JPH0630631B2 - 生物学的液体中のジアミン類および／またはポリアミン類の存在を検出する診断試験キツト及び診断試験方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、アミン類を検出する方法およびキツトに関
し、更に詳しくは、妨害物を除去した後、生物学的液体
中のジアミン類およびポリアミン類の存在を検出する方
法および診断キツトに関する。該方法は、簡単且つ信頼
性が高く、これまで達し得なかつた高い感度を有する。

本発明法は、目的の如何を問わず、ボリアミン類の検出
に適用可能であるが、特に、腫瘍の検出およびこの種の
疾患の治療のための治療的手段の追跡検査に有用であ
る。

従来の技術及びその問題点 天然ポリアミン類、即ち、プトレシン、スペルミジンお
よびスペルミン、およびそれらの誘導体の幾つかは、あ
らゆる植物および動物の組織または細胞に存在する。こ
れらアミン類は、主に核酸物質と関連しており、それら
の濃度は、急速に増殖する細胞において増大する。

癌組織は、ポリアミン類が豊富であり、これら化合物ま
たはそれらの結合誘導体が癌患者の尿中に排泄されるこ
とは、周知である。ポリアミン類（またはそれらの誘導
体）の濃度は、癌患者の血液および脳腫瘍患者の脳脊髄
液中でも増大する。

最近の研究により、ポリアミン類は、抗腫瘍療法に対す
る反応の評価に使用することができることが明らかにさ
れている。また、追跡調査は、臨床症状が出現する前
に、該疾患の再発を評価するのに有用であろうと提案さ
れている。このような研究において、ポリアミン分析は
癌の早期発見に使用できるであろう。

ポリアミン類の定量は、生物学的研究、発育または分化
過程の検査、およびインターフエロン、抗ウイルス剤、
抗腫瘍剤又は駆虫剤の活性のスリーニングにおいても有
用である。

ポリアミン類測定には、数種の定量法が用いられてい
る。この定量法には、ペーパー、ガスまたは薄層クロマ
トグラフ法並びに電気泳動および高速液体クロマトグラ
フ法等の分離法が包含されている。最近、特異酵素によ
るポリアミン類の酸化を含む生物学的方法がよく用いら
れるようになつている。これは主に、この方法が迅速で
あり、複雑な装置を必要としないからである。この方法
においては、ポリアミン類を含む生物学的材料を特異酵
素とインキヤベートし、酸化生成物の濃度を測定するこ
とにより酸化率を検査する。ポリアミン類の酸化中にア
ルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素が形成される。

しかし、このような先行技術の方法は、生物学的材料
（またはそのような材料の加水分解物）からポリアミン
類を抽出するのに比較的困難な操作を必要とするため、
能率的ではない。その他、薬剤等の妨害物質が酸化を阻
害し、誤つたデータを生じる場合がある。更に、既知の
方法の多くは、極めて感受性が高いということもなく、
また比較的大量の生物学的材料の使用を必要とする。

問題点を解決するための手段 本発明は、臨床および研究機関におけるルーチンな使用
に適用できるポリアミン類測定の分析法およびキツトを
提供する。本方法は、感度が高く、簡単で、少量のサン
プルで行なうことができる。例えば、尿分析は、０．１
〜０．２ｍのサンプルで行ない得る。ポリアミン類が
サンプルあたり１０ピコモルの少量でも、検出可能であ
る。

高感受性に加え、本発明の方法は、生物学的材料（また
は生物学的材料の加水分解物）からのポリアミン類抽出
を簡単に行なうことができ、測定を妨害する物質の除去
を容易にする。

本発明は、 (a)アミン類、ジアミン類およびポリアミン類の陽荷電
分子を吸収するホスホセルロース、カルボキシメチルセ
ルロースおよびスルホン酸官能基を有するポリマーで被
覆されたペーパーから成る群から選ばれる陰荷電要素、 (b)アミン類、アミノ酸類およびそれ等の誘導体を前記
要素から除去する溶出液、 (c)ジアミン類およびポリアミン類を前記要素から溶出
する強電解質、 (d)前記アミン類をアルデヒド、アンモニアおよび過酸
化水素に変えるジアミンおよびポリアミン酸化酵素、 (e)過酸化活性を有する物質、および (f)酸化されて過酸化水素になつたジアミン類および／
またはポリアミン類の存在を定量的に測定するための、
酸化された過酸化水素の存在下に発光する物質 を含むことを特徴とする、生物学的液体中のジアミン類
および／またはポリアミン類の存在を検出する診断試験
キツトを提供する。

