JPH06313000A

JPH06313000A - 巨核球増殖分化因子

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Publication number: JPH06313000A
Application number: JP5197752A
Authority: JP
Inventors: Masafumi Tsujimoto; 雅文辻本; Tatsuya Kurihara; 達也栗原; Nobuhiro Ishida; 信宏石田; Fuyuki Iwasa; 冬樹岩佐; Hiroshi Nakazato; 紘中里; Hirozo Yamaichi; 浩造山市; Takehisa Miura; 健寿三浦; Nobuo Tsuruoka; 伸夫鶴岡; Mare Yamaguchi; 希山口
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1992-07-17
Filing date: 1993-07-16
Publication date: 1994-11-08
Anticipated expiration: 2019-04-26
Also published as: AU7538796A; US5972886A; CA2100690C; ES2108228T3; HU218411B; US20010026931A1; DK0583884T3; DE69314574D1; US20020164711A1; US5831030A; EP0583884A1; KR940005799A; CA2100690A1; EP0583884B1; JP3521936B2; HU9302059D0; KR100397244B1; HUT67124A; AU4190893A; US5874253A

Abstract

(57)【要約】【目的】新規な巨核球増殖分化因子を提供する。【構成】下記性質：（１）巨核球の増殖および成熟分化を促進する；（２）ゲル濾過及びSDS-PAGEの分析による分子量が５５
〜５７kDを示し、分子間ジスルフィド結合を待たない；（３）等電点６．５±０．５を示す；及び（４）配列番号１〜９に示すアミノ酸配列のうち少なく
とも１つの配列を有する；を有する巨核球成熟分化因
子、例えば、配列番号：３０に示すアミノ酸配列を有す
る巨核球成熟分化因子及びその製造方法、並びにそれを
コードする遺伝子、例えば配列番号：３０に示すアミノ
酸配列をコードする遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、巨核球増殖分化因子及
びそれをコードする遺伝子に関する。さらに詳細には、
巨核球−血小板系造血の促進因子として有用な巨核球増
殖分化因子、その製造方法、及びその使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】各種血液細胞が、造血幹細胞から成熟血
球に至る過程において、その増殖と分化を誘導する種々
の造血因子が関与することは周知の事実である。血小板
の寿命はヒトで９〜１０日と短いが、血液中の血小板濃
度は定常状態においてほぼ一定に保たれている。また実
験動物において種々の方法で血小板を減少させても、数
日のうちに血液中に血小板数の回復が認められている。
これらのことから血小板減少期において血小板の産生を
促進する因子が存在することが想定され、その因子を同
定することに従来より多くの努力がはらわれてきた。

【０００３】巨核球血小板系造血において血小板の前駆
細胞である巨核球の形成には少なくとも２種類の調節因
子が関与するものと考えられている。第１の因子は単独
で巨核球コロニーを形成するもので巨核球コロニー刺激
因子と呼ばれる。第２の因子は単独では巨核球コロニー
を形成させる活性はないが、前者を共存させると巨核球
のコロニー数を増やしたり、その増殖分化を促進する作
用を有するもので巨核球増幅因子と呼ばれる。

【０００４】前者に属するものとして、インターロイキ
ン３、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子が、後
者として、エリトロポエチン、マクロファージコロニー
刺激因子、インターロイキン６，７及び１１，ＬＩＦな
どが知られている。またこれらの因子のなかには実際に
ｉｎｖｉｖｏにおいて血小板数の増加や回復時期の短
縮などの効果が認められているものもある（溝口秀昭：
蛋白質核酸酵素３６１１９５ ’９１）。

【０００５】しかしこれらの因子の多くは巨核球／血小
板系の増殖や分化のみではなく各系統の血球の分化にも
関与するなど極めて多様な生物活性を示す。例えばＩＬ
−６およびＩＬ−１１には実際にｉｎｖｉｖｏにおけ
る血小板の増多作用があるが急性期蛋白質の産生を促し
たり、著しい場合には悪液質をひきおこす。またＩＬ−
６の場合、腎臓のメサンギウム細胞を増殖させ腎不全を
起こす可能性があるなど臨床応用上の問題点も多い（松
田正ら：蛋白質核酸酵素３６１１８４ ’９１）。
また血小板減少期においてＩＬ−６は血中で高値を示さ
ず生理的因子とは考えられていない。

【０００６】血小板は、止血機構において重要な役割を
果たしている。血小板減少を伴う疾患（Ｆａｎｃｏｎｉ
症候群、巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血等）は
臨床的には危険な疾患であり、特に出血した場合にはそ
れをコントロールできなくなるような状態になる。従っ
て血小板の産生を促進する因子を単離同定することは、
このような危険を回避するうえで有益であろうと考えら
れる。

【０００７】また、骨髄移植は近年白血病等の有力な治
療法になりつつあるがその成功率はＥＰＯ，Ｇ−ＣＳＦ
等のサイトカインの使用により上昇している。現在の問
題点は血小板減少で、その増多因子が得られれば成功率
はさらに上昇し、入院期間も短縮できると期待される。
造血疾患に限らずがん化学療法や放射線療法時の血小板
減少にも血小板増多因子でコントロールできよう。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記既
知因子の持つ問題点に鑑み、血小板減少または血小板の
機能低下を伴う疾患に有効な血小板の産生を促進する因
子を見出すべく、鋭意研究を重ねた結果、巨核球の増殖
および成熟分化を促進する新規因子を見出し、該因子を
コードする遺伝子をクローニングし、さらに該遺伝子を
有する発現ベクターを作製し、本発明の完成に至った。

【０００９】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、下
記性質を有する巨核球増殖分化因子：（１）巨核球の増殖および成熟分化を促進する；（２）ゲル濾過及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析による分子
量が５５〜５７kDを示し、分子間ジスルフィド結合を持
たない；（３）等電点６．５±０．５を示す；および（４）配列番号１〜９に示すアミノ酸配列のうち少なく
とも１つの配列を有する；に関する。

【００１０】本発明の巨核球増殖分化因子の生成原料と
しては、ヒト細胞、例えばヒト癌細胞、好ましくはヒト
類表皮癌細胞Ａ４３１、特に好ましくは無蛋白質培地で
増殖させた、ヒト類表皮癌細胞Ａ４３１由来の細胞があ
げられる。また、本発明は、上記巨核球増殖分化因子と
同一のアミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換
したアミノ酸配列、あるいは該同一のアミノ酸配列また
はその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に１〜
複数個のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有
し、遺伝子組換え技術によって造成された形質転換細胞
の培養物から得られる巨核球増殖分化因子にも関する。

【００１１】さらに、配列番号：３０に示すアミノ酸配
列またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配
列、あるいは該アミノ酸配列またはその一部が欠失もし
くは置換したアミノ酸配列に１〜複数個のアミノ酸が付
加されたアミノ酸配列を有する巨核球増殖分化因子に関
する。本発明はさらに、前記巨核球増殖因子をコードす
る遺伝子に関する。本発明はさらに、該遺伝子を用いて
の、遺伝子組換え技術による巨核球増殖因子の製造方法
にも関する。

【００１２】遺伝子組換え技術は、上記巨核球増殖分化
因子と同一のアミノ酸配列またはその一部が欠失もしく
は置換したアミノ酸配列、あるいは該同一のアミノ酸配
列またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列
に１〜複数個のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列
をコードする合成または天然のポリヌクレオチドを用い
て既知の手法に従って行えばよく、とくに限定されない
が、シグナル配列の付加や改良、宿主−ベクター系の好
適選択、遺伝子の発現制御部位の改良等により発現効率
の調節などを図ることができる。また、宿主の選択によ
り糖鎖が結合されたものとして得てもよい。さらに、配
列番号１〜９に示すアミノ酸配列のうち少なくとも１つ
をコードするポリヌクレオチドを遺伝子クローニング用
のＤＮＡプローブとして用いてもよい。本発明はさらに
また、本巨核球増殖分化因子を有効成分として含有する
医薬組成物を提供し、血小板減少症治療薬として好まし
くは用いられる。また、本巨核球増殖分化因子を用いれ
ば、公知の手法により、特異的抗体を得ることもでき
る。

【００１３】

【具体的な説明】

（１）材料本発明の新規タンパク質の生成原料として、例えば、無
タンパク質培地においてＹａｍａｇｕｃｈｉらの方法
（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ.
５０７００８ ’９１）により増殖可能となったヒト
類表皮癌細胞Ａ４３１（ATCC CRL 1555)由来の細胞の培
養上清を用いる。本細胞はＨｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍ
ｏｉｄＣａｒｃｉｎｏｍａＳＢＭ３３０と命名され
て、工業技術院微生物工学技術研究所に１９９２年７月
１日付で微工研条寄３９１１号（ＦＥＲＭＢＰ−３９
１１）として寄託されている。

【００１４】（２）巨核球増殖分化因子の測定法巨核球の増殖分化因子の測定には、巨核球系細胞株（例
えばＣＭＫ細胞やそれ由来の細胞）、マウス骨髄細胞等
を用いることができ、例えばマウス骨髄細胞を用いて、
齧歯類の巨核球において特異的に検出されることが知ら
れているアセチルコリンエステラーゼの活性測定をＩｓ
ｈｉｂａｓｈｉらの方法（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｔ．ら
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８６
５９５３ ’８９）で行う。また巨核球の組織化学的
な検出は、骨髄細胞を培養後アセチルコリンエステラー
ゼ染色及びメイ＝グリュンワルド＝ギムザ染色を行い染
色された細胞の形状を判定することにより行う。

【００１５】（３）巨核球増殖分化因子の精製巨核球増殖分化因子の精製は、例えば、Ａ４３１細胞の
無タンパク質培養上清を出発材料とし、限外ろ過により
濃縮後、カラムクロマトグラフィー、例えばＭａｔｒｅ
ｘＢｌｕｅＡ（アミコン社）、Ｑ−セファロース（フ
ァルマシア社）、フェニル−セファロース（ファルマシ
ア社）、Ｓ−セファロース（ファルマシア社）、ハイロ
ード２６／６０スーパーデックス７５（ファルマシア
社）、の各カラムクロマトグラフィーを順次組み合わせ
て行える。タンパク質はＡ₂₈₀ nmを測定することにより
モニターする。

【００１６】（４）巨核球増殖分化因子の部分アミノ酸
配列の決定：アミノ酸配列の構造を知るため、（３）で
精製した巨核球増殖分化因子画分をプロテアーゼ（例え
ばアクロモバクターＰｒｏｔｅａｓｅＩ（ＡＰＩ））を
加え３７℃２時間処理してフラグメント化する。得られ
たペプチド断片をＹＭＣ−ＰａｃｋＡＭ−３０３カラ
ムによる逆相ＨＰＬＣ（０．１％トリフルオロ酢酸存
在下アセトニトリル勾配形成）により分取する。得られ
たペプチド断片をシークエンサー、例えばＡｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製ｇａｓ−ｐｈａｓｅシーク
エンサーにかけアミノ酸配列を決定する。上記の巨核球
増殖分化因子の具体的な精製方法、及び詳細な性質は実
施例１に記載する。

【００１７】本発明はまた、上記の巨核球増殖分化因子
をコードする遺伝子を提供する。この遺伝子はｍＲＮＡ
からのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡのいず
れであってもよい。ｃＤＮＡは、例えば、前記のように
してヒト細胞、例えばヒト類表皮癌細胞、例えばＡ４３
１細胞株から精製した巨核球増殖分化因子の、実施例１
に示すような部分アミノ酸配列に基いて設計したＤＮＡ
（ヌクレオチド）プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖
反応法（ＰＣＲ）によりクローニングすることができ
る。クローニングの具体的な１例を実施例２に示す。

【００１８】本発明の遺伝子はさらに、巨核球増殖分化
因子活性を有する蛋白または糖蛋白をコードし、配列番
号：３０のヌクレオチド配列とハイブリダイズするＤＮ
Ａも含まれる。実施例２においてクローニングされた、
本発明の巨核球増殖因子をコードするＤＮＡのヌクレオ
チド配列及び該ヌクレオチド配列から推定されるアミノ
酸配列を配列番号：３０に示す。

