＨ３
遺伝子が特に有用である。従来ｍａｃとして知られたｃ
−ｍｙｃは鳥類骨髄球腫症の原因であると思われるウィ
ルス遺伝子の正常な細胞対応物である。ヒトゲノムにお
いて、遺伝子は等しい長さの３個のエクソンで構成され
た５．２kbの転写単位として存在する。第１エクソンは
非コード性であると思われる。ｃ−ｍｙｃ遺伝子生産物
の機能は正確には知られていないが、恐らく細胞核にお
ける或る種の生長因子の作用を媒介することによる細胞
増殖の保持に関連すると思われる。これに関する証拠は
無数に存在するが、主として細胞が生長因子と接触する
ことにより刺戟されて増殖する際にｃ−ｍｙｃ遺伝子の
活性が常に細胞分裂に関連した実際の物理的現象の前に
急速かつ著しく増大するという観察に関して展開され
る。さらに最近の証拠は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の活性増大
が正常な成熟プログラムを完結しえない細胞の無能力に
関連することを示唆している。したがってｃ−ｍｙｃ遺
伝子はさらに、正常な細胞発生を調整する際に役割を演
ずると思われる。

ウィルスオンコゲン、すなわち生産物が真核細胞を形質
転換させる能力を有する遺伝子は、プロト−オンコゲン
と呼ばれる細胞対応物を有する。細胞内におけるその存
在および発現は、腫瘍表現型をもたらす。ｃ−ｍｙｃは
１種のプロト−オンコゲンである。ｃ−ｍｙｃの他に、
公知の生長調節プロト−オンコゲンはｃ−ｆｏｓ、ｃ−
Ｈａ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｂなどを包含する。ヒストン
は、ＤＮＡに結合することによりクロマチンの構造骨格
を形成する蛋白である。その合成は、殆んどの真核細胞
におけるＤＮＡ合成に一時的に関連する。ヒストンＨ３
は、１種もしくは４種のコアヒストン蛋白、すなわちＨ
２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をコードする遺伝子であ
る。ヒト細胞の半数体ゲノム１個当り各コアヒストン遺
伝子の約４０個のコピーが存在する。ヒストン遺伝子の
発現制御は複雑であると思われ、かつ転写メカニズムお
よび後転写メカニズムの両者に依存する。しかしなが
ら、Ｈ３を包含するヒストン遺伝子は、細胞サイクルの
Ｓ期もしくはＤＮＡ合成期の際に最も高度に発現され
る。

試験の目標となる生長調節遺伝子の発現レベルは、検体
の腫瘍細胞から全細胞ＲＮＡを分離しかつハイブリッド
化技術により標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物を同定するこ
とにより、化学療法の前に決定される。相補的ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）または相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）プローブ
をこの目的に使用することができる。

一方法によれば、全細胞ＲＮＡを、核酸抽出緩衝剤の存
在下にホモゲナイズしかつ次いで遠心分離することによ
り腫瘍細胞から精製する。核酸を沈澱させ、かつＤＮＡ
をＤＮアーゼ１での処理および沈澱によって除去する。
次いで、ＤＮＡ分子を標準技術にしたがうアガロースゲ
ルでのゲル電気泳動によって分離し、たとえばいわゆる
「ノーザン」ブロット技術によりニトロセルロースフィ
ルタに移す。ＲＮＡを、加熱によりフィルタ上に固定す
る。特定ＲＮＡの検出は、問題とするＲＮＡに対し相補
的な充分標識されたＤＮＡもしくはＲＮＡプローブを用
いて行なわれる。

ブロット技術の他に、この試験はその場でのハイブリッ
ド化の技術にしたがって行なうこともできる。この技術
は、より少ない腫瘍細胞しか必要としないので好適であ
る。さらに「細胞学的ハイブリッド化」としても知られ
るその場での技術は、全細胞を顕微鏡カバーガラスに付
着させかつ放射能などで標識されたｃＤＮＡもしくはｃ
ＲＮＡプローブを含有する溶液により細胞の核酸含有量
を検査することを含む。

後記実施例１は、腫瘍白血病の原料としての末梢血液と
放射線標識されたｃＤＮＡプローブとＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッドを検出するためのノーザンブロットとを用い
た９人のＡＭＬ検体（第Ｉ表）および９人のＡＬＬ検体
（第II表）に関する本発明の実施を示している。ブロッ
トＲＮＡを先ず最初にｃ−ｍｙｃにハイブリッド化さ
せ、次いで残余のハイブリッド化を除去した後にヒスト
ンＨ３にハイブリッド化させる。生長調節遺伝子ｃ−ｍ
ｙｃおよびヒストンＨ３（全検体）および非細胞サイク
ル依存性遺伝子β−アクチン（検体１〜６）、並びにβ
_２−マイクログロブリン（検体７および８）の発現レベ
ルを、療法の直前および抗腫瘍剤を最初に加えてから24
時間後に検体から分離された全ＲＮＡにつき決定した。

標的ｍＲＮＡに対し相補的なＤＮＡプローブは、適切な
ｍＲＮＡ遺伝子転写物を抽出しかつ逆転写酵素を用いる
逆転写によりｃＤＮＡを合成して得ることができる。或
いは、このプローブは、核内切断によってゲノムを切断
しかつ問題とする遺伝子を周知技術によりクローン化さ
せて得ることもできる。

種々の生長調節遺伝子に適切なＤＮＡプローブは周知さ
れている。たとえば「ＮＩＨ寄託およびその他のＡＴＣ
ＣコレクションにおけるヒトＤＮＡプローブおよびクロ
ーン化遺伝子」と題するアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションの刊行物（1988年２月20日）に示され
た下記のプローブのような多くのこの種のプローブを、
ＡＴＣＣから入手することができる：ｃ−ｍｙｃ、4101
0；ｃ−ｍｙｂ、41024；ｃ−ｆｏｓ、41024；ｃ−Ｈａ
−ｒａｓ、41001。生長調節遺伝子に対するその他多く
のＤＮＡプローブも知られておりかつ容易に入手するこ
とができる。