本発明は、更に、 (a)生物学的液体サンプルとアミン類、ジアミン類およ
びポリアミン類の陽荷電分子を吸収するホスホセルロー
ス、カルボキシメチルセルロースおよびスルホン酸官能
基を有するポリマーで被覆されたペーパーから成る群か
ら選ばれる陰荷電要素とを接触させ、 (b)アミン類、アミノ酸類およびそれらの誘導体を、ア
ミン溶出液で洗浄することにより該要素から除去し、 (c)強電解質と接触することにより該要素からジアミン
類およびポリアミン類を溶出し、 (d)溶出したジアミン類およびポリアミン類を酸化酵素
で酸化して、該アミン類をアルデヒド、アンモニアおよ
び過酸化水素に変え、 (e)酸化されて過酸化水素を生成するジアミン類および
／またはポリアミン類を定量的に測定するため、酸化さ
れた過酸化水素の存在下に発光する物質の存在下過酸化
活性を有する物質と反応させることにより過酸化水素を
検出する ことを特徴とする、生物学的液体中のジアミン類および
ポリアミン類の存在を検出する方法を提供する。

本発明は、また、塩酸等の無機酸の存在下に、結合形ジ
アミン類およびポリアミン類を含有する液体を単に加熱
して該結合アミン類の加水分解を行ない、それにより該
アミン類を遊離させて前記段階(a)〜(e)に従つて更に処
理することにより、結合したジアミン類またはポリアミ
ン類を検出するために利用することができる。

本発明は、生物学的液体サンプル中のジアミン類および
ポリアミン類の濃度を定量するキツトおよび該キツトの
使用法に関する。本質的には、陰荷電要素を生物学的液
体サンプルと接触させ、アミン酸類、アミン類、ジアミ
ン類およびポリアミン類のような該サンプル中のあらゆ
るカチオン物質を結合させる。次に、該アミノ酸類、ア
ミン類および分析を妨害するその他の弱陽荷電化合物
を、低イオン強度緩衝液に溶出することにより該要素か
ら除去する。該要素に結合したままのより高い荷電ジア
ミン類およびポリアミン類を次いで高いイオン強度緩衝
液で選択的に溶出し、溶出液を酸化／過酸化物検出系で
処理し、該要素から遊離したジアミン類およびポリアミ
ン類を定量する。

陰荷電要素は、ホスホセルロース、カルボキシメチルセ
ルロースおよびスルホン酸官能基を有するポリマーで被
覆されたペーパーから成る群から選ばれるか、またはそ
の他の陰荷電官能基を有する他の固形支持体から成る。
望ましい実施態様においては、ホスホセルロースステイ
ツク（レブ・サイエンテイフイツク社製、テルアビブ、
イスラエル）が使用される。

アミン類、アミノ酸類および他の化合物等の望ましくな
い、妨害を行なうおそれのある分子類の陰荷電要素から
の除去は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム又は水酸
化アンモニウム等の強電解質中低イオン強度での溶出に
より行なわれる。例えば、これら電解質は、この最初の
溶出段階に約０．１Ｍの濃度で使用される。この段階は
室温で約３０分間行なうのが望ましい。

陰荷電要素を低イオン強度電解質で洗浄した後、該電解
質の濃度は段階的に約０．１５Ｍ（ジアミンを溶出）、
次いで１．０Ｍ（ポリアミンを溶出）に増大してもよ
い。このような段階的溶出により、ジアミン類およびポ
リアミン類は別々に定量される。または、より高いイオ
ン強度の電解質を使用してもよく、この場合ジアミン類
およびポリアミン類が共に溶出され、総ポリアミンとし
て測定される。

溶出されたジアミン類およびポリアミン類はともに、ジ
アミンあるいはポリアミン酸化酵素および過酸化活性を
有する物質から成る酵素系により定量化される。後者の
物質は、酸化された過酸化水素の存在下に発光する物質
と共に使用される。