【００１９】こうして、一旦アミノ酸配列が決定されれ
ば、この天然アミノ酸配列に１〜複数のアミノ酸が付加
されておりなお巨核球増殖因子活性を維持しているポリ
ペプチド、前記天然アミノ酸配列から１〜複数個のアミ
ノ酸が除去されておりなお巨核球増殖因子活性を維持し
ているポリペプチド、前記天然アミノ酸配列中の１〜複
数個のアミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられてお
りなお巨核球増殖因子活性を維持しているポリペプチ
ド、さらには、上記のアミノ酸付加変異、アミノ酸除去
変異及びアミノ酸置換変異が組合わされた変異を有しな
お巨核球増殖因子活性を維持しているポリペプチドな
ど、種々の変異型巨核球増殖因子を設計し、それを製造
することができる。

【００２０】上記アミノ酸の付加、除去及び置換等の変
異におけるアミノ酸の数は、特に限定されないが、付加
については、例えば、本発明の巨核球増殖分化因子との
ハイブリッド蛋白に用いられる機能性蛋白のアミノ酸の
数（例えば、マルトースバインディングプロテイン（ｍ
ａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）等の
公知の抽出精製もしくは安定化用蛋白または各種生理活
性蛋白、例えばＩＬ−３，ＩＬ−１１のようなサイトカ
イン）や本因子に付加されたシグナルペプチドのそれに
依存し、すなわち、当該変異の目的に依存して決定され
る。例えば、１〜３０、好ましくは、１〜１０の付加が
あげられる。

【００２１】また、除去については、除去されるアミノ
酸の数は、巨核球増殖活性が維持されるように設計、決
定され、例えば、１〜３０、好ましくは１〜２０、ま
た、本因子の活性領域以外の領域のアミノ酸の数があげ
られる。さらに、置換については、置換されるアミノ酸
の数は、巨核球増殖活性が維持されるように設計、決定
され、例えば、１〜１０、好ましくは、１〜５があげら
れる。

【００２２】本発明においては、巨核球増殖分化因子を
コードする遺伝子のヌクレオチド配列として配列番号：
３０に示すヌクレオチド配列を開示するが、本発明の巨
核球増殖分化因子の遺伝子はこれに限定されない。一
旦、天然巨核球増殖分化因子のアミノ酸配列が決定さ
れ、又は変異型巨核球増殖分化因子のアミノ酸配列が設
計されれば、コドンの縮重に基き、同じアミノ酸配列を
コードする種々のヌクレオチド配列を設計し、それを調
製することができる。この場合、使用すべき宿主により
高頻度で用いられるコドンを使用するのが好ましい。

【００２３】本発明の天然巨核球増殖分化因子をコード
する遺伝子を得るには、実施例２に記載する様にしてｃ
ＤＮＡを得ることができるが、これに限定されない。す
なわち、天然巨核球増殖分化因子のアミノ酸配列をコー
ドする１つのヌクレオチド配列が決定されれば天然巨核
球増殖分化因子をコードする遺伝子は、本発明に具体的
に開示するストラテジーとは異なるストラテジーにより
ｃＤＮＡとしてクローニングすることができ、さらには
それを生産する細胞のゲノムからクローニングすること
もできる。

【００２４】ゲノムからクローニングする場合、実施例
２において使用した種々のプライマーヌクレオチド又は
プローブヌクレオチドを、ゲノムＤＮＡ断片の選択のた
めプローブとして使用することができる。また、配列番
号：３０に記載するヌクレオチド配列に基いて設計され
た他のプローブを用いることもできる。ゲノムから目的
とするＤＮＡをクローニングするための一般的方法は当
業界においてよく知られている（Current Protocols In
Molecular Biology, John Wiley & Sons 社、第５章及
び第６章）。

【００２５】本発明の天然巨核球増殖分化因子をコード
する遺伝子はまた、化学合成によっても調製することが
できる。ＤＮＡの化学合成は当業界において自動ＤＮＡ
合成機、例えばアプライドバイオシステム社３９６ＤＮ
Ａ／ＲＮＡ合成機など採用して容易である。従って、当
業者は、配列番号：３０に示されるヌクレオチド配列の
ＤＮＡを容易に合成することができる。

【００２６】本発明の天然型巨核球増殖分化因子を生来
のコドンとは異なるコドンによりコードする遺伝子、及
び変異型巨核球増殖分化因子をコードする遺伝子は、前
記のごとく化学合成により調製することもでき、また配
列番号：３０又は図１１〜１４に示すヌクレオチド配列
を有するＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として変異誘発プライ
マーと共に用いる部位特定変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄｍｕｔｎｇｅｎｅｓｉｓ）等常法に従っ
て得ることもできる（例えば、Current Protocols In M
olecular Biology, John Wiley & Sons 社、第８章を参
照のこと）。

【００２７】上記のようにして本発明の巨核球増殖分化
因子の遺伝子が得られると、これを用いて、常用の遺伝
子組換え法により組換え巨核球増殖分化因子を製造する
ことができる。すなわち、本発明の巨核球増殖分化因子
をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該
発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、該宿主細胞を
培養し、そして得られた培養物（細胞又は培地）から目
的とする巨核球増殖分化因子を採取する。本発明の巨核
球増殖分化因子は、生化学的又は化学的な修飾、例え
ば、Ｎ末端アシル化等されて得られてもよい。

【００２８】また、配列番号：３０のヌクレオチド配列
に示される翻訳領域に基づき、蛋白質のデータベースを
ｆａｓｔａプログラム（ＧＣＧパッケージ）によって検
索を行ったところ、巨核球増殖分化因子は、セリンプロ
テアーゼ阻害因子のスーパーファミリーに属し、またこ
のファミリーに属し、Ｎ末端の長さ、予想立体構造、疎
水性、親水性アミノ酸の分布が、本巨核球増殖分化因子
と似ているヒト白血球エラスターゼ阻害因子、ニワトリ
オボアルブミンＹ遺伝子産物、ヒトプラスミノーゲンア
クチベーター阻害因子２、ヒトｓｑｕａｍｏｕｓｃｅ
ｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ抗原において、Ｎ末端が、切
断除去を受けないシグナルペプチドを形成している。本
巨核球増殖分化因子も、Ｎ末端がシグナルペプチドとし
ての機能を有し、かつ、切断されずにそのままの形で分
泌されることもありうる。さらに、開始メチオニンの次
がアラニンであることより、一般に述べられているよう
に本巨核球増殖因子は、開始メチオニンが脱離しアラニ
ンがアセチル化されていてもよい。

【００２９】宿主としては原核生物又は真核生物を用い
ることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バシルス属
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバシルス・ズブチリ
ス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。
真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス
・セレビシエー（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、等の真
核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパ
ー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細
胞（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト
細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができ
る。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば
昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いること
もできる。

【００３０】発現ベクターとしては、プラスミド、ファ
ージ、ファージミド、ウィルス（バキュロ（昆虫）、ワ
クチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター
中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例え
ば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えば、ａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモ
ーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとし
てはバキュロウィルスポリヘドリンプロモーター等、動
物細胞としてはＳｉｍｉａｎＶｉｒｕｓ４０のｅａｒ
ｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられる。

【００３１】発現ベクターによる宿主の形質転換は、当
業界においてよく知られている常法により行うことがで
き、これらの方法は例えば、Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley & Sons 社、に記載されて
いる。形質転換体の培養も常法に従って行うことができ
る。培養物からの巨核球増殖分化因子の精製は、タンパ
ク質を単離・精製するための常法に従って、例えば、限
外濾過、各種カラムクロマトグラフィー、例えばセフア
ロースを用いるクロマトグラフィー等により行うことが
できる。

【００３２】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。実施例１．巨核球増殖分化因子の単離精製１〕Ａ４３１細胞の培養無タンパク質培地に馴化させたＡ４３１細胞由来の凍結
保存株ＳＢＭ３３０を解凍後、初期培地（１０％牛胎児
血清を含むＨａｍ’ｓＦ１２培地）で培養した。

【００３３】すなわち、１５０cm² の培養面積をもつＴ
フラスコ１０本に細胞をまき、細胞がコンフルエントに
なるまで３７℃にて５％ＣＯ₂ の存在下で培養した。次
に、０．２５％トリプシン液（千葉血清）で細胞を剥離
した後、８５０cm² の培養面積をもつローラーボトル１
０本に継代培養した。３７℃、０．５rpm で約３日間培
養した結果、１．８×１０⁹ 細胞を回収した。回収した
細胞を、Ｏｐｔｉ−ｃｅｌｌ培養器（チャールス・リバ
ーＩｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のセラミ
ックコア（Ｓ−４５１）に付着せしめ、初期培地１０Ｌ
で還流培養を開始した。

【００３４】還流培養は、３７℃で１５０mmHgの酸素を
供給しながら行った。また、初期培地から無タンパク質
培地への置換は次の様にして完絶した。すなわち、初期
培地で約７日間培養後、無タンパク質培地を２０ｌ／ｄ
ａｙの割合で供給し、かつ、同割合で培養系から培養上
清を回収した。この結果、約１００Ｌの無タンパク質培
地を供給することにより、血清を含む初期培地は、無タ
ンパク質培地にほぼ置き換えられた。以後、細胞培養上
清を連続的に回収することにより、１０００Ｌの細胞培
養上清を得た。得られた細胞培養上清の一部（約３００
Ｌ）を限外ろ過膜（ミリポア、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ；
ＭＷ１０，０００カット）で２Ｌにまで濃縮し、２０
mMTris／HCl バッファー（pH７．４）に対して充分透析
したものを精製に供した。

【００３５】２〕マウス骨髄細胞による巨核球増殖分化
因子の測定雌性ＢＤＦ₁ マウスの大腿骨から骨髄細胞を押し出しα
−ＭＥＭ培地（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ．，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ，ＵＳ）に懸濁した。密
度の異なるパーコール（ファルマシアＬＫＢバイオテ
クノロジー、東京）溶液を重層し骨髄細胞懸濁液をのせ
て４００ｇで２０分遠心した。ｄ＝１．０７／１．０８
（ｇ／ml）のインターフェイスに集まった単核球を１０
％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭで一度洗った後、０．５mMジ
イソプロピルフルオロフォスフェートを含む同培地に再
懸濁しプラスチックの細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ．Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳ）に入れ、３７℃，５％二酸
化炭素−９５％空気の条件下で２時間培養した。途中１
時間目に培養皿を新しいものに替えた。培養後細胞を１
０％ＦＢＳ／α−ＭＥＭで３度洗った。

【００３６】このようにして得た非付着性骨髄単核球細
胞を１０％ＦＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１mM ２−メ
ルカプトエタノール／α−ＭＥＭに懸濁し９６穴マイク
ロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に一穴あたり５×１０
⁴ 細胞を播いた。必要に応じてテストサンプルに２５Ｕ
／mlマウス組み換え型ＩＬ−３（ＧｅｎｚｙｍｅＣｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，Ｕ
Ｓ）、１〜２μｇ／ml抗ＩＬ−６抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＦＲ
Ｇ）を添加した。抗ＩＬ−６抗体を加える時は細胞をシ
ードする前にテストサンプルと抗体を３７℃で１時間前
培養した。

【００３７】培養は５％ＣＯ₂ −５％Ｏ₂ −９０％
窒素存在下３７℃で４〜５日間行った。培養後マイクロ
プレートの各穴の細胞を２回ＰＢＳで洗った後１８０μ
ｌの０．２％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００, １mM E
DTA,０．１２Ｍ NaCl, ５０mM HEPES, pH７．５で細胞
をライシスさせ次に基質の５．６mMヨウ化アセチルチオ
コリンを２０μｌ加えた。室温で1 時間振とう培養した
後各穴から２０μｌの液を蛍光測定用のマイクロプレー
ト（ＤｙｎａｔｅｃｈＭｉｃｒｏＦＬＵＯＲ“Ｂ”Ｐ
ｌａｔｅ）に移した。

【００３８】これに２０μｌの０．４mM ７−ｄｉｅｔ
ｈｙｌａｍｉｎｏ−３−（４′−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ
ｐｈｅｎｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ
ｉｎアセトニトリル、１６０μｌの０．２％（ｗ／ｖ）
トリトンＸ−１００，１mMEDTA, ５０mM Na acetate
pH５．０を加えた後蛍光エミッションをフルオロメー
ターで読んだ（励起、３６５nm, エミッション４５０n
m）。