好適にはプローブは、たとえばＰ³²、Ｃ¹⁴もしくは
Ｓ³⁵；重金属；或いは標識されたリガンド、たとえば標
識抗体、蛍光性分子、化学発光性分子、酵素などにつき
特異性の結合対因子として作用しうるリガンドのような
放射性核種で標識される。

プローブは、ニック翻訳法［リグビー等、ジャーナル・
モレキュラ・バイオロジー、第113巻、第237〜251頁(19
77)］またはランダムプライミング法［ファイエンベル
グ等、アナリチカル・バイオケミストリー、第132巻、
第６〜13頁(1983)］のいずれかによって高特異活性まで
標識することができる。後者は、高特異活性のＰ³²標識
プローブを一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ雛型から合成する
ための選択的方法である。両方法は当業者に周知されて
おり、本明細書では反復しない。予め存在するヌクレオ
チドの代りに高放射能ヌクレオチドを用いることによ
り、ニック翻訳法にしたがって１０^８cpm／マイクログ
ラムより高度の特異活性を有するＰ³²標識ＤＮＡプロー
ブを作成することができる。次いでフィルタを写真フィ
ルムに露出することにより、ハイブリッド化の放射線写
真検出を行なうことができる。フィルタの密度測定走査
は、発現を決定すべき生長調節遺伝子のｍＲＮＡ転写物
を正確に測定する。

放射性核種の標識が実用的でない場合は、ランダム−プ
ライマ法を用いてｄＴＴＰ同族体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオ
チニル−ε−アミノカプロイル）−３−アミノ−アリ
ル）デオキシウリジン三燐酸をプローブ分子中に組込む
ことができる。このようにビオチニル化されたプローブ
のオリゴヌクレオチドは、たとえばアビジン、ストレプ
トアビジンまたは着色反応を生ずる蛍光染料または酵素
と結合した抗−ビオチン抗体などのビオチン結合性蛋白
との反応により検出することができる。

本発明により個々の検体で効果を予測しうる代表的な抗
腫瘍（抗癌）剤は、治療学の薬理学的基準にしたがい次
のように分類することができる： アルキル化剤：窒素マスタード；たとえばトリエチレン
チオホスホルアミド（チオ−テパ）のようなエチレンイ
ミン誘導体；およびたとえばブスルファンのようなアル
キルスルホネート： 抗−代謝物：たとえばメトトレキセートのような葉酸同
族体；たとえば５−フルオロウラシルおよびシトシンア
ラビノシドのようなピリミジン同族体；たとえば６−メ
ルカプトプリンおよび６−チオグアニンのようなプリン
同族体； 天然物質：たとえばビンブラスチンおよびビンクリスチ
ンのようなビンカアルカロイド；たとえばアドリアマイ
シンおよびズアノルビシンのような抗生物質；並びにた
とえばＬ−アスパラギナーゼのような酵素； ホルモン類：たとえばプレドニゾンのような副腎皮質ス
テロイド；たとえばヒドロキシプロゲステロンのような
プロゲスチン；たとえばテストステロンのようなアンド
ロゲン；たとえばジエチルスチルベストロールのような
エストロゲン、並びにたとえばタモキシフェンのような
抗エストロゲン； その他の薬剤：たとえばヒドロキシ尿素のような置換尿
素；たとえばプロカルバジンのようなメチルヒドラジン
誘導体；たとえばミトテンイのような副腎皮質抑制剤；
並びにたとえばｃｉｓ−ジアミンジクロルプラチニウム
のような置換重金属。

特に、抗白血病療法に用途を有する次の抗腫瘍剤の効果
を本発明の実施によって予測することができる：メルカ
プトプリン、メトトレキセート、シクロホスファミド、
ビンクリスチン、チオグアニン、ダウノマイシン、エピ
ルビシン、ＡＲＡ−Ｃ、シクロサイチジン、Ｍ−ＡＭＡ
ＳＡ、メチルプレドニゾロン、アドリアマイシン、プレ
ドニゾロン、イダルビシン。

癌の化学療法は典型的には複数の薬剤組合せとして、す
なわち「組合せ化学療法」として行なわれる。本発明に
よれば、この種の薬剤組合せの効果を直接試験すること
ができる。したがって、本明細書中における「抗腫瘍
剤」という用語は、抗腫瘍剤の組合せを包含することを
意図する。

幾種かの薬剤は、その異なる構造もしくは電荷により混
合物中で非相容性になりうる。そのような場合、組合せ
における個々の薬剤は単独基準で試験することができ、
その組合せ処置の結果を個々の薬剤に基づく結果から推
定することができる。

選択された抗腫瘍剤を最初に施した直後に、検体から第
２の腫瘍細胞試料を得ると共に、細胞ＲＮＡを再び分離
しかつプローブハイブリッド化技術を反復して、監視さ
れている生長調節遺伝子の発現レベルの生じうる変化を
評価する。予備ハイブリッド化にて露呈させたと同量の
全ＲＮＡがハイブリッド化に露呈させる。化学療法の開
始直後における生長調節遺伝子発現の有意な減少を観察
することができる。かくして、この試験は、化学療法の
開始時点における粒状抗腫瘍剤もしくはこれら薬剤の組
合せの効果を予測する迅速な方法を与える。第２回目の
腫瘍細胞のサンプリングおよび生長調節遺伝子の発現測
定は、化学療法の過程に伴って生ずる全般的な細胞死滅
の開始前に行なうべきである。細胞死滅の状態は細胞ｍ
ＲＮＡの全般的低下をもたらし、これを非生長調節遺伝
子の発現レベルにおける低下によって検出することがで
きる。他方、本発明は、他の遺伝子の発現レベルが影響
されていない時点で生長調節遺伝子に対し特異性のｍＲ
ＮＡ合成における初期低下を決定することに向けられ
る。したがって、第２の腫瘍細胞のサンプリングおよび
生長調節遺伝子発現の決定は、この全般的な細胞死滅の
発生前に行なうべきである。第２のサンプリングは、好
ましくは最初に抗腫瘍剤を加えてから約６〜約48時間
後、特に好ましくは約24〜48時間後に行なわれる。