ジアミンおよびポリアミン酸化酵素の供給源は、本発明
では特に限定されず、エンドウ種子、豚腎、細菌または
真菌から精製したジアミン酸化酵素および牛血漿または
血清、細菌または真菌から精製したポリアミン酸化酵素
を使用することができる。これら酵素は、ジアミン類ま
たはポリアミン類をアルデヒド、アンモニアおよび過酸
化水素に変える。望ましい実施態様において、ジアミン
酸化酵素は、本質的にはヒル（Hill）により〔メソツズ
イン エンザイモロジー、１７Ｂ巻、アカデミツク・
プレス、ニユーヨーク、７３０−７３５頁（１９７
１）〕記述されているように、エンドウ種子から精製さ
れる。ポリアミン酸化酵素は、本質的にはテイバー（Ta
bor）らの方法〔メソツズ イン エンザイモロジー、
２巻、アカデミツク・プレス、ニユーヨーク、３９０−
３９３頁（１９５５）〕に従つて、牛血漿から精製する
のが望ましい。

過酸化活性を有する物質としては、セイヨウワサビ（ho
rse radish）またはイチジクラテツクス過酸化酵素のよ
うな酵素が挙げられる。また、代りに、ウロヘミン、血
液又はモリブデン酸イオンを用いてもよい。これら物質
により生じた酸化された過酸化水素は、ルミノール（５
−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
ン）のような酸化された過酸化水素の存在下に発光する
物質により検出される。化合物の発光は、ルマツク社製
バイオカウンター２０１０型（ルマツクＢ．Ｖ．，６３
７０ＡＣシエスベルグ、オランダ）のような装置により
検出することができる。

本発明の方法は、遊離および結合型ジアミン類およびポ
リアミン類に適用することができる。一般に、尿サンプ
ルのような生物学的液体サンプルは、まず塩酸のような
無機酸により、好ましくは最終濃度１Ｎで加水分解され
る。この加水分解は、約１００〜１１０℃の温度で約１
０〜１２時間行なうのが望ましい。加水分解段階が省か
れると、測定されたジアミンおよびポリアミン濃度は、
有意的に低くなるであろう。このことは、化合物の一部
が結合体として分泌されていることを示している。これ
ら結合体は、おそらくアセチル誘導体である。尿サンプ
ルは一度加水分解されると、室温で数週間保存してもポ
リアミン類およびジアミン類の損失を来たすことはな
い。

実施例 本発明は、以下の実施例を参照することにより容易に理
解されようが、本発明は、これらの実施例に限定される
ものではない。

実施例１：ジアミン酸化酵素の精製 本酵素は、本質的には前出ヒルによる文献記載のよう
に、エンドウ種子から次のようにして精製された。

(a)粗エキスの調製 エンドウ種子（約１kg）を流水（水道水）中に１８〜２
４時間浸し、洗浄した砂に４〜６mmの深さにまく。種は
暗所で発芽させる。軟白新芽が高さ２〜５mmの時（通常
種まき後１０日目）、子葉および新芽（２〜２．５kg）
を集め、冷水道水で砂を洗い落し、ワーリングブレンダ
ー（Waring Blendor）で細断する。ホモゲネートを綿布
に入れ、ジユースを絞り取る。固形残渣を０．１Ｍリン
酸カリウム緩衝液（pH７．０）と混合し、再び液体を絞
り出す。この両液体排出物を合せて冷凍する。

(b)エタノール−クロロホルム混液による分別粗エキス
の容量を測定し（一般に２０００〜３０００m）、−
１０℃に冷却した２：１（ｖ／ｖ）エタノール−クロロ
ホルム混液を３０分かけて加える。混合液を冷所で１時
間放置した後、不活性沈殿物を遠心分離（３０００×
ｇ、２０分間）により除去する。上澄液を集め、硫酸ア
ンモニウム（上澄１００mあたり４５ｇ）を１０℃で
加える。固形物は分離し、浮き上る。下層はサイホンで
吸い取り、残りのスラリーを３０００×ｇで１０分間遠
心分離する。沈渣を０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液
（pH７．０；最初の新鮮エンドウ種子２ｇ当り１m）
に懸濁し、２℃で一晩保存する。