【００３９】染色用には細胞をサイトスピンで遠心しス
ライドグラスにはりつけた。アセチルコリンエステラー
ゼ染色は細胞を５% グルタールアルデヒド、１０mMリン
酸バッファー、pH６．７で１５分固定後溝口の方法（血
液幹細胞培養法、中外医学社（１９８６）三浦恭定編 p
p.８２−８８）に従ってアセチルチオコリンを基質とし
て行った。

【００４０】すなわち固定後スライドグラスを０．１Ｍ
リン酸バッファーpH6 で洗浄し、次に各スライドグラ
スに１．５mlの０．６７mg／mlヨウ化アセチルチオコリ
ン、０．１Ｍリン酸バッファー（pH６．０）、０．２
mlの３０mM CuSO₄、０．２mlの５mMフェリシアン化カリ
ウム、０．１mlの０．１Ｍクエン酸ナトリウムの混合
液をのせ、室温で４時間インキュベートした後、水洗い
した。メイ＝グリュンワルド＝ギムザ染色は血液学で周
知の方法でありＥ．メルク社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆ
ＲＧ）の各試薬を用いてメイ＝グリュンワルド染色４
分、ギムザ染色１０分で行った。

【００４１】３〕巨核球増殖分化因子の精製Ａ４３１細胞培養上清濃縮液を透析後遠心し、その上清
を２０mM Tris／HClバッファー（pH７．４）で平衡化
したＭａｔｒｅｘＢｌｕｅＡカラムにかけ、同一バ
ッファーで充分洗浄後２Ｍ NaCl を含む同バッファーで
結合画分を溶出した。前記測定法により検出した巨核球
増殖分化因子活性は結合画分に見出された。そこで同画
分を20mM Tris／HCl バッファー（pH７．４）で透析後
同一バッファーで平衡化したＱ−セファロースカラムに
かけ、十分洗浄後NaClの勾配により巨核球増殖分化因子
を溶出させた（図１参照）。同因子はNaCl０．３〜０．
５Ｍ付近に溶出された。

【００４２】Ｑ−セファロースで得られた活性画分に硫
安３０％飽和相当分を加え、３０%飽和硫安を含む２０m
M Tris／HCl バッファー (pH７．４）で平衡化したフ
ェニルセファロースカラムにかけた。巨核球増殖分化因
子は硫安（３０％→０％）、エチレングルコール（０→
５０％）の濃度勾配を同時に形成させることにより溶出
させた（図２参照）。抗ＩＬ−６抗体存在下で測定した
巨核球増殖分化因子活性は濃度勾配形成の初期に広範囲
にわたって認められた。

【００４３】得られた画分は５０mM MES／NaOHバッファ
ー（pH６．０）に対して充分透析後、同一バッファーで
平衡化したＳ−セファロースカラムにかけた。結合画分
の溶出は０〜０．５ＭのNaClにより濃度勾配を形成され
ることにより行った（図３参照）。活性は極めて広範囲
に分布したが濃度勾配形成の初期に比較的強い活性が認
められた。Ｓ−セファロースにより得られた画分を逐次
ハイロード２６／６０スーパーデックス７５（ファルマ
シア）カラムにかけゲルろ過を行った。カラムは予めPB
S により平衡化し、同バッファーにより溶出させた（図
４参照）。巨核球増殖分化因子活性は分子量５５〜５７
kDa 付近に溶出された。

【００４４】以上の各ステップによりSDS-PAGE分析によ
っても５５〜５７kDa 付近に２本のバンドを示す画分が
Ａ４３１由来細胞培養上清３００ｌより約８０μg 得ら
れた。（図５参照）。この２本のバンドは活性の消長と
良好な相関性（図１）を示した。従って本画分で観察さ
れた２本のバンドが求める巨核球増殖分化因子であると
結論した。

【００４５】４〕巨核球増殖分化因子の性質本発明における因子は下記の性質を有する。１）分子量：約５５kDa （ゲルろ過及びＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）（図４及び図５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては２本のバンドとして検出さ
れるが、還元、非還元条件による移動度の差はない、従
って分子間ジスルフィド結合を有さない。２）等電点：６．５±０．５（図６）当該範囲に数本のバンドとして検出される。

【００４６】３）上記に示される本因子の不均一性は糖
タンパク質の糖鎖構造の不均一性として説明可能であ
る。すなわち本因子をアスパラギン結合糖鎖除去酵素で
あるエンドグリコシダーゼＦで処理すると本因子のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ上での分子量が約４０kDa に減少するとと
もに不均一性の低下が認められる（図７）。またＳＤＳ
−ＰＡＧＥ上で単一バンドを示す画分と２本のバンドを
示す画分をAPI により消化し、逆相 HPLC による分画で
ペプチドマップを作製した場合においても両者で差が認
められない。４）本因子は配列番号１〜９に示されるアミノ酸配列の
少なくとも１つを含有する。

【００４７】５）生物活性精製された巨核球増殖分化因子およびＩＬ−３の存在下
においてマウス骨髄細胞を培養すると巨核球数の増加及
び成熟分化が観察される（図８，９及び１０）。図８は
培養後の巨核球アセチルコリンエステラーゼ活性を測定
した結果であり、図９は培養後、細胞をアセチルコリン
エステラーゼ染色した結果（×２０）であり、そして図
１０は培養後、細胞をメイ＝グリュンワルド＝ギムザ染
色した結果（×１００）である。図９及び図１０のいず
れにおいても巨核球増殖分化因子の存在下（Ｂ）におい
てその非存在下（Ａ）よりも巨核球が増加していること
がわかる。

【００４８】５〕巨核球増殖分化因子の構造精製した本因子の構造を解析する目的で、本因子をＡＰ
Ｉ消化し、各ペプチド断片の構造決定を試みた。ＡＰＩ
消化後逆相ＨＰＬＣにより各ぺプチド断片を回収し、適
当な画分について構造決定を行った結果、各ぺプチド断
片は配列表１〜９に示すアミノ酸配列を有していた。

【００４９】実施例２．巨核球増殖因子ｃＤＮＡの構
造決定１．ＰＣＲによる巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡ塩基配列
の解析（１）アミノ酸配列のうち配列番号：３及び４より、そのアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子配列を推測しそれぞれオリ
ゴマーＮＩ０６５（配列番号：１０；配列番号：３０の
４４９〜４８６に対応）及びＮＩ０６７（配列番号：１
１；配列番号：３０の１０４９〜１０８０に対応）を合
成した。

【００５０】Ａ４３１細胞よりＩＳＯＧＥＮ（和光純
薬）を用いて、添付の操作指示書にしたがって、全ＲＮ
Ａを精製した。このＲＮＡより、ポリＡを有するＲＮＡ
を精製し、３′−ＲＡＣＥＫｉｔ（ＧｉｂｃｏＢＲ
Ｌ）を用い、反応を行った。上記のオリゴマーＮＩ０６
５と３′−ＲＡＣＥＫｉｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）添
付のオリゴマー３′ＲＡＣＥアダプター・プライマー
（配列番号：１２）を用いて添付の操作指示書にしたが
ってポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を行った。

【００５１】この反応産物を用いさらにＮＩ０６７と
３′−ＲＡＣＥＫｉｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）添付のオ
リゴマー３′−ＲＡＣＥアダプター・プライマーを用
いて再びＰＣＲを行うことによりおよそ９００塩基対の
ＤＮＡ断片を得た。次いで、U.Gyllensten et al., Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 85：7652(1988)に基づき、ＰＣＲ
産物の直接塩基配列決定法を採用し、このおよそ９００
塩基対のＤＮＡ断片をそのまま反応基質として用い蛋白
質を指示する部分とその下流の塩基配列を、アプライド
バイオシステムズ社のＴａｑＤｙｅＤｅｏｘｙＴ
ｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇキットと蛍光塩基配列決定装置（アプライドバイオシ
ステムズ社３７０Ａ型機）を採用し、添付の操作指示書
にしたがって決定した。その結果、配列番号：３０のヌ
クレオチド番号１０８１より１９５０の配列が明らかに
なった。

【００５２】この配列よりオリゴマーＫＹ１００（配列
番号：１３；配列番号：３０の１２５５〜１２３６の相
補鎖に対応）を合成した。ＮＩ０６５と３′−ＲＡＣＥ
Ｋｉｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）添付のオリゴマー３′
−ＲＡＣＥアダプター・プライマーを用いてＰＣＲを
行った反応産物を反応基質として用いさらにＮＩ０６５
とＫＹ１００を用いてＰＣＲを行い、８０７塩基対のＤ
ＮＡ断片を得た。

【００５３】この８０７塩基対のＤＮＡ断片をそのまま
反応基質としてその塩基配列をアプライドバイオシステ
ムズ社のＴａｑＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａ
ｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットと蛍
光塩基配列決定装置を採用し、添付の操作指示書にした
がって決定した。その結果、配列番号：３０のヌクレオ
チド番号４８７より１０８０の配列が明らかになった。
この配列よりオリゴマーＮＩ０７３（配列番号：１４；
配列番号：３０の８６４〜８８６に対応）、ＮＩ０７４
（配列番号：１５；配列番号：３０の１０１２〜９９２
の相補鎖に対応）及びＮＩ０７５（配列番号：１６；配
列番号：３０の８０２〜７８２の相補鎖に対応）を合成
した。

【００５４】２．ＰＣＲによる巨核球増殖分化因子ｃＤ
ＮＡ塩基配列の解析（２）Ａ．巨核球増殖分化因子発現細胞株（Ａ４３１）由来の
ｍＲＮＡの調製ヒト類表皮癌細胞株（Ａ４３１）の凍結細胞１．１ｇか
ら、Pharmacia-LKB 社のＲＮＡ抽出キット及びｍＲＮＡ
精製キットを用いて、２５μｇのｍＲＮＡを抽出・精製
した。

【００５５】Ｂ．巨核球増殖分化因子発現細胞株（Ａ４
３１）由来のｃＤＮＡファージ・ライブラリーの調製（１）ｃＤＮＡの合成Ａ４３１由来のｍＲＮＡ５μｇから、Pharmacia-LKB 社
のＴｉｍｅＳａｖｅｒｃＤＮＡ合成キットを用いて、ｃ
ＤＮＡを合成した。先ず、ジエチルピロカーボネート
（ＤＥＰＣ）処理蒸留水２０μｌに溶解したｍＲＮＡ５
μｇを６５℃にて１０分間加熱した後、氷上で冷却し
た。ファースト・ストランド反応混合液１１μｌ、ＤＴ
Ｔ溶液１μｌ、ＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＣｌｏｎｉｎ
ｇＴｏｏｌｂｏｘ（Pharmacia-LKB 社）添付の１３０
OD／ml ＮｏｔＩ／オリゴマ（dT）１８プライマー溶液
（Pharmacia-LKB 社）１μｌを添加し、３７℃にて１時
間保温した。

【００５６】反応物をセカンド・ストランド反応混合液
に添加し、１２℃にて３０分間、２２℃にて１時間保温
した後、６５℃にて１０分間加熱した。１００μｌのフ
ェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２
５：２４：１、以下ＰＣと略す）を加えて、激しく攪拌
した後、１４，０００xgにて１分間遠心し、上清をセフ
ァクリルＳ−４００スピンカラム（Pharmacia-LKB 社）
を用いて分画し、１００μｌのｃＤＮＡ溶液を得た。

【００５７】（２）ＥｃｏＲＩアダプターの付加１００μｌのｃＤＮＡ溶液に１０OD／ml ＥｃｏＲＩア
ダプター（Pharmacia-LKB 社）５μｌ、ポリエチレング
リコール緩衝液３０μｌ、１／５希釈ＡＴＰ溶液１μｌ
及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌを添加し、３７℃にて１
時間保温した。６５℃にて１０分間加熱した後、ＡＴＰ
溶液１．５μｌ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μ
ｌを添加し、３７℃にて３０分間保温した。６５℃にて
１０分間加熱した後、２０Ｕ／μｌＮｏｔＩ２μｌを
添加し、３７℃にて１時間保温した。１５０μｌのＰＣ
を加えて、激しく攪拌した後、１４，０００xgにて１分
間遠心し、上清をセファクリルＳ−４００スピンカラム
を用いて分画し、１５０μｌのｃＤＮＡ溶液を得た。