抗腫瘍化学療法を開始する前後における生長調節遺伝子
の発現レベルの比較は、担当医に対し貴重な情報を与え
る。試験下の生長調節遺伝子の発現に有意の低下が存在
しないことは、恐らく問題とする薬剤での処置の全過程
が軽快をもたらさないことを意味する。加えた薬剤が生
長調節遺伝子のレベルに有意な低下を生ぜしめることが
観察されれば、これは恐らく処置の全過程の継続が最終
的な軽快をもたらすと思われる。

単一の生長調節遺伝子のレベルにおける変化は特定の抗
腫瘍剤もしくはそれらの組合せに対する検体の反応を予
測する基準となりうるが、薬剤の効果に関する一層正確
な測定は２種もしくはそれ以上の生長調節遺伝子の発現
を追跡して達成することができる。２種もしくはそれ以
上の生長調節遺伝子の発現における低下は、単一の遺伝
子における低下よりも高度の予測値となりうる。

本発明の好適具体例によれば、１種もしくはそれ以上の
非細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルは、生長調節
遺伝子の発現の決定と同時に決定される。「非細胞サイ
クル依存性」遺伝子という表現は、発現レベルが細胞サ
イクルとは独立している遺伝子を意味する。したがっ
て、これらの遺伝子は正常状態レベルで連続的に発現さ
れる。多くの非細胞サイクル遺伝子が知られており、こ
れらの遺伝子は、たとえば次のものを包含する：γ−ア
クチン［グニング等、モレキュラ・セルラー・バイオロ
ジー、第３巻、第787〜795頁(1983)］；β−アクチン
［ヌグ等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第５
巻、第2720〜2732頁(1985)］；β_２−マイクログロブリ
ン［ケリー等、セル、第35巻、第603〜610頁(1983)］；
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ（「ＧＡＰＤＨ」）［ズガイチェク等、バイオケミス
トリー、第22巻、第1605〜1613頁(1983)およびオルソン
等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第７巻、第
2104〜2111頁(1987)］。

一般に抗腫瘍剤は、本発明の試験期間中には非細胞サイ
クル依存性遺伝子のｍＲＮＡレベルに影響を与えない。
したがって、非細胞サイクル依存性遺伝子の発現は、目
標の生長調節遺伝子発現における非特異的変化に対し有
用な対照となる。したがって、好ましくは１種もしくは
それ以上の非細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルを
ここに記載した方法により監視する。非細胞サイクル依
存性遺伝子β−アクチンおよびβ_２−マイクログロブリ
ンの発現がこの点に関し特に有用である。β−アクチン
の遺伝子発現が充分であり、生長因子調節性あるとして
も、これは細胞サイクル依存性でない。何故なら、その
ｍＲＮＡレベルは制止細胞および増殖細胞において同レ
ベルであるからである。β_２−マイクログロブリンの発
現も充分でありかつ細胞サイクルの位置とは独立して全
細胞で同等に発現される［ケリー等、セル、第35巻、第
603〜610頁(1983)］。

本発明は上記したように軽快を予測するための生長調節
遺伝子発現に対する選択化学療法剤のインビボ効果を監
視することを包含するが、検体に対し実際に薬剤を加え
ることなく検体からの腫瘍細胞をインビトロで所望の化
学療法剤と共に培養することにより同様な予測値の結果
を得ることができる。この技術は、充実性腫瘍を特徴と
する腫瘍疾患に特に適している。

本発明のこの具体例によれば、腫瘍の１部を外科的生検
の時点または手術が決定された時点のいずれかに検体か
ら採取する。新たな腫瘍組織を微細に細断し、かつ適当
な組織培地で培養する。全細胞ＲＮＡを分離し、かつ１
種もしくはそれ以上の生長調節遺伝子の発現レベルを上
記したようにハイブリッド化によって決定する。腫瘍組
織の第２の部分を同様に処理するが、ただし組織を細断
した後に細胞を１種もしくはそれ以上の抗腫瘍性化学療
法剤を含有する適当な培地で培養し、検体に軽快をもた
らすその効果を評価することができる。化学療法剤は、
検体に対する化学療法剤のインビボ投与後に経験される
ような細胞濃度に近似する量で培養物に添加される。腫
瘍細胞を、抗腫瘍剤と共に特定の生長調節遺伝子の発現
低下が生ずるのに充分な時間かつ全般的な細胞死滅が生
ずるほど長過ぎない時間にわたって培養する。好ましく
は、培養時間は、約６〜約48時間であるが、24〜48時間
が特に好適である。特に有利には、培養時間は約24時間
である。培養後、同数の細胞を用いてハイブリッド化分
析を反復する。生長調節遺伝子の発現レベルが低下し或
いは低下しないことは、最終的な軽快または軽快なしに
関する予測を与える。

［実施例］ 以下、限定はしないが実施例により本発明をさらに説明
する。

実施例１ Ａ．検体 少なくとも50％の芽細胞を有する高い末梢白血球数を持
った検体を選択した（第Ｉ表および第II表）。末梢血液
の使用は、髄液吸引を反復することなく、反復サンプリ
ングを可能にした。処置前および最初に抗腫瘍剤を各検
体に与えてから24時間後に、静脈穿刺によりヘパリン化
末梢血液白血球を採取した。白血球数のフランス−米国
−英国の分類は、形態学的検査および細胞化学反応（Ｐ
ＡＳ、スダンブラック、ミエロペルオキシダーゼ、クロ
ルアセテートエステラーゼ、非特異性エステラーゼ）に
よって確立されている。これら細胞を、表面表現型（ｃ
ＡＬＬａ、Ｌｅｕ−１抗原、ＤＲおよび各種の抗骨髄性
モノクロナーナル抗体）、Ｔｄｔ酵素活性および核型分
析によりさらに特性化した。ＡＬＬを有する検体におい
て、Ｉｇ部位の転位についても分析した。ヒト試料の使
用に関する許可は、フィラデルフィア・テンプル大学の
小児科病院におけるヒト患者の保護委員会およびモデナ
大学の血液学部によって承認された。

