JPH0213400A - 個々の症例における抗腫瘍処置の効果を予測する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ の効果を予測する方法に関するものでおる。

［従来の技術］ 癌の治療方法は照射線療法、外斜療法および化学療法を
包含する。化学療法が広範に使用されているが、指定さ
れる化学療法剤またはその組合せは必ずしも軽快を得る
のに成功を収めていない。

極めてしばしば、指定された化学療法の過程が開始され
ても癌の軽快を得るのに失敗するだけである。化学療法
は、医者がその処置を不成功でおると結論しかつ他の化
学療法剤を断定しうるｉ＊呑前に、この化学療法を１週
間または数ケ月にもわたって継続することがおる。無効
な化学療法法の期間中に肖重な時間が失われる。

患者からの腫瘍細胞に対する活性につき抗癌剤を選択し
うるインビトロ法として、腫瘍細胞のクロノジエニツタ
分析が提案されている。臨床的反応もしくは耐性を予測
する試験として、ハンバーガーおよびザルモンのヒト腫
瘍クロノジェニック分析［ザイエンス、第１９７巻、第
４６１〜４６３頁（１９７７）　］か提案されている［
ジョーンズ等、ジャーナル・クリニカル・オンコロジー
、第３巻、第９２〜９７頁（１９８５）　］。この種の
方法は細菌感染を有する患者における抗生物質の選択性
試験と同類であり、化学療法に対する反応性を予測する
ものとして細胞の生存に基づいている。しかしながら、
これらの方法は信頼性がない［セルビー等、Ｎ、　Ｅｎ
ｇｌ、Ｊ、Ｈｅｄ、　、第３０８巻、第１２９〜１３４
頁（１９８３）　１゜ 古典的Ｕ［究において、ブライスラー等［ジャーナル・
セルラー・バイオケミス１〜リー、補遺１１Ａ。

アブスＩ〜ラクトＮｏ、Ｄ　５１０、第２３７頁（１９
８７）　］は、白白血病者におけるプロｉ−−オンコグ
ンＣ−ｍｙｃおよびヒストンＨ３の発現と化学療法に基
づく軽快との間の相関関係を認めている。他の古典的試
験においては、急性骨髄細胞白血病患者の骨髄細胞から
分離されたＣ　−ｍ　Ｖ　ＣＲＮ　Ａのレベルが完全軽
快した他の群の患者から分離された細胞におけるよりも
高いことが観察された［ブライスラー等、キャンサー・
リサーチ、第４７巻、第８７４〜８８０頁（１９８７）
　］。長期間にわたる化学療法の後の生長調節遺伝子発
現におけるこの種の古典的な相関関係は、生長調節遺伝
子発現における薬剤特異性の変化に基因するのでなく、
寧ろ腫瘍細胞死滅および細胞ｍＲＮＡの全般的低下に基
因する。

ざらに、必要とされることは、化学療法を開始する前ま
たはその直後に個々の患者に対して特定化学療法剤もし
くは薬剤組合せかもたらしうる効果を決定して、最も有
効な化学療法を用いうるようにする方法でおることは明
らかでおる。

予測する方法が提供される。検体から得られた腫瘍細胞
における少なくとも１種の生長調節′５０伝子の発現レ
ベルが決定される。化学療法は、検体に抗腫瘍剤を加え
て開始される。生長調節遺伝子の発現レベルは、抗腫瘍
剤を加えた後かつ腫瘍細胞の死滅開始前、すなわら好ま
しくは抗腫瘍剤を加えてから約６〜約４８時間後、特に
好ましくは約２４〜約４８　［＋、）間接に検体から得
られた腫瘍細胞につき決定される。抗腫瘍剤を加える前
後の生長調節遺伝子の発現レベルが比較される。遺伝子
の発現レベルにおける有意の低下の存在もしくは不存在
が、抗腫瘍剤での継続療法により軽快をもたらすかどう
かを示す予測値となる。本発明は、抗白血病療法におけ
る抗腫瘍剤の効果を予測するのに特に有用である。

本発明の他の特徴によれば、腫瘍細胞を抗腫瘍剤と共に
インビトロで培養する。したがって、検体から得られた
腫瘍細胞における少なくとも１種の生長調節遺伝子の発
現レベルを決定する。次いで、細胞を抗腫瘍剤と共にイ
ンビトロで培養する。

生長調節遺伝子の発現レベルを再び腫瘍細胞死滅の開始
前に決定し、かつ細胞を抗腫瘍剤と共に培養する前の発
現レベルと比較する。好ましくは、少なくとも１種の非
細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルをも生長調節遺
伝子の発現と同時に決定する。非細胞サイクル依存性遺
伝子の発現が常に存在することは、抗腫瘍剤に基づ゛く
生長調節遺伝子の発現にて観察される全ての低下が生長
調節遺伝子に対し特異性でありかつ細胞ｍＲＮＡもしく
は細胞質減少の全般的阻止の結果でないことを示す。

遺伝子発現は、便利には特異性ＲＮＡを検出するのに有
効な各種の核ハイブリッド化技術によって決定すること
ができる。この種の方法は当業者に周知されている。

今回、腫瘍疾患を処置する際に特定の抗腫瘍剤（すなわ
ち抗癌剤）による処置過程が成功するかどうかを、薬剤
を最初に与えた後でざるだ（プ早い検体の腫瘍細胞にお
Ｃプる成る種の遺伝子の発現レベルの変化を決定するこ
とにより、各検体につき予測しうろことが突き止められ
た。さらに、抗腫瘍剤を１回与えた俊の腫瘍細胞におり
る生長調節遺伝子のメツセンジャーＲＮＡ　（ｒｍＲＮ
ＡＪ　）レベルの低下は完全軽快を示唆する一方、これ
らｍＲＮＡの低下が存在しないことは特定の療法に対す
る反応において検体の最終的軽快を達成しえないことを
示唆することも突き止められた。事実、生長調節遺伝子
の発現レベルにおける検出可能な変化は、化学療法の過
程を開始してから数時間以内に生ずることが判明した。

同時に、非細胞量ナイクル依存性渭伝子の発現レベルは
常に一定となる。

本発明の試験法は、生長調節遺伝子が正常組織と対比し
て過度に（すなわち高度に）発現されることが知られた
全ゆる悪性腫瘍にて抗腫瘍化学療法の成功を予測するの
に特に有用である。限定はしないが、例としては肺の小
細胞癌；肺、胸部、結腸もしくは前立腺の腺癌；皐丸お
よび卵巣の癌；並びに成る種の肉腫、たとえば骨の骨肉
腫が包含される。ざらに、本発明は小児病、神経芽細胞
腫およびウィルムス腫瘍にあＣプる化学療法の効果を予
測する際に使用することもできる。

白血病は、白血球の成熟が細胞発生の初期段階で停止す
る腫瘍疾患でおる。この疾患は、骨髄における白血病芽
細胞の個数増加、ｃ！′３よび正常な成長造血細胞生成
における種々な程度の欠損を特徴とする。この状態は急
性または慢性のいずれかである。ざらに白血病は、典型
的にはリンパ球性（すなわら正常なリンパ球に共通の性
質を有する細胞により特性化される）または骨髄球性（
もしくは骨髄性、すなわら正常な顆粒球細胞の幾つかの
特徴を有する細胞により特性化される）のいずれかとし
て分類される。急性リンパ球白血病（ｒＡＬＬＪ　）は
リンパ様組織に発生し、通常の最初の徴候は骨髄におけ
るその存在である。急性骨髄法白血病（ｒＡＭＬＪ　）
は、骨髄）告血中♀細胞またはその後代から発生する。

［急性骨１７ｉｆｉ球白血病」という用詔は、白血病す
なわち骨け１ｂ芽球白血病、前骨髄球白血病および骨髄
単球白血病の幾つかの亜型を包含する。さらに、赤面法
もしくは巨核球の性質を有する白血病も青汁ｉｆｉ性白
血病と考えられる。

・１Ω性の骨髄性白血病（すなわら慢性顆粒球白血病）
は血液、骨髄、膵臓、肝Ｉ臓、およびしばしばその伯の
組織における未成熟顆粒球（好中球、好酸球および好塩
基球）の異常な増殖を特徴とする。