【００５８】（３）ｃＤＮＡのファージベクターへの組
み込みとｉｎｖｉｔｒｏパッケージング１５μｌのｃＤＮＡ溶液に、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで
消化後、脱リン酸化処理したλｇｔ１１Ｄ（Pharmacia-
LKB 社）２μｇを加え、エタノール沈殿後、８μｌのリ
ガーゼ緩衝液に溶解した。１／７５希釈ＡＴＰ溶液１μ
ｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌを添加し、１６℃にて３
０分間保温した後、氷上で冷却保存した。

【００５９】ＧｉｇａＰａｃｋIIＧｏｌｄ（Stratagene
社）を用いて、ｉｎｖｉｔｒｏパッケージング反応を
行い、上記のリガーゼ反応産物３本から３．２２×１０
⁶ pfu の組換え体ファージを得た。大腸菌Ｙ１０９０_r-
を宿主として、上記ライブラリーを増幅し、６．０×１
０¹⁰ pfu／mlのＡ４３１ファージ・ライブラリーストッ
クを得た。

【００６０】Ｃ．ＰＣＲによる巨核球増殖分化因子ｃＤ
ＮＡ断片の単離同定（１）ＰＣＲによるＡ４３１ファージ・ライブラリーｃ
ＤＮＡ挿入ＤＮＡ断片の増幅６．０×１０¹⁰ pfu／mlのＡ４３１ファージ・ライブラ
リーのストック溶液１０μｌ（６．０×１０⁸ pfu 相
当）をＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして、１０×ＰＣＲ緩
衝液５μｌ、１．２５ｍＭ４ｄＮＴＰｓ８μｌ、１ＯＤ
／mlλｇｔ１１−ｆｏｗａｒｄプライマー（λｇｔ１
１Ｆ）（配列番号：１７）２μｌ、１ＯＤ／mlλｇｔ１
１−ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（λｇｔ１１Ｒ）（配
列番号：１８）２μｌ、及び５Ｕ／μｌＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus社）１μｌを添加し
て、総量をＤＥＰＣ処理蒸留水にて５０μｌとし、９３
℃にて１分間、５５℃にて２分間、７２℃にて３分間の
反応サイクルを３０回行い、７２℃にて１０分間保温し
た。１％アガロースゲル電気泳動による解析の結果０．
８〜６kbに及ぶスメアーなパターンを示した。

【００６１】（２）ｃＤＮＡ挿入ＤＮＡ増幅断片混合物
を鋳型としたＴＰ７（配列番号：２０；配列番号：３０
の６８３〜７０３に対応）／ＴＰ１０、ＴＰ７／ＴＰ６
（配列番号：１９；配列番号：３０の１０３６〜１００
１の相補鎖に対応）、ＴＰ８（配列番号：２１；配列番
号：３０の９４１〜９６４に対応）、ＴＰ１０（配列番
号：２２；配列番号：３０の１０３６〜９８６の相補鎖
に対応）及びＴＰ８／ＴＰ６をプライマーとしたＰＣＲ
解析上記ＰＣＲ反応産物１／５０００希釈液１μｌをＰＣＲ
反応の鋳型ＤＮＡとして、１０ｘＰＣＲ緩衝液５μｌ、
１．２５ｍＭ４ｄＮＴＰｓ８μｌ、下記のような組み合
わせの１ＯＤ／mlプライマー２μｌづつ、及びＰｅｒｆ
ｅｃｔＭａｔｃｈ（Stratagene社）１μｌを添加して、
総量をＤＥＰＣ処理蒸留水にて４９μｌとした。

【００６２】９５℃にて５分間、６０℃にて５分間加熱
した後、５Ｕ／μｌＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Pe
rkin Elmer Cetus社）１μｌを添加して、９４℃にて１
分間、６０℃にて２分間、７２℃にて３分間の反応サイ
クルを３０回行い、７２℃にて１０分間保温した。プラ
イマーとしては、ＴＰ７／ＴＰ１０，ＴＰ７／ＴＰ６，
ＴＰ８／ＴＰ１０及びＴＰ８／ＴＰ６を用いた。２％ア
ガロースゲル電気泳動による解析の結果、プライマーに
対応して、それぞれ３５４bp，３５４bp，９６bp及び９
６bpのバンドを得た。

【００６３】（３）ＴＰ７／ＴＰ１０及びＴＰ７／ＴＰ
６をプライマーとしたＰＣＲ増幅産物（３５４bp）の一
次構造配列の解析ＴＰ７／ＴＰ１０及びＴＰ７／ＴＰ６をプライマーする
上記ＰＣＲ増幅産物（３５４bp）のバンドを電気泳動後
の２％アガロースゲルから切り出し、ＤＥＰＣ処理蒸留
水５０μｌを加えて４５℃にて３０分間加熱した。

【００６４】このＤＮＡ溶液２μｌをＰＣＲ反応の鋳型
ＤＮＡとして、１０ｘＰＣＲ緩衝液５μｌ、１．２５ｍ
Ｍ４ｄＮＴＰｓ８μｌ、下記のような組み合わせの１Ｏ
Ｄ／mlプライマー２μｌづつ、ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃ
ｈ（Stratagene社）１μｌを添加して、総量をＤＥＰＣ
処理蒸留水にて４９μｌとし、９５℃にて５分間、６０
℃にて５分間加熱した後、５Ｕ／μｌＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（PerkinElmer Cetus社）１μｌを添加し
て、９４℃にて１分間、６０℃にて２分間、７２℃にて
３分間の反応サイクルを３０回行い、７２℃にて１０分
間保温した。

【００６５】プライマーとしては、ＴＰ７／ＴＰ１０及
びＴＰ７／ＴＰ６を用いた。これらＰＣＲ反応産物（そ
れぞれ３５４bp）のバンドを電気泳動の２％アガロース
ゲルから切り出し、抽出・精製してｐＣＲＩＩ（Invitr
ogen社）に挿入した後、大腸菌ＩＮＶαＦ′（Invitrog
en社）をトランスフォーメーションした。トランスフォ
ーマントのプラスミドＤＮＡを抽出精製し、ＥｃｏＲＩ
消化により３５４bpのＤＮＡ断片が挿入されていること
を確認した。

【００６６】挿入ＤＮＡ断片の一次構造配列はＭ１３ｆ
ｏｗａｒｄプライマー（Ｍ１３Ｆ）（配列番号：２３）
及びＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（Ｍ１３Ｒ）（配
列番号：２４）を用いて解析した（Applied Biosystems
社の自動シーケンサー、モデル３７０Ａ）。

【００６７】その結果、配列番号：３０のヌクレオチド
番号７０４〜９９９に相当する２９６bpの配列が明らか
となり、この中には、プライマーＴＰ７の下流に相当す
るアミノ酸配列番号９のＣ末端３アミノ酸（ＸＲＫ，Ｄ
ＮＡ塩基配列からはＥＲＫ）、プライマーＴＰ６の上流
に相当するアミノ酸配列番号６のＮ末端５アミノ酸（Ａ
ＤＬＳＧ）、及びプライマーＴＰ８に相当するアミノ酸
配列番号５の８アミノ酸（ＹＬＲＡＬＧＬＫ）に対応す
る配列が存在し、このＰＣＲ反応産物（それぞれ３５４
bp）が巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡの一部であることが
明らかとなった。

【００６８】３．巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡのスクリ
ーニングＡ．巨核球増殖分化因子発現細胞株（Ａ４３１）由来の
ｃＤＮＡプラスミド・ライブラリーの調製（１）ファースト・ストランドｃＤＮＡの合成Ａ４３１由来のｍＲＮＡ５μｇから、Gibco BRL 社のＳ
ｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔプラスミドシステムを用いて、ｃ
ＤＮＡを合成した。

【００６９】先ず、２μｌのＮｏｔＩプライマー・アダ
プターを、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理
蒸留水５μｌに溶解したｍＲＮＡ５μｇに加え、７０℃
にて１０分間加熱した後、氷上で冷却した。５ｘファー
スト・ストランド緩衝液４μｌ、０．１ＭＤＴＴ溶液２
μｌ、１０ｍＭ４ｄＮＴＰｓ１μｌ及びＤＥＰＣ処理
蒸留水１μｌを添加し、３７℃にて２分間保温した。５
μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を加え、３７
℃にて１時間保温した後、氷上に置き反応を停止した。

【００７０】（２）セカンド・ストランドｃＤＮＡの合
成ファースト・ストランドｃＤＮＡの合成に用いた２０μ
ｌの反応液のうちの１８μｌに、ＤＥＰＣ処理蒸留水９
３μｌ、５ｘセカンド・ストランド緩衝液３０μｌ、１
０ｍＭ４ｄＮＴＰｓ３μｌ、１０Ｕ／μｌＥ．ｃｏｌ
ｉＤＮＡリガーゼ１μｌ、１０Ｕ／μｌＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼ４μｌ、及び２Ｕ／μｌＥ．ｃｏ
ｌｉＲＮａｓｅＨ１μｌを添加し、１６℃にて２時
間保温した。２μｌ（１０Ｕ）のＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼを添加し、１６℃にて５分間保温した。

【００７１】反応液を氷上に置き１０μｌ０．５ＭＥ
ＤＴＡ及び１５０μｌのＰＣを加えて、激しく攪拌した
後、１４，０００xgにて１０分間遠心し、上清１４０μ
ｌを新たな遠心チューブに移した。７．５Ｍ酢酸アンモ
ニウム７０μｌ及びエタノール０．５mlを加えて攪拌
し、−８０℃にて３０分間放置した。１４，０００xgに
て１０分間遠心し、上清を除いた後、０．５mlの７０％
エタノールで沈殿を洗浄し、減圧下で乾燥した。

【００７２】（３）ＢｓｔＸＩアダプターの付加上記のｃＤＮＡ沈殿を２５μｌのＤＥＰＣ処理蒸留水に
溶解し、５ｘＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液１０μｌ、Ｂｓ
ｔＸＩアダプター（Invitrogen社）１０μｌ及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ５μｌを添加し、１６℃にて１６時間保温
した。５０μｌのＰＣを加えて、激しく攪拌した後、１
４，０００xgにて５分間遠心し、上清４５μｌを新たな
遠心チューブに移した。７．５Ｍ酢酸アンモニウム２５
μｌ及びエタノール１５０μｌを加えて攪拌し、−８０
℃にて３０分間放置した。１４，０００xgにて１０分間
遠心し、上清を除いた後、０．５mlの７０％エタノール
で沈殿を洗浄し、減圧下で乾燥した。

【００７３】（４）ＮｏｔＩ消化上記のｃＤＮＡ沈殿を４１μｌのＤＥＰＣ処理蒸留水に
溶解し、ＲＥＡｃｔ７緩衝液５μｌ、ＮｏｔＩ４μｌ
を添加し、３７℃にて２時間保温した。５０μｌのＰＣ
を加えて、激しく攪拌した後、１４，０００xgにて１０
分間遠心し、上清４５μｌを新たな遠心チューブに移し
た。（５）アダプターの除去と部分的ｃＤＮＡのサイズ分画上記のｃＤＮＡ溶液をＱｕｉｃｋＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ
Ｌｉｎｋｅｒ５（Boehringer Mannheim 社）を用いて分
画した。４０μｇ／ulのｃＤＮＡが５０μｌ得られた。

【００７４】（６）ｃＤＮＡのファージベクターへの組
み込みと大腸菌のトランスフォーメーション上記のｃＤＮＡ溶液３７．５μｌに、ＮｏｔＩ及びＢｓ
ｔＸＩ消化したｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社）ベクタ
ー（２９μｇ／μｌ）を１２．５μｌ加え、Ｔａｋａｒ
ａＬｉｇａｔｉｏｎキットＡ液４００μｌ及びＢ液５０
μｌを添加し、１６℃にて３０分間保温した。ＭａｘＥ
ｆｆｉｃｉｅｎｃｙＤＨ５αコンピテントセル（Gibco
BRL 社）１mlを用いてトランスフォーメーションを行
い、７１，５５０クローンの組換え体を得た。プレート
から全コロニーを集菌し（２．８６ｘ１０⁷ 細胞／m
l）、２０％グリセロール存在下で−８０℃にて保存し
た。