Ｂ．ＤＮＡプローブ 主としてリグビー等［ジャーナル・モレキュラ・バイオ
ロジー、第113巻、第237〜251頁(1977)］の方法にした
がい、高特異活性にてニック翻訳法により次のプローブ
を標識した：ｃ−ｍｙｃ遺伝子プローブの５′および
３′末端を有するプラスミドｐＭＣ４１５およびｐＭＣ
４１３［ダラ・ファベラ等、プロシーディング・ナショ
ナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第79巻、第64
97〜6501頁(1982)］；ヒストンＨ３遺伝子を有するプラ
スミドｐＦＯ４２２；ヒトβ−アクチンｃＤＮＡ［グニ
ング等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第３
巻、第787〜795頁(1983)］；およびヒトβ_２−マイクロ
グロブリンｃＤＮＡ［サグス等、プロシーディング・ナ
ショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第78巻、
第6613〜6617頁(1982)］。ニック翻訳により挿入された
ＤＮＡの放射能標識は、ファインベルク等によりアナリ
チカル・バイオケミストリー、第132巻、第６〜13頁(19
83)に記載されたように行なった。

Ｃ．核酸の分離 全細胞ＲＮＡをフレーザー等の方法［モレキュラ・セル
ラー・バイオケミストリー、第56巻、第113〜122頁(198
3)］にしたがって白血病細胞から精製した。要約すれ
ば、細胞をワーリング・ブレンダーにて抽出緩衝液［75
mMのＮａＣ、20mMのＥＤＴＡ、10mMのトリス−ＨＣ
(pH8.0)および0.2％のドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤ
Ｓ」）］中でホモゲナイズし、１：１の比で緩衝剤飽和
フェノールと混合した。水相を遠心分離により回収し、
同容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコ
ール（25：24：１）で再抽出し、次いで再びクロロホル
ム：イソアミルアルコール（24：１）で１回抽出した。
核酸をエタノールで沈澱させた。ＤＮＡをＤＮアーゼ１
での処理により除去し、かつ３Ｍ酢酸ナトリウム(pH5.
5)で沈澱させた。試料におけるＲＮＡの一体性および量
を、アガロース−ホルムアルデヒドゲルの臭化エチジウ
ム染色によって監視した（下記参照）。ＤＮＡ抽出は、
グロス−ベラード等によりヨーロピアン・ジャーナル・
バイオケミストリー、第36巻、第32〜38頁(1973)に記載
されたように行なった。

Ｄ．ブロッチイング 約1.2ｇのアガロースと10ｍの10×（すなわち10倍濃
度）３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「Ｍ
ＯＰＳ」）と87ｍのジエチルピロカーボネート（「Ｄ
ＥＰＣ」）処理されたオートクレーブ処理水とをオート
クレーブ処理されたフラスコに添加しかつアガロースを
沸騰溶解させて、アガロース−ホルムアルデヒドゲルを
作成した。50℃まで冷却した後、5.1ｍの37％ホルム
アルデヒドをゲルに添加し、次いでこれを11ｘ14cmの皿
に注型した。このゲルを約１時間かけて重合させた。上
記で得られた10〜300μｇのＲＮＡを微小遠沈管におけ
る５μのＤＥＰＣ処理されたオートクレーブ水に溶解
させた。次いで、25μの電気泳動試料緩衝液［0.75ｍ
の脱イオン化ホルムアミド、0.15ｍの10ｘＭＯＰ
Ｓ、0.24ｍのホルムアルデヒド、0.1ｍの脱イオン
化ＲＮアーゼ・フリーの水、0.1ｍのグリセリン、0.0
8ｍの10％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー］を添
加し、かつこの溶液を65℃まで15分間加熱した。次い
で、１μの臭化エチジウム溶液（1.0mg／ｍ）を試
料に添加し、次いでこれを混合しかつゲルに添加した。
このゲルを約30Ｖ（一定電圧）にて18時間にわたり電気
泳動した。次いで、このゲルを10ｘＳＳＣ（最終容積１
のＨ_２Ｏにおける175.3ｇのＮａＣと88.2ｇのクエ
ン酸ナトリウム）にて室温で20分間つづ２回浸漬するこ
とにより、移動用に準備した。移動を行なうニトロセル
ロースフィルタを蒸溜水中で５分間にわたり予備浸漬
し、次いで10ｘＳＳＣにて５分間浸漬した。次いで、フ
ィルタをゲル上に重ね、かつＲＮＡを毛細管作用により
フィルタに移動させた。約２時間にわたり80℃にて減圧
下に焼成することにより、ＲＮＡをニトロセルロースに
固定した。

Ｅ．ハイブリッド化工程 ニトロセルロースフィルタの予備ハイブリッド化を行な
って、フィルタに対するプローブの非特異的ハイブリッ
ド化を減少させた。フィルタを25ｍの５ｘデンハルト
溶液［0.9ＭのＮａＣ、50mMの燐酸塩緩衝剤、10mMの
トリス(pH8.0)、１mMのＥＤＴＡ、50％のホルムアミ
ド、１％の牛血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、１％のポ
リビニルピロリドン（「ＰＶＰ」）および100mg／ｍ
の変性鮭精子ＤＮＡ］中でフィルタを30分間にわたり培
養した。ブロット処理したＲＮＡに、同じ緩衝液にてＰ
³²−標識プローブ［ｃ−ｍｙｃ、ヒストンＨ３、β−ア
クチンもしくはβ_２−マイクログロブリンプローブのい
ずれか；少なくとも1.5〜２ｘ10⁷cpmの比活性を有する1
0〜50mgのＰ³²標識ＤＮＡ］でハイブリッド化し、これ
に10％硫酸デキストランを添加した。これはハイブリッ
ド化反応を促進させ、42℃にて20〜24時間にわたり進行
させる。後ハイブリッド化物の洗浄を行なって、非特異
結合したプローブを除去した。これらの洗浄は、60℃に
て先ず最初に１×ＳＳＣ（0.5のＮａＣ、0.015Ｍのク
エン酸ナトリウム）中で３０分間行ない、次いで0.1ｘ
ＳＳＣにて２回（それぞれ30分間）行なった。次いで、
フィルタを増強スクリーンにより−70℃でコダック社Ｘ
−線フィルムに露出することによりハイブリッドの放射
線写真検出を行ない、次いでこれを製造業者の指示にし
たがって現像した。フィルタの密度測定走査は、ゼイニ
ー・レーザー密度計（カリホルニア州、フラータウン
在、ビオメド・インストルーメンツ・インコーポレーシ
ョン社）を用いて行なった。密度による計測定値の精度
および直線性は、種々異なる露出時間後に現像した同じ
ノーザンブロットのＸ線フィルムを分析することにより
試験した。