慢性骨髄白血病患者の大部分は急性型の疾患から区別し
えないパターンへの移行に発展する。この変化は「ブラ
スト・フライシス」として知られている。本発明は、Ａ
ＬＬおよびその公知の亜型、ＡＭＬおよびその公知の亜
を、並びにブラスト・フライシスにおける慢性骨髄白血
病の処置における特定薬剤の効果を予測するのに特に有
用でおる。

本発明の具体例によれば、成る種の腫瘍疾患を有するが
未だ化学療法を受けてない検体から腫瘍細胞の試料を採
取する。この試料採取は、化学療法の開始前に行なわれ
る。白血病検体を試験するため骨髄細胞は腫瘍細胞の原
料となるが、静脈穿刺により容易に入手しうるため末梢
血液白血球を利用するのが好適である。腫瘍細胞におけ
る１種もしくはそれ以上の生長調節遺伝子の発現レベル
、すなわち問題とする遺伝子のｍＲＮＡ転写の相対数は
、たとえば目標ｍＲＮＡ転写に特異的なＲＮＡもしくは
ＤＮＡプローブを用いる各種の核酸ハイブリッド化技術
のいずれかにより決定される。

「生長調節遺伝子」という用語は、発現が細胞サイクル
の進行およびその後の細胞増殖に関連する遺伝子を意味
する。この種の遺伝子は、非分裂性（すなわち休止）細
胞では発現されず或いは低レベルで発現される。生長調
節遺伝子は、Ｇｏ細胞が生長因子により刺戟された際に
優先的に発現することができる。生長調節遺伝子の同定
は、−般にＣＤＮＡの分別スクリーニングによって行な
われる。生長調節遺伝子を検出するためのＣＤＮＡ保存
物のスクリーニング法は当業者に周知されている。ＣＤ
ＮＡ保存物中に示される遺伝子の約０．５〜１．０％が
生長調節性であると思われる。

従来、多くの生長調節遺伝子が確認されている。

この種の遺伝子は全て、その発現が細胞サイクルの進行
およびそのｊ変の増殖に関連する点において同様な性質
を有する。しかしながら、たとえばｃ　−ｒｎ　ｙ　ｃ
遺伝子のような成る種の生長調節遺伝子は細胞ザイクル
全体にわたり活性である。他のものは、細胞サイクルの
特定期間において最も活性でおる。たとえば、ヒスヒン
ト１３遺伝子は、細胞リーイクルの８期の際に最も高度
に発現される。

さらに、幾つかの生長調節機能もしくは生産物が相互作
用して、それまで正常であった細胞の形質転換もしくは
腫瘍性の表現型を誘発すると思われる。たとえば、生長
調節遺伝子Ｄ５３および活性化ｃ−ｒａｓは、それまで
正常であった主胎芽細胞を形質転換するよう相互作用す
ることができる。

最もよく研究された生長調節遺伝子としてはｃ−ｍｙｃ
［ケリー等、セル、第３５巻、第６０３〜６１０頁（１
９８３）　］　；各種のヒストン遺伝子［プランブ等、
ヌクレイツク・アシッド・リザーチ、第１１巻、第２３
９１〜２４１０頁（１９８３）　］　　；　Ｃ−ｒａｓ
（キャンビシ等、セル、第３６巻、第２４１〜２４７頁
（１９８４）　］　；　ｃ−ｆｏｓ　［グリーンベルク
等、ネイブー１１−（ロンドン）、第３１１巻、第４３
３〜４３８頁（１９８４）およびコツホラン等、サイエ
ンス、第２２６巻、第１０８０〜１０８２頁（１９８４
）　］　：１）５３　［ライヒ等、ネイチャー（ロンド
ン）、第３０８巻、第１９９〜２０１頁（１９８４）　
］　　：　ｃ−ｍｙｂ　［トレリ等、モレキュラ・セル
ラー・バイオロジー、第５巻、第２８７４〜２８７７頁
（１９８５）　］　；ヂミジンキナーピ［リュー等、ジ
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻
、第３２６９〜３２７５頁（１９８５）コ　；カルモジ
ュリン［シャホレアス等、セル、第３６巻、第７３〜８
１頁（１９８４）　］　：およびオルニチン・デカルボ
キシラーゼ［カハナ等、プロシーディング・ナショナル
・アカデミ−・ｌｊイエンス・ＵＳＡ、第８０巻、第３
６４５〜３６４９頁（１９８３）　］が必る。他の生長
調節遺伝子は２Ａ９もしくはカル°す゛イクリン［カラ
プレツタ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２６１巻、第１２６２８〜１２６３２頁（１９８
６）　］　：　４　Ｆ　１もしくはビメンチン［）Ｔラ
リ等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第６巻、
第３６１４〜３６２０頁（１９８６）］　：並びにＡ　
Ｔ　Ｐ　／ＡＤＰ１〜ランスロカーゼをコードする２Ｆ
１　［八ッチ一二等、ジＶ−ナル・バイオロジカル・ケ
ミス１〜リー１第２６２巻、第４３５５〜４３５９頁（
１９８７）　］を包含する。各種のプロテアーゼおよび
プロテアーゼ阻止剤のための遺伝子も生長調節遺伝子と
して確認されている［デンハルト等、バイオケミカル・
バイオフィジカル・アクタ、第８６５巻、第８３〜１２
５頁（１９８Ｂ）　　：エドワーズ等、モレキュラ・セ
ルラー・バイオロジー、第５巻、第３２８０〜３２８８
頁（１９８５）　］。］プロラクチンー生長ホルモンの
一員をコードする生長調節遺伝子も、リンツアー等によ
り確認されている［プロシーディング・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス、第８１巻、第４２５５〜４２５
９頁（１９８４）　］。

本発明を実施するには、ｃ−ｍｙｃおよびヒスヒント１
３遺伝子が特に有用でおる。従来ｍａｃとして知られた
ｃ−ｍｙｃは鳥類骨髄球腫症の原因であると思われるウ
ィルス遺伝子の正常な細胞対応物である。ヒトゲノムに
おいて、遺伝子は等しい長さの３個のエクソンで構成さ
れた５、２ｋｂの転写単位として存在する。第１エクソ
ンは非コード性であると思われる。ｃ−ｍｙｃ遺伝子生
産物の機能は正確には知られていないが、恐らく細胞核
における成る種の生長因子の作用を媒介することによる
細胞増殖の保持に関連すると思われる。

これに関する証拠は無数に存在するか、主として細胞が
生長因子と接触することにより刺戟されて増殖する際に
ｃ−ｍｙｃ３ｉ伝子の活性が常に細胞分裂に関連した実
際の物理的現象の前に急速かつ著しく増大するという１
２察に関して展開される。

ざらに最近の証拠は、ｃ−ｍｙｃＪ伝子の活性増大が正
常な成熟プログラムを完結しえない細胞の無能力に関連
することを示唆している。したがってｃ−ｍｙｃｉ仏子
はさらに、正常な細胞発生を調整する際に１９割を演す
ると思われる。

ウイルスオンコダン、すなわら生産物が真核細胞を形質
転換させる能力を有する遺伝子は、プロシーデングンと
呼ばれる細胞対応物を有する。

細胞内におけるその存在および発現は、腫瘍表現型をも
たら１゜ｃ−ｍｙｃは１種のプロ１〜−Ａンコダンであ
る。ｃ−ｍｙｃの他に、公λ１１の生長調節プロトーオ
ンコダンはＣ−ｆｏｓ、　Ｃ−１−１ａ　−ｒａｓ、ｃ
−ｍｙｂなどを包含する。ヒストンは、ＤＮＡに結合す
ることによりクロマチンの構造骨格を形成する蛋白でお
る。その合成は、殆んどの真核細胞におけるＤＮＡ合成
に一時的に関連する。

ヒストント（３は、１種もしくは４種のコアヒストン蛋
白、すなわち１１２Ａ、Ｈ２Ｂ、１−１３およびＨ４を
コードする遺伝子である。ヒト細胞の半数体ゲノム１個
当り各コアヒストン遺伝子の約４０個のコピーが存在す
る。ヒストン遺伝子の発現制御は復博で必ると思われ、
かつ転写メカニズムおよび後転写メカニズムの両者に依
存する。しかしながら、Ｈ３を包含するヒストン遺伝子
は、細胞１ノイクルの８期もしくり、ＤＮＡ合成期の際
に最も高度に発現される。