【００７５】Ｂ．コロニー・ハイブリダイゼーションに
よる巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡのスクリーニングＡ４３１由来のｃＤＮＡプラスミド・ライブラリーを用
いて、９cmプレート６０枚に合計２２．７万個（プレー
ト当り３７００個）のコロニーをニトロセルロースフィ
ルターに写し取った。プローブは、ＮＩ０６７と３′−
ＲＡＣＥａｄａｐｔｏｒ（Gibco BRL 社）をプライマー
とする９００bpのＰＣＲ産物（前述）のＢａｍＨＩ消化
による２つのＤＮＡ断片（０．５kb及び０．４kb）を
〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰを用いたニックトランスレーショ
ンにより調製した。

【００７６】コロニー・ハイブリダイゼーションにおい
ては、フィルターを５ｘＳＳＣ、２５ｍＭリン酸緩衝液
（pH７．４）、５ｘＤｅｎｈａｌｄｔＳｏｌｕｔｉｏ
ｎ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ml熱変性鮭精子ＤＮＡ及
び５０％ホルムアミド中で４２℃にて１８時間保湿し、
５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で４０℃にて２０分間、
４５℃にて２０分間洗浄した。検出はＢＡＳ２０００
（Fujiフィルム）を用いて１８時間露光にて行った。

【００７７】三次スクリーニングまで行い、ＴＰ２９
０、ＴＰ３０８、ＴＰ３１０、及びＴＰ３１７の４種の
クローンを得た。挿入ｃＤＮＡの長さは、それぞれ１．
２kb、１．１kb、１．２kb及び１．２kbであった。ＴＰ
２９０、ＴＰ３１０、及びＴＰ３１７は配列番号：３０
のヌクレオチド番号６８５より下流の領域をカバーする
ことが明らかとなった。

【００７８】４．ＰＣＲによる巨核球増殖分化因子ｃＤ
ＮＡ塩基配列の解析（３）Ａ．巨核球増殖分化因子発現細胞株（ＨＰＣ−Ｙ１１）
由来）のｍＲＮＡの調製ヒト膵臓癌細胞株（ＨＰＣ−Ｙ１１）の凍結細胞１．１
ｇから、Pharmacia-LKB 社のＲＮＡ抽出キット及びｍＲ
ＮＡ精製キットを用いて、５０μｇのｍＲＮＡを抽出・
精製した。

【００７９】Ｂ．巨核球増殖分化因子発現細胞株（ＨＰ
Ｃ−Ｙ１１）由来のｃＤＮＡファージ・ライブラリーの
調製（１）ｃＤＮＡの合成ＨＰＣ−Ｙ１１由来のｍＲＮＡ５μｇから、Pharmaci
a-LKB 社のＴｉｍｅＳａｖｅｒｃＤＮＡ合成キットを
用いて、ｃＤＮＡを合成した。先ず、ジエチルピロカー
ボネート（ＤＥＰＣ）処理蒸留水２０μｌに溶解したｍ
ＲＮＡ５μｇを６５℃にて１０分間加熱した後、氷上
で冷却した。ファースト・ストランド反応混合液１１μ
ｌ、ＤＴＴ溶液１μｌ、ＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＣｌ
ｏｎｉｎｇＴｏｏｌｂｏｘ（Pharmacia LKB 社）添付
のＮｏｔＩ／オリゴマ（dT）１８プライマー溶液１μｌ
を添加し、３７℃にて１時間保温した。

【００８０】セカンド・ストランド反応混合液１００μ
ｌを添加し、１２℃にて３０分間、２２℃にて１時間保
温した後、６５℃にて１０分間加熱した。１００μｌの
フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２
５：２４：１、以下ＰＣと略す）を加えて、激しく攪拌
した後、１４，０００xgにて１分間遠心し、上清をセフ
ァクリルＳ−４００スピンカラム（Pharmacia-LKB 社）
を用いて分画し、１００μｌのｃＤＮＡ溶液を得た。

【００８１】（２）ＥｃｏＲＩアダプターの付加１００μｌのｃＤＮＡ溶液にＥｃｏＲＩアダプター（Ph
armacia-LKB 社）５μｌ、ポリエチレングリコール３０
μｌ、ＡＴＰ溶液１μｌ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ
を添加し、３７℃にて１時間保温した。６５℃にて１０
分間加熱した後、ＡＴＰ溶液１．５μｌ、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ１μｌを添加し、３７℃にて３０分間
保温した。６５℃にて１０分間加熱した後、ＮｏｔＩ２
μｌを添加し、３７℃にて１時間保温した。１５０μｌ
のＰＣを加えて、激しく攪拌した後、１４，０００xgに
て１分間遠心し、上清をセファクリルＳ−４００スピン
カラムを用いて分画し、１５０μｌのｃＤＮＡ溶液を得
た。

【００８２】（３）ｃＤＮＡのファージベクターへの組
み込みとｉｎｖｉｔｒｏパッケージング１５μｌのｃＤＮＡ溶液に、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで
消化後、脱リン酸化処理したλｇｔｌｌＤ（Pharmacia-
LKB 社）２μｇを加え、エタノール沈殿後、８μｌのリ
ガーゼ緩衝液に溶解した。１／７５希釈ＡＴＰ溶液１μ
ｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌを添加し、１６℃にて３
０分間保温した後、氷上で冷却保存した。ＧｉｇａＰａ
ｃｋIIＧｏｌｄ（Stratagene社）を用いて、ｉｎｖｉ
ｔｒｏパッケージング反応を行い、上記のリガーゼ反応
産物３本から５．３４ｘ１０⁶ pfu の組換え体ファージ
を得た。大腸菌Ｙ１０９０_r-を宿主として、上記ライブ
ラリーを増幅し、１．７ｘ１０¹¹ pfu／mlのＨＰＣ−Ｙ
１１ファージ・ライブラリーストックを得た。

【００８３】Ｃ．ＰＣＲによる巨核球増殖分化因子全長
ｃＤＮＡ５′側断片の単離同定（１）ＰＣＲによるＨＰＣ−Ｙ１１ファージ・ライブラ
リーｃＤＮＡ挿入ＤＮＡ断片プライマーＮＩ０７４上流
領域部分の増幅１．７ｘ１０¹¹ pfu／mlのＨＰＣ−Ｙ１１ファージ・ラ
イブラリーストック溶液１μｌ（１．７ｘ１０⁸ pfu相
当）をＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして、１０ｘＰＣＲ緩
衝液５μｌ、１．２５ｍＭ４ｄＮＴＰｓ８μｌ、１０Ｏ
Ｄ／mlλｇｔ１１−ｆｏｗａｒｄＦ１プライマー（配列
番号：２５）１μｌ、５ＯＤ／mlＮＩ０７４プライマー
１μｌ及びＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ（Stratagene社）
１μｌを添加して、総量をＤＥＰＣ処理蒸留水にて４９
μｌとした。

【００８４】９５℃にて５分間、６０℃にて５分間加熱
した後、５Ｕ／μｌＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Perk
in ElmerCetus 社）１μｌを添加して、９４℃にて１分
間、６０℃にて１分間、７２℃にて２分間の反応サイク
ルを３５回行い、７２℃にて１０分間保温した。２％ア
ガロースゲル電気泳動による解析の結果０．３〜６kbに
及ぶスメアーなパターンを示した。

【００８５】（２）λｇｔ１１Ｆ１／ＮＩ０７４をプラ
イマーとしたＰＣＲ増幅断片混合物を鋳型としたλｇｔ
１１Ｆ２（配列番号：２６）／ＮＩ０７５，λｇｔ１１
Ｆ２／ＴＰ１２（配列番号：２８；配列番号：３０の７
０３〜６８３の相補鎖に対応），λｇｔ１１Ｆ２／ＴＰ
１１（配列番号：２７；配列番号：３０の６１９〜５９
９の相補鎖に対応），λｇｔ１１Ｆ２／ＴＰ１３（配列
番号：２９；配列番号：３０の５９５〜５７５の相補鎖
に対応），ＴＰ７／ＮＩ０７４，ＴＰ７／ＮＩ０７５及
びＮＩ０７３／ＮＩ０７４をプライマーとしたＰＣＲ解
析

【００８６】上記ＰＣＲ反応産物１／１００希釈液１μ
ｌをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして、１０ｘＰＣＲ緩衝
液５μｌ、１．２５ｍＭ４ｄＮＴＰｓ８μｌ、下記のよ
うな組み合わせの１０ＯＤ／mlプライマー０．５μｌづ
つ、及びＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ（Stratagen 社）１
μｌを添加して、総量をＤＥＰＣ処理蒸留水にて４９μ
ｌとし、９５℃にて５分間、６０℃にて５分間加熱した
後、５Ｕ／μｌＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Perkin E
lmer Cetus社）１μｌを添加して、９４℃にて１分間、
６０℃にて２分間、７２℃にて２分間の反応サイクルを
３５回行い、７２℃にて１０分間保温した。

【００８７】プライマーとしては、λｇｔ１１Ｆ２／Ｎ
Ｉ０７５，λｇｔ１１Ｆ２／ＴＰ１２，λｇｔ１１Ｆ２
／ＴＰ１１，λｇｔ１１Ｆ２／ＴＰ１３，ＴＰ７／ＮＩ
０７４，ＴＰ７／ＮＩ０７５、及びＮＩ０７３／ＮＩ０
７４を用いた。２％アガロースゲル電気泳動による解析
の結果、プライマーに対応して、それぞれ９６９bp，８
７０bp，７８６bp，７６２bp，３３０bp，１２０bp、及
び１４９bpのバンドを得た。

【００８８】（３）Ｆ２／ＮＩ０７５をプライマーとし
たＰＣＲ増幅産物（９６９bp）のλｇｔ１１Ｆ／ＴＰ１
１及びλｇｔ１１Ｆ／ＴＰ１３をプライマーとしたＰＣ
Ｒ解析とその一次構造配列の解析 λｇｔ１１Ｆ２／ＮＩ０７５をプライマーとする上記Ｐ
ＣＲ反応産物（９６９bp）の０．５μｌをＰＣＲ反応の
鋳型ＤＮＡとして、１０ｘＰＣＲ緩衝液５μｌ、１．２
５ｍＭ４ｄＮＴＰｓ８μｌ、１０ＯＤ／ml λｇｔ１１
Ｆプライマー１μｌ、１０ＯＤ／ml ＴＰｌｌプライマ
ー１μｌ又は１０ＯＤ／ml ＴＰ１３プライマー１μ
ｌ、及びＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ（Stratagen 社）１
μｌを添加して、総量をＤＥＰＣ処理蒸留水にて４９μ
ｌとした。

【００８９】９５℃にて５分間、６０℃にて５分間加熱
した後、５Ｕ／μｌＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Perk
in ElmerCetus 社）１μｌを添加して、９４℃にて１分
間、６０℃にて２分間、７２℃にて２分間の反応サイク
ルを３５回行い、７２℃にて１０分間保温した。

【００９０】ＰＣＲ反応産物（それぞれ６７８bp，６５
４bp）のバンドを電気泳動後の２％アガロースゲルから
切り出し、抽出・精製してｐＣＲＩＩ（Invitrogen社）
に挿入した後、大腸菌ＩＮＶαＦ′（Invitrogen社）を
トランスフォーメーションした。トランスフォーマント
のプラスミドＤＮＡを抽出精製し、ＥｃｏＲＩ消化によ
り０．７kbのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認し
た。挿入ＤＮＡ断片の一次構造配列はＭ１３ｆｏｗａｒ
ｄプライマーＭ１３Ｆ及びＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅプライ
マーＭ１３Ｒを用いて解析した（Applied Biosystems社
の自動シーケンサー、モデル３７０Ａ）。

【００９１】その結果、配列番号：３０のヌクレオチド
番号１〜６１９に相当する６１９bpの配列が明らかとな
り、配列番号：３０のヌクレオチド番号４８７から６１
９までの１３３ヌクレオチドの配列は、実施例２．１で
明らかになった一次構造配列のＮ末端側に一致した。こ
の６１９bpの配列の中には、アミノ酸配列番号：３の１
９アミノ酸（ＤＮＡ塩基配列からはＶＥＲＶＤＦＴＮＨ
ＬＥＤＴＲＲＮＩＮＫ）、アミノ酸配列番号：７の５ア
ミノ酸（ＬＹＤＡＫ）に対応する配列が存在し、このＰ
ＣＲ反応産物（それぞれ０．７kb）が巨核球増殖分化因
子ｃＤＮＡの一部であることが明らかとなった。