各群における１検体（検体３）は、慢性顆粒球白血病の
芽細胞期であった。試験した検体における末梢血液の芽
細胞数は50〜100％の範囲で変化することが認められた
が、この変化は生長調節遺伝子のｍＲＮＡレベルに関す
るデータに対し有意に作用しないと予測される。何故な
ら、成熟白血球からのｍＲＮＡ収率が芽細胞からの収率
よりもずっと低いからである［カラブレッタ等、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・Ｕ
ＳＡ、第82巻、第4463〜4467頁(1985)］。第III表は、
誘発療法の24時間目およびその終了時における各検体の
抗腫瘍処置に対する反応を示している。血液学的軽快
は、処置終了後の骨髄中における５％未満の芽細胞の存
在として規定される。

ＡＭＬを有する９人の検体の療法前後におけるｃ−ｍｙ
ｃおよびヒストンＨ３のｍＲＮＡレベルを第１図に示
す。加えた抗腫瘍在を第Ｉ表に示す。ＡＭＬを有する検
体において、療法はｃ−ｍｙｃ遺伝子のｍＲＮＡレベル
に対し種々異なって影響を及ぼす。たとえば、検体１、
３、４、７および９においてｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡレベ
ルは療法前後にて実質的に同じであるのに対し、検体
２、５、６および８においてｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡの発
現に顕著な低下が存在する。さらに第１図は、ヒストン
Ｈ３のｍＲＮＡレベルが５人の検体（１、２、５、６お
よび８）において療法により低下することを示してい
る。いずれの検体においても、β−アクチンもしくはβ
_２−マイクログロブリンのｍＲＮＡレベルは療法により
顕著に改変された。

ＡＬＬを有する９人の検体の処置前後におけるｃ−ｍｙ
ｃおよびヒストンＨ３のｍＲＮＡレベル（第II表）を第
２図に示す。ヒストンＨ３の発現は処置前のレベルと比
較して抗腫瘍剤を最初に加えてから24時間後に検体１、
２、５、７および９にて著しく減少することが明らかで
ある。ピストンＨ３遺伝子のｍＲＮＡレベルも検体３に
おいて若干減少したのに対し、検体４、６および８にお
いては殆んど変化せず或いは上昇さえした。ｃ−ｍｙｃ
の発現は、検体１、２、５および９において療法により
著しく減少しかつ検体４において若干減少した。ｃ−ｍ
ｙｃのｍＲＮＡレベルは検体３、７および８において療
法後に変化しなかったのに対し、検体６においては増加
した。化学療法は、β−アクチンおよびβ_２−マイクロ
グロブリン遺伝子のｍＲＮＡレベルにおいて顕著な変化
を誘発しなかった。

第Ｉ表および第II表は、ＡＬＬ検体１における以外には
白血球の個数および芽細胞の比率が患者に与えられた１
回の抗腫瘍剤により有意に変化しなかったことを示して
いる。芽細胞の比率に有意の変化が存在しないことは、
療法後の生長調節遺伝子ｍＲＮＡレベルに対する変化が
白血病細胞の細胞サイクル進行に必要とされる代謝経路
に対する抗腫瘍剤の初期作用に基因することを示してい
る。さらに、これらの試験は、最初の化学療法が白血病
検体の約65％において生長調節遺伝子ｃ−ｍｙｃおよび
ヒストンＨ３のｍＲＮＡレベルに関し初期変化を誘発さ
せるのに対し、全ての検体においてβ−アクチンおよび
β_２−マイクログロブリンのｍＲＮＡレベルには影響を
及ぼさないことをも示している。

特定の理論に拘束されるものでないが、療法後のｃ−ｍ
ｙｃおよびヒストンＨ３のｍＲＮＡレベルにおける低下
は、細胞サイクルにおける生長調節遺伝子の転写に対す
る直接的作用の結果であると思われる。この解釈は、ヒ
ストンＨ３のｍＲＮＡレベルの低下を療法後の６時間程
度に早い時期に或る検体で認めうるという観察によって
支持される。しかしながら、恐らくこの作用の程度は、
β−アクチンのずっと長い半減期と比較して、ｃ−ｍｙ
ｃおよびＨ３メッセージの短い半減期によって増大する
と思われる。関与するメカニズムとは無関係に、これら
の試験は、非細胞サイクル遺伝子β−アクチンおよびβ
_２−マイクログロブリンの不変レベルと比較して生長調
節遺伝子のｍＲＮＡレベルにおける早期変化が細胞ＲＮ
Ａ代謝の一般的阻止の結果でなく特異的作用に基因する
ことを示す。

１回の化学療法の24時間後に測定したヒストンＨ３のｍ
ＲＮＡレベルにおける低下が５人のＡＭＬ検体（１、
２、５、６および８）で観察されたのに対し、ｃ−ｍｙ
ｃのｍＲＮＡレベルはこれら検体のうち４名（２、５、
６および８）で減少した。血液学的軽快が検体５、６お
よび８において得られた。Ｈ３のｍＲＮＡレベルは９人
のＡＬＬ検体のうち６人（１、２、３、５、７および
６）において療法により低下した。ｃ−ｍｙｃの発現
は、これら６人のＡＬＬ検体のうち４人（１、２、５お
よび９）において減少した。５人のＡＬＬ検体（１、
２、３、５および９）は、化学療法の終了時に完全に軽
快した。部分的軽快が検体４で得られ、この場合は療法
の24時間後にｃ−ｍｙｃの発現のみが減少し、かつ検体
７においては療法の24時間後にＨ３の発現のみが減少し
た。