(c)硫酸アンモニウムによる沈殿 この懸濁液を２０℃で１時間攪拌し、沈殿物を遠心分離
（３０００×ｇ、２０分間）により除去する。上澄みを
硫酸アンモニウム（４５ｇ／１００m）で処理し、１
０℃で１時間放置した後、沈殿を遠心分離（３０００×
ｇ、２０分間）により集める。この沈殿物を０．２Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液（pH７．０）約２０mに懸濁し、
まず流水で３〜４時間透析し、次いで０．００５Ｍリン
酸カリウム緩衝液（pH７．０）で３回（各々２）、０
〜４℃で３６時間にわたり透析する。

(d)pH５．０での沈殿 透析物を３０００×ｇで遠心分離し、不活性沈渣は捨て
る。上澄液を５℃に冷却し、０．０５Ｎ酢酸をゆつくり
と加えてpH５．０に調製し、４℃で１時間放置する。沈
殿を遠心分離により集め、蒸留水１０〜１５mで磨砕
し、０．０５Ｎ水酸化カリウムを滴下してpH７．０にす
る。pH５．０での沈殿操作を２度繰り返し、最終溶液は
０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）で適当な
容量にする（エンドウ種子１００ｇ当り１m）。この
溶液を最後に凍結乾燥し、真空中黒いバイアルに保存す
る。

実施例２：ポリアミン酸化酵素の精製 本酵素は、本質的には前記テイバーらが記述したよう
に、次のように牛血漿から精製する。

(a)血漿採集 屠殺場で得た去勢雄牛血液を直ちにクエン酸塩溶液（溶
液１あたりクエン酸８ｇ、クエン酸ナトリウム２６．
７ｇ含有）の1/6容量で処理する。血漿は遠心分離によ
り集める。

(b)硫酸アンモニウムによる分画 血漿３９３０mに飽和硫酸アンモニウム溶液２１１８m
を攪拌下に加える。３℃に冷却後、沈殿をひだ付き
紙を用い去する。液に飽和硫酸アンモニウム溶液３
７６０mを加える。沈殿を取し、水に溶解する（採
集容量８００m）。

これを用い、下記容量の飽和硫酸アンモニウム溶液を加
え、各沈殿を取して２回目の分画を行なう：（Ｉ）１
８５m、（II）８５m、（III）７５m、（IV）１０
０m。各沈殿を水に取り、活性を調べる。沈殿（III）
及び（IV）は最も高い比活性を有することが明らかとな
る。これらを合せ（総量２１４m）、０．０１Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液を３度変え（各々２．０）４８時間
透析する。

(c)アルコール沈殿 この透析物の一部（５０m）ずつを攪拌下に水浴中で
６５℃に速やかに加熱し、この温度で１０分間保つ。こ
れらを０℃に急速に冷却し、合せる。すべてのアルコー
ル沈殿は、−１０℃以下に冷却したエチルアルコールを
用いて０℃で行なう。０．１ＭＭｎＣｌ_２２８．３m
を加えた後、２８３mをエタノールを用い画分する。
以下のアルコール画分は、夫々のアルコール量をゆつく
りと加えることにより得られる：（Ｉ）２５％アルコー
ル１４２m；（II）２５％アルコール７１m；（II
I）２５％アルコール７１m；（IV）無水アルコール１
４．２m；及び（Ｖ）無水アルコール５７m。沈殿を
遠心分離により集め、冷水３０mに取る。

最も高い比活性を示す画分（通常画分IV）を２回目のア
ルコール画分に供する。

この画分（３７．５m）に０．１ＭＭｎＣｌ_２３．７
５mを加える。下記のように冷無水アルコールを連続
的に加える：（Ｉ）１．９１m；（II）１．３m；
（III）１．１３m；（IV）１．６３m；（Ｖ）１．
６３m。得られた沈殿を遠心分離により集め、０．０
５Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）に溶解する。最も高い比
活性を有する画分〔画分（III）、（IV）及び（Ｖ）〕
を集め、凍結乾燥して真空中黒いバイアルに保存する。

実施例３：総ジアミン及びポリアミンの測定 (a)加水分解 尿のような生物学的液体１mを濃塩酸１００μとと
もにねじ蓋試験管に取る。ねじ蓋をしつかりと閉め、試
験管をサーモブロツク中１００〜１１０℃で一晩加熱す
る。