【００９２】翻訳開始メチオニンはヌクレオチド７４番
目と考えられ、５′非翻訳領域は７３bpであった。従っ
て、このＰＣＲ反応産物（それぞれ０．７kb）が巨核球
増殖分化因子の構造遺伝子のＮ末端を含むことが明らか
となった。

【００９３】５．ＰＣＲによる巨核球増殖分化因子ｃＤ
ＮＡ塩基配列の解析（４）本項４．Ｃ（３）より得られたＨＰＣ−Ｙ１１由来巨核
球増殖分化因子の構造遺伝子のＮ末端及び、５′非翻訳
領域と考えられる配列のうち５′非翻訳領域と考えられ
る部分の配列である配列番号：３０のヌクレオチド番号
１２〜３１の配列よりオリゴマーＮＩ０８３（配列番
号：３１）を合成した。

【００９４】本項１．で調製したＡ４３１細胞のポリＡ
を有するＲＮＡを用い、Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、添
付のオリゴマーであるランダム・ヘキサマーを用い添付
の操作指示書にしたがってｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡを合成し、ＮＩ０８３とＮＩ０７４を用いＡｍ
ｐｌｉＴａｑ（宝酒造）にてＰＣＲを行った。その結
果、巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡ断片である１００１塩
基対のＤＮＡ断片を得た。

【００９５】この１００１塩基対のＰＣＲ産物であるＤ
ＮＡ断片をそのまま反応基質として用い、Taq Dye Deox
y Terminator Cycle Sequencing キット（アプライドバ
イオシステムズ社）と蛍光塩基配列決定装置（アプライ
ドバイオシステムズ社３７０Ａ型機）を採用し、添付の
操作指示書にしたがって本項１と同様、直鎖塩基配列決
定法により塩基配列を決定した。その結果、配列番号：
３０のヌクレオチド番号３２より４８６の配列を明らか
にした。また、配列番号：３０のヌクレオチド番号４８
７より９９１の配列について得られた結果は、本項１．
で得られた配列と一致した。

【００９６】本項１．で得られた配列と合わせＡ４３１
細胞の巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡの塩基配列である配
列番号：３０のヌクレオチド番号３２より１９５０の配
列が明らかになった。この配列について、アミノ酸翻訳
への全ての場合である３つの読み枠について機械的にア
ミノ酸配列に翻訳を行った。その内のひとつの読み枠の
中に、配列番号：１〜９のアミノ酸配列全てが存在する
連続してアミノ酸配列に翻訳が可能な領域を持つものを
見いだし、巨核球増殖分化因子の読み枠を明らかにし
た。

【００９７】この読み枠で、翻訳開始部位に見いだされ
るメチオニンのコード（配列番号：３０のヌクレオチド
番号７４より７６）が存在し、ここより配列番号：１〜
９のアミノ酸配列が存在する連続してアミノ酸配列に翻
訳が可能な領域が配列番号：３０のヌクレオチド番号１
２１３まで続くことを見いだし、配列番号：３０のヌク
レオチド番号７４より１２１３までが、巨核球増殖分化
因子に翻訳される部分であることを明らかにした。

【００９８】配列番号：３０のヌクレオチド番号７４よ
り７６のメチオニンのコードは、Ｍ．Ｋｏｚａｋによっ
て見いだされた翻訳開始部位に高頻度に見いだされるメ
チオニンのコードと周辺の配列（^G／_AＮＮＡＴＧＧ）
(Nucleic Acids Research(1981)Vol.9 P.5233-5252) に
たいしＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号：３０のヌクレオチド
番号７１より７７）と適合した。

【００９９】巨核球増殖分化因子の一次構造配列が明ら
かになり、構造遺伝子のアミノ酸残基数は３８０、推定
分子量は４２９０４．４３、推定等電点が６．７９であ
った。アミノ酸配列配列番号：１が、配列番号：３０の
アミノ酸番号１８８より１９６に、アミノ酸配列配列番
号：２が、配列番号：３０のアミノ酸番号１８１より１
８７に、アミノ酸配列配列番号：３が、配列番号：３０
のアミノ酸番号１２６より１４４に、アミノ酸配列配列
番号：４が、配列番号：３０のアミノ酸番号３２５より
３４１に、

【０１００】アミノ酸配列配列番号：５が、配列番号：
３０のアミノ酸番号２８９より２９７に、アミノ酸配列
配列番号：６が、配列番号：３０のアミノ酸番号３０５
より３２４に、アミノ酸配列配列番号：７が、配列番
号：３０のアミノ酸番号１２１より１２５に、アミノ酸
配列配列番号：８が、配列番号：３０のアミノ酸番号２
８４より２８８に、アミノ酸配列配列番号：９が、配列
番号：３０のアミノ酸番号２０４より２１３に対応して
いた。さらに、ポリＡ付加シグナルであるＡＡＴＡＡＡ
配列が、配列番号：３０のヌクレオチド番号１９３３よ
り１９３８に存在した。

【０１０１】実施例３．Ａ４３１細胞からのＰＣＲに
よる巨核球増殖因子ｃＤＮＡの単離同定と発現ベクター
の作製実施例２によって得られた配列（配列番号：３０）より
オリゴマーＮＩ０７８（配列番号：３２）とＮＩ０７９
（配列番号：３３）を合成した。なお、ＮＩ０７８で
は、翻訳開始メチオニンコードを含むヌクレオチド番号
１３から３７が、配列番号：３０のヌクレオチド番号７
４より９８の配列と一致し、人工的に、ＥｃｏＲＩ認識
部位（ヌクレオチド番号４から９）とＮｒｕＩ認識部位
（ヌクレオチド番号８から１３）を付加してあり、そし
てＮＩ０７９では、ヌクレオチド番号１７から４９が、
配列番号：３０のヌクレオチド番号１２３７より１２６
９の相補鎖の配列と一致し、人工的に、ＥｃｏＲＩ認識
部位（ヌクレオチド番号３から８）とＮｏｔＩ認識部位
（ヌクレオチド番号９から１６）を付加してある。

【０１０２】実施例３の項１．で調製したＡ４３１細胞
のポリＡを有するＲＮＡを用い、Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を
用い、添付のオリゴマーであるランダムヘキサマーを
用い添付の操作指示書にしたがって第一鎖ｃＤＮＡを合
成し、ＮＩ０７８とＮＩ０７９を用いＡｍｐｌｉＴａｑ
（Perkin Elmer Cetus社）にてＰＣＲを行った。その結
果、巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡ断片であり巨核球増殖
分化因子蛋白質の情報の全てを有する、１２２４塩基対
のＤＮＡ断片を得た。

【０１０３】このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで処理し、オ
リゴマーＮＩ０７８（配列番号：３２）とＮＩ０７９
（配列番号：３３）に人工的に付加してあるＥｃｏＲＩ
認識部位を利用し、巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡ断片の
両端にＥｃｏＲＩ接着部位を生じさせた。この巨核球増
殖分化因子ｃＤＮＡ断片をほ乳類細胞系における発現ベ
クターｐｄＫＣＲ−ＤＨＦＲの導入部位である、Ｅｃｏ
ＲＩ認識部位に導入した。

【０１０４】動物細胞発現ベクターｐｄＫＣＲ−ＤＨＦ
Ｒ（Oikawa,S., et al., Biochem.Biophys.Res.Commu
n., 164, 39, 1989)はｐＫＣＲ（O' Hare, et al., Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA, 78, 1527, 1981)の誘導体でＳＶ
４０の初期プロモーター、ラビットβ−グロビン、ｄｈ
ｆｒ（dehydrofolate reductase)遺伝子を有する。尚、
この発現ベクターにより形質転換された宿主細胞は、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＳＢＭ３０８と命名
されて、工業技術院微生物工業技術研究所に平成２年６
月７日に微工研菌寄第１１５０６号（ＦＥＲＭＰ−１１
５０６）として寄託され、そして１９９３年２月１８日
にＦＥＲＭＢＰ−４１９７としてブダペスト条約に基
く国際寄託に移管された。

【０１０５】得られた発現ベクターのｐｄＫＣＲ−ＤＨ
ＦＲに組み込まれた巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡを含む
クローンｐｄＫＣＲ−ＤＨＦＲ−ＴＰＯ５５についても
ＴａｑＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ
ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（アプライド
バイオシステム社）と蛍光塩基配列決定装置（アプライ
ドバイオシステム社３７０Ａ型機）を採用し、添付の操
作指示書にしたがって決定した。その結果、配列番号：
３０のヌクレオチド番号９９より１２３６の配列および
オリゴマーＮＩ０７８とＮＩ０７９の配列と一致した。
またベクターに導入された巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡ
が発現用プロモーターに対して、順方向であることも塩
基配列の決定によって確認した。

【０１０６】本項の実施例により示されるように、配列
番号：３０のヌクレオチド配列の情報のみあれば、任意
の巨核球増殖分化因子発現細胞（たとえばＡ４３１細
胞）より、巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡの全て、及び任
意の部分を増幅し、塩基配列を決定すること、さらに、
任意の発現ベクターにクローン化することは、同業者に
とって容易である。

【０１０７】実施例４．巨核球増殖分化因子の発現（１）カイコ発現系ベクターの構築巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡクローンｐｄＫＣＲ−ＤＨ
ＦＲ−ＴＰＯ５５をＮｏｔＩで消化し、ＮＩ０７９に人
工的に付加してあるＮｏｔＩ認識部位で切断した。これ
によって生じたＮｏｔＩ接着末端を宝酒造（株）のブラ
ンティングキットを用い、平滑化し、この平滑末端に、
ＸｂａＩリンカー（宝酒造（株））を添付の操作指示書
にしたがって導入した。

【０１０８】このようにして得られたプラスミドをＮｒ
ｕＩとＸｂａＩで同時に消化し、ＮＩ０７８に人工的に
付加してあるＮｒｕＩ認識部位と、導入したＸｂａＩリ
ンカーのＸｂａＩ認識部位とで切断し、ＮｒｕＩ接着末
端とＸｂａＩ接着末端を持つ巨核球増殖分化因子ｃＤＮ
Ａ断片を作製した。この断片を、カイコ多角体ウイルス
用バキュロウイルス転移ベクターであるｐＢｍ４（蚕糸
・昆虫農業技術研究所より入手可能）をＮｒｕＩとＸｂ
ａＩで同時に消化しｐＢｍ４の遺伝子導入部位であるＮ
ｒｕＩ認識部位に導入し、ｐＢｍ４−ＴＰＯ５５を得
た。

【０１０９】（２）巨核球増殖分化因子組み換えウイル
スの作製カイコ胚子由来細胞株ＢｏＭｏ１５ＡIIｃ（蚕糸・昆虫
農業技術研究所より入手可能）はＭＧＭ４４８に１０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と抗生物
質としてゲンタマイシン（５００μｇ／ml）を加えた培
地で２５℃にて継代培養を行った。巨核球増殖分化因子
組み換えウイルスはカイコ多核体ウイルス遺伝子ＤＮＡ
とｐＢｍ４−ＴＰＯ５５プラスミドＤＮＡをカイコ培養
細胞にたとえばリン酸カルシウム共沈法などで同時に導
入することによって作製した。

【０１１０】野生型ウイルスＰ６Ｅ株（蚕糸・昆虫農業
技術研究所より入手可能）のゲノムＤＮＡ２μｇとトラ
ンスファープラスミドｐＢｍ４−ＴＰＯ５５１０μｇ
を２４０μｌの滅菌精製水に溶解し、等量の０．５Ｍ
ＣａＣｌ₂，０．１ＭＨＥＰＥＳを加え混合し１０分
間室温で放置した後、この混合液に０．２ＭＮａＣ
ｌ，０．０５ＭＨＥＰＥＳ，０．７５mM ＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄，０．７５mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄を４８０μｌ加え、
数秒攪拌後、室温で２０−３０分間放置することによ
り、ゲノムＤＮＡとプラスミドを含むリン酸カルシウム
ゲルを形成させた。

【０１１１】次にこの様にして得られたウイルス遺伝子
ＤＮＡとトランスファーベクターを含むリン酸カルシウ
ムゲル混液（サスペンジョン）９６０μｌを前日に２５
cm²のＴフラスコ（Ｔ２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）中のＭＧ
Ｍ４４８（１０％ＦＢＳ、抗生物質を含む）４mlにまき
直したＢｏＭｏ１５ＡIIｃ細胞へ加え、１２時間放置し
た。新たなＭＧＭ４４８（１０％ＦＢＳ、抗生物質を含
む）に培地を交換し２５℃にて培養した。培養６日目に
培地を回収しウイルス原液とした。