これらの結果は、２種の生長調節遺伝子ｃ−ｍｙｃおよ
びヒストンＨ３の同時的低下の欠如が望ましくない予知
因子であることを示している。療法の後にｃ−ｍｙｃお
よびヒストンＨ３のｍＲＮＡレベルに変化を生ぜず或い
は増加さえする６人の検体は、いずれも軽快を達成し
た。これらの知見はさらに、化学療法剤を１回のみ施こ
してから24時間後のｃ−ｍｙｃもしくはヒストンＨ３の
ｍＲＮＡレベルにおける低下が完全な血液学的軽快を最
終的に達成する示唆となることを示している。

次の実施例は、その場におけるハイブリッド化技術を用
いる本発明の実施を例示している。

実施例２ Ａ．組織作成 外科的生検の時点または手術決定時点のいずれかにおけ
る腫瘍組織を検体から剔出しかつ微細片まで細断し、こ
れらを直ちに（ｉ）１ｍのＬ−グルタミンと１ｍの
ピルビン酸ナトリウムと１ｍの非必須アミノ酸と0.8
ｍのＮａＨＣＯ_３と0.75ｍのペニシリン／ストレプ
トマイシン溶液（培地100ｍ当り）と５％（ｖ／ｖ）
の胎児牛血清とが補充された新鮮な組織培養培地のみ
（ＲＰＭＩ1640）または（ii）検体に化学療法剤をイン
ビボ投与した後に予測される細胞濃度にほぼ等しい最終
濃度の被検抗腫瘍剤を含有する同じ培地のいずれかを含
む無菌の25ｍ組織培養フラスコに入れた。５％ＣＯ_２
を含有する雰囲気にて37℃で24時間培養した後、組織を
直ちに液体窒素中のＯＣＴ組織埋込み培地（ティシュー
ＴｅｋII、マイルズ・ラボラトリーズ社）で直ちに凍結
した。試料は、これらの条件下で無限に貯蔵することが
できる。凍結した組織ブロックを−20℃の低温保存室に
30分間入れて、ブロックの温度をミクロトームナイフの
温度（−20℃）と平衡化させ、このナイフにより組織切
片（厚さ約４〜20μｍ）を切除した。450mMＮａＣ／4
5mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)を含有するデンハルト溶
液（0.02％フィコールＬ、0.02％ＰＶＰ、0.02％ＢＳ
Ａ）にて65℃で３時間培養することにより、ガラススラ
イドを予備処理した。これらスライドを２回蒸溜水で濯
ぎかつエタノール：酢酸（３：１）で20分間固定した。
切片を予備処理されたガラススライドの上に浮遊させ、
次いで平滑化しかつ軟質毛ブラシでスライド上にならし
た。次いで、これらスライドを熱プレート上で50℃まで
２分間加温し、そして風乾した。次いで、スライドを４
％パラホルムアルデヒドで20〜30分間にわたり室温にて
固定し、３ｘ燐酸塩緩衝塩水（「ＰＢＳ」）で５分間濯
ぎ、次いで１×ＰＢＳにて２回（それぞれ５分間）濯い
だ。次いで、処理された組織を勾配エタノール溶液（30
％、30％、80％、95％、100％）に５分間浸漬すること
により脱水させた。次いで、これらスライドを風乾しか
つ−20℃で無期限に貯蔵した。

Ｂ．予備ハイブリッド化処理 上記で作成したスライドを、ＤＥＰＣ処理水に４〜５回
浸漬して濯いだ。これらスライドを、５mMのＭｇＣ_２
を含有するＰＢＳで10分間にわたり再加水した。次い
で、スライドを0.1Ｍの新たに作成されたトリエタノー
ルアミン（3.71ｇ／水200ｍ）に対し５分間移し、次
いで0.1Ｍの新たに作成されたトリエタノールアミン0.2
5％（ｖ／ｖ）無水酢酸（200ｍトリエタノールアミン
＋0.5ｍ無水酢酸）に５分間移した。次いで、スライ
ドをＰＢＳ＋５mM ＭｇＣ_２で濯いだ。この時点でス
ライドを２群に分割することができ、１群をＲＮアーゼ
比較として利用する。残余のスライドをＰＢＳ＋５mM
ＭｇＣ_２中に保つ。残余の細胞をＲＮアーゼ緩衝液
［20ｍの10mg／ｍＤＮアーゼフリーのＲＮアーゼＡ
保存溶液を１ｍの0.5Ｍ ＮａＣの10mMのトリス−
ＨＣ(pH8.0)と１mMのＥＤＴＡとに最終濃度200mg／ｍ
まで添加］におけるＲＮアーゼＡ（ミズーリ州、セン
トルイス在、シグマ社）で処理した。ＲＮアーゼＡを含
有する緩衝溶液を37℃まで予備加温し、セル上に層とし
て載せ、かつ37℃で30分間培養した。その後、スライド
をＰＢＳ＋５mM ＭｇＣ_２で２回濯いだ。次いで、ス
ライドを0.2Ｍトリス−ＨＣ＋0.1Ｍグリシン（750mg
／100ｍ、pH7.4）に10分間移した。これらスライドを
２ｘＳＳＣ（20ｘ＝３Ｍ ＮａＣ、0.3Ｍクエン酸ナ
トリウム、pH7.2）で濯ぎ、かつ２ｘＳＳＣ＋50％ホル
ムアミド（これは100ｍのホルムアミドを80ｍのＤ
ＥＰＣ処理水および20ｍの20ｘＳＳＣ（90ｍ：90ｍ
：20ｍ）に添加して作成）に移した。［ハイブリッ
ド化を放射線標識プローブにつき行なう場合は50％ホル
ムアミドを使用し、またハイブリッド化をビオチニル化
プローブにつき行なう場合には45％ホルムアミドを用い
た］。溶液をハイブリッド化の直前に65℃まで10分間加
熱した。この時点で、プローブをハイブリッド化工程に
使用することができる。