(b)サンプルの適用 ホスホセルロース・ステイツク（１０×３０mm）をプラ
スチツク製ホルダーに取り付け、加水分解物５５μを
各ステイツクに塗布する。ステイツクを室温で、または
熱風により、或いは真空オーブンにて乾燥させる。

(c)妨害物質の除去 ホウ酸ナトリウム緩衝液（０．０２Ｍ、pH８．６）５０
００mを磁気スターラーの上においてプラスチツク製
シリンダーに注ぎ込む、。加水分解物を塗布したステイ
ツクを含むホルダーを緩衝液中に浸し、溶液を室温で３
０分間攪拌する。別に調製したホウ酸ナトリウム緩衝液
５０００mで２回洗浄を繰り返す。

ステイツクを有するホルダーを緩衝液から取出し、ステ
イツクをワツトマン（Whatman）No.１紙に押付けて吸
い取らせる。ステイツクは最終的には前記(b)と同様に
乾燥させる。

(d)ジアミン類及びポリアミン類の溶出 乾燥ステイツクをホルダーから取外し、各ステイツクを
０．２Ｍホウ酸緩衝液（pH８．６）中１Ｎ塩化ナトリウ
ム１．０mを含有するプラスチツク製試験管に移す。

試験管を振盪しながら３７℃で３０分間インキユベート
し、次いでステイツクをこの液から取り出し、水気を切
り、過剰の緩衝液はガラス棒またはプラスチツク製ピペ
ツトの先端を用いて試験管壁に各ステイツクを押付けて
除去する。

(e)発光 澄明な溶出液２５、５０及び１００μをプラスチツク
製発光測定試験管に移す。容量は、適当量（表１）の溶
出緩衝液を加えて１００μにする（(d)におけると同
様）。

ルミノール（１０^−４Ｍ）及び過酸化酵素（３０μｇ／
m）各々１００μと６．２×１０^−２Ｍグリシン緩
衝液（pH８．６）２５０μを各試験管に加え、この試
験管をバツクグラウンド発光が消失するまで少なくとも
５分間暗所に保存する。

ジアミン類（例えば、プトレシン）の定量には、ジアミ
ン酸化酵素を使用する。エンドウ種子から精製した酵素
（１〜２単位／mが最善であるが、豚腎、細菌、真菌
またはその他の植物から精製したジアミン酸化酵素を使
用してもよい。

試験管をバイオカウンター２０１０型（ルマツクＢ．
Ｖ．６３７０ＡＣシエスベルグ、オランダ）または類似
のルミノメーターの読取り室に移し、バツクグラウンド
値を３０℃で記録する。発光率は３００以下である。

ジアミン類の定量の場合、ジアミン酸化酵素（１〜２単
位／m）１００μを各試験管に分注する。集積発光
は、値が基準値（６０秒につき６００以下）に低下する
まで、各６０秒間にわたり直ちに記録する。

ポリアミン類は、ポリアミン酸化酵素を分注する以外は
上記と同様にして定量する。牛血漿から精製した酵素
（５〜１０単位／m）が最善であるが、植物、細菌又
は真菌から精製したポリアミン酸化酵素を同様に使用し
てもよい。

(f)標準品および内部標準 プトレシン、スペルミジンおよよびスペルミンの標準線
は、溶液（１０^−４Ｍまたは１０^−５Ｍ）をステイツク
にスポツトし、前記のように処理して作成する。必要で
あれば、ポリアミン標準液をステイツクに適用する前に
該標準液の既知量を生物学的液体中に加えることによ
り、内部標準を本分析法に含めてもよい。

(g)結果の計算 生物学的液体の発光読取り値は標準品で得られたものと
比較される。検出限界は、少なくとも１０ｐmoleアツセ
イである。尿の場合、結果は、ｎmole／mgクレアチニン
で表わされる。スペルミジンは、尿中に存在するポリア
ミン類の大部分の構成要素であるので、スペルミジン標
準品を尿中ポリアミン類の算出に使用してもよい。