【０１１２】その培養液を遠心して清澄化した上清を希
釈して平面に培養したＢｏＭｏ１５ＡIIｃ細胞の培養基
に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によりウイルス感
染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選択
した（限界希釈法）。このウイルス液のなかに野生型の
ウイルスの混入は認められなかった。ここで作製した巨
核球増殖分化因子をコードするＤＮＡを含む組み換え体
ウイルスをＴＰＯ５５−ＢｍＮＰＶとした。

【０１１３】（３）組み換え体ウイルス液の調製２５cm²のフラスコ底面で約１×１０⁶細胞のＢｏＭｏ
１５ＡIIｃ細胞を４mlの１０％ＦＢＳを含むＭＧＭ４４
８培地中で２日間平面培養した培養基に前記（２）項で
クローニングした組み換え体ウイルスを含むＢｏＭｏ１
５ＡIIｃ細胞の培養液１０μｌをＢｏＭｏ１５ＡIIｃ細
胞に添加して、２５℃で１４日間培養後、培養液を１０
００rpm で５分間遠心分離して、遠心上清を組み換え体
ウイルス液として得た。

【０１１４】（４）組み換え体巨核球増殖分化因子の発
現の検証２５cm²のフラスコ底面で約１×１０⁶細胞のＢｏＭｏ
１５ＡIIｃ細胞を４mlの１０％ＦＢＳを含むＭＧＭ４４
８培地中で２日間平面培養した培養基に前記で得られた
組み換え体ウイルス液あるいは野生型ウイルスを感染多
重度０．５になるようにＢｏＭｏ１５ＡIIｃ細胞に添加
して、２５℃で３日間培養した。感染細胞及び非感染細
胞よりＩｓｏｇｅｎ（和光純薬）をもちいて全ＲＮＡを
回収した。

【０１１５】この全ＲＮＡ１μｇを、アガロース電気
泳動に付し、大きさによる分画を行った後、Ｚｅｔａｐ
ｒｏｂｅメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に毛細管現象に
よって移した。このメンブレンを、ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ
ｉｎ（ベーリンガーマンハイム）で標識した巨核球増殖
分化因子ｃＤＮＡ（実施例２．１．で得られたＮ２０６
５とＫＹ１００によるＰＣＲ産物；配列番号：３０のヌ
クレオチド番号４４９−１２５５の配列)(巨核球増殖分
化因子プローブＤＮＡ）を含むハイブリダイゼーション
バッファー中に浸し、４２℃で１２時間保温することに
より、組み換え体巨核球増殖分化因子ｍＲＮＡと巨核球
増殖分化因子プローブＤＮＡの特異的複合体を形成させ
た。

【０１１６】この複合体にアルカリホスファターゼを結
合させた抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体（ベーリンガー
マンハイム）を反応させた後、ＡＭＰＰＤ（ベーリンガ
ーマンハイム）のアルカリホスファターゼによる分解時
に生ずる化学蛍光発光によって組み換え体巨核球増殖分
化因子ｍＲＮＡを検出した。図１１に示すごとく、ＴＰ
Ｏ５５−ＢｍＮＰＶ感染細胞の全ＲＮＡに組み換え体巨
核球増殖分化因子ｍＲＮＡが検出され、この感染細胞内
で巨核球増殖分化因子ｍＲＮＡが発現していることが示
された。

【０１１７】（５）カイコ体液の調製５令のカイコ幼虫に、本項（２）で得た組み換え体ウイ
ルスのウイルス液と比較対照として、野生型ウイルスＢ
６Ｅ株を１０^-1希釈し５０μｌ／頭注射し、２６℃で４
〜５日間、市販の人工飼育（モーラス：片倉工業製）を
与えて飼育後、５０頭のカイコの腹部を切り、体液及び
中腸内物などを含む抽出液を氷冷したプラスチックチュ
ーブに採取し、遠心分離の上清を得た。

【０１１８】（６）巨核球増殖分化因子の活性確認本項（５）で得たカイコ体液５０mlを２０mM Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ（pH７．４）緩衝液に対して充分透析し、同一
緩衝液で平衡化したＭａｔｒｅｘＢｌｕｅＡカラム
（Φ２．５×１５cm）にて分画し組換え体ウイルス、野
生型ウイルスを注射したカイコ体液中の活性を比較し
た。結合蛋白質の溶出は、非結合画分を充分に洗浄後０
〜１ＭのＮａＣｌの濃度勾配を形成させることにより行
った。図１２に示すごとく、組換えウイルス液を注射し
た体液中の巨核球誘導活性は野生型ウイルスを注射した
体液由来の活性よりも明らかに高値を示した。

【０１１９】本明細書に開示された方法は、カイコバキ
ュロウイルス転移ベクターｐＢｍ４、カイコ多角体ウイ
ルスＰ６Ｅ株、カイコ細胞ＢｏＭｏ１５ＡIIｃ細胞に限
定されるものではない。例えば、その他のバキュロウイ
ルス転移ベクター（例えばｐＢＫ２８３，ｐＢＫｂｌｕ
ｅ；以上フナコシ（株）より入手可能）、カイコ多角体
ウイルス（精製されたＤＮＡとしてフナコシ（株）より
入手可能）、カイコ細胞（ＢｍＮ４細胞；フナコシ
（株）より入手可能）を用いてこれと同等の生理活性物
質を得ることは当業者にとって容易である。

【０１２０】

【発明の効果】Ａ４３１細胞培養上清より新規の巨核球
増殖分化因子を精製し、その性質及び部分アミノ酸構造
を決定した。今回精製した最終標品はＩＬ−３の存在下
で骨髄細胞から巨核球の産生を促進することが認められ
た。本因子は巨核球の増殖分化過程で重要な調節機能を
果たしており、ｉｎｖｉｖｏでも血小板増多因子とし
て働くものである。従って本因子は臨床上大きな問題の
ある、血小板の減少を伴う各種造血疾患に対してのみな
らず骨髄移植時の放射線照射によって減少する血小板数
のコントロール、がんの化学療法時における血小板数の
コントロールなどに対しても有効な治療薬と成りうる。

【０１２１】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１２２】配列番号：２配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１２３】配列番号：３配列の長さ：１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Val Glu Xxx Val Asp Phe Thr Asn His Leu Glu Asp Thr Xxx Xxx 1 5 10 15 Asn Ile Asn Lys 19

【０１２４】配列番号：４配列の長さ：１７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Xxx Tyr Ile Glu Val Thr Glu Glu Gly Thr Glu Ala Xxx Ala Ala 1 5 10 15 Xxx Gly 17

【０１２５】配列番号：５配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１２６】配列番号：６配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Ser 1 5 10 15 Arg Met Xxx Gly Lys 20

【０１２７】配列番号：７配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１２８】配列番号：８配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１２９】配列番号：９配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１３０】配列番号：１０配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：配列番号３のアミノ酸配列に翻訳対応。Ｉ
はイノシン配列： GTIGARIIIG TIGAYTTYAC IAAYCAYYTI GARGAYAC 38

【０１３１】配列番号：１１配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：配列番号４のアミノ酸配列に翻訳対応。Ｉ
はイノシン配列： TACATCGAIG TIACIGARGA RGGIACNGAR GC 32

【０１３２】配列番号：１２配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：３′−ＲＡＣＥＫｉｔ（ＧｉｂｃｏＢ
ＲＬ）添付のオリゴマー配列： GGCCACGCGT CGACTAGTAC TTTTTTTTTT TTTTTTT 34

【０１３３】配列番号：１３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： ATGTTGTGGG GACTGCTATA 20

【０１３４】配列番号：１４配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： CAAGGCGAAT GACCTCTAAG TAT 23

【０１３５】配列番号：１５配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： CCCCGAAGCA ATCCCAGAGA G 21

【０１３６】配列番号：１６配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： CTCAGGCAGC AGAACGTACA T 21

【０１３７】配列番号：１７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： GGCGACGACT CCTGGAGCCC G 21

【０１３８】配列番号：１８配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： GACACCAGAC CAACTGGTAA TG 22

【０１３９】配列番号：１９配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： CATCCGGGAG ATGTACAGCC GGCCGCCAGA GGCAAT 36

【０１４０】配列番号：２０配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： GCTGTGGCCA TGATGCACCA G 21

【０１４１】配列番号：２１配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： TACCTGCGGG CCCTGGGCCT GAAG 24

【０１４２】配列番号：２２配列の長さ：５１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： CATCCGGGAG ATGTACAGCC GGCCGCCAGA GGCAATGCCA GACAGGTCAG C 51

【０１４３】配列番号：２３配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： GTTTTCCCAG TCACGAC 17

【０１４４】配列番号：２４配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： CAGGAAACAG CTATGAC 17

【０１４５】配列番号：２５配列の長さ：２０配列の特徴：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： AATTATGGCC CACACCAGTG 20

【０１４６】配列番号：２６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： ACTAGCCGCT ACAGTCAACA 20

【０１４７】配列番号：２７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： TTGCCACTTG CCTTTGAAGT A 21

【０１４８】配列番号：２８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： CTGATGCATC ATGGCGACTG C 21

【０１４９】配列番号：２９配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： AGCATTCACC AGCACCATTA C 21

【０１５０】配列番号：３０配列の長さ：１９５０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）起源生物名：ヒト（Ａ４３１細胞）配列の特徴：ヒト巨核球増殖分化因子をコードするＤＮ
Ａ配列：