Ｃ．標識されたプローブ溶液の作成 （ｉ）Ｈ^３もしくはＳ³⁵−標識プローブ 凍結乾燥された放射能標識プローブを、50％ホルムアミ
ド含有のハイブリッド化カルテル（オハイオ州、ソロン
在、アムレスコ社）中で室温にて溶融させた。標識プロ
ーブの最終濃度は、ハイブリッド化カクテル１ｍ当り
約200〜500ngとすべきである。作成した後、プローブ／
カクテル溶液を無制限に−20℃で貯蔵することができ
る。このプローブ／カクテルは、ハイブリッド化工程に
使用する前に約10分間にわたり加熱ブロックで微小遠沈
管にて約95℃まで加熱すべきである。

（ii）ビオチン−標識プローブ 凍結乾燥したビオチン標識プローブを、0.9ｍの50％
ホルムアミドカクテルと0.1ｍの０％ホルムアミドカ
クテルとの混合により作成された45％ホルムアミド含有
のハイブリッド化カクテルで溶融させた。ハイブリッド
化カクテルにおける標識プローブの最終濃度は、ハイブ
リッド化カクテル１ｍ当り約200〜500ngとすべきであ
る。作成後、プローブ／カクテル溶液は−20℃にて無制
限に貯蔵することができる。ハイブリッド化工程に使用
する前に、このプローブ／カクテルは加熱ブロック内で
微小遠沈管にて約95℃まで約10分間加熱すべきである。

Ｄ．ハイブリッド化 標識プローブを含有する約30ｍの熱ハイブリッド化カ
クテルをスライド載置試料の上に載せ、全ての液体が腫
瘍細胞を含む小領域以外にはスライドから除去されたこ
とを確認する。このスライドを第２のスライド、すなわ
ちパラフィルム（４枚，２枚並列）で覆い、固定しかつ
37℃の湿潤スライド加温器または密閉水浴に移した。ハ
イブリッド化を１晩にわたり進行させた。

Ｅ．ハイブリッド化洗浄 ここに特定した希釈物は、全てＤＥＰＣ処理水で作成し
た。

ハイブリッド化スライドを７回の別々の洗浄工程で次の
ように洗浄した。放射能標識でなくビオチル化されたプ
ローブを用いる場合は、洗浄NO.１につき50％ホルムア
ミド＋２ｘＳＳＣ溶液を使用し（90ｍのホルムアミド
と20ｍの20ｘＳＳＣと90ｍのＤＥＰＣ処理水）、ま
た洗浄NO.３については50％ホルムアミド＋１ｘＳＳＣ
溶液を用いた（90ｍのホルムアミドと10ｍの20ｘＳ
ＳＣと100ｍのＤＥＰＣ処理水）。

洗浄NO.１：50％ホルムアミド＋20ｘＳＳＣにて37℃で3
0分間。

洗浄NO.２：50％ホルムアミド＋１ｘＳＳＣにて37℃で3
0分間。

洗浄NO.３：0.2ｘＳＳＣ＋0.1％ＳＤＳ（５ｍの20ｘ
ＳＳＣ、500mgのＳＤＳ、これを500ｍにする）にて室
温で３分間。

洗浄NO.４：洗浄NO.３の反復。

洗浄NO.５：0.16ｘＳＳＣ＋0.1％ＳＤＳ（４ｍの20ｘ
ＳＳＣ、500mgのＳＤＳ、これを500ｍにする）にて室
温で３分間。

洗浄NO.６：洗浄NO.５の反復。

洗浄NO.７：２ｘＳＳＣ＋0.1％ＳＤＳにて室温で１分
間。

次いで細胞を３％ＢＳＡと共にトリス−塩水（0.1Ｍト
リス−ＨＣ、0.1Ｍ ＮａＣ、pH7.5）で５分間培養
し、その際溶液をスライド上の細胞に対し緩和に積層し
た。次いで、スライドを風乾した。

Ｆ．ハイブリッド信号検出 （ビオチニル化ＤＮＡプローブ） 次の手順は、ビオチニル化ｃＤＮＡプローブに対する目
標ｍＲＮＡ転写物のハイブリッド化の検出を示してい
る。これらの緩衝剤は次のように作成した： 緩衝剤NO.１：0.1Ｍトリス−ＨＣ(pH7.5)、0.1Ｍ Ｎ
ａＣ、２mM ＭｇＣ_２、0.05％（ｖ／ｖ）トリトン
（1.58ｇ／100ｍ；0.584ｇ／100ｍ；0.019ｇ／100
ｍ；0.050ｍ／100ｍ）。

緩衝剤NO.２：３％（ｗ／ｖ＝３ｇ／100ｍ）のＢＳＡ
を含む緩衝剤NO.１； 緩衝剤NO.３：0.1Ｍトリス−ＨＣ(pH9.5)、0.1Ｍ Ｎ
ａＣ、50mM ＭｇＣ_２（1.58ｇ／100ｍ；0.584ｇ
／100ｍ；0.48ｇ／100ｍ）。