試験の目標となる生長調節遺伝子の発現レベルは、検体
の腫瘍細胞から全細胞ＲＮＡを分離しかつハイブリッド
化技術により標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物を同定するこ
とにより、化学療法の前に決定される。相補的ＤＮＡ　
（ｃＤＮＡ）または相補的ＲＮＡ　（ｃＲＮＡ）プロー
ブをこの目的に使用することができる。

一方法によれば、全細胞ＲＮＡを、核酸抽出緩衝剤の存
在下にホモグナイズしかつ次いで遠心分離することによ
り腫瘍細胞から精製する。核酸を沈澱させ、かつＤＮＡ
をＤＮアーピ１での処理および沈澱によって除去する。

次いで、ＤＮＡ分子を標準技術にしたがうアガロースゲ
ルでのゲル電気泳動によって分離し、たとえばいわゆる
「ノーザン」ブロワ１〜技術によりニトロセルロースフ
ィルタに移す。ＲＮＡを、加熱にＪ：リフィルタ上に固
定する。特定ＲＮＡの検出は、問題とするＲＮＡに対し
相補的な充分標識されたＤＮＡもしくはＲＮＡプローブ
を用いて行なわれる。

プロット技術の他に、この試験はその場でのハイブリッ
ド化の技術にしたがって行なうこともできる。この技術
は、より少ない腫瘍細胞しか必要としないので好適でお
る。ざらに「細胞学的ハイブリッド化」としても知られ
るその場での技術は、全細胞を顕微鏡カバーガラスに付
着させかつ敢ｑ」能などで標識されたＣＤＮＡもしくｂ
ｃＲＮＡプローブを含有する溶液により細胞の核酸含有
量を検査することを含む。

後記実施例１は、腫瘍白血球の原料としての末梢血液と
放射線標識されたＣＤＮＡプローブとＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッドを検出するためのノーザンプロットとを用い
た９人のＡＭＬ検体（第１表）および９人のＡＬＬ検体
（第■表）に関する本発明の実施を示している。プロッ
トＲＮＡを先ず最初にｃ−ｍｙｃにハイブリッド化させ
、次いて残余のハイブリッド化を除去した後にヒストン
１−１３にハイブリッド化させる。生長調節遺伝子ｃ−
ｍｙｃおよびヒストント１３（全検体）および非細胞サ
イクル依存性遺伝子β−アクチン（検体１〜６）、並び
にβ２−マイクログロブリン（検体７および８）の発現
レベルを、療法の直前および抗腫瘍剤を最初に加えてか
ら２４時間後に検体から分離された全ＲＮＡにつき決定
した。

標的ｍＲＮＡに対し相補的なりＮＡプローブは、適切な
ｍＲＮＡｍＲＮＡｍ物子転写物かつ逆転写酵素を用いる
逆転写によりＣＤＮＡを合成して得ることができる。或
いは、このプローブは、核内切断によってゲノムを切断
しかつ問題とする遺伝子を周知技術によりクローン化ぎ
Ｖて得ることもできる。

種々の生長調節遺伝子に適切なりＮＡプローブは周知さ
れている。たとえばｒＮＩＨ寄託およびその他のＡＴＣ
ＣコレクションにおけるヒトＤＮＡプローブおよびクロ
ーン化遺伝子」と題するアメリカン・タイプ・カルブー
ヤー・コレクションの刊行物（１９８８年２月２０日）
に示された下記のプローブのような多くのこの種のプロ
ーブを、ＡＴＣＣから入手することができる：ｃ−ｍｙ
ｃ、４１０１０：Ｃ−ｍｙｂ１４１０２４；Ｃ−ｆ’ｏ
ｓ。

４１０４２：　ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、４１００１゜生長調
節遺伝子に対するその他多くのＤＮＡプローブもλ■ら
れておりかつ容易に入手することができる。

好適にはプローブは、たとえばｐ３２、Ｃ１４もしくは
３３５：ｉ金属；或いは標識されたリガンド、たとえば
標識抗体、蛍光性分子、化学発光性分子、酵素などにつ
き特異性の結合対因子として作用しうるリガンドのよう
な放射性核種で標識される。

プローブは、ニック翻訳法［リグビー等、ジャーナル・
モレキュラ・バイオロジー、第１１３巻、第２３７〜２
５１頁（１９７７）　］またはランダムプライミング法
［ファイエンベルブ等、アナリチカル・バイオケミスト
リー、第１３２巻、第６〜１３頁（１９８３）　］のい
ずれかによって高高特異性まで標識することができる。

後者は、高特異活性のｐ３２標識プローブを一本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡＩ型から合成するための選択的方法であ
る。両方法は当業者に周知されており、本明細書では反
復しない。

予め存在するヌクレオチドの代りに高放射能ヌクレオチ
ドを用いることにより、ニック翻訳法にしたがって１０
８　Ｃｐｍ　／マイクログラムより高度の特異活性を有
するｐ３２標識ＤＮＡプローブを作成することができる
。次いでフィルタを写真フィルムに露出することにより
、ハイブリッド化の放射線写真検出を行なうことができ
る。フィルタの密度測定走査は、発現を決定すべき生長
調節遺伝子のｍ　ＲＮ　Ａ転写物を正確に測定する。

放射性核種の標識が実用的でない場合は、ランダム−プ
ライマ法を用いてｄＴＴＰ同族体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオ
チニル−ε−アミノカプロイル）−３−アミノ−アリル
）デオキシウリジン三燐酸をプローブ分子中に組込むこ
とができる。このようにビオチニル化されたプローブの
オリゴヌクレオチドは、たとえばアビジン、ストレア１
〜アヒジンまたは着色反応を生ずる蛍光染料または酵素
と結合した抗−ビオチン抗体などのビオチン結合性蛋白
との反応により検出することができる。

本発明により個々の検体で効果を予測しうる代表的な抗
腫瘍（抗癌）剤は、治療学の薬理学的基準にしたがい次
のように分類することができるニア　／Ｌｚ　−Ｆ　、
シ北１１：窒素マスタード；たとえばトリエチレンチオ
ホスホルアミド（チオーテパ）のようなエチレンイミン
誘導体；およびたとえばブスルファンのようなアルキル
スルホネート： 抗−代謝物：たとえばメトトレキセートのような葉酸同
族体：たとえば５−フルオロウラシルおよびシ１−シン
アラビノシトのようなピリミジン同族体；たとえば６−
メルカプｌ−プリンおよび６−チオグアニンのようなプ
リン同族体； 天然物質：たとえばビンブラスチンおよびビンクリスチ
ンのようなビンカアルカロイド；たとえばアドリアマイ
シンおよびズアノルビシンのような抗生物質；並びにた
とえばＬ−アスパラギナービのような酵素；ホルモン類
：たとえばプレドニゾンのような副腎皮質ステロイド：
たとえばヒドロキシプロゲステロンのようなプロゲスチ
ン：たとえばテストステロンのようなアンドロゲン；た
とえばジエチルスチルベストロールのようなエストロゲ
ン、並びにたとえばタモキシフェンのような抗エストロ
ゲン；その他の薬剤：たとえばヒドロキシ尿素のような
置換尿素；たとえばプロカルバジンのようなメチルヒド
ラジン誘導体；たとえばミトテンイのような副腎皮質抑
制剤；並びにたとえばｃｉｓ−ジアミンジクロルプラチ
ニウムのような置換重金属。

特に、抗白血病療法に用途を有する次の抗腫瘍剤の効果
を本発明の実施によって予測することができる：メルカ
プトプリン、メトトレキセ−１〜、シクロホスファミド
、ビンクリスチン、チオグアニン、ダウノマイシン、エ
ビルビシン、ＡＲＡ−０１シクロザイチジン、Ｍ−ＡＭ
ＡＳＡ、メチルプレドニゾロン、アドリアマイシン、プ
レドニゾロン、イダルヒシン。

癌の化学療法は典型的には複数の薬剤組合せとして、す
なわち「組合Ｕ化学療法」として行なわれる。本発明に
よれば、この種の薬剤組合せの効果を直接試験すること
ができる。したがって、水明細書中における「抗腫瘍剤
」といつ用Ｍ）は、抗腫瘍剤の組合せを包含１−ること
を意図する。