分析混合物の組成を表１に示す。

実施例４：癌患者における総ポリアミンの定量 実施例３の手順に従い、癌患者の尿サンプルを治療開始
後定期的に検査した。総尿ポリアミンの正常値は２５．
１±９．７ｎmolo／mgクレアチニンである。得られた結
果は表２に示す。

実施例５：ジアミン類およびポリアミン類の逐次溶出 (a)サンプルの加水分解および適用 手順は本質的には前記実施例３(a)および(b)に概説した
ものである。

(b)妨害物質の除去 水酸化アンモニウム溶液（０．１Ｍ）２０００mをフ
ード中で磁気スターラー上に置いたプラスチツク製シリ
ンダーに注ぎ込む。加水分解物を有するステイツクを含
むホルダーをこの溶液に浸し、室温で３０分間攪拌す
る。次いで、ステイツクを付けたホルダーを溶液から取
り出し、ステイツクを最初室温で、次に真空オーブン中
熱風で乾燥させる。

(c)ジアミン類の溶出 各乾燥ステイツクをホルダーから取外し、０．１５Ｍ塩
酸マグネシウム溶液１．０mを入れたプラスチツク製
試験管中に置く。この試験管を振盪しながら３０℃で３
０分間インキユベートし、ステイツクを液から取り出
し、前記段階(b)と同様にして乾燥させる。

(d)ポリアミン類の溶出 乾燥ステイツクを１．０Ｍ塩化マグネシウム溶液１．０
mを入れたプラスチツク製試験管に入れる。試験管を
振盪しながら３０℃で３０分間インキユベートし、ステ
イツクを取り出し、乾燥させる。

(e)発光 ジアミン類は、前記５、３(e)項で述べたように、ジア
ミン酸化酵素を用い、０．１５Ｍ塩化マグネシウム溶液
中で定量する。エンドウ種子から精製した酵素が最適で
あるが、他のジアミン酸化酵素源を使用してもよい。

ポリアミン類は、精製したポリアミン酸化酵素を用い、
０．１Ｍ塩化マグネシウム溶液中で分析される。牛血漿
から精製された酵素が最適であるが、他のポリアミン類
酸化酵素源を使用してもよい。

分析の残りは実質的に実施例３に記載のようにして行な
う。

実施例６：遊離ポリアミン類の定量 遊離ジアミン類を又はポリアミン類の量を定量するた
め、加水分解段階は省いてもよい。あらゆる生物学的液
体または細胞抽出物が分析可能であり、サンプルはサバ
ント社製エバポレーターを用い濃縮あるいは乾燥させて
もよい。尿中遊離ジアミン類又はポリアミン類を測定す
る場合、以下の操作を用いても良い。

酸による加水分解を行わなかつた尿の一部２００μを
ステイツクに塗り、このステイツクを前述のように乾燥
させる。次いで前述のように溶出および発光測定を行
う。

実施例７：別の発光法 少量の酵素を用いる場合又はサンプルがジアミン類また
はポリアミン類の酸化をおくらせる化合物を含有してい
る場合には、酸化および発光測定の別の方法を用いても
よい。

サンプルをステイツクに塗り、前述のように溶出し、ジ
アミン類およびポリアミン類の酸化は次のように行な
う。

ジアミン類又はポリアミン類を含有する溶出液（５０〜
１００μ）を０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH７．
６）１００μに加え、ジアミン酸化酵素（ジアミン定
量用）またはポリアミン酸化酵素（ポリアミン定量用）
をプラスチツク製試験管中の液体に加える。対照は、酵
素を加えない溶出液と、溶出液を加えない酵素とし、標
準品と平行して操作し、全サンプルを３０℃で６０分間
インキユベートする。

試験管をルミノメーターの測定室に移し、以下の溶液を
各試験管に分注する： 水酸化ナトリウム（２５ｍＭ） １００μ
過酸化酵素（１mg／m）１００μ ルミノール（１０^−４Ｍ） １００μ 発光は、基準バツクグラウンド値に達するまで記録し、
対照（溶出液を加えない酵素、および酵素を加えない溶
出液）で得られた測定値を差し引く。最終値は、標準溶
液で得られた値と比較する。