【０１５１】 GGCACGAGAG GAACTGAAGC CCAGCTGTGA AGGCCGCAGA CTGCAGTGAG 50 AGGAGGCTGC ACTCCATTTT GCA ATG GCC TCC CTT GCT GCA GCA AAT 97 Met Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asn 1 5 GCA GAG TTT TGC TTC AAC CTG TTC AGA GAG ATG GAT GAC AAT CAA 142 Ala Glu Phe Cys Phe Asn Leu Phe Arg Glu Met Asp Asp Asn Gln 10 15 20 GGA AAT GGA AAT GTG TTC TTT TCC TCT CTG AGC CTC TTC GCT GCC 187 Gly Asn Gly Asn Val Phe Phe Ser Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala 25 30 35 CTG GCC CTG GTC CGC TTG GGC GCT CAA GAT GAC TCC CTC TCT CAG 232 Leu Ala Leu Val Arg Leu Gly Ala Gln Asp Asp Ser Leu Ser Gln 40 45 50 ATT GAT AAG TTG CTT CAT GTT AAC ACT GCC TCA GGA TAT GGA AAC 277 Ile Asp Lys Leu Leu His Val Asn Thr Ala Ser Gly Tyr Gly Asn 55 60 65 TCT TCT AAT AGT CAG TCA GGG CTC CAG TCT CAA CTG AAA AGA GTT 322 Ser Ser Asn Ser Gln Ser Gly Leu Gln Ser Gln Leu Lys Arg Val 70 75 80 TTT TCT GAT ATA AAT GCA TCC CAC AAG GAT TAT GAT CTC AGC ATT 367 Phe Ser Asp Ile Asn Ala Ser His Lys Asp Tyr Asp Leu Ser Ile 85 90 95 GTG AAT GGG CTT TTT GCT GAA AAA GTG TAT GGC TTT CAT AAG GAC 412 Val Asn Gly Leu Phe Ala Glu Lys Val Tyr Gly Phe His Lys Asp 100 105 110 TAC ATT GAG TGT GCC GAA AAA TTA TAC GAT GCC AAA GTG GAG CGA 457 Tyr Ile Glu Cys Ala Glu Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Val Glu Arg 115 120 125 GTT GAC TTT ACG AAT CAT TTA GAA GAC ACT AGA CGT AAT ATT AAT 502 Val Asp Phe Thr Asn His Leu Glu Asp Thr Arg Arg Asn Ile Asn 130 135 140 AAG TGG GTT GAA AAT GAA ACA CAT GGC AAA ATC AAG AAC GTG ATT 547 Lys Trp Val Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Asn Val Ile 145 150 155 GGT GAA GGT GGC ATA AGC TCA TCT GCT GTA ATG GTG CTG GTG AAT 592 Gly Glu Gly Gly Ile Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val Asn 160 165 170 GCT GTG TAC TTC AAA GGC AAG TGG CAA TCA GCC TTC ACC AAG AGC 637 Ala Val Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Gln Ser Ala Phe Thr Lys Ser 175 180 185 GAA ACC ATA AAT TGC CAT TTC AAA TCT CCC AAG TGC TCT GGG AAG 682 Glu Thr Ile Asn Cys His Phe Lys Ser Pro Lys Cys Ser Gly Lys 190 195 200 GCA GTC GCC ATG ATG CAT CAG GAA CGG AAG TTC AAT TTG TCT GTT 727 Ala Val Ala Met Met His Gln Glu Arg Lys Phe Asn Leu Ser Val 205 210 215 ATT GAG GAC CCA TCA ATG AAG ATT CTT GAG CTC AGA TAC AAT GGT 772 Ile Glu Asp Pro Ser Met Lys Ile Leu Glu Leu Arg Tyr Asn Gly 220 225 230 GGC ATA AAC ATG TAC GTT CTG CTG CCT GAG AAT GAC CTC TCT GAA 817 Gly Ile Asn Met Tyr Val Leu Leu Pro Glu Asn Asp Leu Ser Glu 235 240 245 ATT GAA AAC AAA CTG ACC TTT CAG AAT CTA ATG GAA TGG ACC AAT 862 Ile Glu Asn Lys Leu Thr Phe Gln Asn Leu Met Glu Trp Thr Asn 250 255 260 CCA AGG CGA ATG ACC TCT AAG TAT GTT GAG GTA TTT TTT CCT CAG 907 Pro Arg Arg Met Thr Ser Lys Tyr Val Glu Val Phe Phe Pro Gln 265 270 275 TTC AAG ATA GAG AAG AAT TAT GAA ATG AAA CAA TAT TTG AGA GCC 952 Phe Lys Ile Glu Lys Asn Tyr Glu Met Lys Gln Tyr Leu Arg Ala 280 285 290 CTA GGG CTG AAA GAT ATC TTT GAT GAA TCC AAA GCA GAT CTC TCT 997 Leu Gly Leu Lys Asp Ile Phe Asp Glu Ser Lys Ala Asp Leu Ser 295 300 305 GGG ATT GCT TCG GGG GGT CGT CTG TAT ATA TCA AGG ATG ATG CAC 1042 Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Ser Arg Met Met His 310 315 320 AAA TCT TAC ATA GAG GTC ACT GAG GAG GGC ACC GAG GCT ACT GCT 1087 Lys Ser Tyr Ile Glu Val Thr Glu Glu Gly Thr Glu Ala Thr Ala 325 330 335 GCC ACA GGA AGT AAT ATT GTA GAA AAG CAA CTC CCT CAG TCC ACG 1132 Ala Thr Gly Ser Asn Ile Val Glu Lys Gln Leu Pro Gln Ser Thr 340 345 350 CTG TTT AGA GCT GAC CAC CCA TTC CTA TTT GTT ATC AGG AAG GAT 1177 Leu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Val Ile Arg Lys Asp 355 360 365 GAC ATC ATC TTA TTC AGT GGC AAA GTT TCT TGC CCT TGA 1216 Asp Ile Ile Leu Phe Ser Gly Lys Val Ser Cys Pro ... 370 375 380 AAATCCAATT GGTTTCTGTT ATAGCAGTCC CCACAACATC AAAGAACCAC 1266 CACAAGTCAA TAGATTTGAG TTTAATTGGA AAAATGTGGT GTTTCCTTTG 1316 AGTTTATTTC TTCCTAACAT TGGTCAGCAG ATGACACTGG TGACTTGACC 1366 CTTCCTAGAC ACCTGGTTGA TTGTCCTGAT CCCTGCTCTT AGCATTCTAC 1416 CACCATGTGT CTCACCCATT TCTAATTTCA TTGTCTTTCT TCCCACGCTC 1466 ATTTCTATCA TTCTCCCCCA TGACCCGTCT GGAAATTATG GAGAGTGCTC 1516 AACTGGTAAG GAGAACGTAG AAGTAGCCCT AGGGATCCTT TTTGAAACTC 1566 TACAGTTATC GCAGATATTC TAGCTTCATT GTAAGCAATC TAGGAAATAA 1616 GCCCTGCTGC TTTCTAGAAA TAAGTGTGAA GGATAAATTT TCTTTGTTGA 1666 CCTATGAAGA TTTTAGAGTT TACCTTCATA TGTTTGATTT TAAATCAGTG 1716 TATAATCTAG ATGGTAAAAA ATGTGAAATT GGGATTAGGG ACCAACCAAA 1766 ATATTTCATT AATGCTTTCA ATTGACAAAT TTTGGTCTTT CTTTGATAAG 1816 ACAATATGTA CATAGTTTTT TCAAATATTA AAGATCTTTT AACTGTTGGC 1866 AGTTGTTATC TACAGAATCA TATCTCATAT GCTGTGTAGT TTATAAGTTT 1916 TTTCTCTATT TATCAGAATA AAGAAATACA ACAT 1950

【０１５２】配列番号：３１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ起源生物名：ヒト配列の特徴：５′非翻訳領域配列： AACTGAAGCC CAGCTGTGAA 20

【０１５３】配列番号：３２配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： CTCGAATTCG CGATGGCCTC CCTTGCTGCA GCAAATG 37

【０１５４】配列番号：３３配列の長さ：４９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列： GGGAATTCGC GGCCGCGTGG TGGTTCTTTG ATGTTGTGGG GACTGCTAT 49

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＱ−セファロースによる分画の過程を示
す。溶出はNaCl（０→１．０Ｍ）の濃度勾配をフラクシ
ョン１より１２０まで形成させることで行った。黒丸実線；蛋白質の溶出パターン白丸点線；アセチルコリンエステラーゼ活性

【図２】図２はフェニル−セファロースによる分画の過
程を示す。溶出は硫安（３０％→０％）、エチレングリ
コール（０→５０％）の濃度勾配形成をフランクション
１より１００まで行い、フランクション１００から１２
０までは５０％エチレングリコールで行った。黒丸実線；蛋白質の溶出パターン白丸点線；アセチルコリンエステラーゼ活性

【図３】図３はＳ−セファロースによる分画の過程を示
す。溶出はNaCl（０→０．５Ｍ）の濃度勾配をフラクシ
ョン１より１００まで形成させることで行った。黒丸実線；蛋白質の溶出パターン白丸点線；アセチルコリンエステラーゼ活性

【図４】図４はハイロード２６／６０スーパーデックス
７５による分画の過程および各画分を示す電気泳動図を
示す。上図実線；蛋白質の溶出パターン白丸実線；アセチルコリンエステラーゼ活性下図；各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果

【図５】図５は精製した巨核球増殖分化因子のＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる分析の結果を示す電気泳動図である。

【図６】図６は精製した巨核球増殖分化因子の等電点電
気泳動による分析の結果を示す等電点電気泳動図であ
る。

【図７】図７は精製した巨核球増殖分化因子のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ電気泳動による糖鎖分析の結果を示す電気泳動
図である。１．無処理の巨核球増殖分化因子２．エンドグリコシダーゼＦで処理した巨核球増殖分化
因子（３５kDa 付近のバンドは酵素由来のものである）

【図８】図８は、精製した巨核球増殖分化因子（５５kD
a 蛋白質）の存在下又は非存在下で、且つＩＬ−３の添
加又は無添加のもとでマウス骨髄細胞を５日間培養した
場合の巨核球のアセチルコリンエステラーゼ活性を比較
したグラフである。

【図９】図９は、精製した巨核球増殖分化因子の存在下
（Ｂ）又は非存在下（Ａ）で、ＩＬ−３の添加後４日間
培養したマウス骨髄細胞をアセチルコリンエステラーゼ
染色した結果を示し、生物の形態を表わす図面に代る写
真である。

【図１０】図１０は、精製した巨核球増殖分化因子の存
在下（Ｂ）又は非存在下（Ａ）で、ＩＬ−３の添加後４
日間培養したマウス骨髄細胞をメイ＝グリンワルド＝ギ
ムザ染色した結果を示し、生物の形態を表わす図面に代
る写真である。

【図１１】図１１は、巨核球増殖分化因子をコードする
遺伝子を含有する組換え型ウイルス（ＴＰＯ５５−Ｂｍ
ＮＰＶ）を感染させたカイコ細胞（レーンＢ）、野生型
ウイルス（Ｂ６Ｅ）を感染させたカイコ細胞（レーン
Ａ）又は未感染細胞（レーンＣ）の培養細胞から抽出し
たＲＮＡを巨核球増殖分化因子ｃＤＮＡプローブ（配列
番号：３０のヌクレオチド番号４４９−１２５５）とハ
イブリダイズさせた結果を示すものであり、図面に代る
電気泳動図である。

【図１２】図１２は、カイコでの巨核球増殖分化因子の
発現を示すグラフである。黒丸；組換え型ウイルスを感染させたカイコの結果白丸；野生型ウイルスを感染させたカイコの結果。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者岩佐冬樹大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者中里紘大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者山市浩造大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者三浦健寿大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者鶴岡伸夫大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者山口希京都府京都市北区鞍馬口通り寺町西入ル新御霊口町285−79

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記性質を有する巨核球増殖分化因子：（１）巨核球の増殖および成熟分化を促進する；（２）ゲル濾過及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析による分子
量が５５〜５７kDを示し、分子間ジスルフィド結合を持
たない；（３）等電点６．５±０．５を示す；及び（４）配列番号１〜９に示すアミノ酸配列のうち少なく
とも１つの配列を有する。
【請求項２】ヒト細胞によって生産される請求項１に
記載の巨核球増殖分化因子。
【請求項３】ヒト癌細胞により生産される請求項２に
記載の巨核球増殖分化因子。
【請求項４】ヒト類表皮癌細胞Ａ４３１由来の細胞に
よって生産される請求項３に記載の巨核球増殖分化因
子。
【請求項５】無蛋白質培地で増殖させたヒト類表皮癌
細胞Ａ４３１由来の細胞によって産生される請求項４記
載の巨核球増殖分化因子。
【請求項６】請求項１記載の巨核球増殖分化因子と同
一のアミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換し
たアミノ酸配列、あるいは該同一のアミノ酸配列または
その一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に１〜複
数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、遺伝
子組換え技術によって造成された形質転換細胞の培養物
から得られる巨核球増殖分化因子。
【請求項７】配列番号：３０に示すアミノ酸配列また
はその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列あるい
は該アミノ酸配列または一部が欠失もしくは置換したア
ミノ酸配列に１〜複数個のアミノ酸が付加されたアミノ
酸配列を有する請求項６に記載の巨核球増殖分化因子。
【請求項８】糖鎖が結合したものである請求項６また
は７記載の巨核球増殖分化因子。
【請求項９】Ｎ−末端が生化学的又は化学的に修飾さ
れている、請求項６〜８のいずれか１項に記載の巨核球
増殖分化因子。
【請求項１０】翻訳開始のメチオニンが除去され、そ
れに続くアラニンがアセチル化されている、請求項９に
記載の巨核球増殖分化因子。
【請求項１１】配列番号１〜９に示すアミノ酸配列の
うち少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドとハ
イブリダイズするポリヌクレオチドを用いて遺伝子組換
え技術によって造成された形質転換細胞の培養物から得
られる請求項６〜１０のいずれか１項に記載の巨核球増
殖分化因子。
【請求項１２】請求項１〜１１のいずれか１項に記載
の巨核球増殖分化因子のアミノ酸配列をコードする遺伝
子。
【請求項１３】請求項１２に記載の遺伝子を含んで成
る発現ベクター。
【請求項１４】請求項１３に記載の発現ベクターによ
り形質転換された宿主。
【請求項１５】請求項１〜１１のいずれか１項に記載
の巨核球増殖分化因子を有効成分として含有する医薬組
成物。
【請求項１６】血小板減少症治療薬である請求項１５
に記載の医薬組成物。
【請求項１７】請求項１〜１１のいずれか１項に記載
の巨核球増殖分化因子を抗原とする抗体。
【請求項１８】請求項１４に記載の宿主を培養又は飼
育し、巨核球増殖分化因子を採取することを特徴とす
る、巨核球増殖分化因子の製造方法。