幾種かの薬剤は、その異なる構造もしくは電荷により混
合物中で非相容性になりうる。そのような場合、組合Ｕ
における個々の薬剤は単独基準で試験することができ、
その組合せ処置の結果を個々の薬剤に基づく結果から推
定することができる。

選択された抗腫瘍剤を最初に施した直後に、検体から第
２の腫瘍細胞試料を得ると共に、細胞ＲＮＡを再び分離
しかつプローブハイブリッド化技術を反復して、監視さ
れている生長調節遺伝子の発現レベルの生じうる変化を
評価する。予備ハイブリッド化にて露呈させたと同量の
全ＲＮＡがハイブリッド化に露呈させる。化学療法の開
始直後における生長調節遺伝子発現の有意な減少を観察
することができる。かくして、この試験は、化学療法の
開始時点における粒状抗腫瘍剤もしくはこれら薬剤の組
合せの効果を予測する迅速な方法を与える。第２回目の
腫瘍細胞のサンプリングおよび生長調節遺伝子の発現測
定は、化学療法の過程に伴って生ずる全般的な細胞死滅
の開始前に行なうべきでおる。細胞死滅の状態は細胞ｍ
ＲＮＡの全般的低下をもたらし、これを非生長調節遺伝
子の発現レベルにおりる低下によって検出することがで
きる。他方、本発明は、他の遺伝子の発現レベルか影響
されていない時点で生長調節遺伝子に対し特異性のｍＲ
ＮＡ合成における初期低下を決定することに向けられる
。したがって、第２の腫瘍細胞のサンプリングおよび生
長調節遺伝子発現の決定は、この全般的な細胞死滅の発
生前に行なうべきである。第２の豐ナンプリングは、好
ましくは最初に抗腫瘍剤を加えてから約６〜約４８時間
後、特に好ましくは約２４〜４８時間後に行なわれる。

抗腫瘍化学療法を開始する前後における生長調節遺伝子
の発現レベルの比較は、担当医に対し貫重な情報を与え
る。試験下の生長調節遺伝子の発現に有意の低下が存在
しないことは、恐らく問題とする薬剤での処置の全過程
が軽快をもたらさないことを意味する。加えた薬剤が生
長調節遺伝子のレベルに有意な低下を生ぜしめることが
観察されれば、これは恐らく処置の全過程の継続が最終
的な軽快をもたらすと思われる。

単一の生長調節遺伝子のレベルにおける変化は特定の抗
ｊ匝瘍剤もしくはそれらの組合Ｕに対する検体の反応を
予測する基準となりうるが、薬剤の効果に関する一層正
確な測定は２種もしくはそれ以上の生長調節遺伝子の発
現を追跡して達成することができる。２種らしくはそれ
以上の生長調節遺伝子の発現における低下は、単一の遺
伝子における低下よりも高度の予測値となりつる。

本発明の好適具体例によれば、１種もしくはそれ以上の
非細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルは、生長調節
遺伝子の発現の決定と同時に決定される。［非細胞サイ
クル依存性］遺伝子という表現は、発現レベルが細胞サ
イクルとは独立している遺伝子を意味する。したがって
、これらの遺伝子は正常状態レベルで連続的に発現され
る。多くの非細胞ナイクル遺伝子が知られており、これ
らの遺伝子は、たとえば次のものを包含する：γ−アク
チン［グニング等、モレキュラ・セルラー・バイオロジ
ー、第３巻、第７８７〜７９５頁（１９８３）　］　：
］β−アクチンヌグ等、モレキュラ・セルラー・バイオ
ロジー、第５巻、第２７２０〜２７３２頁（１９８５）
　］　：］β２−マイクログロブリンＵケリー、セル、
第３５巻、第６０３〜６４０頁（１９８３）　］　］ニ
ゲリセルアルデヒドー３−ホスフェ　１−デヒドロゲナ
ーゼ（ｆ’ＧＡＰＤＨＪ　）　　［ズガイチェク等、バ
イオケミストリー、第２２巻、第１６０５〜１６１３頁
（１９８３）およびオルソン等、モレキュラ・セルラー
・バイオロジー、第７巻、第２１０４〜２１１１頁（１
９８７）　］。

一般に抗腫瘍剤は、本発明の試験期間中には非細胞サイ
クル依存性遺伝子のｍＲＮＡレベルに影響を与えない。

したがって、非細胞サイクル依存性遺伝子の発現は、目
標の生長調節遺伝子発現における非特異的変化に対し有
用な対照となる。したがって、好ましくは１種もしくは
それ以上の非細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルを
ここに記載した方法により監視する。非細胞リーイクル
依存性遺伝子β−アクチンｄ″３Ｊ：びβ２−マイクロ
グロブリンの発現がこの点に関し特に有用である。

β−アクチンの遺伝子発現が充分でおり、生長因子調節
性あるとしても、これは細胞リイクル依存性でない。何
故なら、そのｍ　ＲＮ　Ａレベルは制止細胞および増殖
細胞において同レベルであるからでおる。β２−マイク
ログロブリンの発現も充分でおりかつ細胞サイクルの位
置とは独立して全細胞で同等に発現されるしケリー等、
セル、第３５巻、第６０３〜６１０頁（１９８３）　］
。

本発明は上記したように軽快を予測するための生長調節
遺伝子発現に対する選択化学療法剤のインビボ効果を監
視することを包含するが、検体に対し実際に薬剤を加え
ることなく検体からの腫瘍細胞をインビトロで所望の化
学療法剤と共に培養することにより同様な予測値の結果
を得ることができる。この技術は、充実性腫瘍を特徴と
する腫瘍疾患に特に適している。

本発明のこの具体例によれば、腫瘍の１部を外科的生検
の時点または手術が決定された時点のいずれかに検体か
ら採取する。新たな腫瘍組織を微細に細断し、かつ適当
な組織培地で培養する。全細胞ＲＮＡを分離し、かつ１
　ｅＥもしくはそれ以上の生長調節遺伝子の発現レベル
を上記したようにハイブリッド化によって決定する。腫
瘍組織の第２の部分を同様に処理するが、ただし組織を
細断した後に細胞を１種もしくはそれ以上の抗腫瘍性化
学療法剤を含有する適当な培地で培養し、検体に軽快を
もたらすその効果を評価することができる。化学療法剤
は、検体に対する化学療法剤のインビボ投与後に経験さ
れるような細胞濃度に近似する量で培養物に添加される
。腫瘍細胞を、抗腫瘍剤と共に特定の生長調節遺伝子の
発現低下が生ずるのに充分な時間かつ全般的な細胞死滅
が生ずるほど長過ぎない時間にわたって培養する。好ま
しくは、培養時間は、約６〜約４８時間であるが、２４
〜４８時間が特に好適でおる。特に有利には、培養時間
は約２４時間で必る。培養後、同数の細胞を用いてハイ
ブリッド化分析を反復する。生長調節遺伝子の発現レベ
ルが低下し或いは低下しないことは、最終的な軽快また
は軽快なしに関する予測を与える。

［実施例］ 以下、限定はしないか実施例により本発明をさらに説明
する。

実施例　１ Ａ、肋 少なくとも５０％の芽細胞を有する高い末梢白面球数を
持った検体を選択した（第１表および第■表）。末梢血
液の使用は、髄液吸引を友復することなく、反復サンプ
リングを可能にした。処置前および最初に抗腫瘍剤を各
検体に与えてから２４時間後に、静脈穿刺によりヘパリ
ン化末梢血液白血球を採取した。白血球数のフランス−
米国一英国の分類は、形態学的検査および細胞化学反応
（ＲＡＳ、スダンブラック、ミエロペルオキシダーし、
クロルアセテートニステラーし、非特異性エステラーピ
）によって確立されている。これら細胞を、表面表現型
（ｃＡＬＬａ、Ｌｅｕ−１抗原、ＤＲおよび各種の抗骨
髄性モノクロナーナル抗体）、ｌ’−ｄｔ酵素活性およ
び核型分析によりざらに特性化した。ＡＬＬを有する検
体において、ＩＱ部位の転位についても分析した。ヒト
試料の使用に関する許可は、フィラデルフィア・テンプ
ル大学の小児科病院におけるヒト患者の保護委員会およ
びモデナ大学の血液学部によって承認された。