乾燥したスライドを緩衝剤NO.１にて10分間わたり再加
水し、次いでストレプトアビジン保存溶液（緩衝剤NO.
１の１ｍ当り１mg／ｍ、最終濃度＝２mg／ｍ）２
ｍの溶液をスライド上に載せた。次いで、これらスラ
イドをパラフィルム膜で覆いかつ10分間培養した。次い
で、スライドを少なくとも20〜40倍容積の緩衝剤NO.１
にて約３分間洗浄した。この洗浄手順を３回反復した。
１μのアルカリホスァターゼ（１mg／ｍ、ミズーリ
州、ベセスダ在、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース
社）を１ｍの緩衝剤NO.１と混合して、最終濃度１μ
ｇ／ｍを有するアルカリホスファターゼ溶液を得た。
この溶液をスライド上に載せ、かつこれをパラフィルム
膜で覆い、10分間培養した。次いで、スライドを再び少
なくとも20〜40倍容量の緩衝剤NO.１で約３分間にわた
り洗浄した。この洗浄を反復した。次いで、スライドを
緩衝剤NO.３で３分間洗浄した。この洗浄を１回反復し
た。8.8μのニトロブルーテトラゾリウム溶液（ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ社）および6.6μの
５−ブロモ−４−クロル−３−インドリルホスフェート
溶液（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社）を２ｍ
の緩衝剤NO.３に混入した。この溶液をスライド上に
載せると共に、パラフィルムで覆って蒸発を防止した。
スライドを暗所にて４時間の最大発色時間まで培養し
た。理想的には、これらスライドを密閉された37℃の水
浴にて培養する。次いで、スライドを20mMのトリス(pH
7.5)＋５mMのＥＤＴＡで洗浄して、着色反応を終了させ
た。これらスライドを95％エタノールで約５〜10秒間濯
ぎ、次いで100％エタノールでさらに５〜10秒間濯い
だ。スライドをキシレン中に５〜10秒間入れ、次いでた
とえば「ペルマウント」（フィッシャー・ケミカル社）
に設置した。これらの細胞および染料は遮光箱で所蔵す
れば安定である。ハイブリッド形成の程度を適当な密度
測定により定量化した。

実施例２の上記組織作成の代案として、腫瘍組織を検体
から剔出しかつ直ちに液体窒素で凍結し、種々の程度の
厚さ（50〜100μｍ）の切片に切断した。次いで切片を
（ｉ）新鮮組織培地または（ii）さらに上記実施例２の
Ａ（組織作成）にしたがう被検抗腫瘍剤を含有した同じ
培地のいずれかで解凍させた。24時間の培養後、組織ス
ライドを再凍結させ、かつより薄い切片（厚さ約４〜20
μｍ）までスライスし、そして実施例２における残余の
手順を行なった。

本発明の方法をＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド化により
（すなわち目標とする生長調節遺伝子および非細胞サイ
クル依存性遺伝子のｍＲＮＡ転写物を検出するためＤＮ
Ａプローブを用いることにより）例示したが、この検出
は目標とするｍＲＮＡ転写物に対し相補的なヌクレオチ
ド配列を有するＲＮＡプローブを用いてＲＮＡ／ＲＮＡ
ハイブリッド化技術により行なうこともできる。

以上、本発明を特定実施例につき説明したが、本発明は
これら実施例のみに限定されず、本発明の思想および範
囲を逸脱することなく多くの改変が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は化学療法を開始する前（「ｂ」）および２４時
間後（「ａ」）の急性骨髄性白血病患者におけるｃ−ｍ
ｙｃ、ヒストンＨ３、β−アクチンおよびβ_２−マイク
ログロブリンの遺伝子発現レベル棒である。 第２図は化学療法の開始前（「ｂ」）および２４時間後
（「ａ」）の急性リンパ球白血病患者におけるｃ−ｍｙ
ｃ、Ｈ３、β−アクチンおよびβ_２−マイクログロブリ
ンの遺伝子発現レベルの棒グラフである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）抗腫瘍剤を細胞に加える前に腫瘍細
   胞における少なくとも１種の生長調節遺伝子の発現レベ
   ルを決定し、 （ｂ）抗腫瘍剤を細胞に加え、 （ｃ）抗腫瘍剤を加えた後かつ腫瘍細胞死滅の開始前に
   腫瘍細胞における前記生長調節遺伝子の発現レベルを決
   定し、かつ （ｄ）上記過程（ａ）で決定された生長調節遺伝の発現
   レベルを上記過程（ｃ）で決定された遺伝子の発現レベ
   ルと比較する ことを特徴とする抗腫瘍剤の効果の予測方法。
2. 【請求項２】抗腫瘍剤を細胞に加える前に腫瘍細胞にお
   ける少なくとも１種の非細胞サイクル依存性遺伝子の発
   現レベルを決定し、 抗腫瘍剤を加えた後かつ腫瘍細胞死滅の開始前に腫瘍細
   胞における非細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルを
   決定し、かつ 抗腫瘍剤を加える前後における非細胞サイクル依存性遺
   伝子の発現レベルを比較する 過程をさらに含む請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】腫瘍性疾患が白血病からなる請求項１記載
   の方法。
4. 【請求項４】生長調節遺伝子をｃ−ｍｙｃおよびヒスト
   ンＨ３並びにその組合せよりなる群から選択する請求項
   １記載の方法。
5. 【請求項５】（ａ）検体から分離された腫瘍細胞におけ
   る少なくとも１種の生長調節遺伝子の発現レベルを決定
   し、 （ｂ）腫瘍細胞を抗腫瘍剤と共にインビトロで培養し、 （ｃ）細胞を抗腫瘍剤と共に培養した後かつ腫瘍細胞の
   死滅開始前に腫瘍細胞における生長調節遺伝子の発現レ
   ベルを決定し、かつ （ｄ）上記過程（ａ）で決定された生長調節遺伝子の発
   現レベルを上記過程（ｃ）で決定された遺伝子の発現レ
   ベルと比較する ことを特徴とする腫瘍性疾患を有する生物検体における
   抗腫瘍剤の効果の予測方法。
6. 【請求項６】前記過程（ａ）にて検体から分離された腫
   瘍細胞における少なくとも１種の非細胞サイクル依存性
   遺伝子の発現レベルを決定し、 細胞を抗腫瘍剤と共に培養した後の腫瘍細胞における非
   細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルを決定し、かつ 腫瘍細胞を抗腫瘍剤と共に培養する前後の非細胞サイク
   ル依存性遺伝子の発現レベルを比較する 過程をさらに含む請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】生長調節遺伝子をｃ−ｍｙｃおよびヒスト
   ンＨ３並びにその組合せよりなる群から選択する請求項
   ５記載の方法。