本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明
の多くの改良・改変を行ない得ることは、当業者には明
らかである。ここに記載の特定の実施態様は、例示の目
的でのみ示したものであり、本発明は添付の特許請求の
範囲によつてのみ限定されるものである。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】(a)アミン類、ジアミン類およびポリアミ
   ン類の陽荷電分子を吸収するホスホセルロース、カルボ
   キシメチルセルロースおよびスルホン酸官能基を有する
   ポリマーで被覆されたペーパーから成る群から選ばれる
   陰荷電要素、 (b)アミン類、アミノ酸類およびそれ等の誘導体を前記
   要素から除去する溶出液、 (c)ジアミン類およびポリアミン類を前記要素から溶出
   する強電解質、 (d)前記アミン類をアルデヒド、アンモニアおよび過酸
   化水素に変えるジアミンおよびポリアミン酸化酵素、 (e)過酸化活性を有する物質、および (f)酸化されて過酸化水素になったジアミン類および／
   またはポリアミン類の存在を定量的に測定するための、
   酸化された過酸化水素の存在下に発光する物質 を含むことを特徴とする、生物学的液体中のジアミン類
   および／またはポリアミン類の存在を検出する診断試験
   キット。
2. 【請求項２】前記陰荷電要素が、ホスホセルロースステ
   ィックである特許請求の範囲第１項記載のキット。
3. 【請求項３】前記強電解質が、塩化ナトリウム、塩化マ
   グネシウムおよび水酸化アンモニウムから成る群から選
   ばれる特許請求の範囲第１項記載のキット。
4. 【請求項４】前記強電解質が、塩化ナトリウムである特
   許請求の範囲第３項記載のキット。
5. 【請求項５】前記ジアミンおよびポリアミン酸化酵素
   が、エンドウ種子、豚腎、細菌または真菌から精製され
   たジアミン酸化酵素および牛血漿または血清、細菌およ
   び真菌から精製されたポリアミン酸化酵素から成る群か
   ら選ばれる特許請求の範囲第１項記載のキット。
6. 【請求項６】前記過酸化活性を有する物質が、セイヨウ
   ワサビ過酸化酵素、イチジクラテツクス過酸化酵素、ウ
   ロヘミン、血液鉄およびモリブデン酸イオンから成る群
   から選ばれる特許請求の範囲第１項記載のキット。
7. 【請求項７】前記過酸化活性を有する物質が、セイヨウ
   ワサビ過酸化酵素である特許請求の範囲第１項記載のキ
   ット。
8. 【請求項８】前記発光物質が、ルミノールである特許請
   求の範囲第１項記載のキット。
9. 【請求項９】結合形ジアミン類およびポリアミン類の加
   水分解のために無機酸を更に含むことを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載のキット。
10. 【請求項１０】(a)結合形および非結合形のジアミン類
    およびポリアミン類を含有する生物学的液体サンプルと
    アミン類、ジアミン類およびポリアミン類の陽荷電分子
    を吸収するホスホセルロース、カルボキシメチルセルロ
    ースおよびスルホン酸官能基を有するポリマーで被覆さ
    れたペーパーから成る群から選ばれる陰荷電要素とを接
    触させること、 (b)アミン類、アミノ酸類およびそれらの誘導体をアミ
    ン溶出用溶液で洗浄して前記要素から除去すること、 (c)ジアミン類およびポリアミン類を強電解質と接触さ
    せて前記要素から溶出すること、 (d)前記溶出ジアミン類およびポリアミン類を酸化酵素
    で酸化して該アミン類をアルデヒド、アンモニアおよび
    過酸化水素に変えること、および (e)ジアミン類およびポリアミン類の酸化により生じた
    過酸化水素を、酸化された過酸化水素の存在下に発光す
    る物質の存在下、過酸化活性を有する物質と反応させる
    ことにより検出すること、 を特徴とする、生物学的液体中のジアミン類およびポリ
    アミン類の存在を検出する方法。
11. 【請求項１１】段階(a)を実施する前に、前記結合形ジ
    アミン類およびポリアミン類を含有する生物学的液体サ
    ンプルを無機酸の存在下に加熱してジアミン類およびポ
    リアミン類を遊離させることを特徴とする特許請求の範
    囲第１０項記載の方法。
12. 【請求項１２】前記酸が１Ｎ塩酸である特許請求の範囲
    第１１項記載の方法。