Ｂ、ＤＮＡプローブ 主としてリグビー等［ジャーナル・モレキ１う・バイオ
ロジー、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）
　］の方法にしたがい、高特異活性にてニック翻訳法に
より次のプローブを標識した：Ｃ−ｍｙｃ遺伝子プロー
ブの５′および３′末端を有するプラスミドｐＭＣ４１
５およびｌ）ＭＣ４１３［ダラ・ファベラ等、プロシー
ディング・ナシ３ナル・アカテ゛ミー・４ナイエンス・
ＵＳＡ、第７９巻、第６４９７〜６５０１頁（１９８２
）　］　：ヒストン］−１３遺伝子を有するプラスミド
ｐＦＯ４２２：ヒ］〜β−アクチンｃＤＮＡ　［グニン
グ等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第３巻、
第７８７〜７９５頁（１９８３）　］　　：および］ヒ
トβ２−マイクログロブリンＣＤＮＡサグス等、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミ−・］ナイエンス・
ＵＳＡ、第７８巻、第６６１３〜６６１７頁（１９８２
）　１゜ニック翻訳により挿入されたＤＮＡの放射能標
識は、ファインベルり等によりアナリチカル・バイオケ
ミストリー、第１３２巻、第６〜１３頁（１９８３）に
記載されたように行なった。

Ｃ１核酸の分離 全細胞ＲＮＡをフレーザー等の方法［モレキュラ・セル
ラー・バイオケミストリー、第５６巻、第１１３〜１２
２頁（１９８３）　］にしたがって白血病細胞から精製
した。要約すれば、細胞をワーリング・ブレンダーにて
抽出緩衝液［７５ｍＨのＮａＣｌ２．２０ｍＨのＥＤＴ
Ａ、１０ｍ）ｌのトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ８，０）およ
び０．２％のドデシル硫酸ナトリウム（ｆ’５ＤｓＪ）
　　］中でホモゲナイズし、１：１の比で緩衝剤飽和フ
ェノールと混合した。水相を遠心分離により回収し、同
容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２５：２４：　　１）で再抽出し、次いで再びクロ
ロホルム：イソアミルアルコール（２４：　　１）で１
回抽出した。核酸をエタノールで沈澱させた。ＤＮＡを
ＤＮアーゼ１での処理により除去し、かつ３Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５，５＞で沈澱させた。試料にお（ブるＲ
ＮＡの一体性および伍を、アガロース−ホルムアルデヒ
ドゲルの臭化エチジウム染色によって監視した（下記参
照）。ＤＮＡ抽出は、グロスーベラード等によりヨーロ
ピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第３６巻、
第３２〜３８頁（１９７３）に記載されたように行なっ
た。

０．７旦ヱユイ之ｌ 約１．２ｇのアガロースと１０ｍ１の１０ｘ（ｖなわち
１０（”ｏ濃度＞３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスル
ホン酸　（ｒＭＯＰｓＪ　）と８７ｄのジエチルピロカ
ーボネート（ｒＤＥＰＣ」）処理されたオートクレーブ
処理水とをオートクレーブ処理されたフラスコに添加し
かつアカロースを沸ｌｌヲ溶解させて、アガロース−ホ
ルムアルデヒドゲルを作成した。

５０″Ｃまで冷却した後、５．１ｍｉの３７％ホルムア
ルデヒドをゲルに添加し、次いでこれを１１Ｘ　１／１
ｃｍの曲に注型した。このゲルを約１時間かけて重合さ
せた。上記で得られた１０〜３００μ９のＲＮＡを微小
遠沈管における５μりのＤＥＰＣ処理されたオートクレ
ーブ水に溶解させた。次いで、２５μρの電気泳動試料
緩衝液［０，７５ｄの脱イオン化ホルムアミド、０．１
５ｄの１０ｘＭＯＰＳ、０．２４ｍのボルムアルデヒド
、０１１ｍ１の１ｊ党イオン化ＲＮアーＬ番フリーの水
、０．１ｄのグリはリン、０．０８ｍ１の１０％（Ｗ／
）プロしフェノールブルー］を添加し、かつこの溶液を
６５°Ｃまで１５分間加熱した。次いで、１度の臭化エ
チジウム溶液（１，０ｍＭｍ）を試料に添加し、次いで
これを混合しかつゲルに添加した。このゲルを約３０Ｖ
　（一定電圧）にて１８時間にわたり電気泳動した。次
いで、このゲルを１０ｘＳＳＣ（最終容積１２のＨ２０
における１７５．３（１のＮａＣｆ！と８８．２ｇのク
エン酸すＩ〜リウム）にて室温で２０分間つづ２回浸漬
することにより、移動用に４（備した。移動を行なうニ
トロセルロースフィルタを蒸溜水中で５分間にわたり予
備浸漬し、次いでｌ０ＸＳＳＣにて５分間浸漬した。次
いで、フィルタをゲル上に重ね、かつＲＮＡを毛細管作
用によりフィルタに移動させた。約２時間にわたり８０
’Ｃにて減圧下に焼成することにより、ＲＮＡを二１〜
口セルロースに固定した。

Ｅ、ハイブリッド化工程 二１〜口セルロースフィルタの予備ハイブリッド化を行
なって、フィルタに対するプローブの非特異的ハイブリ
ッド化を減少させた。フィルタを２５ｄの５×デンハル
ト溶液（０，９ＭのＮａＣｌ２．５０ｍＭの燐酸塩緩衝
剤、１０ｍＨのトリス（ｐＨ８，０）、１ｍＨのＥＤＴ
△、５０％のホルムアミド、１％の牛血清アルブミン（
ｒＢＳＡＪ　）　、１％のポリビニルピロリドン（ｒＰ
ＶＰＪ　）および１００ｍｇ　／ｒａｉｌの変性鮭精子
ＤＮＡ］中でフィルタを３０分間にわたり培養した。プ
ロット処理したＲＮＡに、同じ緩衝液にてｐ３２−標識
プローブ［ｃ−ｍｙｃ、ヒストンＨ３、β−アクヂンも
しくはβ２−マイクログロブリンプローブのいずれ／〕
居少なくとも１，５〜２ｘＴＯ７ｃｐｍの比活性を有す
る１０〜５０ｍｇのｐ３２標識ＤＮＡ］でハイブリッド
化し、これに１０％硫酸デキス１ヘランを添加した。こ
れはハイブリッド化反応を促進させ、４２°Ｃにて２０
〜２４時間にわたり進行させる。後ハイブリッド化物の
洗浄を行なって、非特異結合したプローブを除去した。

これらの洗浄は、６０°ＣＬＯＴ先ず最初に１　Ｘ５Ｓ
Ｃ（０，５ＭのＮａ（１，０，０１５Ｍのクエン酸ナト
リウム）中で３０分間行ない、次いで０．１ｘＳＳＣに
て２回（それぞれ３０分間）行なった。次いで、フィル
タを増強スクリーンにより一７０℃でコダック社Ｘ−線
フィルムに露出１−ることによりハイブリッドの敢ｑ」
線写真検出を行ない、次いでこれを製造業者の指示にし
たがって現像した。フィルタの密度測定走査は、ビイニ
ー・レーザー密度計（カリホルニア州、フラータウン在
、ヒオメド・インストルーメンツ・インコーポレーショ
ン社）を用いて行なった。密度による計測定値の精度お
よび直線性は、種々異なる露出時間復に現像した同じノ
ーザンブロツ１〜のＸ線フィルムを分析することにより
各群における１検休（検体３）は、・慢性顆粒球白血病
の芽細胞期でめった。試験した検体における末梢血液の
芽細胞数は５０〜１００％の範囲で変化することか認め
られたが、この変化は生長調節遺伝子のｍＲＮＡレベル
に関するデータに対し有意に作用しないと予測される。

何故なら、成熟白血球からのｍＲＮＡ収率が芽細胞から
の収率よりもずっと低いからで必る［カラプレツタ等、
プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・１ナイエ
ンス・ＵＳＡ、第８２巻、第４４６３〜４４６７頁（１
９８５）　］。

第■表は、誘発療法の２４時間間口よびその終了時にお
ける各検体の抗腫瘍処置に対する反応を示している。血
液学的軽快は、処置終了復の骨髄中における５％未満の
芽細胞の存在として規定される。

ＡＭＬを有する９人の検体の療法前後におけるＣ−ｍｙ
Ｃおよびヒスｌ〜ンＨ３のｍＲＮＡレベルを第１図に示
す。加えた抗腫瘍剤を第工表に示す。

ＡＭＬを有する検体において、療法はｃ−ｍｙｃ逍伝遺
伝ｍＲＮＡレベルに対し種々異なって影響を及ぼす。た
とえば、検体１．３．４．７および９にＪｉいてｃ−ｍ
ｙｃのｍＲＮＡレベルは療法前後にて実質的に同じであ
るのに対し、検体２．５．６　ｃＩ−３、Ｊ：び８にお
いてはｃ−ｍｙｃのｍＲＮ△の発現に顕著な低下が存在
する。ざらに第１図は、ヒスｌ〜ント１３のｍＲＮＡレ
ベルが５人の検体（１，２，５，６および８〉において
療法により低下することを示している。いずれの検体に
おいても、β−アクチンもしくはβ２−マイクログロブ
リンのｍ　ＲＮ　Ａレベルは療法により顕著に改変され
た。

Ａ　Ｌ　Ｌを有する９人の検体の処置前後におけるｃ−
ｍｙｃおＪ：びヒストンＨ３のｍＲＮＡレベル（第■表
）を第２図に示す。ヒス１〜ンＨ３の発現は処首前のレ
ベルと比較して抗腫瘍剤を最初に加えてから２４時間後
に検体１．２．５．７および９にて著しく減少すること
が明らかで必る。ヒストンＨ３Ｗ伝子のｍＲＮＡレベル
も検体３にｄ５いて若干減少したのに対し、検体４．６
および８においては殆んど変化せず或いは上昇さえした
。

ｃ−ｍｙｃの発現は、検体１．２．５および９において
療法により著しく減少しかつ検体４にｄ３いて若干減少
した。ｃ−ｍｙｃのｒｎ　ＲＮ　Ａレベルは検体３．７
および８において療法後に変化しなかったのに対し、検
体６においては増加した。化学療法は、β−アクチンお
よびβ２−マイクログロブリン遺伝子のｒｎ　ＲＮ　Ａ
レベルにおいて顕著な変化を誘発しなかった。

第１表および第■表は、ＡＩＬ検体１におりる以外には
白血球の個数Ｊ３よび芽細胞の比率か患者に与えられた
１回の抗腫瘍＾１１により右怠に変化しなかったことを
示している。芽細胞の比率に何危の変化が存在しないこ
とは、療法後の生長調節遺伝子のｍＲＮＡレベルに対す
る変化が白血病細胞の細胞量ナイクル進行に必要とされ
る代謝経路に対する抗＋１！１！瘍剤の初期作用に基因
することを示している。ざらに、これらの試験は、最初
の化学療法が白血病検体の約６５％において生長調節遺
伝子ｃ−ｍｙｃおよびヒストン１−１３のｍ　ＲＮ　Ａ
レベルに関し初期変化を誘発させるのに対し、全ての検
体においてβ−アクチンおよびβ２−マイクログロブリ
ンのｍＲＮＡレベルには影響を及ぼさないことをも示し
ている。

特定の理論に拘束されるものでないが、療法後のｃ−ｍ
ｙｃおよびヒストンＨ３のｍＲＮＡレベルにおける低下
は、細胞リイクルにおける生長調節遺伝子の転写に対す
る直接的作用の結果で必ると思われる。この解釈は、ヒ
スＩ〜ント１３のｍＲＮＡレベルの低下を療法後の６０
４間程度に早い時期に成る検体で認めうるという観察に
よって支持される。しかしながら、恐らくこの作用の程
度は、β−アクチンのずっと長い半減期と比較して、ｃ
−ｍｙｃおよびト（３メツセージの短い半減期によって
増大すると思われる。関与するメカニズムとは無関係に
、これらの試験は、非細胞４ノイクル遺伝子β−アクチ
ンおよびβ２−マイクログロブリンの不変レベルと比較
して生長調節遺伝子のｍＲＮＡレベルにおける早期変化
が細胞ＲＮＡ代謝の一般的阻止の結果でなく特異的作用
に基因することを示す。

１回の化学療法の２４０４間後に測定したヒストンＨ３
のｍＲＮＡレベルにおける低下が５人のＡＭＬ検体（１
，２，５，６および８）で観察されたのに対し、ｃ−ｍ
ｙｃのｍ　ＲＮ　Ａレベルはこれら検体のうち４名（２
，５，６および８）で減少した。血液学的軽快が検体５
．６および８において得られた。Ｈ３のｍＲＮＡレベル
は９人のＡＬＬ検体のうち６人（１，２，３，５，７お
よび６）において療法により低下した。ｃ−ｍｙｃの発
現は、これら６人のＡＬＬ検体のうち４人（１，２，５
および９）において減少した。５人のＡ　Ｌ　Ｌ検体（
１，２，３，５および９〉は、化学療法の終了時に完全
に軽快した。部分的軽快か検体４で得られ、この場合は
療法の２４時間後にｃ−ｍｙｃの発現のみが減少し、か
つ検体７においては療法の２４時間後にＨ３の発現のみ
か減少した。

これらの結果は、２種の生長調節遺伝子Ｃ−。

ｍｙｃおよびヒストン）−１３の同時的低下の欠如が望
ましくない予知因子で必ることを示している。

療法の後にｃ−ｍｙｃおよびヒス１ヘンＨ３のｍ　ＲＮ
　Ａレベルに変化を生ぜず或いは増加ざえする６人の検
体は、いずれも軽快を達成した。これらの知見はざらに
、化学療法剤を１回のみ施こしてから２４時間後のｃ−
ｍｙｃもしくはヒストン１−１３のｍＲＮＡレベルにお
ける低下が完全な血液学的軽快を最終的に達成する示唆
となることを示している。

次の実施例は、その場におけるハイブリッド化技術を用
いる本発明の実施を例示しでいる。

実施例　２ Ａ１組織作成 外科的生検の時点または手術決定時点のいずれかにおけ
る腫瘍組織を検体から味］出しかつ微細片まで細断し、
これらを直らに（ｉ）１ｍのＬ−グルタミンと１ｉのピ
ルビン酸す１〜リウムと１１ｎ１の非必須アミノ酸と０
．８ｄのＮａＨＣＯ３と０．７５ｍ１のペニシリン／ス
トレプトマイシン溶液（培地１００ｎｄｌ当り）と５％
（Ｖ／）の胎児牛血清とが補充された新鮮な組織培養培
地のみ（ＲＰＭＩ１６４０）または（ｉｉ）検体に化学
療法剤をインビホ投与した後に予測される細胞濃度にほ
ぼ等しい最終濃度の被検抗腫瘍剤を含有する同じ培地の
いずれかを含む無菌の２５　ｄ　１１１培養フラスコに
入れた。

５％ＣＯ２を含有する雰囲気にて３７℃で２４時間培養
した後、組織を直ちに液体窒素中のＯＣＴ組織埋込み培
地（ティシュ−Ｔｅｋｌｌ、マイルズ・ラボラトリーズ
社〉で直ちに凍結した。試料は、これらの条件下で無限
に貯蔵することができる。凍結した組織ブロックを一２
０’Ｃの低温保存室に３０分間入れて、ブロックの温度
をミクロトームナイフの温度（−２０’Ｃ）と平衡化さ
け、このナイフにより組織切片（厚ざ約４−２０μ、）
を切除した。４５０ｍ閂Ｎ　ａ　Ｃ（！　／　４５ｍＭ
クエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０＞を含有するデンハル
ト溶液（０，０２％フィコールし、０．０２　％　Ｐ　
Ｖ　Ｐ、０．０２％ＢＳＡ）にて６５°Ｃで３時聞培益
することにより、ガラススライドを予（Ｂ処理した。こ
れらスライドを２回蒸溜水で濯ぎかつエタノール：酢！
　（３：　１　）で２０分間固定した。切片を予備処理
されたガラススライドの上に浮遊させ、次いで平滑化し
かつ軟質毛ブラシでスライド上にならした。次いで、こ
れらスライドを熱プレート上で５０°Ｃまで２分間加温
し、そして風乾した。次いで、スライドを４％パラホル
ムアルデヒドで２０〜３０分間にわたり室温にて固定し
、３Ｘ燐酸塩緩衝塩水（ｒＰＢｓＪ　）で５分間濯ぎ、
次いで１ｘＰＢＳにて２回（それぞれ５分間〉ｊＲいた
。次いで、処理された組織を勾配エタノール溶液（３０
％、３０％、８０％、９５％、１００％）に５分間浸漬
することにより脱水させた。次いで、これらスライドを
風乾しかつ一２０°Ｃで無期限に貯蔵した。

Ｂ、予備ハイブリッド化処理 上記で作成したスライドを、ＤＥＰＣ処理水に４〜５回
浸漬して濯いだ。これらスライドを、５■ト１のＭＱＣ
ｆ２２を含有するＰＢＳで１０分間にわたり再加水した
。次いで、スライドを０．１Ｍの新たに作成された１〜
リエタノールアミン（３，７１ｇ／水２００ｄ　）に対
し５分間移し、次いでＯ，ＩＭの新たに作成されたトリ
エタノールアミン０．２５％（ｖ／）無水酢酸（２００
ｍｉトリエタノールアミン＋０．５ｙｍ無水酢酸）に５
分間移した。次いで、スライドをＰＢＳ＋５ｍＭ　　Ｍ
ＱＣｊ２て゛）在いた。

この時点でスライドを２群に分割することができ、１群
をＲＮＮアール較として利用する。残余のスライドをＰ
ＢＳ＋５ｍ）ｌ　　ＭＱＣρ２中に保つ。残余の細胞を
ＲＮアーピ緩衝液［２０ｄｌの１０ｍ（］／ｄＤＮアー
ゼフリーのＲＮアービＡ保存溶液をＩｄの０．５Ｍ　　
ＮａＣｌ２と１０　ｍ）ｌの１〜リス−ＨＣｊ２（ｐＨ
８，０＞と１■ト１のＥＤＴＡとに＠終）農度２００ｍ
（］　／ｄまで添加１におけるＲＮアーヒＡ（ミズーリ
州、セントルイス在、シグマ社）で処理した。ＲＮアー
ゼＡを含有する緩衝溶液を３７°Ｃまで予備加温し、セ
ル上に層として載せ、かつ３７°Ｃで３０分間培養した
。その後、スライドをＰＢＳ十５ｍＨＭＱＣｊ２で２回
濯いだ。次いで、スライドを０．２Ｍトリス−１−ＩＣ
ｊ＋０．１Ｍグリシン（７５０ｍｇ　／　１００ｍ、Ｄ
Ｉ−１７，４＞に１００分間移た。

これらスライドを２ｘＳＳＣ（２０ｘ＝３ＭＮａＣＬ　
　Ｏ，３Ｍクエン酸ナトリウム、ｌ’）Ｈ７，２）て濯
ぎ、かつ２ｘＳＳＣ＋５０％ホルムアミド（これは１０
０ｄのホルムアミドを８０７のＤＥＰＣ処理水Ｊ３よひ
２０ｄの２０ＸＳＳＣ（９（７二９０ｄ：２０ｄ＞に添
加して作成）に移した。［ハイブリッド化を放射線標識
プローブにつき行なう場合は５０％ホルムアミドを使用
し、またハイブリッド化をビオチニル化プローブにつき
行なう場合には４５％ホルムアミドを用いた］。溶液を
ハイブリッド化の直前に６５℃まで１０分間加熱した。

この時点で、７０−ブをハイブリッド化工程に使用する
ことかできる。

凍結乾燥された放射能標識プローブを、５０％ホルムア
ミド含有のハイブリッド化カルチル（オハイオ州、ソロ
ン在、アムレスコ社）中で室温にて溶融ざぜた。標識プ
ローブの最終）農度は、ハイ７リツド化カクテル１ｍ１
当り約２００〜５００ｎｇとすべきでおる。作成した後
、プローブ／カクテル溶液を無制限に一２０’Ｃで貯蔵
することができる。このプローブ／カクテルは、ハイブ
リッド化工程に使用する前に約１０分間にわたり加熱ブ
ロックで微小遠沈管にて約９５℃まで加熱すべきでおる
。

（ｉｉ　）ビオチン−標識プローブ 凍結乾燥したビオチン標識プローブを、０．９ｍｌの５
０％ホルムアミドカクテル ムアミドカクテルとの混合により作成された４５％ホル
ムアミド含有のハイブリッド化カクテルで溶融させた。

ハイブリッド化カクテルにおける標識プローブの最終潤
度は、ハイブリッド化カクテル１ｄ当り約２００〜ｓｏ
ｏｎｇとすべきである。作成後、プローブ／カクテル溶
液は一２０°Ｃにて無制限に貯蔵することができる。ハ
イブリッド化工程に使用１−る前に、このプローブ／カ
クテルは７ＪＪ　？！’，ブロック内で微小遠沈管にて
約９５°Ｃまで約１０分間加熱すべきである。

Ｄ、ハイブリッド化 標識プローブを含有覆る約３０７の熱ハイブリッド化カ
クテルをスライド・装置試料の上にｉｌｌ　Ｌ！　Ｎ全
ての液体か腫瘍細胞を含む小領域以外にはスライドから
除去されたことを確認する。このスライドを第２のスラ
イド、すなわらパラフィルム（４枚。

２枚並列）で覆い、固定しかつ３７°Ｃの湿潤スライド
加温器または密閉水浴に移した。ハイブリッド化を１晩
にわたり進行さけた。

Ｅ、ハイブリッド化洗浄 ここに特定した希釈物は、全てＤＥＰＣ［理水で作成し
た。

ハイブリッド化スライドを７回の別々の洗浄工程で次の
ように洗浄した。放射能標識でなくビオデル化されたプ
ローブを用いる場合は、洗浄Ｎα１につぎ５０％ホルム
アミド＋２ＸＳＳＣ溶液を使用しく９０威のホルムアミ
ドと２０ｄの２０ＸＳＳＣと９０ｍＡのＤＥＰＣ処理水
〉、また洗浄Ｎα３については５０％ホルムアミド＋１
　Ｘ５ＳＣ溶液を用いた（　９（７のホルムアミドと１
００認の２０ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃと１０（７のＤＦＰＩ迎水
）。

洗浄ＮＯ，１：５０％ホルムアミド＋２ＸＳＳＣにて３
７℃で３０分間。

洗浄ＮＯ，２：５０％ホルムアミド＋１ＸＳＳＣにて３
７°Ｃで３０分間。

洗浄Ｎｏ３　：　　０．２ｘＳＳＣ＋〇、１％ＳＤＳ　
＜！５ｎ認の２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ、５００ｍｇのＳＤＳ
、これを５００　ｔｒｄｌにする）にて室温で３分間。

洗浄ＮＯ，４：洗浄Ｎα３の反復。

洗）争Ｎｏ、５　　：　　　０．１６　　Ｘ５ＳＣ＋　
　０．１％ＳＤＳ（４ｍｌの２０ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，５０
０ｍｇのＳＤＳ、これを５００　ｒｎｌ！にする）にて
室温で３分間。

洗浄ＮＯ，６：洗浄Ｎｏ、　５の反復。

）先：′１ＩＮｏ７　：　２ＸＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ
にて窄）晶で１分間。

次いで細胞を３％８３△と共に１〜リス−塩水（０，１
Ｍ＋−リス−１−１ｃＱ、０．１Ｍ　　ＮａｃＱ、１）
Ｈ７，５＞で５分間培養し、その際溶液をスライド上の
細胞に対し緩和に積層した。次いで、スライドを風乾し
た。

Ｆ、ハイブリッド信号検出 次の手順は、ビオチニル化ｃＤＮＡプローブに対する目
標ｍＲＮＡ転写物のハイブリッド化の検出を示している
。これのＦＡ衝剤は次のように作成した： 緩衝剤Ｎｏ、”ｌ　：　　０．１Ｍ＋へリスートＩ（１
（ｏｆ−１７，５）、０、１Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｊ、２ｍ
ＨＭＯＣｆ！２．０．０５％（ｖ／ｖ）ｌ〜リドン（１
，５８ｇ／　１０（７：　　０．５８／Ｉ（］／　１０
０ｄ　：　　０．０１９１１Ｊ　／　１００ｍ１：　　
０．０５０ｄ／　１００ｄ＞。

緩衝剤ＮＯ２：３％（Ｗ／Ｖ＝３ｇ／　１００７）（７
）ＢＳＡを含む緩衝剤Ｎα１； 緩衝剤Ｎｏ、３　：　　０．１１ｖｌ　トリス−Ｈ（１
！　（１）Ｈ９，５χ０、ＩＭ　　ＮａＣｊ、５０ｍＭ
　　ＭＱＣｊ２　（１，５８Ｍ１００威：　　０．５８
４（１／　　１００ｎｄｌ　：　　０．４８（］／　　
１００ｍ＞。

屹燥したスライドを綴杆ｊ剤Ｎｏ、　１にて１（）分間
わたり再加水し、次いでストレブ１〜アビジン保存溶液
（Ｎｇ　’ｔｉ剤Ｎｏ、　１の１ｉ当り１１Ｉ１９／ｍ
Ｉｌ、最終２Ｑ　Ｉｇ　−２ｍｑ／ｕｆ＞２ｉの溶液を
スライド上に戎Ｕた。次いて、これらスライドをパラフ
ィルム膜て覆いか０１０分間培養した。次いで、スライ
ドを少なくとも２０〜４０倍容積の緩衝剤Ｎｏ、　１に
て約３分間洗ン争した。この洗浄手順を３回反復した。

１μ夕のアルカリホスアターｔ’　（１１１１ｇ／ｄ、
ミズーリ州、べＣスダ在、ベセスダ・リサーチ・ラボラ
１へリース社）を１ｍｌの緩衝剤Ｎｏ、　１と混合して
、最終ｉ農度１μ９／ｄを有するアルカリホスファター
Ｕ溶液を得た。

この溶液をスライド上に戟ケ、かつこれをパラフィルム
膜で覆い、１０分間培養した。次いで、スライドを再び
少なくとも２０〜４０倍容峨の緩衝剤Ｎｏ、　’＋で約
３分間にわたり洗浄した。この洗浄を反復した。次いで
、スライドを緩辻ｉ＾ＩＪ　Ｎｏ、　３で３分間洗浄し
た。この洗浄を１回反復した。８．８μｅのニトロブル
ーテ１〜ラゾリウム溶液（ベセスグ・リナーヂ・ラボラ
トリーズ社）および６．６μｅの５−ブロモ−４−クロ
ル−３−インドリルホスフェ−１へ）ン１陵（ベセスダ
・り會ナーヂ・ラボラｉ・リーズ礼）を２ｍｌのＮ）Ａ
　（］’ｊ　ｆｆ１ｌｌ　Ｎｏ、　３に）昆人した。こ
の溶）陵をスライド上に戎せると共に、パラフィルムで
罵って蒸発を防止した。スライドを暗所にて７１時間の
最大発色＋１：’１間まで培養した。理想的には、これ
らスライドを密閉された３７℃の水浴にて培養する。次
いで、スライドを２０ｍＨの１〜リス（１）８７．５）
　＋５ｍＨのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａで洗浄して、着色反応を終
了させた。これらスライドを９５％エタノールで約５〜
１０秒間濯ぎ、次いで１００％エタノールでさらに５〜
１０秒間ｉＫいだ。スライドをキシレン中に５〜１０秒
間入れ、次いでたとえば［ベルマウント］　（フィッシ
ャー・ケミカル社）に設置した。これらの細胞および染
料は遮光箱で貯Ｒすれば安定である。ハイブリッド形成
の程度を適当な密度測定にＪ：り定量化した。

実施例２の上記組織作成の代案として、腫瘍組織を検体
から鞭１出しかつ直ちに液体窒素で凍結し、種々の程度
の厚さ（５０〜１００μｍ）の切片に切断した。次いで
、切片を（ｉ）新鮮組織培地または（１１）ざらに上記
実施例２のＡ（組織作成）にしたがう被検抗肺瘍剤を含
有した同じ培地のいずれかで解凍させた。２４時間の培
養後、組織スライスを再凍結させ、かつより博い切片（
厚ざ約４〜２０卯）までスライスし、そして実施例２に
おける残余の手順を行なった。

本発明の方法をＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド化により（
′？ｌなわち目標とする生長調節遺伝子および非細胞サ
イクル依存性遺伝子のｍＲＮＡ転写物を検出するためＤ
ＮＡプローブを用いることにより）例示したが、この検
出は目標とするｍ　ＲＮ　Ａ転写物に対し相補的なヌク
レオチド配列を有するＲＮＡプローブを用い−ＵＲＮＡ
／ＲＮＡハイブリッド化技術により行なうこともできる
。

以上、本発明を特定実施例につぎ説明したか、本発明は
これら実施例のみに限定されず、本発明の思想おにび範
囲を逸脱することなく多くの改変が可能で必る。

【図面の簡単な説明】

第１図は化学療法を開始する前（ｒｂＪ　）および２４
時間後（ｒａＪ）の急性骨髄性白血病患者におけるｃ−
ｍｙｃ、ヒス１ヘンＨ３、β−アクチンおよびβ２−マ
イクログロブリンの遺伝子発現レベルの棒グラフであり
、 第２図は化学療法の開始前（ｒｂＪ　）および２４時間
後（ｒａｊ）の急性リンパ球白血病患者におけるＣ−ｍ
ｙＣｌｌ」３、β−アクチンおよびβ２−マイクログ【
］プリンの遺伝子発現レベルの捧グラフである。 ＭＬ １Ｆ工Ｇｌ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）抗腫瘍剤を細胞に加える前に腫瘍細胞にお
   ける少なくとも１種の生長調節遺伝子の発現レベルを決
   定し、 （ｂ）抗腫瘍剤を細胞に加え、 （ｃ）抗腫瘍剤を加えた後かつ腫瘍細胞死滅の開始前に
   腫瘍細胞における前記生長調節遺伝子の発現レベルを決
   定し、かつ （ｄ）上記過程（ａ）で決定された生長調節遺伝の発現
   レベルを上記過程（ｃ）で決定された遺伝子の発現レベ
   ルと比較する ことを特徴とする抗腫瘍剤の効果の予測方法。
2. （２）抗腫瘍剤を細胞に加える前に腫瘍細胞における少
   なくとも１種の非細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベ
   ルを決定し、 抗腫瘍剤を加えた後かつ腫瘍細胞死滅の開始前に腫瘍細
   胞における非細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルを
   決定し、かつ 抗腫瘍剤を加える前後における非細胞サイクル依存性遺
   伝子の発現レベルを比較する過程をさらに含む請求項１
   記載の方法。
3. （３）腫瘍性疾患が白血病からなる請求項１記載の方法
   。
4. （４）生長調節遺伝子をｃ−ｍｙｃおよびヒストンＨ３
   並びにその組合せよりなる群から選択する請求項１記載
   の方法。
5. （５）（ａ）検体から分離された腫瘍細胞における少な
   くとも１種の生長調節遺伝子の発現レベルを決定し、 （ｂ）腫瘍細胞を抗腫瘍剤と共にインビトロで培養し、 （ｃ）細胞を抗腫瘍剤と共に培養した後かつ腫瘍細胞の
   死滅開始前に腫瘍細胞における生長調節遺伝子の発現レ
   ベルを決定し、かつ （ｄ）上記過程（ａ）で決定された生長調節遺伝子の発
   現レベルを上記過程（ｃ）で決定された遺伝子の発現レ
   ベルと比較する ことを特徴とする腫瘍性疾患を有する生物検体における
   抗腫瘍剤の効果の予測方法。
6. （６）前記過程（ａ）にて検体から分離された腫瘍細胞
   における少なくとも１種の非細胞サイクル依存性遺伝子
   の発現レベルを決定し、 細胞を抗腫瘍剤と共に培養した後の腫瘍細胞における非
   細胞サイクル依存性遺伝子の発現レベルを決定し、かつ 腫瘍細胞を抗腫瘍剤と共に培養する前後の非細胞サイク
   ル依存性遺伝子の発現レベルを比較する過程をさらに含
   む請求項５記載の方法。
7. （７）生長調節遺伝子をｃ−ｍｙｃおよびヒストンＨ３
   並びにその組合せよりなる群から選択する請求項５記載
   の方法。